CN103597081B - 用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法 - Google Patents

用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103597081B
CN103597081B CN201280027891.9A CN201280027891A CN103597081B CN 103597081 B CN103597081 B CN 103597081B CN 201280027891 A CN201280027891 A CN 201280027891A CN 103597081 B CN103597081 B CN 103597081B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
plant
aspat
gene
pepcase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280027891.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103597081A (zh
Inventor
阿尼什·卡奇拉
苏伦德·库马尔·瓦茨
帕拉姆维尔·辛格·阿胡贾
桑贾伊·库马尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Original Assignee
Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Council of Scientific and Industrial Research CSIR filed Critical Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Publication of CN103597081A publication Critical patent/CN103597081A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103597081B publication Critical patent/CN103597081B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

同化的C和N很大程度地影响植物生长和农作物产量。之前的尝试企图用一个或两个基因改变植物的碳和氮状态。本发明涉及三个基因的同时共同过表达，其中一个基因(PECPase)有效地捕获CO2，而另外两个编码参与氮同化的酶(Asp？AT和GS)。组合的效果为植物的碳和氮状态以及生产力的增加。

Description

用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法
以下的说明书说具体地描述了本发明及其实施方式。
技术领域
本发明涉及用于增强植物的碳(C)、氮(N)、生物量和产量的表达构建体。
另外，本发明提供了通过使用前述的表达构建体增强C和N水平并随之改进植物的生物量和产量的方法，所述构建体利用源自酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下称为“PEPCase”)，谷氨酰胺合成酶(以下称为“GS”)和天冬氨酸氨基转移酶(以下称为“AspAT”))之基因的共同过表达(co-overexpression)。特别地，本发明涉及编码所述蛋白的核酸序列在植物细胞中表达的转基因植物。
更特别地，本发明涉及用实现在组成型启动子控制下的三个基因的共同过表达的遗传构建体转化植物，所述三个基因中一个基因PEPCase编码负责捕获CO2的酶，而另外两个编码参与N同化的酶(AspAT和GS)，其中N同化所需要的C骨架由PEPCase满足，其包括用AspAT+GS+PEPCase基因转化的植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)和此基因在植物中的表达，从而提高植物的C和N状态以及生物量和产量。
发明背景和现有技术
本发明涉及具有三个基因(即AspAT、GS和PEPCase)的共同过表达从而导致C、N含量、生物量和产量组分提高的经转化植物。PEPC酶(EC.4.1.1.31)是在植物中普遍存在的酶，在HCO3 -和Mg2 +的存在下催化磷酸烯醇丙酮酸(以下称为“PEP”)的β-羧化，得到草酰乙酸(oxaloacetate)(以下称为“OAA”)和无机磷酸盐(inorganicphosphate)(以下称为“Pi”)，它主要具有为三羧酸循环补充中间体的回补作用。在高等植物中，有具有不同器官特异性的几个PEPC酶同种型，他们参与多种功能，包括气孔开放、果实成熟和种子成熟。C4和CAM植物的叶含有高水平的PEPC酶，其催化光合作用的初始CO2固定。在C3植物的叶中观察到低得多的PEPC酶水平，其有助于回补功能并在细胞pH调节中发挥作用。
GS(EC6.3.1.2)催化氨(以下称为“NH3”)与谷氨酸(以下成为“Glu”)的ATP依赖性缩合产生谷氨酰胺(以下成为“Gln”)。随后，谷氨酸合酶(GOGAT)转移Gln的酰胺基到α-酮戊二酸以产生两个分子的Glu。Gln和Glu二者是蛋白质、核酸和叶绿素的有机N的主要来源。
AspAT(EC2.6.1.1)催化天冬氨酸(以下称为“Asp”)的氨基到α-酮戊二酸以形成OAA和Glu的可逆转移。在植物中，已提出AspAT发挥几种代谢作用，包括：在根部同化NH3 +的过程中回收C骨架，提供酰胺前体用于主要的氮转运分子(例如天冬酰胺(以下称为“Asn”)和酰基脲)的生物合成，在种子填充(filling)期间募集Asn氮以及参与C4植物中的细胞内C穿梭，提供用于Asp家族氨基酸的生物合成的前体。
在生物量产生、产量或收获指数方面，植物的表现依赖于多个内部和环境因素。在这些因素中，植物的C和N水平是控制植物生产力的重要因子之一。越来越多的C和N同化的细节表明，调控系统响应于代谢和环境这两种因素来协调这些营养物质的摄取和分布。植物感受到其C和N状态的变化并传递该信息给细胞核，在细胞核带来中基因表达的改变。由于植物生长和农作物产量很大程度地受C和N同化的影响，过去已经进行了很多尝试来改造有效的C和N同化。然而还没有报告显示出植物中C、N状态、生物量及产量的显著改进。
表1举例说明对于在不同植物中提高C和/或N及生物量的多种策略方面可获得的信息状态
表1
更高的PEPC酶活性将促进CO2捕获并且使得碳骨架对于通过AspAT和GS的联合活性将氮转化成有机形式而言可获得。因此，本发明人发现本发明的目的可以通过编码AspAT、GS和PEPC酶的基因的表达同时增加来实现。
下面给出与本发明相关的现有技术知识和此前实施的增加植物中碳和/或氮水平的尝试。
可以参考由Hudspeth，R.L.，Grula，J.W.，Dai，Z.，Edwards，G.E.和Ku，M.S.B.撰写的题为“Expressionofmiazephosphoenolpyruvatecarboxylaseintransgenictobacoo”(1992，PlantPhysiology，98：458-464)的文献，其中源自玉米的PEPC酶在烟草植物中在烟草(皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia))叶绿体a／b结合蛋白基因启动子下表达。相对于非转基因株，观察到在转基因叶中PEPCase的活性高至两倍，伴随可滴定酸度和苹果酸水平的升高。然而这些生物化学差异没有使得光合作用速率或者CO2补偿点有任何显著生理学改变。
可以参考由Lebouteiller，B.，Dupont，A.G.，Pierre，J.N.，Bleton，J.，Tchapla，A.，Maucourt，M和Moing，A.，Rolin，D.，和Vidal，J.撰写的题目为“PhysiologicalimpactsofmodulatingphosphoenolpyruvatecarboxylaselevelsinleavesandseedsofArabidopsisthaliana”(2007，PlantScience，172：256-272)的文献，其中高粱的PEPCase在拟南芥植物中在CaMV35S启动子下表达。原代转化株的叶子显示出PEPCase活性增至10倍并且种子的干重和总蛋白含量增加30％。然而转化株(原代和子代)没有显示出生长表型的任何改进或者每株种子产量的改变。
还可以参考另一篇由Chen，L.M.，Li，K.Z.Miwa，T.和Izui，K.撰写的题目为“OverexpressionofacyanobacterialphosphoenolpyruvatecarboxylasewithdiminishedsensitivitytofeedbackinhibitioninArabidopsischangesaminoacidmetabolism”(2004，Planta，219：440-419)的文章，其中对反馈抑制具有降低的敏感性的蓝藻聚球藻属蓝藻(Synechococcusvulcanus)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(SvPEPCase)在拟南芥植物中在CaMV35S启动子的控制下过表达。三分之一的T1转化株显示出严重的白化叶表型并且在土壤上生长时不育。但是，在转化了用于C4光合作用的玉米PEPCase(ZmPEPC)(在正常情况下对反馈抑制剂L型苹果酸敏感)的拟南芥中没有观察到这样的表型。推测SvPEPC转化的T2植物中的生长抑制主要是由于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(合成芳香族氨基酸和苯丙烷类化合物(phenylpropanoid)的莽草酸途径的前体之一)的可获得性降低。
还可以参考另一篇由Fukayama，H.，Hatch，M.D.，Tamai，T.，Tsuchida，H.，Sudoh，S.，Furbank，R.T.和Miyao，M.撰写的题目为“ActivityregulationandphysiologicalimpactsofmaizeC(4)-specificphosphoenolpyruvatecarboxylaseoverproducedintransgenicriceplants”(2003，PhotosynthesisResearch，77：227-239)的文章，其中完整的玉米PEPCase基因在稻植物的叶中过表达。在转基因稻的叶中引入的PEPCase以类似于内源性稻PEPCase但与玉米叶子中的相反的方式通过蛋白质磷酸化调节活性，其在光下被下调，在黑暗中上调。与未转化的稻相比，转化的稻中PEP水平略微较低并且产物(OAA)略微较高，这证明即使玉米PEPCase在光下保持去磷酸化并且活性较低，其仍发挥功能。14CO2标记实验表明玉米PEPCase没有对转基因稻植物的光合CO2固定做出显著贡献。然而，它轻微的降低了CO2同化速度。该作用是由于光下呼吸作用的刺激，其在低O2浓度下更为显著。结论是PEPC酶的过度产生不显著地直接影响光合作用，但其通过在光下刺激呼吸作用间接地抑制光合作用。
还可以参考另一篇由Vincent，R.，Fraisier，V.，Chaillou，S.，Limami，M.A.，Deleens，E.，Phillipson，B.，Douat，C，Boutin，J.P，和Hirel，B.撰写的题目为“OverexpressionofasoybeangeneencodingcytosolicglutaminesynthetaseinshootsoftransgenicLotuscorniculatusL.plantstriggerschangesinammoniumassimilationandplantdevelopment”(1997，Planta.201：424-433)的文章，其中大豆胞质GS基因(GS15)与CaMV35S启动子融合为以实现在百脉根植物中的组成型表达。转基因植物在不同的N状况(regime)下生长，相对于在相同条件下生长的野生型，在使用12mMNH4+培养的转基因植物中观察到游离氨基酸和铵的增加，伴随可溶性碳水化合物的减少。标记实验显示在过表达GS的植物中，根中的铵摄取和随后的氨基酸至枝干的转运二者都较低。然而，在转化的植物中早的花发育表明当植物在富含铵的培养基中生长时GS在早衰和过早开花中的作用。预期到C骨架和能量对增强的NH4+同化的限制。
还可以参考另一篇由Fuentes，S.I.，Allen，D.J.，Ortiz-Lopez，A.和Hernandez，G.撰写的题目为“Overexpressionofcytosolicglutaminesynthetaseincreasesphotosynthesisandgrowthatlownitrogenconditions”(2001，JournalofExperimentalBotany，52：1071-1081)的文章，其中通过组成型CaMV35S启动子驱动的苜蓿(alfaalfa)GS被引入烟草植物中。在转基因植物中叶GS活性增加到非转基因植物的六倍。N饥饿条件下，通过将光合作用速度维持在与高N下植物的无法区分，GS转基因植物生长的更好，而在对照植物中光合作用由于N剥夺被抑制了40-50％。然而，在最优的N施用条件下，没有观察到GS过表达对光合作用或生长的影响。
还可以参考另一篇由Oliveira，I..，Brears，T.，Knight，T.，Clark，A.和Coruzzi，G.撰写的题目为“Overexpressionofcytosolicglutaminesynthetase.Relationtonitrogen，light，andphotorespiration”(2002，PlantPhysiology，129：1170-1180)的文章，其中研究过表达豌豆胞质GS与氮、光和光呼吸的关系。烟草植物(在叶中异位过表达胞质GS1)在N限制的和N非限制的条件下表现出光依赖的生长表型提高，这由鲜重、干重和叶可溶性蛋白的增加证明。胞质GS1转基因植物也表现出CO2光呼吸增强和光呼吸中间体的水平增加，表明了光呼吸中的改变。然而，没有讨论GS过表达对光呼吸的刺激对植物生产力的影响。
还可以参考另一篇由Cai，H.，Zhou，Y.，Xiao，J.，Li，X.，Zhang，Q.和Lian，X.撰写的题目为“Overexpressedglutaminesynthetasegenemodifiesnitrogenmetabolismandabioticstressresponseinrice”(2009，PlantCellReports.28：527-537)的文章，其中编码水稻(Oryzasativa)胞质GS基因(OsGSl；1和OsGS1；2)的全长cDNA与大肠杆菌GS基因(glnA)一起在组成型CaMV35S启动子下于稻植物中过表达。获得了GS过表达植物中代谢水平增加，其显示了叶中更高的总GS活性和可溶蛋白质浓度以及整个植物中更高的在总氨基酸和总N含量。然而，相对于野生型植物，观察到GS过表达植物的种子中谷物生产产量和总氨基酸二者的降低。
还可以参考另一篇由Sentoku，N.，Taniguchi，M.，Sugiyama，T.，Ishimaru，K.，Ohsugi，R.，Takaiwa，F.和Toki，S.撰写的题目为“AnalysisofthetransgenictobaccoplantsexpressingPanicummiliaceumaspartateaminotransferasegenes”(2000，PlantCellReports，19：598-603)的文章，其中在转基因烟草植物中评估黍线粒体和胞质AspAT(分别为mAspAT和cAspAT)在CaMV35S启动子控制下过表达的作用。与没有转化的植物相比，mAspAT或者cAspAT转化的植物的叶中分别具有大约3倍或者3.5倍的AspAT活性。有意思的是，两种转化植物的叶中PEPC酶的水平都增加，并且用cAspAT转化的植物的叶中mAspAT的水平也增加。这些结果表明，黍cAspAT在转基因烟草中表达的增加增强了其内源性mAspAT和PEPC酶的表达，并且黍mAspAT的表达增加增强了其内源性PEPCase的表达。然而，没有提及AspAT过表达对植物生长和生产力的影响。
还可以参考另一篇由Zhou，Y.，Cai，H.，Xiao，J.，Li，x.，Zhang，Q.和Lian，X.撰写的题目为“Over-expressionofaspartateaminotransferasegenesinriceresultedinalterednitrogenmetabolismandincreasedaminoacidcontentinseeds”(2009，TheoreticalandAppliedGenetics，118：1381-1390)的文章，其中在水稻植物中在CaMV35S启动子的控制下过表达来源于稻的三个AspAT基因(OsAAT1-3)(分别编码叶绿体、胞质和线粒体AspAT同工酶)以及一个源自大肠杆菌的AspAT基因(EcAAT)。OsAAT1、OsAAT2和EcAAT转化株显示出显著增加的叶AspAT活性以及更高的种子氨基酸和蛋白质含量。然而，在OsAAT3过表达的植物中没有发现叶AspAT活性、种子氨基酸含量或蛋白质含量的显著变化。
还可以参考另一篇由Murooka，Y.，Mori，Y.和Hayashi，M.撰写的题目为“VariationoftheaminoacidcontentofArabidopsisseedsbyexpressingsoyabeanaspartateaminotransferasegene”(2009，JournalofBioscienceandBioengineering，94：225-230)的文章，其中将来自大豆的编码叶绿体AspAT的AspAT5连接至CaMV35S启动子以实现其在拟南芥植物中的过表达。转化株中AspAT5的表达导致了在T3种子中游离甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和Glu的含量分别增加为3、4、23和50倍。然而也观察到缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸含量减少了数倍。另外，没有关于AspAt过表达对植物生长和生产力影响的报道。
还可以参考另一篇由Yanagisawa，S.，Akiyama，A.，Kawaka，H.，Uchimiya，H.和Miwa，T.撰写的题目为“MetabolicengineeringwithDofltranscriptionfactorinplants：Improvednitrogenassimilationandgrowthunderlow-nitrogenconditions”(2004，ProceedingsoftheNationalAcademyofSceinces(USA)，101：7833-7838)的文章，其中来自玉米的转录因子Dofl的过表达提升了转基因拟南芥植物中的N同化。表达Dofl的植物显示出编码C骨架产生酶的基因的上调，氨基酸含量的显著增加以及葡萄糖水平的降低。结果提示基于C和N代谢密切联系的其协同变化。元素分析揭示在Dofl转基因植物中N含量增加(约为30％)，表明净N同化的提升。然而，没有讨论CN变化对于植物生物量或产量的影响。
还可以参考另一篇由Takahashi，H.，Takahara，K.，Hashida，S.，Hirabayashi，T.，Fujimori，T.，Kawai-Yamada，M.，Yamaya，T.，Yanagisawa，S.和HirofumiUchimiya，H.撰写的题目为“PleiotropicModulationofcarbonandnitrogenmetabolisminArabidopsisplantsoverexpressingtheNADkinase2gene”(2009，PlantPhysiology.151：100-113)的文章，其中培育过表达NAD激酶2(NADK2)以及NADK2突变体的转基因拟南芥植物以研究改变NADP水平对于植物代谢的影响。代谢物谱提示在NADK2过表达株和在NADK2突变体中NADP(H)的浓度与NADK的活性是成比例的。与卡尔文循环相关的一些代谢物也在过表达株中更高，伴随整体核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)活性的提高。此外，NADP(H)产量因NADK2过表达增加了N同化而提高。Gln和Glu浓度以及一些其他氨基酸在过表达株中更高。然而，没有明确的证据表明NADK2有影响C和N代谢的作用。
植物中C和N状态的提高是提高生产力的主要关注点。然而还没有报告显示C和N水平的增加和随后的植物生物量和产量的提高。
此外，没有进行过共同过表达三个基因(即，AspAT、GS和PEPCase)从而导致C和N状态、生物量和产量提高的尝试。
发明目的
本发明的主要目的是提供用于提高植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体，其消除了如上文所详述的迄今已知的现有技术的缺点。
本发明的另一个目的是提供共同过表达AspAT(SEQIDNO：1)、GS(SEQIDNO：2)和PEPcase(SEQIDNO：3)的表达构建体，其中PEPCase有效地捕获CO2，而另外两个基因编码具有N同化(使用由PEPCase介导的反应提供的碳骨架)功能的酶(AspAT和GS)，导致C和N状态的提高以及植物生物量和产量的提高。
本发明的另一个目的是栽培显示出AspAT、GS和PEPCase基因共同过表达的转基因植物。
本发明的另一个目的是评估转基因植物中AspAT、GS和PEPCase基因的表达。
本发明的另一个目的是评估与野生植物相比转基因植物的C与N状态、生物量和产量。
发明概述
因此，本发明提供了SEQIDNO.7所示的用于基因AspAT，GS和PEPCase之共表达的表达构建体，其包含与至少一个控制序列和转录终止子序列相连的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示核苷酸序列，其中SEQIDNO：1示出AspAT基因，SEQIDNO：2示出GS基因以及SEQIDNO：3示出PEPCase基因，所述表达构建体可用于提高植物相对于野生型或非转化植物的碳、氮、生物量和产量。
在本发明的一个实施方案中，控制序列优选地如SEQIDNO：4所示。
在本发明的另一个实施方案中，转录终止子序列如SEQIDNO：5所示。
在一个实施方案中，本发明提供了由来自大豆的胞质AspAT基因、来自烟草的胞质GS基因和来自玉米的PEPCase基因制备的表达构建体。
在本发明的另一个实施方案中，在植物中过表达具有SEQIDNo：7的多核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，使用的控制序列是选自以下的组成型启动子：CaMV35S启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子。
在本发明的另一个实施方案中，使用的终止子优选选自Nos终止子和CaMV3′UTR。
在本发明的另一个实施方案中，用于制备表达构建体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)使用SEQIDNO：10和SEQIDNO：11所示引物扩增编码SEQIDNO：1所示基因的cDNA序列，使用SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示引物扩增编码SEQIDNO：2所示基因的cDNA序列，以及使用SEQIDNO：12和SEQIDNO：13所示引物扩增编码SEQIDNO：3所示基因的cDNA序列；
ii)将在步骤(i)中获得的SEQIDNO：1、2和3的扩增产物独立地克隆入pGEM-Teasy载体中；
iii)将来自步骤(ii)中获得之阳性克隆的质粒独立地与pCAMBIA1302一起消化，以及进一步将消化的基因产物和pCAMBIA1302连接并转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞中；
iv)对来自步骤(iii)中获得之阳性菌落的质粒进行测序，确认AspAT：：pCAMBIA1302；GS：：pCAMBIA1302和PEPCase：：pCAMBIA1302的框内(inframc)克隆；
v)使用SEQIDNO：10和SEQIDNO：16；SEQIDNO：14和SEQIDNO：15以及SEQIDNO：17和SEQIDNO：18所示引物扩增步骤(iv)中获得的产物；
vi)对扩增的GS编码序列再次独立地进行克隆、消化、连接和测序以形成GS+pCAMBIA1302，将其进一步被消化并与扩增的AspAT编码序列之阳性克隆的质粒连接以形成AspAT+GS+pCAMBIA1302表达盒；
vii)将扩增的PEPCase编码序列之阳性克隆的经消化质粒与目的pCAMBIA1302连接，所述pCAMBIA1302预先克隆有步骤(vi)中获得的AspAT+GS+表达盒，以使得AspA、GS和PEPCase基因被独立的CaMV35S启动子和Nos终止子控制，以形成SEQ.IDNO：7所示的单个植物表达构建体AspAT+GS+PECPase。
在本发明的另一个实施方案中，使用表达构建体提高植物的碳、氮、生物量和产量的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)用权利要求1所述的表达构建体转化根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefacians)菌株；
b)用步骤(a)中获得的重组根瘤农杆菌菌株转化外植体；
c)选择步骤(b)的经转化外植体以获得期望的经转化植物，相对于野生型植物，所述经转化植物具有提高的碳、氮、生物量和产量水平。
在本发明的另一个实施方案中，方法，其中相对于野生型，经转化植物表现出增加约45-50％的PEPC酶活性、至少55％的GS活性和55-60％的AspAT活性，导致所述植物中碳和氮水平的增加。
在本发明的另一个实施方案中，所提供的农杆菌菌株选自具有ATCC号的GV3101根瘤农杆菌(GV3101(pMP90RK)(C58衍生)号：33970参考：HayashiH，CzaiaI，LubenowH，SchellJ，WaldenR.1992。
在本发明的另一个实施方案中，经转化植物选自谷物作物、豆类(pulses)、蔬菜作物、油籽作物和观赏植物。
在另一个实施方案中，经转化植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、烟草、玉米、小麦、稻、棉花、芥菜、木豆、豇豆、豌豆、甘蔗、大豆和高粱。
在另一个实施方案中，与野生型相比，经转化的植物表现出由种子产量和／或荚果产量增加所表明的产量和／或生物量增加。
在另一个实施方案中，经转化植物表现出提高的生长特性，所述提高的生长特性的特征在于，与野生型或未转化的植物相比嫩枝(shoot)鲜重、嫩枝干重、根鲜重和干重增加。
在本发明的另一个实施方案中，经转化植物相对于野生植物显示出碳、氮、生物量和产量水平的提高。
在本发明的另一个实施方案中，评估转基因植物中过表达的酶的表达和功能性。
在本发明的另一个实施方案中，使用的可选择标记为通过重复的CaMV35S启动子控制并且由CaMV3′UTR(polyA信号)终止的用于潮霉素抗性的SEQ.IDNO：6所示的hpt基因(潮霉素磷酸转移酶)。
在本发明的另一个实施方案中，进行生物化学测定和RT-PCR以评估转基因植物中所引入基因的表达和过表达酶的功能性。
在本发明的另一个实施方案中，研究转基因植物的不同生长和产率参数并与在相同的条件下培养的野生植物相比较。
附图说明
图1表示实施例1至4所讨论的(a)植物转化载体pCAMBIA1302之T-DNA区域的示意图，pCAMBIA1302用于AspAT、GS和PEPCase的共同过表达和(b)各植物来源的AspAT、GS和PEPCase之编码序列的扩增。
图2表示WT、L1和L2的(a)DNA分析和(b)RNA分析，其中WT=野生；L1和L2=共同过表达AspAT、GS和PEPCase的两种不同转基因系。
图3表示播种60天时，WT和AspAT+GS+PEPCase转基因植物的嫩枝鲜重(FW)(a)、嫩枝干重(DW)(b)、根鲜重(c)和根干重(d)。数据是5个独立的生物学重复的平均值，标准差标注在各自的柱上。
图4表示在播种42天时，WT、L1和L2的AspAT活性(a)GS活性(b)和PEPC酶活性(d)。数据是3个独立的生物学重复的平均值，标准差标注在各自的柱上。
图5表示在播种65天时，来自WT、L1和L2系的不同植物部分的N(a)和C(b)含量分析。数据是3个独立的生物学重复的平均值，标准差标注在各自的柱上。
图6表示播种75天时的代表性WT和AspAT+GS+PEPCase转基因植物。
图7表示在播种75天时，在WT、L1和L2中荚果数目(a)和种子产量(b)。数据是5个独立的生物学重复的平均值，标准差标注在各自的柱上。
发明详述
本发明涉及植物中C和N代谢的基因改造。特别地，本发明涉及共同过表达AspAT、GS和PEPCase的表达构建体，其用来同时改变参与C和N同化或利用和/或其表达的酶，以将植物改造为具有增加的C和N水平，从而促使更佳生长和生物量产出以及产量的提高。
术语“载体”指由核苷酸构成的构建体，其中来自外源的基因可以在需要时被连接和分离。构建体通常是质粒(即染色体外自我复制核酸)并且被增殖，例如大肠杆菌的细菌细胞。在本发明中载体被用来将基因从一种来源转移到另一种。
术语“基因”是指可产生多肽链的核酸序列。
术语“基因表达”指通过DNA(即脱氧核糖核酸序列)转录的(即由DNA合成RNA的过程)所选RNA(即核糖核酸序列)的水平／量。当基因相对于对照以更高的量转录时，其被称为基因的“过表达”。
术语“可选择标记”指允许细胞在不具有可选择标记时为毒性的抗生素的存在下生存的基因。
术语“转基因植物”指引入基因稳定整合入其基因组的遗传转化植物。术语“启动子”指特定的DNA序列，其通常位于参与转录的DNA序列的上游(5′)，其中RNA聚合酶结合以进行转录过程。“组成型启动子”在所有阶段指导基因在所有组织中的表达而不管周围环境和器官的发育阶段为何。
术语“表达盒”指包括以下并且能够在连续世代间传递遗传信息的载体，(a)组成型启动子，(b)克隆到组成型启动子3′的所有三个基因，(c)位于编码序列3′的多聚腺苷酸信号。
“野生型”植物是未转化的植物。
术语“T0”指可以根据在选择剂抗生素存在下的生长而被鉴定和选择的第一组遗传转化植物，其中转基因植物包含相应的抗性基因。术语“T1”指T0代植物的花自体受精获得的植物世代。“T2”植物产生自T1植物，以此类推。
本发明将通过下列实施例以更多的细节举例说明。
实施例
以下实施例通过举例说明本发明方式给出，因此不能被认为是对本发明范围的限制。
本发明中所用的引物序列在以下列出：
实施例1
AspAT基因的扩增与克隆
从NCBI的核苷酸序列数据库获得编码大豆胞质AspAT基因的核苷酸序列(SEQIDNO：1)(GenBank登录号AF034210.1；(http：／／www.ncbi.nlm.nih.pov／nuccore／AF034210.1)。使用iRIS植物RNA试剂盒(Ghawana等人，US专利号0344NF2004／IN)从大豆植物中分离RNA。总RNA制品(2μg)按照制造说明书使用2UDNaseI(扩增级，Invitrogen，USA)消化后，在1μg寡聚(dT)12-18和400U逆转录酶SuperscriptII(Invitrogen)存在下合成cDNA。然后使用AspATBglIIF(SEQIDNO：10)和AspATpmlR(SEQIDNO：11)引物从大豆cDNA扩增AspAT的完整编码区，使得限制性酶切位点BglII(AGATCT)和PmlI(CACGTG)被并入AspAT的编码序列。使用Qiagen高保真Taq聚合酶进行PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在59℃退火30秒，在72℃延伸1分钟20秒)，72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中。使用BglII和PmlI消化来自阳性克隆的质粒和pCAMBIA1302质粒，将从琼脂糖凝胶电泳分离的消化产物进行连接并转化到大肠杆菌DH5α细胞(获得自TakaraBio公司，日本(Cat.No.9057))中。对阳性克隆的质粒进行测序以确认位于pCAMBIA1302的CaMV35S启动子(SEQIDNO：4)和Nos终止子(SEQIDNO：5)之间的AspAT编码序列的框内克隆(inframecloning)，获得的载体被称为AspAT：：pCAMBIA1302。
实施例2
GS基因的扩增和克隆
从NCBI的核苷酸序列数据库获得编码烟草胞质GS基因的核苷酸序列(SEQIDNO：2)(GenBank登录号X95932.1；(http：／／www.ncbi.nlm.nih.gOv／nuccore／X95932.1)。使用iRIS植物RNA试剂盒(Ghawana等人，US专利号0344NF2004／IN)从烟草植物中分离RNA。总RNA制品(2μg)按照制造说明书使用2UDNaseI(扩增级，Invitrogen，USA)消化后，在1μg寡聚(dT)12-18和400U逆转录酶SuperscriptII(Invitrogen)存在下合成cDNA。
使用具有限制性酶切位点NcoI(CCATGG)的引物GSNcoIF(SEQIDNO：8)和具有限制性酶切位点BstEII(GGTGACC)的引物GSBstEIIR(SEQIDNO：9)从烟草cDNA扩增GS的完整编码区。修饰GSNcoIF引物，以通过将15位的核苷酸“A”替换为“G”消除BglII位点。
使用Qiagen高保真Taq聚合酶进行PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在59℃退火30秒，在72℃延伸1分钟10秒)，72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中。使用NcoI和BstEII消化来自阳性克隆的质粒和双元载体pCAMBIA1302，将从琼脂糖凝胶电泳分离的消化产物进行连接，使得GS位于pCAMBIA载体的CaMV35S启动子下游。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α细胞中，对转化子测序以确认GS编码基因序列的框内克隆，所得载体被称为GS：：pCAMBIA1302。
实施例3
玉米PEPCase基因的扩增和克隆
从NCBI的核苷酸序列数据库获得编码玉米PEPCase基因的核苷酸序列(SEQIDNO：3)(NCBI参考序列：NM_001111948.1；flittp：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／NM001111948.1)。使用iRIS植物RNA试剂盒(Ghawana等人，US专利号0344NF2004／IN)从玉米植物中分离RNA。总RNA制品(2μg)按照制造说明书使用2UDNaseI(扩增级，Invitrogen，USA)消化后，在1μg寡聚(dT)12-18和400U逆转录酶SuperscriptII(Invitrogen)存在下合成cDNA。
使用具有限制性酶切位点BglII(AGATCT)的引物PEPCaseBglIIF(SEQIDNO：12)和具有限制性酶切位点SpeI(ACTAGT)的引物PEPCasespeIR(SEQIDNO：13)从玉米cDNA扩增PEPCase的全长编码区。使用补充Q-溶液(便于扩增富含GC的模板)的Qiagen高保真Taq进行聚合酶PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，32个循环(在94℃进行30秒，在58℃退火30秒，在72℃延伸3分钟)，72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中。使用BglII和SpeI消化来自阳性克隆的质粒和pCAMBIA1302质粒，将从琼脂糖凝胶电泳分离的消化产物进行连接，随后转化到大肠杆菌DH5α细胞中。对转化子测序以确认PEPCase编码序列的框内克隆，所得载体被称为PEPCase：：pCAMBIA1302。
实施例4
在单个pCAMBIA1302载体(来自澳大利亚“国际农业分子生物学应用中心”的慷慨礼物)中组装ApsAT、GS和PEPCase的表达盒
下面将描述将各ApsAT、GS和PEPCase的表达盒扩增与整合至单个植物转化载体pCAMBIA1302的分步方法：
使用引物35SSpeIF(SEQIDNO：14)和NOSTAscI、BbvCl、PmlIR(SEQIDNO：15)从GS：：pCAMBIA1302扩增包含CaMV35S启动子、下游克隆的GS和胭脂碱合酶(下文中被称作“Nos”)终止子的GS表达盒。设计引物用以在正向引物中整合SpeI(ACTAGT)和在反向引物中整合Ascl(GGCGCGCC)、BbvCI(CCTCAGC)和PmlI(CACGTG)以便于将GS表达盒亚克隆进入pCAMBIA1302载体的SplI和PmlI位点以及在载体骨架的3′末端建立额外限制性酶切位点(AscI、BbvCI)。使用Qiagen高保真Taq聚合酶进行PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在59℃退火30秒，在72℃延伸2分钟)，72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中。使用SpeI和PmlI消化来自阳性克隆的质粒，然后从琼脂糖凝胶电泳分离消化产物并连接进入pCAMBIA1302载体的SpeI和PmlI位点。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α细胞中，通过质粒的测序鉴定转化子。
使用分别带有限制性酶切位点BglII(AGATCT)和SpeI(ACTAGT)的引物AspATBglIIF(SEQIDNO：10)和NosTspel(SEQIDNO：16)从AspAT：：pCAMBIA1302载体(实施例1)扩增带有3′Nos终止子序列的AspAT编码序列。
使用Qiagen高保真Taq聚合酶进行PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在59℃退火30秒，在72℃延伸2分钟)，在72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中。使用BglII和SpeI消化来自阳性克隆的质粒，克隆到目标pCAMBIA1302(预先克隆了GS表达盒)的CaMV35S启动子下游。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α细胞中，对转化子测序以鉴定AspAT编码序列的框内克隆。
使用带有限制性酶切位点Ascl(GGCGCGCC)的引物35SAsclIF(SEQIDNO：17)和带有限制性酶切位点BbVCI(CCTCAGC)的PEPCaSeBbVClR(SEQEDNO：18)自PEPCase：：pCAMBIA1302载体(实施例3)扩增CaMV35S启动子以及下游克隆的PEPCase基因。
使用Qiagen高保真Taq聚合酶进行PCR，使用下列条件：94℃初始变性3分钟，30个循环(在94℃进行30秒，在60℃退火30秒，在72℃延伸4分钟)，在72℃最终延伸7分钟。扩增产物被克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)中，使用AscI(GGCGCGCC)和BbVCI(CCTCAGC)消化来自阳性克隆的质粒，然后从琼脂糖凝胶电泳分离消化产物，连接到目的pCAMBIA1302(预先克隆了GS和AspAT表达盒)Nos终止子序列的上游。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α细胞中，对转化子测序以鉴定PEPCase编码序列的框内克隆。所得的植物表达载体被命名为AspAT+GS+PEPCase，其用于AspAT、GS和PEPCase的共同过表达。引入潮霉素抗性基因(SEQIDNO.6)作为可选择标记用于筛选转基因植物。由SEQIDNO.7所示的表达构建体的示意图在图1中示出，所述构建体用于植物转化，从而使得转基因植物生产更高量的SEQIDNO.29、30和31所示蛋白质。
实施例5
栽培共同过表达基因AspAT、GS和PEPCase的转基因拟南芥植物
植物表达载体(AspAT+GS+PEPCase)的产生
简要地，植物表达载体如下构建：编码大豆AspAT基因(SEQIDNO：1)、烟草胞质GS基因(SEQIDNO：2)和玉米PEPCase基因(SEQIDNO：3)的cDNA序列首先被独立地克隆入pCAMBIA1302载体。然后将AspAT、GS和PEPCase表达盒元件扩增并组装到目的pCAMBIA1302中，使得基因AspAT、GS和PEPCase被独立的CaMV35S启动子和Nos转录终止子控制。
农杆菌介导的植物转化
使用标准的三亲杂交法将AspAT+GS+PEPCase转移至具有ATCC号的根瘤农杆菌菌株GV3101(GV3101(pMP90RK)(C58衍生)号：33970参考文献：HayashiH，CzajaI，LubenowH，SchellJ，WaldenR.1992。
简要地，具有重组构建体AspAT+GS+PEPCase的大肠杆菌DH5α细胞和具有辅助质粒pRK2013的细胞在37℃培养过夜。农杆菌菌株GV3101在28℃生长48小时。然后将所有这三种培养物沉淀、洗涤和混合，继而在添加了抗生素卡那霉素(50μg／ml)和利福平(50μg／ml)的YEM(酵母提取物甘露醇)平板上铺板。抗生素抗性克隆通过集落PCR确认以确保用重组构建体AspAT+GS+PEPCase转化农杆菌。
哥伦比亚生态型拟南芥种子由UK、Harpenden、IACR-洛桑的ChristineHFoyer博士慷慨馈赠。
使用真空渗透法，用具有AspAT+GS+PEPCase的农杆菌转化拟南芥植物。简要地，从单一转化的农杆菌菌落建立5ml液体培养并且在28℃在补充50μg／ml卡那霉素，50μg／ml利福平的YEM培养基中生长至对数期后期。接着，将1ml细菌悬浮液用补充有相同抗生素的100mlYEB培养基稀释。使培养物生长过夜，直到其光密度在600nm处达到1.2-1.8。细菌在室温以2000g旋转20分钟，并悬浮在含半强度MS(Murashige和Skoog)培养基(具有2％蔗糖，0.05％MES(Sigma)和0.01％的SilwetL-77(LehleSeeds，美国))的渗透溶液中。将拟南芥花在细菌悬浮液中浸渍，并在真空下渗透10分钟。然后将植物转移到生长室，在受控制的日长条件(在22-23℃光照16小时并在20℃黑暗8小时)下生长以形成种子。
原代转化株T0转基因拟南芥植物的选择：将来自转化植物的种子表面灭菌(通过在70％(体积／体积)乙醇中浸泡2分钟，随后浸泡在10％(体积／体积)的次氯酸钠溶液中)。然后将种子用无菌蒸馏水洗涤四次，并播种到含1％琼脂并补充潮霉素B(Sigma#H3274，浓度为20μgml-1)的MS培养基上，种子在黑暗中于4℃层化(stratified)2天。之后分层板被转移至16小时光照和8小时黑暗循环的生长室中以发芽。14天后，选择潮霉素抗性苗作为假定的原代转化株(T0)，并转移到含有蛭石、珍珠岩和椰糠混合物(1：1：1)的罐子中在光照、温度和湿度受控的条件下生长至成熟以生长并产生种子。
培植T1和T2代AspAT+GS+PEPCase转基因植物：使从T0转基因植物收获的种子在MS+潮霉素B(浓度为20μgml-1)在平板上发芽并且选择表现出3：1分离比(通过其对潮霉素B的敏感性评分)的转基因株系来培植转基因植物的T1代。在T2代中获得纯合的转基因植物并且评估不同的生理和生化参数(相对于野生对照植物)。
实施例6
来自用AspAT+GS+PEPCase转化的拟南芥植物之基因组DNA的分析
选择来自用AspAT+GS+PEPCase转化的来自两个独立的转基因株系的拟南芥植物以鉴定转基因是否插入植物基因组。使用DNeasyPlantmini试剂盒(QIAGENCo.)分离基因组DNA。使用分离的DNA作为模板，用退火至潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因(SEQIDNO：6)(来自pCAMBIA1302载体的植物选择标记物)的引物hptF(SEQIDNO：19)和hptR(SEQIDNO：20)进行PCR。
PCR条件被限定为：94℃初始变性3分钟，28个循环(在94℃进行30秒，在58℃退火30秒，在72℃延伸1分钟)，在72℃最终延伸7分钟。
结果显示在图2A中，其中WT代表野生的，L1和L2代表了两个不同的转基因系。仅在转基因中观察到hpt基因的扩增，确认AspAT+GS+PEPCase插入拟南芥植物。
实施例7
通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)评估AspAT+GS+PEPCase转基因
进行转化体的RNA分析以确认AspAT、GS和PEPCase的表达。使用iRIS植物RNA试剂盒(Ghawana等人，US专利号0344NF2004／IN)从转基因植物的叶和根分离总RNA。总RNA制品(2μg)按照制造说明书使用2UDNaseI(扩增级，Invitrogen，USA)消化后，在1μg寡聚(dT)12-18和400U逆转录酶SuperscriptII(Invitrogen)存在下合成cDNA。使用对AspAT、GS和PEPCase特异的引物(命名为PEPCaseExpF(SEQIDNO：21)、PEPCaseExpR(SEQIDNO：22)、GSExpF(SEQIDNO：23)、GSExpR(SEQEDNO：24)、AspATExpF(SEQIDNO：25)和AspATExpR(SEQIDNO：26)评估转基因的表达。使用引物26SF(SEQIDNO：27)和26SR(SEQIDNO：28))来扩增26SrRNA作为RT-PCR的阳性对照。
分析的结果显示在图2B中，其中WT代表野生的，L1和L2代表了两个转基因系。仅在转基因中观察到RT-PCR扩增产物，确认了引入基因的表达。
实施例8
野生型和AspAT+GS+PEPCase转基因拟南芥植物的酶学分析
按照以下进行AspAT+GS+PEPCase转基因和野生植物的酶学分析：
PEPC酶活性测定：在1ml提取缓冲液中用研钵和杵研磨冷冻叶样品(200mg)，所述提取缓冲液含50mMTris-Cl缓冲液(pH7.5)、1.0mMMgCl2、5.0mMDTT、1.0mMPMSF、2％(重量／体积)PVPP、10％(体积／体积)甘油和0.1％(体积／体积)TritonX-100。该提取物在4℃以12,000g离心10分钟，上清液用于测定酶活性。在过量MDH和乳酸脱氢酶存在下，用分光光度法在340nm处测定PEPCase(Ashton等人，1990)。该反应混合物含有50mMTris-Cl(pH8.0)、5mMMgCl2、5mMDTT、1mMNaHCO3、5mM葡萄糖-6-磷酸、0.2mMNADH，2个单位MDH、0.1个单位乳酸脱氢酶和粗提物。通过加入5mMPEP起始反应。
AspAT活性测量：AspAT的提取缓冲液包括200mMTris-Cl缓冲液(pH7.5)、2.0mMEDTA和20％甘油。
基本上如Ireland和Joy(1990)所描述的在MDH偶联反应中测定酶。简单地说，反应混合物含有10mM的2-酮戊二酸，2mM天冬氨酸，0.2mMNADH和50mMHEPES缓冲液(pH8.0)。加入2-酮戊二酸开始反应。通过从反应混合物中去除2-酮戊二酸进行对照测定。
GS活性测量：在研磨介质中提取GS(谷氨酰胺合成酶)，所述介质包含50mMTris-Cl缓冲液(pH7.8)、1mMEDTA、10mMMgSO4、5mM的谷氨酸钠、10％(体积/体积)甘油和不溶性PVPP(2％重量／体积)。按照早先Lea等人(1990)所述进行酶测定并且从γ-谷氨酰羟肟酸制备的标准曲线计算活性。
分析结果显示在图5A至5C，相比于野生植物，两个独立的AspAT+GS+PEPCase转基因植物均观察到约45至50％的PEPC酶活性增加，55％的GS活性增加和55至60％的AspAT活性增加。
实施例9
野生和AspAT+GS+PEPCase转基因拟南芥植物中C和N的分析
AspAT+GS+PEPCase转化的拟南芥植物和野生对照植物的种子在补充了20g/l蔗糖的半浓度MS平板上发芽。14日龄的苗转移至含有蛭石、珍珠岩、椰糠混合物(比例1：1：1)的罐子中并在长日照条件(在拟南芥生长室中保持在22℃光照16小时，在20℃黑暗8小时)下生长。从65日龄植物收获不同的植物部分(包括莲座叶、茎、茎生叶和绿荚果)，在80℃干燥48小时。使用ElementarCHNS分析仪进行C和N元素的定量测定，使用磺胺作为标准。结果示于图6。元素分析表明，与野生植物相比，由于AspAT、GS和PEPCase的共同过表达，在AspAT+GS+PEPCase转基因植物的叶中C和N的总含量显著增加。
实施例10
野生和AspAT+GS+PEPCase转基因植物中生长和产量的研究
分析野生和AspAT+GS+PEPCase转基因植物的不同生长特性。对60日龄的植物记录嫩枝、根的鲜重和干重。经不同的参数评估，AspAT+GS+PEPCase植物显示出生长特性的增强。特别地，转基因植物的每个莲座面积更大，有更多的叶子数目。转基因植物的嫩枝鲜重表现出大约70％的增加和嫩枝干重的60％增加，而对根的鲜重和干重分别观察到40％和30％的增加(如图3所示)。
计算72日龄AspAT+GS+PEPCase转基因植物的荚果总数，并与非转基因野生植物相比(在图7a中显示)。另外还测量转基因和对照植物的总种子产量(每颗植物的总种子重量)。这两个参数中，AspAT+GS+PEPCase转基因拟南芥植物相比于野生植物显示出产量的增加(如图7b所示)。
本发明的优点
1.努力提高了植物的碳和氮状态，这是迈向食物保障的一步。
2.本发明提供了一种创新的方法，其中PEPCase的过表达提供了碳骨架以通过AspAT和GS的过表达捕捉同化的氮。
3.植物捕捉碳和氮能力的提高也反映在植物种子和植物生物量生产两个方面上的植物生产力的提高。

Claims (8)

1.SEQIDNO.7所示的用于AspAT、GS和PEPCase基因之共表达的表达构建体，其包含与至少一个控制序列和转录终止子序列相连的SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示核苷酸序列，其中SEQIDNO:1示出AspAT基因，SEQIDNO:2示出GS基因以及SEQIDNO:3示出PEPCase基因，所述表达构建体可用于使植物相对于野生型或未转化植物具有提高的碳、氮、生物量和产量。
2.权利要求1所述的表达构建体，其中所述控制序列如SEQIDNO.4所示，所述转录终止子序列如SEQIDNO.5所示。
3.用于制备权利要求1所述的表达构建体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)使用SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示引物扩增编码SEQIDNO:1所示基因的cDNA序列，使用SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示引物扩增编码SEQIDNO:2所示基因的cDNA序列，以及使用SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示引物扩增编码SEQIDNO:3所示基因的cDNA序列；
ii)将在步骤(i)中获得的SEQIDNO:1、2和3的扩增产物独立地克隆入pGEM-Teasy载体中；
iii)将来自步骤(ii)中获得之阳性克隆的质粒独立地与pCAMBIA1302一起消化，以及进一步将消化的基因产物与pCAMBIA1302连接并转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞中；
iv)对来自步骤(iii)中获得之阳性菌落的质粒进行测序，确认AspAT::pCAMBIA1302；GS::pCAMBIA1302和PEPCase::pCAMBIA1302的框内克隆；
v)使用SEQIDNO:10和SEQIDNO:16；SEQIDNO:14和SEQIDNO:15以及SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示引物扩增步骤(iv)中获得的产物；
vi)对扩增的GS编码序列再次独立地进行克隆、消化、连接和测序以形成GS+pCAMBIA1302，将其进一步被消化并与扩增的AspAT编码序列之阳性克隆的质粒连接以形成AspAT+GS+pCAMBIA1302表达盒；
vii)将扩增的PEPCase编码序列之阳性克隆的经消化质粒与目的pCAMBIA1302连接，所述目的pCAMBIA1302预先克隆有步骤(vi)中获得的所述AspAT+GS+表达盒，以使得AspA、GS和PEPCase基因被独立的CaMV35S启动子和Nos转录终止子控制，以形成SEQIDNO:7所示的单个植物表达构建体AspAT+GS+PECPase。
4.使用权利要求1中所述的表达构建体提高植物的碳、氮、生物量和产量的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)用权利要求1所述的表达构建体转化根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefacians)菌株；
b)用步骤(a)中获得的重组根瘤农杆菌菌株转化外植体；
c)选择步骤(b)的经转化外植体以获得期望的经转化植物，其相对于野生型植物具有提高的植物碳、氮、生物量和产量水平。
5.权利要求4所述的方法，其中所述经转化植物选自拟南芥、番茄、马铃薯、烟草、玉米、小麦、稻、棉花、芥菜、木豆、豇豆、豌豆、甘蔗、大豆和高粱。
6.权利要求4所述的方法，其中所述经转化植物相对于野生型表现出45％至50％的PEPC酶活性增加，至少55％的GS活性增加和55％至60％的AspAT活性增加，从而使得所述植物中碳和氮水平增加。
7.权利要求4所述的方法，其中所述经转化植物相对于野生型表现出由种子产量和/或荚果产量增加所表明的产量和/或生物量增加。
8.权利要求4所述的方法，其中所述经转化植物表现出提高的生长特性，所述提高的生长特性的特征在于与野生型或未转化植物相比嫩枝鲜重、嫩枝干重、根鲜重和根干重增加。
CN201280027891.9A 2011-04-19 2012-04-19 用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法 Active CN103597081B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN1143/DEL/2011 2011-04-19
IN1143DE2011 2011-04-19
PCT/IB2012/051965 WO2012143877A2 (en) 2011-04-19 2012-04-19 An expression construct and process for enhancing the carbon, nitrogen, biomass and yield of plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103597081A CN103597081A (zh) 2014-02-19
CN103597081B true CN103597081B (zh) 2016-02-24

Family

ID=46146990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280027891.9A Active CN103597081B (zh) 2011-04-19 2012-04-19 用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10808259B2 (zh)
EP (1) EP2699687B1 (zh)
JP (1) JP5856283B2 (zh)
KR (1) KR101590521B1 (zh)
CN (1) CN103597081B (zh)
AU (1) AU2012245969B2 (zh)
MX (1) MX346985B (zh)
WO (1) WO2012143877A2 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015056130A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having increased biomass and / or sugar content and a method for making the same
CN110904148A (zh) * 2019-11-19 2020-03-24 湖北大学 一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株dzggppsts和盾叶薯蓣及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006069610A2 (en) * 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69434715D1 (de) * 1993-10-06 2006-06-01 Univ New York Methode zur herstellung von transgenen pflanzen, die eine erhöhte stickstoffaufnahme zeigen
US6969782B2 (en) * 1993-10-06 2005-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
US20060127889A1 (en) * 2000-07-25 2006-06-15 Dotson Stanton B Method for assessing transgene expression and copy number
JP2001299118A (ja) * 2001-03-19 2001-10-30 Natl Inst Of Agrobiological Resources Ｃ４植物の光合成酵素を発現するｃ３植物体
JP4189636B2 (ja) * 2002-02-19 2008-12-03 味の素株式会社 アミノ酸含量の増大した植物、窒素含量が増大した植物、窒素制限下での成育抑制が解除された植物、およびそれらの作製法
US20070271623A1 (en) * 2003-11-28 2007-11-22 University Of Copenhagen Plant Disease Resistance and Sar Regulator Protein
CA2598792A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
CA2644273A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
DE112008002456T5 (de) * 2007-09-21 2011-01-13 Basf Plant Science Gmbh Pflanzen mit erhöhtem Ertrag
BRPI0918991A2 (pt) * 2008-09-24 2017-09-19 Basf Plant Science Gmbh Métodos para intensificar traços relacionados com o rendimento em plantas em relação ás plantas de controle, e para produzir uma planta transgênica, planta, parte de planta ou célula de planta, construção, uso de uma construção, partes colhíveis de uma planta, produtos, uso em um ácido nucleico, molécula de ácido nucleico isolada, e, polipeptídeo isolado

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006069610A2 (en) * 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
can less yield more? is reducing nutrient input into the environment compatible with maintaining crop production?;allen g.good et al.;《trends in plant science》;20041231;第9卷(第12期);597-605 *
glutamate synthase and nitrogen assimilation;stephen j. temple et al.;《trends in plant science》;19980228;第3卷(第2期);51-56 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10808259B2 (en) 2020-10-20
EP2699687B1 (en) 2015-08-19
KR20140019438A (ko) 2014-02-14
WO2012143877A3 (en) 2013-01-31
US20140137297A1 (en) 2014-05-15
WO2012143877A2 (en) 2012-10-26
MX2013012185A (es) 2014-03-27
AU2012245969B2 (en) 2016-04-28
EP2699687A2 (en) 2014-02-26
JP5856283B2 (ja) 2016-02-09
WO2012143877A9 (en) 2012-12-13
CN103597081A (zh) 2014-02-19
MX346985B (es) 2017-04-07
KR101590521B1 (ko) 2016-02-01
AU2012245969A1 (en) 2013-11-07
JP2014512819A (ja) 2014-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060090219A1 (en) Methods for producing plants with improved growth under nitrogen-limited conditions
Seger et al. Impact of concurrent overexpression of cytosolic glutamine synthetase (GS 1) and sucrose phosphate synthase (SPS) on growth and development in transgenic tobacco
JPH09503389A (ja) 窒素同化の増加を示すトランスジェニック植物
CN109825501B (zh) 一种来源于拟南芥的长链非编码rna t5120及其用途
CN107629121A (zh) 一个来源于玉米的转录因子ZmNLP9及其用途
US20040197915A1 (en) C3 plants expressing photosynthetic enzyme of C4 plants
CN103597081B (zh) 用于增加植物的碳、氮、生物量和产量的表达构建体和方法
CN110964740B (zh) 一种高黄酮醇烟草的制备方法及其应用
CN107602683A (zh) 一个来源于玉米的转录因子ZmNLP4及其用途
WO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
CN102942623B (zh) AtTAR2蛋白及其编码基因在调控植物侧根发育中的应用
CN105671074B (zh) 一种提高植物甲硫氨酸含量的载体及其构建方法和用途
Ahmed et al. Improving nitrogen use efficiency in wheat (Triticum aestivum L.) through transformation of codon optimized alanine aminotransferase gene
Tao et al. Enhanced photosynthetic efficiency for increased carbon assimilation and woody biomass production in hybrid poplar INRA 717-1B4
JP2001506123A (ja) 解糖効率が上昇したトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物
US9695436B2 (en) Plants having enhanced nitrogen use efficiency and methods of producing same
CN1974771B (zh) 一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的顺式元件及其应用
Ligaba-Osena et al. The maize Corngrass1 miRNA-regulated developmental alterations are restored by a bacterial ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic tobacco
NZ716717B2 (en) An expression construct and process for enhancing the carbon, nitrogen, biomass and yield of plants
NZ716717A (en) An expression construct and process for enhancing the carbon, nitrogen, biomass and yield of plants
Ligaba-Osena et al. Research Article The Maize Corngrass1 miRNA-Regulated Developmental Alterations Are Restored by a Bacterial ADP-Glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Tobacco
CN117568340A (zh) 香蕉长链非编码RNA-Malnc2471及其应用
CN117264991A (zh) 向日葵HaFAD2-1基因在促进种子早期萌发中的应用
CN112029779A (zh) 拟南芥中介体成员med14和/或med16基因在抗旱中的应用
Yan et al. Improve Photosynthic Efficiency of Rice Via Over-Expressing a Ferredoxin-Like Protein Gene from Methanothermobacter Thermautotrophicus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant