CN109593742A - 定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶基因ak2和dhps1及其应用 - Google Patents

定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶基因ak2和dhps1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶基因AK2和DHPS1及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明应用体外定点突变技术获得具有两个突变碱基的水稻AK2基因，以及具有一个碱基突变的水稻DHPS1基因。该AK2基因编码蛋白质是具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列，该编码基因具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；该DHPS1基因编码蛋白质是具有SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列，该编码基因具有SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。经过转基因水稻验证和分析，这些转基因水稻中被修饰的AK2和DHPS1基因能够有效提高水稻中赖氨酸的水平。该修饰基因可用于水稻中赖氨酸的生物强化。

Description

定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶基因AK2和DHPS1及其 应用
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域，具体涉及能够提高水稻中游离赖氨酸含量的改造后的AK2和DHPS1基因及其在高赖氨酸水稻材料培育中的应用。
背景技术：
水稻作为一种至关重要的粮食作物，富含淀粉和优质的稻米蛋白，为人类和家畜提供机体所需能量和蛋白。但赖氨酸含量较低，从而引起其他氨基酸的吸收受阻，进而影响稻米蛋白质的有效利用，造成食物营养组分和膳食结构的不平衡，因此赖氨酸被称为禾谷类作物中第一限制性氨基酸（Shewry, J Cereal Sci, 2007, 3(46):239-250）。尤其是在以稻米为主要食粮的发展中国家，蛋白质-能量的营养不良严重影响了人体的身体健康水平（Millward, P Nutr Soc, 1999, 58(2):249-260），因此，提高稻米中赖氨酸含量对于提高水稻营养品质至关重要。
赖氨酸作为禾谷类作物中第一限制性氨基酸，较多的研究者已尝试用多种策略来提高作物中赖氨酸的含量，主要包括传统育种技术和现代生物技术。
传统育种选育高赖氨酸种质：目前有两种方法用于高赖氨酸作物材料的选育，一是使用回交兼轮回选择法，使优良基因得以纯合、综合性状得以增强；二是通过选育高赖氨酸基因库，把不同的高赖氨酸基因混合，结合轮回选育方法加以改良（丁占生,中国农业学,2000, 33(21):80-86）。虽然采用常规育种技术来提高玉米、高粱等作物籽粒中赖氨酸含量已获得一些进展（Nelson等, Science, 1965, 3702 (150): 1469-1470; Rognes等,Planta,1983, 157:32-38），但是，在水稻等其他作物上的进展却极小。其中主要的原因有两个，一是大多数作物中缺乏高赖氨酸含量的种质资源，二是即使有高赖氨酸种质，但往往会伴随一些不良副效应的出现，如植株生长发育、产量降低和种子萌发受影响等（Zhu和Galili, Plant Cell. 2003,15: 845-853; Angelovici等, NewPhytol，2011, 189:148-159；Galili和Amir,Plant Biotechnol J,2013,11:211-222）。稻属中缺乏高赖氨酸含量的种质资源，因此用常规育种技术提高稻米的赖氨酸含量显得更为艰难 (刘巧泉等，分子植物育种，2007，5: 301-308)。
现代生物技术的发展为改良水稻等禾谷类作物营养品质提供了一条有效的途径，目前有三种较为有效的策略被用于提高植物种子的赖氨酸含量。第一种策略是人工合成新的优良蛋白基因，使其在植物中过量表达（Keeler等, Plant MolBiol, 1997, 1(34):15-29）；第二种策略是同种或不同物种间优质蛋白基因的转移和表达（Sun等, Eur JBiochem, 1987,162:477-483; Altenbach等, Plant Mol Biol. 1989, 5(13): 513-522）；第三种策略是通过调控特定的代谢途径，特异性增加植物中游离赖氨酸的含量（Houmard等, PlantBiotechnol J, 2007,5:605-614; Long等, Plant BiotechnolJ.2013,11:490-501）。目前，已有很多成功的研究表明通过基因工程对赖氨酸代谢途径关键酶表达进行调控，可显著提高种子中的赖氨酸的含量（Wang 和Galili, 2016, J ExpBot, 67(14):4009-4011）。
植物中赖氨酸的合成和代谢已较为清晰。在高等植物中，赖氨酸的合成来自于天冬氨酸代谢途径的一个分支，在合成赖氨酸的同时还调控异亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸三种必需氨基酸的生物合成。大量的研究表明，在依赖于天冬氨酸途径的赖氨酸合成通路中，赖氨酸的生物合成受天冬氨酸激酶（Aspartate Kinase, AK, EC2.7.2.4）和二氢毗考琳酸合成酶（Dihydropicolinate synthase, DHPS, EC4.2.1.52）两种关键酶的调控（Perl等,1992,Plant Mol Biol,19:815-823）。天冬氨酸激酶是天冬氨酸代谢途径中生物合成的第一个关键酶，参与调控依赖于天冬氨酸途径分支的赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的生物合成，并受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制（Azevedo和Lea, 2001, Amino Acids, 20(3):261-279）。二氢毗考琳酸合成酶（DHPS）作为赖氨酸合成分支途径中的第一个主要限速酶，在植物中受赖氨酸专一性反馈抑制。在拟南芥、玉米、大麦、水稻、胡萝卜和薏米等多种植物中，天冬氨酸激酶的生化水平和分子特征均被表征（Azevedo和Lea, 2001, AminoAcids, 20(3):261-279; Lugli等, 2002, Plant Physiol Biochem, 40:25-32）。
AK和DHPS两种关键酶由于受赖氨酸的反馈抑制，因此一些植物中赖氨酸水平较低，尤其是禾本科作物中（Ferreira等, 2005, Braz J Med Biol Res, 38(7) 985-994）。大肠杆菌中存在3种天冬氨酸激酶同工酶AKI、AKII和AKIII，其中AKI由thrA基因编码，其酶活性受苏氨酸和异亮氨酸的反馈抑制；AKII虽然酶活性不受天冬氨酸途径中的氨基酸及其中间物质抑制，但其产物同型丝氨酸则受蛋氨酸浓度的控制（Galili,1995, Plant Cell,7:899-906）；AKIII则是由lysC基因编码，且特异性受赖氨酸的反馈抑制。Shaul等首次从大肠杆菌的突变体中分离得到对赖氨酸反馈抑制不敏感的lysC等位基因，并成功将其转入到烟草中，提高了烟草中天冬氨酸激酶的活性和游离苏氨酸的积累（Shaul和Galili, 1992,Plant Physiol, 100(3):1157-1163）。大麦中发现一种天冬氨酸激酶同工酶的突变基因lt1，其对赖氨酸反馈抑制浓度由0.4mM提升为10mM，使得大麦种子中游离苏氨酸和甲硫氨酸含量分别显著高于亲本对照4倍和2倍（Bright等, 1982, Biochem Genet, 20(3-4):229-243）。相对于野生型玉米中赖氨酸浓度达到10µM就能抑制50%天冬氨酸激酶活性，玉米天冬氨酸激酶一种同工酶对赖氨酸反馈抑制迟钝的Ask2突变能在同样条件下使赖氨酸的浓度提高为760µM, 籽粒中苏氨酸和赖氨酸水平分别提高了174倍和10倍（Dotson等,1990, Planta, 182(4):546-552）。
多种植物中的DHPS基因已经被克隆，而DHPS作为赖氨酸合成的第一个限速酶，寻求对于赖氨酸反馈抑制不敏感或者低敏感的DHPS和基因的突变较为重要。早期的研究表明，大肠杆菌中的DHPS对赖氨酸的敏感程度显著低于植物中的DHPS，即大肠杆菌中DHPS受赖氨酸反馈抑制的阈值为1000 M,而植物中的赖氨酸阈值浓度为10-50 M（Galili, 2002,Annu Rev Plant Biol, 53(1):27）。因此大肠杆菌中DHPS对赖氨酸的低敏感性被应用到植物中用以提高植物中游离赖氨酸水平。在烟草中表达大肠杆菌DHPS基因，与非转化亲本对照相比，DHPS酶活提高25倍以上，转基因烟草中的游离赖氨酸含量也比亲本对照增加了15倍。类似的方法也成功应用于油菜、大豆的高赖氨酸品质培育中（Falco等, 1995, NatBiotechnol, 13(6):577-582）。UV照射诱变产生的烟草DHPS对赖氨酸抑制降低，叶片和种子中游离赖氨酸含量也显著提高（Negrutiu等, 1984, Theor Appl Genet, 68(1-2):11-20）。含有突变的玉米DHPS基因的构建导入玉米细胞培养物中，转化的细胞中与野生型相比游离赖氨酸含量提高4倍（Bittel等, 1996, Theor Appl Genet, 92(1):70-77）。类似的DHPS突变基因也发现在大豆中（Silk和Mattews, 1997, Plant Mol Biol, 33: 931-933）。
在植物中，已发现一些具有反馈不敏感型天冬氨酸激酶同工酶的突变体可产生并累计大量的游离苏氨酸，而赖氨酸水平则少量提高（Bright等,1982, Nature, 299, 278-279; Dotson等, 1990, Planta, 182(4):546-552; Frankard等, 1992, Plant Physiol,99(4):1285-1293）。在依赖于天冬氨酸途径的赖氨酸合成通路中，对赖氨酸反馈抑制不敏感或低敏感的AK和DHPS突变基因组合表达显得尤为有效。虽然在大肠杆菌、大麦和玉米等物种中获得了对赖氨酸反馈抑制不敏感或者低敏感的AK和DHPS基因，并通过基因工程的技术获得一些高赖氨酸转基因植物，但是水稻作为一种重要的粮食作物，其还未发现对赖氨酸反馈抑制不敏感的AK和DHPS基因的存在，同时，植物中转入其他物种的外源基因存在一定的负效应和健康危害，因此本发明通过改造水稻内源的AK和DHPS基因，以达到提高水稻中赖氨酸含量的目的。
此外，研究发现，在植物中只提高AK和DHPS的水平，赖氨酸水平并没有得到较高的积累，这是因为随着植物中赖氨酸合成的增强，赖氨酸的降解水平也相应加剧，以致赖氨酸不能在植物中得到有效积累，因此赖氨酸的分解代谢在植物赖氨酸的累积调控中同样具有十分重要的地位（Arruda等, 2000, Trends Plant Sci, 5(8):324-330）。赖氨酸通过酵母氨酸途径分解代谢为酵母氨酸和氨基己二酸，赖氨酸酮戊二酸酯还原酶/酵母氨酸脱氢酶（Lysine-ketoglutarate reductase/ saccharopine dehydrogenase,LKR/SDH）作为酵母氨酸途径的关键酶，调控赖氨酸的分解代谢（Arruda等, 2000, Trends Plant Sci, 5(8):324-330）。为了阻止赖氨酸的分解代谢，Zhu等敲除拟南芥中LKR/SDH基因，从而使得游离赖氨酸含量提高5倍（Zhu等, 2001, Plant Physiol, 126(4):1539-1545）。通过RNA干扰技术降低或者抑制LKR/SDH基因的表达，能够使玉米种子中可溶性赖氨酸含量提高20倍（Houmard等, 2007, Plant Biotechnol J, 5:605-614）。
发明内容：
本发明的目的是提供能够提高水稻中游离赖氨酸含量的天冬氨酸激酶（AK2）和二氢毗考琳酸合成酶（DHPS1）基因及其应用，本发明通过聚合水稻AK2、DHPS1和LKR-RNAi结构构成融合载体，导入野生型水稻中，通过鉴定和筛选，获得高赖氨酸转基因水稻。本发明排除了外源天冬氨酸激酶进而二氢毗考琳酸合成酶基因在水稻中表达的不良效应，为培育优良的高赖氨酸水稻提供相应的理论依据。
一种采用定点突变改造修饰的AK2基因，它是在水稻天冬氨酸激酶基因AK的基础上进行体外定点突变获得的，该基因AK序列为SEQ ID NO 1，该基因AK编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 2，编码AK基因的第1345位和1346位碱基分别由A和G变为C和T，第449位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，该基因AK2序列为SEQ ID NO 3，该基因编码的氨基酸序列为SEQ IDNO 4。SEQ ID NO 1-4所示序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。
优选地，上述所采用的定点突变采用重叠PCR技术引入碱基突变，所述水稻AK基因扩增和重叠PCR扩增突变AK2中所使用的引物为：
AK-F：5’ AGGATCCATG GCGATCGCTC TCCGATT 3’
AK-R：5’ AGAGCTCTCA GCTCATGTGA AGGGCTT 3’
AK2-F: 5’ TAGATTGTGT GGCTACTCTT GAAGTTAGTA TTTCTGT 3’
AK2-R: 5’ ACAGAAATAC TAACTTCAAG AGTAGCCACA CAATCTA 3’ 。
一种采用定点突变改造修饰的DHPS1基因，它是在水稻二氢毗考琳酸合成酶DHPS基因的基础上进行体外突变获得的，该基因DHPS序列为SEQ ID NO 5，该基因DHPS编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 6，编码DHPS1基因的第371个碱基G变为A，编码第124位氨基酸的密码子AGT变为AAT，由丝氨酸变为天冬酰胺，该基因DHPS1序列为SEQ ID NO 7，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 8。SEQ ID NO 5-8所示序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。
优选地，上述所采用的定点突变采用重叠PCR技术引入碱基突变，所述水稻DHPS基因扩增和重叠PCR扩增突变DHPS1中所使用的引物为:
DHPS-F: 5’AGG ATC CAT GCA ACA CTC TGA CAC AG 3’
DHPS-R: 5’AGA GCT CTT AAT ACC TAC TGA TCA AC 3’
DHPS1-F: 5’GGC AAC ACA GGA AAT AAC TCA ACA AGG 3’
DHPS1-R: 5’CCT TGT TGA GTT ATT TCC TGT GTT GCC 3’。
所述基于体外定点突变获得水稻赖氨酸反馈抑制敏感降低的基因AK2和DHPS1的应用，具体是指所述对水稻反馈抑制敏感降低的基因AK2和DHPS1在培育高赖氨酸水稻，从而提高水稻营养品质的应用，具体为：
一种包含有AK2和DHPS1基因的重组质粒的构建，所述重组质粒中涉及的启动子为植物通用组成型启动子。
将所述重组质粒通过农杆菌介导法或者基因枪法导入水稻胚性愈伤组织中，经筛选、分化和生根获得转化再生植株；通过聚合酶链式反应检测目的基因获得转基因阳性植株和阳性纯合系；通过荧光实时定量PCR方法检测修饰后的目的基因AK2和DHPS1在水稻中的表达水平，通过氨基酸分析验证修饰的AK2和DHPS1在水稻中的效应。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1. 本发明所述基于其它植物种类中天冬氨酸激酶和二氢毗考琳酸合成酶突变位点的对比分析，利用体外定点突变技术获得AK2和DHPS1基因，并创制高赖氨酸水稻资源，该方法直接对水稻内源赖氨酸合成关键酶天冬氨酸激酶和二氢毗考琳酸合成酶基因进行定向修饰，可实现水稻赖氨酸水平的定向遗传改良，丰富了水稻高赖氨酸种质资源，同时避免了自然变异或传统人工诱变的非定向遗传改良带来的非预期效应。
2. 本发明所述的提高游离赖氨酸含量的AK2基因和DHPS1基因及其应用将填补水稻天冬氨酸激酶和二氢毗考琳酸合成酶基因反馈抑制不敏感或低敏感的突变基因的空白，该AK2和DHPS1的应用将获得不含有外源天冬氨酸激酶和二氢毗考琳酸合成酶基因序列的高赖氨酸水稻材料。
3. 本发明所述的提高游离赖氨酸含量的AK2基因和DHPS1基因及其应用，在本发明的一个实例中，所述目的植物为水稻，所述目的植物中表达AK2和DHPS1基因，所述转基因水稻后代种子中游离赖氨酸含量显著高于未转化亲本对照。在水稻中表达大肠杆菌反馈抑制不敏感天冬氨酸激酶和二氢毗考琳酸合成酶基因，可见高赖氨酸成熟种子呈现棕褐色的外观表型（Yang et al., 2016）。相应地，本发明所述获得的高赖氨酸转基因水稻种子外观未见明显的非预期表型。本发明在提高水稻营养品质上具有潜在的应用价值。
附图说明
图1. AK2和DHPS1突变位点示意图。
Modified protein是基因碱基替换后编码的氨基酸序列，Rice AK Protein 是水稻野生型天冬氨酸激酶基因编码的氨基酸序列，Rice DHPS Protein是水稻野生型二氢毗考琳酸合成酶基因编码的氨基酸序列，AK2和DHPS1是碱基替换后的基因序列，384、1359是指所表示的具体最后一位碱基在目的基因中的位置。
图2. 转基因高赖氨酸水稻的分子鉴定PCR产物图。
第1栏是DNA标记，DL 2000，第2栏是野生型（wild type, WT）对照，第3、4、5、6是AK2基因和35S的PCR产物，第7、8、9、10是DHPS1基因和35S的PCR产物，第11、12、13、14是LKR- RNAi片段和NOS终止子的PCR产物，V4-10、V4-32、V4-33和V4-229分别代表转入载体构建后的不同的转化子。
图3A. 各转基因系水稻发育胚乳中AK基因表达图；
图3B. 各转基因系水稻发育胚乳中DHPS基因表达图；
图3C. 各转基因系水稻发育胚乳中LKR基因表达图。
图4. 各转基因系水稻成熟种子中游离赖氨酸含量对照图。
图5. 各转基因系水稻成熟种子外观观察图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，实施例中所采用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均可通过商业途径得到。
实施例1：定点突变技术获得水稻AK2和DHPS1基因及其应用。
天冬氨酸激酶突变基因AK2和二氢毗考琳酸合成酶突变基因DHPS1的获得
以水稻武育粳9号的cDNA为模板，PCR扩增水稻内源天冬氨酸激酶基因AK，所使用引物为AK-forward: 5’ AGGATCCATGGCGATCGCTCTCCGATT 3’和
AK-Reverse: 5’AGAGCTCTCAGCTCATGTGAAGGGCTT 3’，
PCR扩增水稻内源DHPS基因，所使用引物为
DHPS-Forward: 5’ AGGATCCATGCA ACACTCTGACACAG 3’和
DHPS-Reverse: 5’ AGAGCTCTTAATACCTACTGATCA AC 3’。
获得的水稻内源AK和DHPS基因经测序鉴定正确后，通过重叠PCR技术实现定向突变获得AK2和DHPS1基因，重叠PCR方法中所使用的特异性引物为分别为
AK2-Forward 5’TAGATTGTGTGGCTACTCTTGAAGTTAGTATTTCTGT 3’、AK2-Reverse 5’ACAGAAATACTAACTTCAAGAGTAGCCACACAATCTA 3’和DHPS1-Forward 5’GGCAACACAGGAAATAACTCAACA AGG 3’和
DHPS1-Reverse 5’ CCTTGTTGAGTTATTTCCTGTGTTGCC 3’。
包含AK2和DHPS1基因重组质粒表达载体的构建
将上述步骤中获得的AK2和DHPS1基因克隆到pSB130超双元表达载体上，利用组成型表达的CaMV 35S启动子驱动AK2和DHPS1基因，同时干扰抑制赖氨酸降解酶基因LKR的表达，构建包含AK2和DHPS1基因重组质粒表达载体。
含有AK2和DHPS1基因表达载体的水稻遗传转化
通过农杆菌EHA105介导的遗传转化，将上述构建的表达载体转入野生型水稻武育粳9号愈伤组织中，通过再分化获得转基因植株，利用引物
P35S-F (5’ TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC 3’) / AK2-R2 (5’ CGAACTTCATCACCACGCTCA3’)、P35S-F (5’ TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC 3’) / DHPS1-R2 (5’ CGTAGTAAGGATTGATGTGG3’) 和LKR-R (5’ CCTTAGCTGAGGCCAATCTAG 3’) / NOS-2R (5’ ATTGCGGGACTCTAATCATAAAAAC 3’)
对转基因植株的目的基因进行PCR鉴定，筛选带有目的基因的转基因阳性植株，并经过多世代筛选获得遗传稳定的转基因纯合系。实时荧光定量PCR分析结果显示AK2和DHPS1基因表达在水稻发育种子中显著高于未转化亲本对照。各水稻植株自然成熟后，收获成熟种子鉴定水稻种子中游离氨基酸水平，在获得的3个独立的转化子与未转化亲本相比，游离赖氨酸水稻均呈显著提高，提高范围在11倍-58倍。
综上所述，多个表达载体的独立转化个体均能表现高赖氨酸水平的表型，这证明了修饰的AK2和DHPS1基因在提高水稻赖氨酸水平中的有效性。
<110>扬州大学
<120>定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶基因AK2和DHPS1及其应用
<160>21
SEQ ID NO.1
<210>1
<211>1713
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ATGGCGATCG CTCTCCGATT AGCGGCCGCG CCGCTCCGCC TCCGCCTCGT CTCGCCGGCC60
CCTCCGGCGA TCGGCGGCGC GGGAGATGGA GGACGACGAG GAGGAGGAGG AGCAGCTCGT120
ATCGGTGTCC TGGGCAGGGC TCGCTGCCGC CGCCGCCGCG GCGGAGGCGG GAGACTGGAG180
GTGGCGGCGG CGGCCGCCGA TGACTCCGCT CGCTGTCGGG CCAAGGGAGT GGGCGCCGCC240
GCCGCCGCGG CGGAAACCCT AGGTGGGATC GGGGTGGGAG GTGGGGACCA GCTGAGCGTG300
GTGATGAAGT TCGGGGGGTC GTCGGTGTCG TCGGCGGCGA GGATGCGGGA GGTGGCGGGC360
CTCATCCTCG CCTTCCCCGA GGAGCGCCCC GTCGTCGTCC TCTCCGCCAT GGGGAAGACC420
ACCAATCTCC TCCTCCTCGC TGGTGAGAAG GCAGTGGGAT GCGGCGTGAT CCGTGTTTCG480
GAAATTGAAG AGTGGAATTT GATCAAAGAT CTACACATTA AAACTGTGGA GGAACTTGCA540
CTGCCAAGAT CTGTAATACA CACTATGCTG GATGAACTGG AGCAGCTCTT GAAAGGTATT600
GCAATGATGA AAGAGCTGAC ACTTCGGACC ACTGACTACC TTGTTTCATT TGGGGAGTGC660
ATGTCTACAC GGATTTTTGC TGCTTATTTG AACAAAATCG GAGTAAAAGC ACGGCAGTAC720
GACGCATTTG ATATTGGTTT CATAACAACA GACGATTTCG GAAACGCGGA CATCTTGGAG780
GCAACTTATC CTGCTGTTGC GAAGAGATTA CATGGAGACT GGATTCGTGA TCCAGCGATA840
CCTATTGTTA CTGGGTTCCT TGGGAAGGGC TGGAAATCAG GCGCTGTAAC CACTTTAGGC900
CGAGGTGGCA GTGACTTGAC TGCTACAACC ATTGGTAAAG CCCTGGGGTT GAGAGAAATT960
CAGGTATGGA AAGATGTTGA TGGTGTACTG ACCTGTGATC CAAATATCTA CCCGAATGCA1020
ACCACTGTGC CATACTTAAC ATTTGAAGAG GCAGCAGAAC TTGCTTATTT TGGTGCCCAG1080
GTATTACATC CACAATCTAT GAGACCTGCT AGAGAAGGTG ATATACCAGT CAGGGTTAAG1140
AATTCGTACA ACCCTAAAGC TCCAGGCACC CTGATCACTA AACAAAGAGA GATGGATAAG1200
GTTGTGCTAA CTAGCATAGT GCTCAAGTCA AATGTCACTA TGTTGGATAT AGTAAGCACT1260
CGGATGCTTG GTCAATTTGG TTTTCTGGCA AAGGTCTTCT CTATATTCGA AGATCTAGGG1320
ATATCTGTAG ATTGTGTGGC TACTAGTGAA GTTAGTATTT CTGTGTCGCT TGATCCATCA1380
AAGATCTGGA GCAGGGAACT TATTCAACAG GAACTTGACC ATGTAGTTGA AGAGCTTGAG1440
AAAATTGCAG TTGTACATCT ACTTCAGCAG AGGGCAATAA TATCACTCAT TGGAAACGTA1500
CGGCGATCAT CTCTTATACT GGAAAAGGCC TTTCAAGTGT TGAGGAAAAG CGGGGTGAAT1560
GTCCAGATGA TCTCGCAAGG TGCATCCAAG GTTAACATGT CTCTGATTGT TCATGATAGC1620
GAGGCAAAGC AGTGCATAAA GGCCCTCCAC CAGGCGTTCT TCGAGGACGA TGTCCTGACA1680
GAAGTCGAGG AAGAAGCCCT TCACATGAGC TGA 1713
SEQ ID NO.2
<210>2
<211>570
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
M A I A L R L A A A P L R L R
1 5 10 15
L V S P A P P A I G G A G D G
20 25 30
G R R G G G G A A R I G V L G
35 40 45
R A R C R R R R G G G G R L E
50 55 60
V A A A A A D D S A R C R A K
65 70 75
G V G A A A A A A E T L G G I
80 85 90
G V G G G D Q L S V V M K F G
95 100 105
G S S V S S A A R M R E V A G
110 115 120
L I L A F P E E R P V V V L S
125 130 135
A M G K T T N L L L L A G E K
140 145 150
A V G C G V I R V S E I E E W
155 160 165
N L I K D L H I K T V E E L A
170 175 180
L P R S V I H T M L D E L E Q
185 190 195
L L K G I A M M K E L T L R T
200 205 210
T D Y L V S F G E C M S T R I
215 220 225
F A A Y L N K I G V K A R Q Y
230 235 240
D A F D I G F I T T D D F G N
245 250 255
A D I L E A T Y P A V A K R L
260 265 270
H G D W I R D P A I P I V T G
275 280 285
F L G K G W K S G A V T T L G
290 295 300
R G G S D L T A T T I G K A L
305 310 315
G L R E I Q V W K D V D G V L
320 325 330
T C D P N I Y P N A T T V P Y
335 340 345
L T F E E A A E L A Y F G A Q
350 355 360
V L H P Q S M R P A R E G D I
365 370 375
P V R V K N S Y N P K A P G T
380 385 390
L I T K Q R E M D K V V L T S
395 400 405
I V L K S N V T M L D I V S T
410 415 420
R M L G Q F G F L A K V F S I
425 430 435
F E D L G I S V D C V A T S E
440 445 450
V S I S V S L D P S K I W S R
455 460 465
E L I Q Q E L D H V V E E L E
470 475 480
K I A V V H L L Q Q R A I I S
485 490 495
L I G N V R R S S L I L E K A
500 505 510
F Q V L R K S G V N V Q M I S
515 520 525
Q G A S K V N M S L I V H D S
530 535 540
E A K Q C I K A L H Q A F F E
545 550 555
D D V L T E V E E E A L H M S
560 565 570
SEQ ID NO.3
<210>3
<211>1713
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ATGGCGATCG CTCTCCGATT AGCGGCCGCG CCGCTCCGCC TCCGCCTCGT CTCGCCGGCC60
CCTCCGGCGA TCGGCGGCGC GGGAGATGGA GGACGACGAG GAGGAGGAGG AGCAGCTCGT120
ATCGGTGTCC TGGGCAGGGC TCGCTGCCGC CGCCGCCGCG GCGGAGGCGG GAGACTGGAG180
GTGGCGGCGG CGGCCGCCGA TGACTCCGCT CGCTGTCGGG CCAAGGGAGT GGGCGCCGCC240
GCCGCCGCGG CGGAAACCCT AGGTGGGATC GGGGTGGGAG GTGGGGACCA GCTGAGCGTG300
GTGATGAAGT TCGGGGGGTC GTCGGTGTCG TCGGCGGCGA GGATGCGGGA GGTGGCGGGC360
CTCATCCTCG CCTTCCCCGA GGAGCGCCCC GTCGTCGTCC TCTCCGCCAT GGGGAAGACC420
ACCAATCTCC TCCTCCTCGC TGGTGAGAAG GCAGTGGGAT GCGGCGTGAT CCGTGTTTCG480
GAAATTGAAG AGTGGAATTT GATCAAAGAT CTACACATTA AAACTGTGGA GGAACTTGCA540
CTGCCAAGAT CTGTAATACA CACTATGCTG GATGAACTGG AGCAGCTCTT GAAAGGTATT600
GCAATGATGA AAGAGCTGAC ACTTCGGACC ACTGACTACC TTGTTTCATT TGGGGAGTGC660
ATGTCTACAC GGATTTTTGC TGCTTATTTG AACAAAATCG GAGTAAAAGC ACGGCAGTAC720
GACGCATTTG ATATTGGTTT CATAACAACA GACGATTTCG GAAACGCGGA CATCTTGGAG780
GCAACTTATC CTGCTGTTGC GAAGAGATTA CATGGAGACT GGATTCGTGA TCCAGCGATA840
CCTATTGTTA CTGGGTTCCT TGGGAAGGGC TGGAAATCAG GCGCTGTAAC CACTTTAGGC900
CGAGGTGGCA GTGACTTGAC TGCTACAACC ATTGGTAAAG CCCTGGGGTT GAGAGAAATT960
CAGGTATGGA AAGATGTTGA TGGTGTACTG ACCTGTGATC CAAATATCTA CCCGAATGCA1020
ACCACTGTGC CATACTTAAC ATTTGAAGAG GCAGCAGAAC TTGCTTATTT TGGTGCCCAG1080
GTATTACATC CACAATCTAT GAGACCTGCT AGAGAAGGTG ATATACCAGT CAGGGTTAAG1140
AATTCGTACA ACCCTAAAGC TCCAGGCACC CTGATCACTA AACAAAGAGA GATGGATAAG1200
GTTGTGCTAA CTAGCATAGT GCTCAAGTCA AATGTCACTA TGTTGGATAT AGTAAGCACT1260
CGGATGCTTG GTCAATTTGG TTTTCTGGCA AAGGTCTTCT CTATATTCGA AGATCTAGGG1320
ATATCTGTAG ATTGTGTGGC TACTCTTGAA GTTAGTATTT CTGTGTCGCT TGATCCATCA1380
AAGATCTGGA GCAGGGAACT TATTCAACAG GAACTTGACC ATGTAGTTGA AGAGCTTGAG1440
AAAATTGCAG TTGTACATCT ACTTCAGCAG AGGGCAATAA TATCACTCAT TGGAAACGTA1500
CGGCGATCAT CTCTTATACT GGAAAAGGCC TTTCAAGTGT TGAGGAAAAG CGGGGTGAAT1560
GTCCAGATGA TCTCGCAAGG TGCATCCAAG GTTAACATGT CTCTGATTGT TCATGATAGC1620
GAGGCAAAGC AGTGCATAAA GGCCCTCCAC CAGGCGTTCT TCGAGGACGA TGTCCTGACA1680
GAAGTCGAGG AAGAAGCCCT TCACATGAGC TGA 1713
SEQ ID NO.4
<210>4
<211>570
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
M A I A L R L A A A P L R L R
1 5 10 15
L V S P A P P A I G G A G D G
20 25 30
G R R G G G G A A R I G V L G
35 40 45
R A R C R R R R G G G G R L E
50 55 60
V A A A A A D D S A R C R A K
65 70 75
G V G A A A A A A E T L G G I
80 85 90
G V G G G D Q L S V V M K F G
95 100 105
G S S V S S A A R M R E V A G
110 105 120
L I L A F P E E R P V V V L S
125 130 135
A M G K T T N L L L L A G E K
140 145 150
A V G C G V I R V S E I E E W
155 160 165
N L I K D L H I K T V E E L A
170 175 180
L P R S V I H T M L D E L E Q
185 190 195
L L K G I A M M K E L T L R T
200 205 210
T D Y L V S F G E C M S T R I
215 220 225
F A A Y L N K I G V K A R Q Y
230 235 240
D A F D I G F I T T D D F G N
245 250 255
A D I L E A T Y P A V A K R L
260 265 270
H G D W I R D P A I P I V T G
275 280 285
F L G K G W K S G A V T T L G
290 295 300
R G G S D L T A T T I G K A L
305 310 315
G L R E I Q V W K D V D G V L
320 325 330
T C D P N I Y P N A T T V P Y
335 340 345
L T F E E A A E L A Y F G A Q
350 355 360
V L H P Q S M R P A R E G D I
365 370 375
P V R V K N S Y N P K A P G T
380 385 390
L I T K Q R E M D K V V L T S
395 400 405
I V L K S N V T M L D I V S T
410 415 420
R M L G Q F G F L A K V F S I
425 430 435
F E D L G I S V D C V A T L E
440 445 450
V S I S V S L D P S K I W S R
455 460 465
E L I Q Q E L D H V V E E L E
470 475 480
K I A V V H L L Q Q R A I I S
485 490 495
L I G N V R R S S L I L E K A
500 505 510
F Q V L R K S G V N V Q M I S
515 520 525
Q G A S K V N M S L I V H D S
530 535 540
E A K Q C I K A L H Q A F F E
545 550 555
D D V L T E V E E E A L H M S
560 565 570
SEQ ID NO.5
<210>5
<211>1044
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ATGCAACACT CTGACACAGA CAAATATTCA TACAGGATTA GCAGAGGAAA GTTTTCAGTG60
ACGGCCATCT CCCTGGATGA TTATCTTCCA ATGCGAAGTA GTGAAGTGAA AAATCGGACA120
TCAACAGGTG ATATCACTAG CCTCAGAGTA ATAACAGCGG TTAAAACCCC TTATCTGCCG180
GATGGAAGAT TTGATCTTGA AGCATATGAT TCGCTGATAA ACATGCAGAT TGAAGGTGGT240
GCTGAAGGTG TAATAGTGGG AGGAACAACA GGAGAGGGCC ACCTGATGAG CTGGGATGAA300
CACATCATGC TTATTGGGCA TACAGTTAAC TGCTTTGGCA CTAAAATTAA AGTGGTCGGC360
AACACAGGAA GTAACTCAAC AAGGGAGGCT ATTCACGCAA CTGAGCAGGG ATTCGCTGTA420
GGTATGCACG CGGCTCTCCA CATCAATCCT TACTACGGGA AGACCTCCGT CGAAGGGTTG480
ATCTCCCATT TTGAGGCTGT TCTCCCAATG GGTCCAACCA TCATTTACAA TGTGCCATCC540
AGAGACTGGC AAGACATACC ACCTCCTGTG ATTGAGGCGG TTTCCTCTTA TACGAACATG600
GCAGGTGTCA AAGAATGTGT TGGACATGAG AGGGTTAAGT GCTATGCTGA CAGAGGAATA660
AGCATATGGA GTGGTAATGA TGATGAATGC CATGAGTCTA GGTGGAAATA TGGTGCCACT720
GGAGTCATTT CTGTAGCCAG CAACCTTATT CCCGGTCTCA TGCATAGCCT CATGTACGAA780
GGGGAGAATG CAGCGCTCAA TGATAAGCTA CTTCCTCTGA TGAAATGGTT GTTTTGCCAG840
CCTAATCCGA TTGCGCTCAA CACCGCCCTG GCTCAGCTTG GAGTGGCAAG ACCCGTTTTC900
AGATTACCTT ATGTACCTCT CCCCCTTGAA AAGAGGGTTG AGTTCGTCCG AATTGTCGAA960
TCCATTGGAC GGGAAAATTT TGTGGGTCAG AAAGAAGCAA GGGTTCTTGA TGATGATGAT1020
TTTGTGTTGA TCAGTAGGTA TTAA 1044
SEQ ID NO.6
<210>6
<211>347
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
SEQ ID NO 6:
M Q H S D T D K Y S Y R I S R
1 5 10 15
G K F S V T A I S L D D Y L P
20 25 30
M R S S E V K N R T S T G D I
35 40 45
T S L R V I T A V K T P Y L P
50 55 60
D G R F D L E A Y D S L I N M
65 70 75
Q I E G G A E G V I V G G T T
80 85 90
G E G H L M S W D E H I M L I
95 100 105
G H T V N C F G T K I K V V G
110 115 120
N T G S N S T R E A I H A T E
125 130 135
Q G F A V G M H A A L H I N P
140 145 150
Y Y G K T S V E G L I S H F E
155 160 165
A V L P M G P T I I Y N V P S
170 175 180
R D W Q D I P P P V I E A V S
185 190 195
S Y T N M A G V K E C V G H E
200 205 210
R V K C Y A D R G I S I W S G
215 220 225
N D D E C H E S R W K Y G A T
230 235 240
G V I S V A S N L I P G L M H
245 250 255
S L M Y E G E N A A L N D K L
260 265 270
L P L M K W L F C Q P N P I A
275 280 285
L N T A L A Q L G V A R P V F
290 295 300
R L P Y V P L P L E K R V E F
305 310 315
V R I V E S I G R E N F V G Q
320 325 330
K E A R V L D D D D F V L I S
335 340 345
R Y
347
SEQ ID NO.7
<210>7
<211>1044
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
SEQ ID NO 7:
ATGCAACACT CTGACACAGA CAAATATTCA TACAGGATTA GCAGAGGAAA GTTTTCAGTG60
ACGGCCATCT CCCTGGATGA TTATCTTCCA ATGCGAAGTA GTGAAGTGAA AAATCGGACA120
TCAACAGGTG ATATCACTAG CCTCAGAGTA ATAACAGCGG TTAAAACCCC TTATCTGCCG180
GATGGAAGAT TTGATCTTGA AGCATATGAT TCGCTGATAA ACATGCAGAT TGAAGGTGGT240
GCTGAAGGTG TAATAGTGGG AGGAACAACA GGAGAGGGCC ACCTGATGAG CTGGGATGAA300
CACATCATGC TTATTGGGCA TACAGTTAAC TGCTTTGGCA CTAAAATTAA AGTGGTCGGC360
AACACAGGAA ATAACTCAAC AAGGGAGGCT ATTCACGCAA CTGAGCAGGG ATTCGCTGTA420
GGTATGCACG CGGCTCTCCA CATCAATCCT TACTACGGGA AGACCTCCGT CGAAGGGTTG480
ATCTCCCATT TTGAGGCTGT TCTCCCAATG GGTCCAACCA TCATTTACAA TGTGCCATCC540
AGAGACTGGC AAGACATACC ACCTCCTGTG ATTGAGGCGG TTTCCTCTTA TACGAACATG600
GCAGGTGTCA AAGAATGTGT TGGACATGAG AGGGTTAAGT GCTATGCTGA CAGAGGAATA660
AGCATATGGA GTGGTAATGA TGATGAATGC CATGAGTCTA GGTGGAAATA TGGTGCCACT720
GGAGTCATTT CTGTAGCCAG CAACCTTATT CCCGGTCTCA TGCATAGCCT CATGTACGAA780
GGGGAGAATG CAGCGCTCAA TGATAAGCTA CTTCCTCTGA TGAAATGGTT GTTTTGCCAG840
CCTAATCCGA TTGCGCTCAA CACCGCCCTG GCTCAGCTTG GAGTGGCAAG ACCCGTTTTC900
AGATTACCTT ATGTACCTCT CCCCCTTGAA AAGAGGGTTG AGTTCGTCCG AATTGTCGAA960
TCCATTGGAC GGGAAAATTT TGTGGGTCAG AAAGAAGCAA GGGTTCTTGA TGATGATGAT1020
TTTGTGTTGA TCAGTAGGTA TTAA 1044
SEQ ID NO.8
<210>8
<211>347
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
SEQ ID NO 8:
M Q H S D T D K Y S Y R I S R
1 5 10 15
G K F S V T A I S L D D Y L P
20 25 30
M R S S E V K N R T S T G D I
35 40 45
T S L R V I T A V K T P Y L P
50 55 60
D G R F D L E A Y D S L I N M
65 70 75
Q I E G G A E G V I V G G T T
80 85 90
G E G H L M S W D E H I M L I
95 100 105
G H T V N C F G T K I K V V G
110 115 120
N T G N N S T R E A I H A T E
125 130 135
Q G F A V G M H A A L H I N P
140 145 150
Y Y G K T S V E G L I S H F E
155 160 165
A V L P M G P T I I Y N V P S
170 175 180
R D W Q D I P P P V I E A V S
185 190 195
S Y T N M A G V K E C V G H E
200 205 210
R V K C Y A D R G I S I W S G
215 220 225
N D D E C H E S R W K Y G A T
230 235 240
G V I S V A S N L I P G L M H
245 250 255
S L M Y E G E N A A L N D K L
260 265 270
L P L M K W L F C Q P N P I A
275 280 285
L N T A L A Q L G V A R P V F
290 295 300
R L P Y V P L P L E K R V E F
305 310 315
V R I V E S I G R E N F V G Q
320 325 330
K E A R V L D D D D F V L I S
335 340 345
R Y
347
SEQ ID NO.9
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
AGGATCCATG GCGATCGCTC TCCGATT 27
SEQ ID NO.10
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
AGAGCTCTCA GCTCATGTGA AGGGCTT 27
SEQ ID NO.11
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
AGGATCCATG CAACACTCTG ACACAG 26
SEQ ID NO.12
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
AGAGCTCTTA ATACCTACTG ATCAAC 26
SEQ ID NO.13
<210>13
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
TAGATTGTGT GGCTACTCTT GAAGTTAGTA TTTCTGT 37
SEQ ID NO.14
<210>14
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ACAGAAATAC TAACTTCAAG AGTAGCCACA CAATCTA 37
SEQ ID NO.15
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
GGCAACACAG GAAATAACTC AACAAGG 27
SEQ ID NO.16
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
CCTTGTTGAG TTATTTCCTG TGTTGCC 27
SEQ ID NO.17
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
TCCTTCGCAA GACCCTTCCT C 21
SEQ ID NO.18
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
CGAACTTCAT CACCACGCTC A 21
SEQ ID NO.19
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
CGTAGTAAGG ATTGATGTGG 20
SEQ ID NO.20
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
CCTTAGCTGA GGCCAATCTA G 21
SEQ ID NO.21
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ATTGCGGGAC TCTAATCATA AAAAC 25

Claims (6)

1.定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶，其特征是，所述关键酶包括：
定点突变改造的天冬氨酸激酶AK2，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示；和
定点突变改造的二氢毗考琳酸合成酶DHPS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
2.根据权利要求1所述的定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶，其特征在于，所述定点突变改造的天冬氨酸激酶AK2是由氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示的来源于Oryza sativa水稻的天冬氨酸激酶AK进行体外定点突变修饰得到的，其第449位氨基酸由丝氨酸变成了亮氨酸；
所述二氢毗考琳酸合成酶DHPS1是由氨基酸序列为SEQ ID NO 6所示的来源于水稻的二氢毗考琳酸合成酶DHPS进行体外定点突变修饰得到的，其第124位氨基酸由丝氨酸变成了天冬酰胺。
3.定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶编码基因，包括定点突变改造的天冬氨酸激酶AK2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；
定点突变改造的二氢毗考琳酸合成酶DHPS1编码基因，核苷酸序列SEQ ID NO 7所示。
4.根据权利要求1所述基于定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶获得水稻赖氨酸反馈抑制敏感降低的基因AK2和DHPS1的应用。
5.一种重组质粒，包含权利要求3所述的定点突变改造的赖氨酸合成途径关键酶编码基因，重组质粒的构建方法是：将权利要求3所述的AK2和DHPS1基因克隆到pSB130超双元表达载体上，利用组成型表达的CaMV 35S启动子驱动AK2和DHPS1基因，同时干扰抑制赖氨酸降解酶基因LKR的表达，构建包含AK2和DHPS1基因重组质粒表达载体。
6.一种高赖氨酸转基因水稻的构建方法：通过农杆菌介导法或基因枪法将权利要求5所述的重组质粒植物表达载体导入水稻胚性愈伤组织中，经筛选、分化和生根获得高赖氨酸转基因水稻；通过聚合酶链式反应检测目的基因获得转基因阳性植株和阳性纯合系；通过荧光实时定量PCR方法检测修饰后的目的基因AK2和DHPS1在水稻中的表达水平，通过氨基酸分析验证改造后的AK2和DHPS1在水稻中的效应。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1242050A (zh) * 1996-11-18 2000-01-19 阿韦贝公司 超量产生至少两个天冬氨酸家族氨基酸的具有天然高含水量的转基因植物
CN1834252A (zh) * 2006-04-05 2006-09-20 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1242050A (zh) * 1996-11-18 2000-01-19 阿韦贝公司 超量产生至少两个天冬氨酸家族氨基酸的具有天然高含水量的转基因植物
CN1834252A (zh) * 2006-04-05 2006-09-20 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 一种提高水稻种子中赖氨酸含量的方法及其专用载体

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