DE10159987A1

DE10159987A1 - Verfahren zur Aufreinigung von Glycerolether enthaltenden Mischungen

Info

Publication number: DE10159987A1
Application number: DE2001159987
Authority: DE
Inventors: Dirk Fabritius; Heinz Engelhardt; Dominik Burger
Original assignee: Nutrinova Nutrition Specialties and Food Ingredients GmbH
Current assignee: Celanese Sales Germany GmbH
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2003-06-26
Also published as: WO2003048095A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufarbeitung von Mischungen, die Glycerolether und PUFA enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung auf eine feste Phase aufbringt und anschließend Bestandteile der Mischung mit mindestens einem überkritischen Fluid selektiv extrahiert, wobei man zur Auftrennung der Mischung den Druck des Fluids variiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Aufreinigung von Mischungen, die Glycerolether und PUFA enthalten.
Glycerolether treten in der Natur häufig als 1-O-Alkyl-2,3-diacyl-sn-glycerole auf. Diese werden dann als unpolare Glyceroletherlipide (oder Etherlipide) bezeichnet und sind natürliche Hauptbestandteile von Leberölen (Lebertrane) bestimmter Fischarten (z. B. Hai oder Kabeljau). Neben den unpolaren O-Alkylethern treten aber auch polare Verbindungen vom Typ der O-Alkyletherphospholipide auf (Smith, J. P., C. M. Mello and D. J. O'Reilly (1988): Separation of phospholipids and phosphonolipids of Tetrahymena by highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography, 431, 395-399).
Ihnen werden gesundheitsfördernde Wirkung zugeschrieben und stellen zugleich hochwertige Verbindungen dar, da sie starke Ähnlichkeit mit dem sogenannten Platelet activating factor (PAF) aufweisen (Mangold, H. K. and F. Paltauf (1983): Ether Lipids. Biochemical and Biomedical Aspects. Academic Press, Inc., New York). PAF ist 1-O-Alkyl-2-acetyl-sn- glycerophosphocholin und gehört demnach zur Gruppe der Phopholipide (Choline). Weiterhin wirken sie antibakteriell und hemmen das Wachstum von Tumorzellen und schützen Zellen von Strahlenschäden (Seppänen-Laakso, T. (1990): Rapid determination of unsubstituted alkylglyceryl ethers by gas chromatography-mass spectrometry. J. Chrom., 530, 94-101).
Es sind drei Hauptgruppen von Alkoholen beschrieben, die im Glycerol in 1-Position verethert sind. Oleylalkohol (18:1) führt zum Selachylalkohol (SA), Stearylalkohol (18:0) führt zum Batylalkohol (BA) und 1-Hexadecanol (16:0) führt zum Chimylalkohol (CA).
Ausgehend von diesen 1-O-Alkylethern lassen sich mittels biokatalytischer Verfahren entsprechende PAF-Substituenten herstellen (Haraldsson, G. G. and A. Thorarensen (1994): The generation of glyceryl ether lipids highly enriched with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid by lipase. Tetrahedron Lett., 35, 7681-7684). Insbesondere die Herstellung von Glycerolethern mit hochungesättigten Fettsäuren, wie z. B. EPA oder DHA scheint dabei besonders interessant, da diese Vertreter in der Natur nur in geringen Mengen vorliegen (Haraldsson, G. G. in Enzymes in Lipid modification (2000), S. 178-179, Ed. U. Bornscheuer. Wiley-VCH, Weinheim).
Bestimmte Mikroorganismen wie z. B. Arten der Gattung Tetrahymena zeichnen sich durch einen hohen Gehalt an Etherlipiden aus und sind gleichzeitig in der Lage hohe Mengen von hochungesättigten Fettsäuren (PUFAs: Polyunsaturated Fatty Acids) zu synthetisieren (Holz, G. G. Jr. (1973): The composition, metabolism, and roles of lipids in Tetrahymena. Eds. Elliot, A. M., Biol. Tetrahymena, 99-122). So zeichnet sich Tetrahymena durch sehr hohe Gehalte an der für den Menschen essentiellen Fettsäure γ-Linolensäure (GLA) aus. Daneben weist das Fettsäurespektrum von Tetrahymena aber auch unerwünschte und ungewöhnliche Fettsäuren wie z. B. Isofettsäuren und ungeradzahlige Fettsäuren auf (Koroly, M. J. and R. L. Conner (1976): Unsaturated fatty acid biosynthesis in Tetrahymena. J. Biol. Chem., 251(23), 7588-7592). Für die Verwendung in der menschlichen Ernährung oder der klinischen Anwendung ist es daher erforderlich die unerwünschten Fettsäuren von den gewünschten Fettsäuren abzutrennen.
Tetrahymena eignet sich besonders für die industrielle Anzucht, da der Organismus heterotroph in konventionellen Fermentern angezogen werden kann (Hellenbroich, D., U. Valley, T. Ryll, R. Wagner, N. Tekkant, W. Kessler, A. Roß und W-D. Decker (1999): Cultivation of Tetrahymena thermophila in a 1,5-m³ airlift bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 447-455). Dadurch gelingt der gleichzeitige Zugang zu Etherlipiden und PUFAs.
PUFAs können vom Menschen nicht de-novo synthetisiert werden, da ihnen die Enzymsysteme fehlen, die eine Doppelbindung in die Kohlenstoffkette an Positionen > C9 einführen können (fehlende Δ12-Desaturase). Erst durch die Zufuhr von sogenannten Vorläufer-Fettsäuren (Precursoren, z. B. α-Linolensäure) über die Nahrung ist der Mensch in der Lage, hochungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren. Ob diese Menge jedoch ausreicht, um den Bedarf an hochungesättigten Fettsäuren zu decken, ist umstritten.
Der allergrößte Teil der essentiellen Fettsäuren wird durch die Nahrung aufgenommen. Insbesondere Pflanzenöle sind angereichert mit ω-6 Fettsäuren (z. B. enthält Nachtkerzenöl GLA), jedoch nur bis zu einer Kettenlänge von C18, und Fischöle bzw. Öle aus Mikroorganismen mit ω-3 Fettsäuren (z. B. enthält Lachsöl EPA und DHA). Grundsätzlich stellen Fischöle und Öle aus Mikroorganismen die einzige kommerzielle Quelle für hochungesättigte Fettsäuren dar. Im Allgemeinen ist jedoch der Gehalt an der erwünschten PUFA gering und diese liegt in einer Mischung vor, wobei antagonistisch wirkende PUFAs ebenfalls enthalten sein können. Um die empfohlene tägliche Dosis an PUFAs zu sich zu nehmen, muß also eine hohe Ölmenge aufgenommen werden. Insbesondere trifft das auf solche Patienten zu, die hohe Dosen von PUFAs zu sich nehmen müssen (z. B. Cystische Fibrose). Um eine möglichst gezielte Wirkung der einzelnen PUFAs zu erreichen, müssen angereicherte bzw. hochreine PUFAs eingesetzt werden Es besteht daher im Stand der Technik ein hoher Bedarf an hochreinen PUFAs.
In der Regel laufen alle technischen Aufreinigungsverfahren für PUFAs über die freien Fettsäuren oder Ester und nicht über die nativen Triglyceride oder polaren Lipide (Chen, T.- C. and Y.-H. Ju (2000): Enrichement of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid in saponified menhaden oil. JAOCS, 77(4), 425-428; Gunstone, F. D. (1999): The availability of polyunsaturated fatty acids. Appendix to chapter 1, Scottish Crop Research Institute, Dundee, UK. Editor(s): Gunstone, Frank D., Lipid Synth. Manuf., 39-45. Publisher: Sheffield Academic Press, Sheffield, UK). Vielfach kommen Fällungsreaktionen mit Harnstoff (Spurvey, S. A. and F. Shaidi (2000): Concentration of gamma linolenic acid (GLA) from borage oil by urea complexation: optimization of reaction conditions. J. Food Lipids, 7, 163-174) oder chromatographische Verfahren (Yamamura, R. and Y. Shimomura (1997): Industrial high-performance liquid chromatography purification of docosahexaenoic acid ethyl ester and docosapentaenoic acid ethyl ester from single cell oil. JAOCS, 74(11), 1435-1440)) zum Tragen, die zum einen aufgrund der hohen technischen Anforderung aufwendig und teuer und zum anderen wegen der potentiellen Carbamatbildung (krebserregend) nur bedingt geeignet sind berichtet (B. J. Canas (1999): Ethyl carbamate formation during urea complexation for fractionation of fatty acids. JAOCS, 76(4), 537). Weiterhin gelingt die Abtrennung bei verschiedenen anderen Aufreinigungsverfahren nicht oder nur unzureichend.
In Anbetracht des hierin angegebenen und diskutierten Standes der Technik war es mithin Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Aufreinigung von PUFA und Gylcerolether enthaltenden Mischungen anzugeben, die besondere einfach und kostengünstig durchführbar sind. Hierbei sollte insbesondere auf die Verwendung von gesundheitsbedenklichen Verbindungen verzichtet werden.
Aufgabe der Erfindung war es weiterhin, mit dem neuen Verfahren polyungesättigte Fettsäurederivate zu generieren, welche besonders bezüglich des Restlösungsmittelgehaltes, des Nebenproduktspektrums und der Produkteigenschaften in Hinblick auf deren natürliches Vorkommen rein ist.
Aufgabe der Erfindung ist somit, ein verbessertes Verfahren zur Aufarbeitung von aus dem Herstellprozeß erhaltenen Rohmaterial zur Verfügung zu stellen, welches gleichzeitig die verschiedenen PUFAs aufkonzentriert.
Des weiteren sollten die unterschiedlichen PUFAs entsprechend ihrer Anzahl an Kohlenstoffatomen aufgetrennt werden, um antagonistisch wirkende PUFAs aus den Mischungen abzutrennen.
Darüber hinaus sollten Glycerolether von PUFAs getrennt werden, da diese einerseits wertvolle Rohstoffe darstellen und andererseits deren physiologische Wirkung bei Verabreichung von hohen PUFA-Dosen zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Hierbei ist zu bedenken, daß PAFs bereits in sehr geringen Mengen eine hohe Wirkung zeigen.
Gelöst werden diese sowie weitere, nicht explizit genannten Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1. Zweckmäßige Abwandlungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüchen unter Schutz gestellt.
Dadurch, daß man eine Glycerolether und PUFA enthaltende Mischung auf eine feste Phase aufbringt und anschließend Bestandteile der Mischung mit mindestens einem überkritischen Fluid selektiv extrahiert, wobei man zur Auftrennung der Mischung den Druck des Fluids variiert, gelingt es überraschend ein Verfahren zur Aufreinigung zur Verfügung zu stellen, das besonders kostengünstig und einfach durchführbar ist.
Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen werden u. a. insbesondere folgende Vorteile erzielt:

- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch in industriellem Maßstab durchgeführt werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf erstaunlich einfache Weise die Gewinnung von wertvollen Estern langkettiger Fettsäuren.
- Durch das vorliegende Verfahren gelingt es überraschend PUFA in hoher Konzentration zu erhalten, ohne daß die üblichen Fällungsverfahren notwendig sind. Hierdurch können sehr reine Produkte erhalten werden, die im wesentlichen frei von Nebenprodukten und Restlösemitteln sind.
- Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Auftrennung der verschiedenen PUFAs gemäß ihrer Anzahl an Kohlenstoffatomen und/oder ihrer Anzahl an ungesättigten Bindungen, ohne daß hierfür eine aufwendige Chromatographie notwendig wäre.
- Die Durchführung des Verfahrens ist relativ einfach und kostengünstig.

Erfindungsgemäß werden Mischungen aufgereinigt, die Glycerolether und PUFA enthalten. Der Begriff Mischung ist hierbei weit zu verstehen. Es kann sich insbesondere um ein Rohmaterial handeln. Rohmaterial bedeutet, daß das Gemisch aus natürlichen Quellen gewonnen wurde, wobei das Gemisch üblichen physikalischen oder chemischen Trennmethoden, wie Extraktion, Winterisierung, Filtration, Chromatographie, Zentrifugation, Sedimentation oder Destillation unterzogen worden sein kann. Hierdurch können beispielsweise PUFA enthaltende Öle aus den Rohmaterialien gewonnen werden, die anschließend gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung aufgereinigt werden.
Des weiteren fallen hierunter auch Gemische, die durch chemische Umwandlung von Rohmaterialien erhalten wurden. Hierzu gehört unter anderem, daß das die PUFAs und Glycerolether enthaltende Gemisch vor der erfindungsgemäßen Aufarbeitung verseift oder umgeestert wurde.
Als Rohmaterial können alle bekannten Quellen, die neben PUFA auch Glycerolether enthalten verwendet werden. Neben den zu beginn erwähnten Pflanzen- und Fischölen handelt es sich insbesondere auch um Fermentationsprodukte von Mikroorganismen. Zu den bevorzugten Quellen gehören insbesondere die durch Fermentation von Tetrahymena gewonnenen Rohmaterialien. Die Fermentation von Tetrahymena ist an sich bekannt, wobei auf die zu beginn erwähnte Literatur verwiesen wird.
Wie zuvor erwähnt sind Glycerolether an sich bekannt. Vorzugsweise sind hierunter Verbindungen zu verstehen, die insbesondere an der 1-Position des Glycerinrests verethert sind. Diese Verbindungen können am Glycerinrest weitere Substituenten tragen. Dementsprechend kann die Glycerinverbindung polar sein. Derartige Verbindungen kommen insbesondere als Glycerinphospate oder Lecithine vor. Darüber hinaus kann der Glycerolether auch unpolarer Natur sein. Hierzu gehören insbesondere auch Verbindungen, die neben der Ethergruppe auch weitere langkettige Fettsäurereste tragen, die am Glycerinrest verestert sind.
Die Begriffe polar und unpolar sind in der Fachwelt bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet polar, daß die Verbindung bei einem pH-Wert von 7,0 rechnerisch mindestens eine Ladung trägt. Dies umfaßt auch Verbindungen, die neben einer positiven auch eine negative Partialladung tragen, wie beispielsweise Lecithine. Unpolar bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Verbindung nicht geladen ist, wobei jedoch eine gewisse Polarisierung der Verbindung unschädlich ist.
Zu den bevorzugten Glycerolethern gehören insbesondere Verbindungen, die neben dem Glycerinrest einen langkettigen Alkylrest mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 14 Kohlenstoffatomen aufweisen. Bevorzugt sind hierbei Alkylreste mit einer geradzahligen Anzahl an Kohlenstoffatomen, wobei der Kohlenstoffrest keine Verzweigung aufweist. Zu diesen Glycerolethern gehören insbesondere Selachylalkohol (SA), Batylalkohol (BA) und Chimylalkohol (CA).
Neben dem Glycerolether enthalten die erfindungsgemäß aufzureinigenden Mischungen mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs), die sowohl als freie Säuren oder als Derivat vorliegen können. Zu den bevorzugten Derivaten zählen unter anderem die Ethylester dieser Fettsäuren. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auf einfache Weise eine Trennung dieser verschiedenen PUFA enthaltenden Ethylestermischungen von den Alkylethern.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die unterschiedlichen Glyceride oder andere Lipidklassen (z. B. Phospholipide) in die Ester eines einwertigen Alkohols überführt. Zu geeigneten Alkoholen gehören unter anderem Alkanole mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome, die eine Hydroxygruppe umfassen. Beispiele dieser bevorzugten Verbindungen sind unter anderem Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Cyclopentanol, Hexanol und Cyclohexanol.
Verfahren zur Umesterung sind an sich bekannt. Beispielsweise kann eine Umesterung mit ethanolischer Schwefelsäure erfolgen. Hierdurch werden die Ethylester der ungesättigten Fettsäuren erhalten.
Zur Aufreinigung behandelt man die Mischung mit einem überkritischen Fluid. Der Begriff Fluid soll verdeutlichen, daß sich das Gas bzw. die Flüssigkeit im überkritischen Zustand befindet. Derartige Fluide sind an sich bekannt, wobei im allgemeinen die überkritischen Daten der Stoffe, d. h., der jeweils überkritische Druck bzw. die überkritische Temperatur, aus Tabellen oder Nachschlagewerken entnommen werden können.
Zu den bevorzugten Stoffen, die als Fluid dienen können, gehören unter anderem Kohlendioxid (CO₂), Distickstoffmonoxid, Ethylen, Propan und Ammoniak.
Beispielsweise kann CO₂ in einem Bereich von 50 bis 500 bar als Fluid eingesetzt werden.
Dem oben genannten Verfahren ist eigen, daß eine PUFA und Glycerolether enthaltende Mischung mit überkritischem Gas oder einer überkritischen Flüssigkeit behandelt wird. Hierzu wird das Fluid mit der Mischung in Kontakt gebracht. Das kann batchweise oder kontinuierlich geschehen, wobei die fluide Phase als Lösungsmittel die Mischung je nach Fahrweise der Aufarbeitung entweder durchströmt oder umspült. Dies kann auf jede dem Fachmann bekannte Weise durchgeführt werden.
Die aufzureinigende Mischung wird obligatorisch auf eine feste Phase aufgebracht. Besonders bevorzugt sind unter anderem Seesand, Aminophasen, Cyanophasen und Kieselgel. Amino- bzw. Cyanophasen sind Matrixmaterialien, die Amino- bzw. Cyanogruppen enthalten. Derartige Materialien sind weithin bekannt und kommerziell (z. B. von Merck) erhältlich.
Die die zu reinigende Mischung enthaltende feste Phase kann anschließend mit Fluid umspült oder durchströmt werden, wobei die einzelnen Bestandteile der Mischung unterschiedlich auf bzw. an der festen Phase haften. Durch diese Unterschiede ist eine Auftrennung der Mischung möglich. Dementsprechend kann man die Mischung mittels Extraktion trennen.
Zur selektiven Extraktion wird der Druck dem das Fluid ausgesetzt ist variiert. Unter Variation ist jede Änderung des Drucks zu verstehen, die zu einer Änderung des Lösungsvermögens des Fluids führt. Üblicherweise erhöht man den Druck, um das Lösungsvermögen des Fluids zu verbessern. Diese Variation kann kontinuierlich oder stufenförmig erfolgen.
Erfolgt die Druckänderung stufenförmig, so kann diese Änderung in weiten Bereichen schwanken. Die Variation des Drucks ist insbesondere von der festen Phase sowie der Löslichkeit der einzelnen Bestandteile der Mischung abhängig. Um eine besonders hohe Trennungsleistung zu erzielen wird der Druck von Schritt zu Schritt nur sehr wenig geändert. Aus wirtschaftlichen Gründen kann eine hohe Änderung des Drucks sinnvoll sein. Dies gilt insbesondere in Bereichen in denen sich nur Nebenprodukte von der festen Phase lösen, deren Auftrennung nicht von besonderem Interesse ist. Im allgemeinen unterscheidet sich der Druck der verschiedenen Extraktionsschritte vorzugsweise um mindestens 1 bar, insbesondere um mindestens 5 bar, ohne daß hierdurch eine Einschränkung erfolgen soll.
Die Dauer der einzelnen Extraktionsschritt hängt von der auf die feste Phase aufgetragenen Menge an PUFA und Glycerolether enthaltenden Mischung ab, so daß diese in weiten Bereichen schwanken kann. Vorzugsweise wird jedoch bei einem Extraktionsschritt mindestens 5 Minuten, besonders bevorzugt mindestens 10 Minuten extrahiert.
Je nach Wahl des festen Phase wird hierdurch eine überraschend einfache Auftrennung der Mischung durch selektive Extraktion möglich, da die Löslichkeit der zu trennenden Bestandteile in besonderem Maß vom Druck abhängig ist, dem das Fluid ausgesetzt ist.
Falls das Lösungsvermögen des Fluids nicht zur Extraktion eines gewünschten Bestandteils der zur reinigenden Mischung ausreicht sowie zur Regeneration der festen Phase kann man die feste Phase zusätzlich mit einem organischen Lösungsmittel extrahieren. Geeignete Lösungsmittel sind an sich bekannt. Diese Lösungsmittel sollten leicht von den gewünschten Bestandteilen abzutrennen sein und ein hohes Lösungsvermögen aufweisen. Zu den geeigneten Lösungsmittel gehören unter anderem n-Hexan, n-Heptan und Ethanol.
Durch die Variation des Drucks kann gemäß dem vorliegenden Verfahren beispielsweise eine Fraktion erhalten werden, die PUFAs umfaßt. Diese Fraktion zeichnet sich besonders bevorzugt durch eine hohe Konzentration an PUFAs aus. Vorzugsweise liegt diese Konzentration im Bereich von 15 bis 100 Gew.-%, bevorzugt 30 bis 100 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Fraktion nach Abtrennung des Fluids.
Darüber ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Gewinnung von zwei, drei, vier oder mehr Fraktionen, die PUFAs umfassen, wobei sich die einzelnen Fraktionen in der Zusammensetzung der PUFAs unterscheiden.
Überführt man die PUFAs vor der Aufreinigung in die Monoester, so ermöglicht das vorliegende Verfahren die Auftrennung der PUFAs entsprechend der Anzahl der Kohlenstoffatome und/oder der Anzahl der ungesättigten Bindungen.
Hierdurch können Fraktionen erhalten werden, die insbesondere eine hohe Konzentration an PUFA mit einer bestimmten Anzahl an Kohlenstoffatomen enthalten. So weisen einzelne Fraktionen mehr als 15 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 20 Gew.-% und besonders bevorzugt mehr als 40 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Fraktion, einer bestimmten polyungesättigten Fettsäure aus.
Die Abtrennung des Fluids erfolgt gemäß einer besonderen Ausführungsform durch entspannen der jeweiligen Fraktion bei einer ausreichend hohen Temperatur. Bevorzugt werden dementsprechend Fluide eingesetzt, die bei Normalbedingungen gasförmig sind. Durch den Druckabfall wird das Fluid dementsprechend gasförmig, so daß die jeweiligen Fraktionen nach dem Entspannen nur sehr geringe Restmengen an Fluid enthalten. Hierdurch wird eine besonders schonende Aufarbeitung möglich.
Vorrichtungen zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens sind an sich bekannt. Eine besonders bevorzugte Vorrichtung wird in den Beispielen beschrieben. Diese Vorrichtung kann an die jeweilige Anforderungen besonders einfach angepaßt werden.
Die Aufarbeitung kann in jedem Temperaturbereich durchgeführt werden, wobei die zu reinigenden Verbindungen unter diesen Bedingungen im wesentlichen stabil sein sollten. Vorzugsweise findet daher die Aufarbeitung bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 50°C statt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt zu sehr milden Bedingungen bei der Aufarbeitung, die eine Zersetzung von PUFA vermeiden helfen. Diese Bedingungen führen zu qualitativ sehr hochwertigen polyungesättigten Verbindungen und Glycerolethern, deren Restlösemittelgehalt jedoch unter demjenigen einer nach dem Stand der Technik gereinigten Verbindung bei wesentlich geringerem Nebenproduktanteil liegt. Polyungesättigte Verbindungen und Glycerolethern, die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellt wurden, besitzt ein Nebenproduktanteil und Restlösemittelanteil, der besser ist als der nach einem Verfahren des Standes der Technik hergestellten polyungesättigten Verbindungen.
Nachfolgend wird die Erfindung durch Beispiele eingehender erläutert, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt werden soll. Abkürzungsverzeichnis CA: Chimylalkohol
DC: Dünnschichtchromatographie
PUFA: Polyunsaturated Fatty Acid
SFE: Supercritical Fluid Extraction.

Beispiel 1

Präparative Abtrennung von Chimylalkohol und Fettsäureethylestern auf Seesand

Das Beispiel beschreibt eine Verfahren zur Abtrennung von Chimylalkohol aus einem Fettsäureethylestergemisch durch selektive Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid. Die Abtrennung von Chimylalkohol von Fettsäureethylestern wird in einer SFE Apparatur durchgeführt, die in Abb. 1 dargestellt ist.
In Abb. 1 ist eine CO₂ Steigrohrflasche dargestellt, in der CO₂ in flüssigem Zustand vorliegt. Bei der Durchführung der Aufreinigung ist unbedingt darauf zu achten, daß CO₂ bis zum Eintritt in die Pumpe flüssig bleibt. Zu diesem Zweck wird CO₂ über eine Kupferspirale durch ein auf -5°C gekühltes Ethylenglykolbad geleitet. Das CO₂ tritt in flüssiger Form in die HPLC-Pumpenköpfe ein. Da die Pumpenköpfe einer starken mechanischen Beanspruchung unterliegen, wird Reibungswärme erzeugt, welche dazu führt, daß CO₂ "ausgast" und somit nicht mehr gepumpt werden kann. Um die Reibungswärme der Pumpenköpfe abzuführen und das "Ausgasen" des CO₂ zu verhindern, wird eine präparative HPLC-Pumpe so modifiziert, daß die Pumpenköpfe gekühlt werden. Die Kühlung erfolgt über eine Kupferplatte, die im Innern mit auf -5°C gekühltem Ethylenglykol gespült wird (Umwälzpumpe des Kryostaten). Die Pumpe pumpt das flüssige CO₂ in einen Gaschromatograph-Ofen (Erzeugung der überkritischen Temperatur); der überkritische Druck wird dabei über ein Back-pressure-Ventil erzeugt, das sich hinter der Extraktionskammer befindet. Die Extraktion der Analyte erfolgt nun durch CO₂ im überkritischen Zustand. Hinter dem Back-pressure-Ventil wird CO₂ wieder auf Normaldruck entspannt und liegt gasförmig vor; CO₂ besitzt unter diesen Bedingungen kein Lösungsvermögen mehr für die Analyte. Die Analyte werden in einem Aerozyklon abgeschieden, wobei das gasförmige CO₂ entweichen kann. Das Back-pressure-Ventil und der Aerozyklon befinden sich in einem auf 80°C thermostatisierten Trockenschrank, um eine Verblockung der Kapillaren auf Grund von Trockeneis (Joule-Thomson-Effekt) zu verhindern.
Als Extraktionskammer für die SFE fand eine präparative Edelstahlsäule Verwendung (Leersäule: 25.250 mm), die in Abb. 2 dargestellt ist. Diese wird mit 15 g Seesand (Merck, Darmstadt) befüllt auf den das zu trennende Gemisch aufgetragen wird. In diesem Beispiel wurde 1 g Fettsäuregemisch aufgetragen. Anschließend werden weitere 160 g Seesand zugegeben.
Eingesetzt wurde ein Fettsäureethylestergemisch, das aus dem Organismus der Gattung Tetrahymena gewonnen wurde. Der Organismus wurde nach einer Literaturvorschrift angezogen (Kiy, T. and A. Tiedke (1992): Mass cultivation of Tetrahymena thermophila yielding high cell densities and short generation times. Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 576-579). Die erhaltene lyophilisierte Biotrockenmasse wurde nach dem Stand der Technik mit ethanolischer Schwefelsäure in die Ethylester überführt. Das erhaltene Ethylestergemisch enthält ca. 5% (w/w) Chimylalkohol/Ethylestergemisch. Die Fettsäurezusammensetzung ist in Beispiel 4 angegeben.
Die Dichte, d. h. die Extraktionsstärke des überkritischen Kohlendioxids kann so eingestellt werden, daß nur die Fettsäureethylester aus dem Gemisch vom Seesand extrahiert werden. Bei einem CO₂ Fluß von 20 ml/min (80 bar) wird 30 min bei 40°C extrahiert. Dünnschichtchromatographische Analyse Stationäre Phase: HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (Merck, Damstadt)
Mobile Phase: Diethylether/n-Hexan, 80 : 20 (v:v)
Entwicklung der DC-Platte mit Sprühreagenz: Molybdatophosphorsäure
Die in Abb. 3 dargestellte DC-Analytik zeigt, daß eine Abtrennung von Chimylalkohol (CA) von Fettsäureethylestern mittels selektiver Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) durchgeführt werden kann. Es läßt sich kein CA mehr im Ethylester-Produkt nachweisen.

Beispiel 2

Analytische Abtrennung von Chimylalkohol von Fettsäureethylestern auf Seesand

Die nachfolgenden Beispiele wurden in einer kommerziellen analytischen SFE Apparatur Hewlett Packard HP SFE Module 7680 T durchgeführt. Diese analytische Apparatur zur Abtrennung von Chimylalkohol von Feltsäureethylestern ist in Abb. 4 dargestellt.
Zur Auftrennung füllt man in eine analytische Edelstahl-Extraktionskammer (Dimension: 1,1 mm × 81,0 mm), die in Abb. 5 dargestellt ist, 1,0 g Seesand (Merck, Darmstadt). Darauf gibt man 25-75 mg Fettsäureethylester-Gemisch (enthält ca. 5% (w/w) Chimylalkohol). Die Probe wird schließlich mit 10,0 g Seesand überschichtet.
Die Dichte, d. h. die Extraktionsstärke, des überkritischen CO₂ kann so eingestellt werden, daß nur die Fettsäureethylester aus dem Gemisch extrahiert wird, Chimylalkohol bleibt hierbei auf Seesand adsorbiert. Extraktionsbedingungen Dauer: 30 min
Temperatur: 40°C
Druck: 89 bar
Flussrate: 4 ml/min.
Die Abscheidung der Fettsäureethylester erfolgt nach Entspannen des CO₂ auf Normaldruck an einer RP18-Festphasenfalle (Lichrosorp RP18, 5 µm, Durchmesser 100 Å, Merck, Darmstadt) der Dimension 50 mm × 5 mm. Die Fettsäureethylester werden mit n-Heptan von der Festphasenfalle eluiert und können anschließend mittels DC und GC-MS analysiert werden.
Erhöht man die Extraktionsstärke des überkritischen CO₂, so kann in einem 2. Schritt der adsorbierte Chimylalkohol (Glycerolether) von dem Adsorbens extrahiert werden. Bedingungen für die Extraktion von Chimylalkohol (CA) Dauer: 30 min
Temperatur: 40°C
Druck: 97 bar
Flussrate: 4 ml/min.
Der analytische Nachweis von Chimylalkohol (Glycerolether) wird nach Elution von der Festphasenfalle ebenfalls mit DC und GC-MS durchgeführt.

Beispiel 3

Fraktionierte Abtrennung von zudotiertem Chimylalkohol (6,4%) von Fettsäureethylestern auf Seesand

Der Versuch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, allerdings wurden weitere 6,4% (w/w) Chimylalkohol dem Fettsäureethylestergemisch zugegeben. Es wurden 54,5 mg Fettsäureethylestergemisch (enthält bereits 5% (w/w) Chimylalkohol) und 3,5 mg Chimylalkohol mit 11,0 g Seesand vermischt und analog zu Beispiel 1 extrahiert.
Die Proben wurden nach Silylierung mit MSTFA (N-Methylsilytrifluoracetamid) per Gaschromatographie-Massenspektrometrie untersucht (Hewlett Packard GC 6890 mit MSD 5973 Massenspektrometer, Säule: Hewlett Packard HP5-MS 0,25 µm Belegung (30 m Länge, 0,25 mm Innendurchmesser), Splitbetrieb (10 : 1), Trägergas: Helium (constant flow 1,0 ml/min), Injektortemperatur 270°C, GC-Ofen-Temperaturprogramm: Anfangstemperatur 100°C, Temperaturanstiegsrate 10°C/min auf Temperatur 315°C, weiter mit einer Temperaturanstiegsrate von 2°C/min auf Endtemperatur 325°C, Injektionsvolumen: 1,0 µl). Das Massenspektrometer wurde im EI-Betrieb mit 70 eV betrieben. Der detektierte Massenbereich lag zwischen 35 und 550 m/e. Es zeigt sich, das der noch im Ausgangsgemisch vorliegende Chimylalkohol im Produkt vollständig entfernt werden konnte.
In Abb. 6, die die Ergebnisse der GC-MS Untersuchung der Probe vor und nach Abtrennung von CA durch SFE darstellt, ist der Totalionenstrom abgebildet aus dem hervorgeht, daß unter dem Signal des CA eine weitere Verbindung retentiert, die durch GC- MS als Ethylester der Fettsäure 21 : 0 identifiziert werden konnte (M = 354 g/mol). Diese wurde durch die SFE nicht beeinflußt. Das Signal für den CA ist dagegen vollständig entfernt.

Beispiel 4

Fraktionierte Abtrennung von zudotierten 50% Chimylalkohol von Fettsäureethylestern auf Seesand

Der Versuch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, allerdings wurden weitere 50% (w/w) Chimylalkohol dem Fettsäureethylestergemisch zugegeben. Es wurden 11,1 mg Esthylestergemisch (enthält bereits 5% (w/w) Chimylalkohol) und 9,0 mg Chimylalkohol mit 1,01 g Seesand vermischt und analog zu Beispiel 1 extrahiert.
Analog werden folgende Extraktionen durchgeführt (4 ml/min, jede Extraktion 20 Minuten): Tabelle 1 Parameter der SFE-Extraktion mit dem Adsorbens Seesand
Die Analytik der Extrakte wurden wiederum mit DC durchgeführt. Die erhaltenen Dünnschichtchromatogramme sind in Abb. 7 dargestellt. Es zeigt sich deutlich, daß auch bei einem sehr hohen Chimylalkoholgehalt die Abtrennung von Fettsäureethylestern gelingt.

Beispiel 5

Fraktionierte Abtrennung von zudotierten 6,4% Chimylalkohol von Fettsäureethylestern auf Kieselgel

Für die Extraktion wird in die Extraktionskammer aus Beispiel 1 mit 65,4 mg Fettsäureethylester-Gemisch (wie in Beispiel 1) und 4,2 mg Chimylalkohol (6,4%, w/w) gegeben. Als Adsorbens dienten 4,1 g Kieselgel F60 der Firma Merck (Darmstadt).
Teilchengröße: 70-230 µm
Porendurchmesser: 60 Å.
Es werden 7 Extraktionsversuche mit überkritischem CO₂ durchgeführt: Tabelle 2 Parameter der SFE-Extraktion mit dem Adsorbens Kieselgel
Der analytische Nachweis auf Chimylalkohol wurde mit DC und GC-MS durchgeführt. Dünnschichtchromatographische Analyse Stationäre Phase: HPTLC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt)
Mobile Phase: Diethylether/n-Hexan, 80 : 20 (v : v)
Entwicklung der DC-Platte mit Iod.
Die in Abb. 8 dargestellte DC-Analytik zeigt, daß eine Abtrennung von Chimylalkohol (CA) von Fettsäureethylestern mittels selektiver Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid (SFE) erfolgreich durchgeführt werden kann.
Bei niederen Drücken (81 bar) wird ein ganz geringer Anteil Chimylalkohol extrahiert.
Bei Drücken von 115-161 bar können anschließend die Fettsäureethylester extrahiert werden, die Extrakte sind hierbei Chimylalkohol-frei. Gleichzeitig beobactet man eine Fraktionierung der Fettsäureethylester nach aufsteigender Kettenlänge bzw. Sättigungsgrad. Tabelle 3 Fettsäurezusamnensetzung der SFE-Proben (Adsorbens Kieselgel)
Im vorliegenden Fall erhält man gegenüber Seesand eine Extraktionsumkehr, zunächst wird CA und erst bei höheren Drücken die Fettsäureethylester extrahiert (bei Seesand zunächst die Fettsäureethylester und dann CA).
Das Adsorbens wurde nach der SFE mit heißen Lösungen (60°C, 30 Minuten) von n-Heptan (1. Extraktion) und Ethanol (2. Extraktion) extrahiert. Die Extrakte wurden ebenfalls mittels DC analysiert (Abb. 6). Es ist zu erkennen, daß mit Ethanol der CA vom Kieselgel extrahiert werden konnte. In jedem Fall ist bei Einsatz von Kieselgel als Adsorbens auf diese Weise eine Abtrennung CA von FAEE-Gemischen durchführbar.

Claims

1. Verfahren zur Aufarbeitung von Mischungen, die Glycerolether und PUFA enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung auf eine feste Phase aufbringt und anschließend Bestandteile der Mischung mit mindestens einem überkritischen Fluid selektiv extrahiert, wobei man zur Auftrennung der Mischung den Druck des Fluids variiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man CO₂, Distickstoffmonoxid, Ethylen, Propan und/oder Ammoniak als Fluid verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen polaren Glycerolether aufreinigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Glycerolether aufarbeitet, der eine Phosphorgruppe aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen unpolaren Glycerolether aufreinigt.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Glycerolether einen Alkylrest mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung Selachylalkohol (SA), Batylalkohol (BA) und/oder Chimylalkohol (CA) oder Isomere als Glycerolether umfaßt.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung ein Rohmaterial ist.

9. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohmaterial durch Fermentation von Mikroorganismen erhalten wurde.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste Phase Seesand, Aminophasen, Cyanophasen oder Kieselgel verwendet.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei PUFAs umfassende Fraktion erhält, die sich in ihrer PUFA-Zusammensetzung unterscheiden.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die in der Mischung vorhandenen Fettsäuren in Monoester umestert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fettsäuren mit ethanolischer Schwefelsäure in die Ethylester umwandelt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Monoester der PUFAs nach der Anzahl ihrer Kohlenstoffatome und/oder der Anzahl ihrer ungesättigten Bindungen in mindestens zwei Fraktionen trennt.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die PUFAs aufkonzentriert.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den Druck zur Extraktion stufenförmig variiert.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Druck der verschiedenen Extraktionsschritte um mindestens 1 bar unterscheidet.

18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Extraktion mit einem überkritischen Fluid die feste Phase zusätzlich mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert.

19. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man CO₂ in einem Druckbereich von 50 bis 500 bar einsetzt.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufarbeitung bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 50°C erfolgt.