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Verfahren zur Trennung der Komponenten des Actinomycins C Durch das
Patent 912 010 ist ein Verfahren zur Herstellung von Actinochrysin bekanntgeworden,
nach welchem Pilzstämme aus der Gruppe der Actinomyceten, welche in der Lage sind,
einen Farbstoff zu bilden, der die Nährlösung in natürlichen Konzentrationen gelb
färbt und als ziegelrotes Produkt vom ungefähren Schmelzpunkt 25¢° isoliert werden
kann, insbesondere der Streptomyces (Actinomyces) chrysomallus, vorzugsweise im
Submersverfahren gezüchtet und das Actinochrysin aus den Kulturen vorzugsweise nach
Extraktions- und Adsorptionsverfahren gewonnen, angereichert und gegebenenfalls
in reiner Form dargestellt wird.
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Bei der weiteren Bearbeitung hat sich gezeigt, daß das so gewonnene
Actinochrysin, für das auch der wissenschaftliche Name Actinomycin C vorgeschlagen
worden ist, nicht einheitlicher Natur ist, sondern ein Gemisch nahe verwandter Substanzen
darstellt. Ihrer chemischen Zusammensetzung nach sind alle diese Actinomycinewahrscheinlich
Chromopeptide, die dadurch charakterisiert sind, daß in ihrem Molekül ein gelber
Farbstoffanteil mit einem Polypeptidrest verknüpft ist. Die verschiedenen Actinomycine
unterscheiden sich in der Zusammensetzung der Aminosäuren im Polypeptidteil.
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Trotz dieser nahen Verwandtschaft ist es nun erfindungsgemäß gelungen,
die einzelnen Actinomycine in gereinigter Form dadurch herzustellen, daß man das
auf mikrobiologischem Wege anfallende Actinomycin C (Actinochrysin) einer Verteilung
zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln unterwirft.
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Die Löslichkeit der verschiedenen Actinomycine ist im allgemeinen
nicht so voneinander verschieden, daß man mit einer einzigen Verteilung eine vollständige
Trennung bewirken kann. Man arbeitet
daher zweckmäßig im Gegenstromverfahren
und schaltet eine größere Anzahl von Verteilungsstufen hintereinander. Als Lösungsmittelsysteme
sind solche brauchbar, die erstens eine wäßrige Phase. enthalten und zweitens eine
Phase, die aus organischen, mit Wasser beschränkt mischbaren Lösungsmitteln, wie
Äthern, z. B. Methylbutyläther und Dibutyläther, oder Estern, besteht. Da die Löslichkeit
des Actinomycins C in reinem Wasser in dieser Konzentration gering ist, hat es sich
als zweckmäßig erwiesen, in der wäßrigen Phase Substanzen zu lösen, die die Löslichkeit
des Actinomycins C steigern, z. B. Harnstoff, Salze aromatischer Sulfosäuren, wie
z. B. Alkalisalze der Xylolsulfosäure oder der Naphthalin-i, 6-disulfosäure.
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Es ist auch möglich, die Trennung z. B. durch Verteilung zwischen
wäßriger Salzsäure und Äther zu bewirken.
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Das auf mikrobiologischem Wege anfallende Actinochrysin (Actinomycin
C) besteht nach den Ergebnissen der auf diese Weise durchgeführten Trennungsversuche
im wesentlichen aus drei Bestandteilen, die als Actinomycin Cl, Actinomycin C2 und
Actinomycin C3 bezeichnet werden. Die Zusammensetzung des Peptidrestes dieser drei
Actinomycine ist in der folgenden Tabelle wiedergegeben:
| Cl I C2. I C3 |
| Threonin ... .. .. .. ... -I- |
| Sarkosin ............ -F- -I- |
| Prolin ... .. .: ....... =f- -I- |
| Valin ............... -f- -f- - |
| N-Methylvalin . .. .. .. + -I- -I- |
| Isoleucin ............ - -L- -h |
Bei der quantitativen Analyse des Aminosäuregehaltes ergab sich etwa folgendes molare
Verhältnis für Actinomycin C2 und Actinomycin C3:
| Ca I Ca |
| Threonin ... .. .. .. ... 2 2 |
| Sarkosin ............ i i |
| Prolin ... .. .. .. ... ... 2 2 |
| Valin ............... i - |
| N-Methylvalin ....... 2 2 |
| Isoleucin ... .. .. .. ... 1 2 |
In den chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden sich die rein dargestellten
Actinomycine nicht charakteristisch voneinander. Es wurde z. B. für Actinomycin
C2 und C3 praktisch der gleiche Stickstoffgehalt gefunden, und auch im Kohlenstoffgehalt
sind die Unterschiede nicht entscheidend. Das Drehungsvermögen für polarisiertes
Licht, das Absorptionsspektrum im sichtbaren und ultravioletten Licht und auch das
Infrarotspektrum lassen keine deutlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen
Actinomycinen erkennen. Das ist auch nicht überraschend, wenn man berücksichtigt,
daß in dem relativ großen Gesamtmolekül der Actinomyeine nur ein kleiner Molekülanteil
unterschiedlich gebaut ist, noch dazu in einem Molekülbezirk, der zum Chromophor
nicht in unmittelbarer Beziehung steht.
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Die gereinigten Antibiotica sollen therapeutische Verwendung finden.
Beispiel i 9 1 5-molare Harnstofflösung [300/Gig; Sog Harnstoff (Merck) auf ioo
ml mit aqua Best. aufgefüllt] werden 12 Stunden vor dem Gebrauch angesetzt. Die
Harnstofflösung wird durch eine Filternutsche filtriert.
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Es werden zusammen 91 Methyl-butyläther (Kp. 7o,1°) und n-Dibutyläther
(KP- 14o°) im Verhältnis 71 : 29 Volumprozent, beide peroxydfrei, gemischt.
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Die zur Verteilung verwendeten Lösungsmittel werden zusammengegeben
und gegeneinander abgesättigt. In dem auf diese Weise bereiteten Lösungsmittelpaar,
bei gleichen Mengen beider Phasen, ist der Verteilungskoeffizient des Actinomyces
C ganz wenig unter i und optimal für die Trennung. 22o mg Actinomycin C werden in
beiden Phasen der Null-und ersten Stufe aufgelöst. Es werden dazu je zweimal
50 ml des vorbereiteten Lösungsmittelpaares verwandt. Nach beendeter Lösung
wird jede Phase vor dem Einfüllen filtriert. Die Verteilung wird möglichst unter
Ausschaltung von Lichteinwirkung in der von G r u b h o f e r, Chemie Ingenieur
Technik 22, 2o9 (195o) beschriebenen Apparatur durchgeführt. Jede Stufe wird durch
fünfzig- bis sechzigmaliges Hinundherschwenken zur Gleichgewichtseinstellung gebracht
und nach jedem Verteilungsschritt völlige Trennung der Phasen abgewartet.
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Zur Aufnahme der Verteilungskurve werden jeweils beide Phasen, zunächst
nur jeder vierten Fraktion, im Zeiß-Pulfrich-Kolorimeter bei Filter i mit Küvette
30 mm gemessen und nachträglich an den Maxima und Minima noch alle Zwischenstufen.
Auf Grund der empirisch gewonnenen und der berechneten Kurve werden die noch als
praktisch rein anzusehenden Stufen jedes Maximums ermittelt und die entsprechenden
Fraktionen zu jeder Komponente vereinigt: Maximum i (Actinomycin C1) die Stufen
28 bis 51; Maximum 2 (Actinomycin C2) die Stufen 62 bis 77; Maximum 3 (Actinomycin
C3) die Stufen 95 bis 128.
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Aus den Harnstofflösungen konnten die Actinomycine durch Ausschütteln
mit Benzol quantitativ in die Benzolphase aufgenommen werden. Auf 1 1 Harnstofflösung
werden etwa Zoo ml Benzol benötigt. Das Benzol wird dann im Vakuum eingeengt. Daraus
werden die Actinomycine an Aluminiumoxyd adsorbiert. Durch Elution mit Äthylessigester
werden sie zur Kristallisation gewonnen.
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Die Actinomycin enthaltenden Äthergemische werden im Vakuum eingeengt.
Dabei ging der Methyl-butyläther zuerst über, und es fiel Harnstoff aus. Die Actinomycine
können aus dem zum größten Teil aus Dibutyläther bestehenden Rückstand ebenfalls
durch Chromatographie an Aluminiumoxyd gewonnen werden. Dabei ist gutes Nachspülen
der Säule mit Benzol wichtig. Die Actinomycine werden
mit Essigester
eluiert. Da sich Reste von n-Dibutyläther noch störend bemerkbar machten, wurde
im Vakuum vom Essigester zur Trockene eingeengt, mit Benzol aufgenommen und erneut
chromatographiert. Essigesterelution ergab dann das Produkt zum Kristallisieren.
Beispiel e 2 15'o/oige xylolsulfonsaure Natriumlösung (ioo g p-xylolsulfonsaures
Natrium auf 2 1 mit aqua dest. aufgefüllt) werden i2 Stunden vor dem Gebrauch angesetzt,
da innerhalb dieser Zeit eine Alterung der Lösung eintritt, bei der die Verteilung
des Actinomycins aus ätherischer Phase zugunsten einer steigenden Löslichkeit in
der wäßrigen Phase sich ändert. Die xylolsulfonsaure Natriumlösung wird durch eine
Filternutsche filtriert.
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Es werden zusammen 2 1 Methyl-butyläther (Kp. 7o,i°) und n-Dibutyläther
(Kp. 1q.0°) im Verhältnis 6o : 40 Volumprozent, beide peroxydfrei, gemischt.
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Die zur Verteilung verwendeten Lösungsmittel werden zusammengegeben
und gegeneinander abgesättigt. In dem auf diese Weise bereiteten Lösungsmittelpaar,
bei gleichen Mengen beider Phasen, war der Verteilungskoeffizient etwa i und optimal
für die Trennung.
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In 5o ml der oberen Phase des Lösungsmittelpaares werden io mg Actinomycin
C gelöst und vor dem Einfüllen in die Verteilungsapparatur filtriert. Die Verteilung
wird unter möglichst starker Ausschaltung von Lichteinwirkung vorgenommen. Jede
Stufe wird durch sechzigmaliges Hinundherschwenken der Apparatur zur Gleichgewichtseinstellung
gebracht.
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Zur Aufnahme der Verteilungskurve werden jeweils beide Phasen im Zeiß-Pulfrich-KOlorimeter
bei Filter i mit Küvette 50,07 mm gemessen.
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Die Trennwirkung des beschriebenen Systems gleicht derjenigen des
Systems Äther - 3oo/aige Harnstofflösung und auch derjenigen des Systems Äther -
5,6o/oige Salzsäure.