CZ200118A3

CZ200118A3 - Prostředek a způsob ke zvýšení obsahu sirných sloučenin v rostlinách

Info

Publication number: CZ200118A3
Application number: CZ200118A
Authority: CZ
Inventors: Holger Hesse; Karsten Harms; Rainer Höfgen
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1999-07-07
Publication date: 2001-07-11
Also published as: EP1095155A1; ES2260926T3; EP1095155B1; DE69930270D1; PL345346A1; ATE319847T1; CA2336893A1; US6608239B1; CZ301853B6; DE69930270T2; HUP0203469A3; WO2000001833A1; AU5370399A; HUP0203469A2; AU773973B2; PL205174B1

Description

Prostředek a způsob ke zvýšení obsahu sirných sloučenin v rostlinách

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantni molekuly DNA, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferasovou aktivitou (SAT), a případně molekulu nukleové kyseliny kódující protein s cystein-y-syntetasovou aktivitou (CyS). Zmíněná molekula (případně molekuly) je funkčně spojena s regulačními úseky, které umožňují expresi molekuly (respektive molekul) nukleové kyseliny v rostlinné buňce. Navíc se vynález týká použití výše zmíněných rekombinantních molekul DNA a vektorů v rostlinných buňkách, tkáňových kulturách, při šlechtění rostlin a/nebo v zemědělství. Rovněž se týká výroby potravin, krmiv a přísad, které obsahují výše zmíněné rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny.

Dosavadní stav techniky

Vyšším rostlinám slouží anorganický síran z půdy jako hlavní zdroj síry pro syntézu síru obsahujících aminokyselin cysteinu a methioninu. Předpokládá se, že biosyntéza cysteinu u rostlin hraje zásadní roli v přírodním cyklu síry. Redukovaná síra ve formě cysteinu je potřebná k mnoha různým funkcím v rostlině (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992). Je důležitá i pro normální rostlinný metabolismus, protože propojuje metabolismus šeřinu a methioninu tím, že přenáší redukovanou síru potřebnou pro biosyntézu methioninu (Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold a Rennenberg, 1997). Dále cystein slouží jako substrát dalším molekulám, které obsahují síru, jako jsou určité kofaktory, sloučeniny vázané na membránu a jako esenciální aminokyselina sloužící k syntéze proteinů (Giovanelli, 1980; Schmidt, 1992). Cystein je také důležitý jako prekurzor při tvorbě glutathionu (GSH) a dalších metabolitů spojených se stresem. Potřeba cysteinu kolísá v průběhu rostlinného vývoje a je také závislá na změnách okolního prostředí včetně světla, dostupnosti síranů a některých druzích abiotického nebo biotického stresu (von Arb a Brunold, 1986; Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser, 1991; Ghisi, 1993; Hell, 1994).

V průběhu biosyntézy cysteinu musí být nejdříve L-serin aktivován přenosem acetylového zbytku z acetylkoenzymu A za vzniku intermediátu O-acetyl-L-serinu (OAS). Tato důležitá reakce je katalyzována enzymem serinacetyltransferasou • · 4 • · · · · • 4 · · 4

4 4 4 4

4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 444 (SAT). Aktivace šeřinu, klíčová reakce biosyntézy šeřinu, byla zkoumána na molekulární úrovni pouze u prokaryontů (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans, 1991; Lai a Baumann, 1992). Syntézy cysteinu u rostlin je dosaženo sulfhydrylací O-acetyl-L-serinu v přítomnosti volného nebo vázaného sulfidu, za katalýzy O-acetylserin(thiol)lyasy (OAS-TL, cysteinsynthasa, CSasa, EC 4.2.99.8) (Schmidt a Jáger, 1990). Tato reakce byla podrobně studována (Saito, 1992, 1993 a 1994; Rolland, 1993 a 1996; Youssefian, 1993; Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 a 1996; Takahashi a Saito, 1996).

U bakterií tvoří SAT společně s OAS-TL komplex, který je nazýván cysteinsynthasa. V rámci tohoto komplexu je pouze malá část (5 %) O-acetylserin(thiol)lyasy asociována s veškerou aktivitou SAT (Kredich, 1969). Studie regulace biosyntézy cysteinu u bakterií navíc odhalily citlivost serinacetyltransferasy ke zpětné inhibici Lcysteinem a že O-acetylserin (nebo N-acetylserin) je zapojen v transkripční aktivaci několika promotorů z operonu cys (Ostrowski a Kredich, 1989; Kredich, 1993).

V nedávné době byly nakloňovány rostlinné cDNA kódující serinacetyltransferasy z různých druhů rostlin (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995; Saito, 1995; Roberts and Wray, 1996). SAT existuje u rostlin také v komplexu s OAS-TL, což nasvědčuje o efektivním metabolickém přenosu ze šeřinu na cystein, čímž se zabrání difúzi intermediátu O-acetyl-L-serinu (Nakamura, 1988; Nakamura a Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova a Hell, 1997; Hesse, 1997). Jak pro SAT, tak pro OAS-TL byla prokázána u několika rostlin lokalizace v plastidu, mitochondriích a cytosolu. To značí, že schopnost syntézy cysteinu se zdá být nepostradatelnou ve všech buněčných kompartmentech, které mají schopnost endogenní biosyntézy proteinů (Smith a Thompson, 1969; Smith, 1972; Brunold a Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolland, 1992; Ruffet, 1994). Např. u Pisum sativum existují tři různé isoformy SAT a každá z těchto izoforem se zdá být specifickou pro daný vnitrobuněčný kompartment (Ruffet, 1995). Vedle těchto požadovaných umístění v buňce umožňuje fakt, že biosyntéza cysteinu je v komplexní interakci s příjmem a redukcí síranu, což je samo o sobě řízeno fotosyntézou a asimilací dusičnanu (Anderson, 1990; Brunold, 1993), předpokládat důležitou roli biosyntézy cysteinu v rámci metabolismu síry u vyšších rostlin.

Velice důležitým znakem sledu reakcí při tvorbě cysteinu je fakt, že aktivita SAT je mnohonásobně nižší v porovnání s aktivitou OAS-TL. V semenech a v klíčcích je aktivita OAS-TL deset- až dvacetkrát vyšší než SAT (Smith, 1971; Ngo a • ·♦ · · ···· ♦· • · · · ·· * · · · • · · · · · · ·· ··«···· ··· ···· ·· ·· ·· ···

Shargool, 1974). V celých listech poměr aktivit obou enzymů dosahuje hodnoty 100 až 300násobek (Nakamura, 1987), zatímco v samotných chloroplastech dosahuje tento poměr hodnoty 340násobek (Ruffer, 1994). Jak bylo ukázáno na rodu Allium a u špenátu, je SAT v porovnání s OAS-TL málo se vyskytujícím enzymem (Nakamura a Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Navíc bylo popsáno, že dostupnost OAS je limitujícím faktorem rychlosti syntézy cysteinu (Neuenschwander, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg, 1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). Aktivita SAT u melounu je znatelně regulována zpětnou inhibicí cysteinu (Saito, 1995). Regulace SAT také probíhá na úrovni genové exprese. U Arabidopsis thaliana v odpověď na světelný a sirný stres se mRNA hromadí asi dvojnásobně (Bogdanova, 1995). Avšak zatímco funkce a role SAT, OAS a OAS-TL v řetězci reakcí při biosyntéze cysteinu byly podrobeny mnoha studiím, předchozí snahy změnit rychlost syntézy cysteinu byly neúspěšné (Saito, 1994). Stále tedy ještě nerozumíme plně přesnému řízení cesty biosyntézy cysteinu, které je součástí kontroverzní diskuse. Proto nebyly doposud dostupné prostředky kontroly obsahu síry v rostlinách, které mohou mít uplatnění v několika směrech v zemědělství.

Technickým problémem podkládajícím tento vynález bylo vyhovět potřebě mít prostředků a způsobů úpravy obsahu sirných sloučenin v rostlinách.

Řešení tohoto technického problému se dosáhne poskytnutím provedení popsaných v nárocích.

Podstata vynálezu

Vynález se tedy týká rekombinantní molekuly DNA, která obsahuje:

(a) molekulu nukleové kyseliny kódující protein, který má serinacetyltransferasovou aktivitu (SAT), a případně (b) molekulu nukleové kyseliny kódující protein, který má cystein-y-syntetasovou aktivitu (CyS);

kde zmíněná molekula (respektive molekuly) je funkčně spojena s regulačními úseky umožňujíc expresi této molekuly (respektive molekul) nukleové kyseliny v rostlinných buňkách.

• ·· · · ···· ·· • · · · « · · · · · • · · · · ···· · • · · · · · ··· ··· ·'·· ·· ·· ·· ···

Výraz „protein, který má serinacetyltransferasovou aktivitu (SAT)“, jak je zde užit, značí, že zmíněný protein je schopný přenosu acetylové skupiny z acetylkoenzymu A na L-serin za tvorby intermediátu biosyntézy cysteinu O-acetyl-L-serin.

Výraz „protein, který má cystein-y-syntetasovou aktivitu (CyS)“ podle vynálezu udává protein schopný katalýzy tvorby L-cystathioninu nebo L-homocysteinu v závislosti na substrátu obsahujícím síru, L-cysteinu nebo sulfidu. Tento protein je také znám jako cystathionin-y-syntetasa. Výrazy „cystein-y-syntetasa“ a „cystathionin-y-syntetasa jsou zde použity jako zaměnitelné. U rostlin obvykle CyS katalyzuje první reakci specifickou pro syntézu methioninu, jmenovitě se jedná o záměnu fosforylového substituentu homoserin-O-fosfátu v gama pozici cysteinem. Cystein je tedy hlavním prekurzorem při biosyntéze methioninu u rostlin.

Podle vynálezu byla kódující sekvence genu cysE z Escheríchia coli (Denk a Bóck, 1987), která kóduje enzym náležející do biosyntézy cysteinu, jmenovitě serinacetyltransferasu (SAT, EC 2.3.1.30), vložena do genomu rostlin brambor řízená 35S promotorem viru mozaiky květáku (CaMV). Aby byl protein nasměrován do chloroplastů, byl cysE translačně fúzován s 5’-signální sekvencí malé podjednotky rubisca (viz příklad 1). U úspěšně transformovaných rostlin byla zaznamenána vysoká akumulace mRNA cysE. Navíc v surových extraktech připravených z listů těchto rostlin byla zaznamenána významně vyšší aktivita SAT, a to až 20krát vyšší v porovnání s rostlinami divokého typu. Transgenní rostliny brambor přeexprimující gen z E.coli vykazovaly dva až třikrát zvýšenou hladinu cysteinu a glutathionu (GSH) v porovnání s kontrolními rostlinami (viz příklad 2). Avšak zvýšení enzymové aktivity SAT a hladiny substrátu pro biosyntézu cysteinu O-acetyl-L-serinu (OAS) překvapivě nemělo žádný vliv na expresi a na aktivitu O-acetylserin(thiol)-lyasy (OAS-TL), což je enzym, který přeměňuje OAS, produkt SAT, na cystein (viz příklady 3 a 4). Jak exprese tohoto genu na úrovni RNA, tak enzymová aktivita zůstaly nezměněny ve srovnání s divokým typem rostlin.

Z těchto pokusů byly vyvozeny následující závěry: na jednu stranu bakteriální SAT z E.coli exprimované v transgenních rostlinách brambor se hromadila jako katalyticky funkční protein v chloroplastech. Na druhou stranu buněčný obsah cysteinu a glutathionu byly výrazně zvýšené v listech transgenních rostlin. Hladiny cysteinu dosahovaly u jednoho z transformantu (SAT-48) téměř trojnásobné hodnoty a u jiného transformantu (SAT-26) dvojnásobně vyšší hodnoty než dosahovala množství nalezená u netransformovaných kontrolních rostlin. To naznačuje, že exprese cysE je zodpovědná za stimulaci syntézy cysteinu. Pokusy provedené v souladu s tímto vynálezem také ukázaly, že oba transformanty měly výrazně zvýšenou hladinu glutathionu, která dosahovala až dvojnásobné hodnoty v porovnání s rostlinami divokého typu. Tyto neočekávané výsledky ukazují, že za normálních podmínek bez jakéhokoli sirného stresu je limitujícím krokem při biosyntéze cysteinu endogenní hladina SAT, alespoň v chloroplastech, kam byla SAT z E.coli směrována. To znamená, že za normálních podmínek je hladina OAS-TL dostatečně vysoká k tomu, aby konvertovala veškerý OAS vzniklý v buňce, takže není limitující pro normální průběh biosyntézy cysteinu. Fakt, že nadměrná exprese SAT v transgenních rostlinách brambor je schopna zvýšit obsah cysteinu a glutathionu, dále znamená, že kroky asimilace síranu, které předcházejí inkorporaci sulfidu do cysteinu, tj. příjem síranu, aktivace síranu a redukce adenosin-5-fosfosíranu (APS), také nejsou za normálních podmínek limitující pro biosyntézu cysteinu. Vypadá to, že rostliny mají dostatečnou kapacitu pro příjem síranu a aktivity pro konverzi síranu na sulfid, aby bylo poskytnuto dostatečné množství redukované síry potřebné k produkci cysteinu. Na závěr je vhodné zmínit, že výsledky prezentované podle vynálezu přímo ukazují spojení mezi volným cysteinem a glutathionem. Zvýšené hladiny cysteinu u transgenních rostlin brambor stimulují biosyntézu glutathionu, což vede k až dvojnásobným hladinám tripeptidu v porovnání s rostlinami divokého typu. To naznačuje, že biosyntéza glutathionu v listech bramboru je limitována dostupností cysteinu. Tyto výsledky také potvrzují nedávné pokusy s topolem (Strohm, 1995; Noctor, 1996).

Jak bylo odhaleno při pokusech provedených podle vynálezu, rostliny disponují dostatečnou kapacitou příjmu síranu a aktivitami ke konverzi síranu na sulfid k poskytnutí dostatečného množství redukované síry potřebné k biosyntéze sloučenin, které obsahují síru. Na základě objevů vynálezu tedy lze očekávat, že zavedení cystein-y-syntetasy, prvního enzymu specifického pro biosyntézu methioninu v transgenních rostlinách, by mohlo vést k výraznému zvýšení obsahu methioninu v rostlinách v porovnání s rostlinami divokého typu. V tomto ohledu je třeba poznamenat, že zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru v rostlinách alespoň o 10% už prokazuje výhodné účinky na rostlinu, například zvýšenou odolnost k abiotickému stresu. Výhodné je, aby byl obsah těchto sloučenin zvýšen o nejméně 50%, velmi výhodně o 100% a zvláště výhodné je zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru více než 1 krát, s výhodou 2krát. Když byla exprimována v rostlinách CyS, bylo za•t ···· znamenáno zvýšení hladiny methioninu 3 až 5krát (Locke, Keystone meeting

6.-11.4.1997, Abstrakt 306 (1997)). Jelikož zavedení SAT má za následek přírůstek substrátu CyS, očekává se po zavedení CyS do rostlin exprimujících SAT z tohoto vynálezu nebo naopak nárůst obsahu sloučenin obsahujících síru je dále zvýšen 1 až 10násobně, s výhodou 5 až 10násobně nebo vyšší.

Ve výhodném provedení vynálezu je u molekuly rekombinantní DNA zmíněným proteinem majícím SAT aktivitu serinacetyltransferasa odvozená z prokaryontů nebo archebakterií. Mezi prokaryontní organismy mohou být zahrnuty gramnegativní, stejně jako grampozitivní bakterie, jako jsou například E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis a různé druhy z rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, přestože mohou být využity i jiné. Například molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny s SAT aktivitou mohou být získány z dosavadní techniky (např. Bogdanova, FEBS Lett. 358 (1995), 43 až 47; Denk, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 515 až 525; Evans, J. Bacteriol. 173 (1991), 5457 až 5469).

Obecně může být molekula nukleové kyseliny kódující protein s CyS aktivitou odvozena z jakéhokoli zdroje materiálu, například z jakékoli rostliny mající takovéto molekuly, s výhodou z jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, zvláště pak z jakékoli rostliny významné v zemědělství, zahradnictví nebo lesnictví, jako jsou plodiny, jmenovitě pak z rodiny Poaceae, jakékoli rostliny produkující škrob, jako jsou brambor, maniok, luskové rostliny, rostliny produkující olej, jako je řepka olejka, len atd., rostliny používající polypeptidy jako zásobní sloučeniny, např. sója, rostliny používající sacharosu jako zásobní sloučeninu, jako je cukrová řepa nebo cukrová třtina, stromy, okrasné květiny, atd., nebo rostliny náležející do rodiny Gramineae. Molekuly nukleové kyseliny kódující cystein-y-syntetasu byly již dříve popsány (například Ravanel, Biochem. J. 331 (1998), 639 až 648 a tam uvedené odkazy).

Dále molekuly nukleových kyselin mohou být použity k hybridizaci na výše popsané molekuly nukleových kyselin a kódování proteinu, který má SAT a CyS aktivitu, samostatně. Takové molekuly nukleových kyselin mohou být izolovány, např. z knihoven jako je cDNA nebo genomové knihovny, technikami známými v oboru. Hybridizující molekuly nukleových kyselin mohou být například identifikovány a izolovány s použitím výše popsaných molekul nukleové kyseliny známých v oboru nebo jejich fragmentů nebo jejich komplementárních řetězců jako průzkum prohledání knihoven hybridizaci s uvedenými molekulami podle standardních způsobů. V úvahu také připadá izolace těchto molekul nukleových kyselin s pomocí polymerázové řetě• ·· ·· ·♦♦· ·· · ·· · · ·· · · · ·· J ···· · fc · · ···*··! ··♦ ···· ·· ·· _ee zové reakce (PCR), kde jako primery jsou použity oligonukleotidy odvozené od výše zmíněných molekul nukleových kyselin. Mezi molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s kteroukoli z výše zmíněných molekul nukleových kyselin, patří také fragmenty, deriváty a alelické varianty výše zmíněných molekul nukleových kyselin, které kódují protein s SAT nebo CyS aktivitou, nebo jejich biologicky aktivní fragmenty. Fragmenty jsou rozuměny části molekul nukleových kyselin, které jsou dostatečně dlouhé na to, aby kódovaly popsaný protein nebo jeho fragment mající výše definovanou biologickou aktivitu.

Výraz „derivát“ v tomto kontextu znamená, že sekvence nukleotidů se liší od výše popsaných molekul nukleových kyselin v jedné či více polohách nukleotidů a je vysoce homologní k výše zmíněným molekulám nukleových kyselin. Homologií je zde rozuměna identita sekvencí z alespoň 40 %, zejména identita z alespoň 60 %, s výhodou více než 80 % a ještě výhodněji 90 %. Odchylky od sekvencí výše zmíněných molekul nukleových kyselin mohou být například způsobeny substitucí (substitucemi), delecí (delecemi), adicí (adicemi), inzercí (inzercemi) a/nebo rekombinací (rekombinacemi), a to buď jednotlivě nebo v kombinaci. To může proběhnout přirozeně nebo to může být vytvořeno dobře známými technikami rekombinantní DNA (viz například techniky popsané v Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates a Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Homologie dále znamená, že příslušné molekuly nukleových kyselin nebo kódované proteiny jsou funkčně a/nebo strukturně ekvivalentní. Mezi molekuly nukleových kyselin, které jsou homologní k výše zmíněným molekulám nukleových kyselin a které jsou deriváty zmíněných molekul nukleových kyselin, patří například varianty zmíněných molekul nukleových kyselin, které představují modifikace se stejnou biologickou funkcí, zvláště pak kódující protein se stejnou nebo v podstatné míře stejnou biologickou aktivitou, jak je to zde definováno. Mohou to být přirozené varianty, jako například sekvence kódující SAT a CyS proteiny z jiných prokaryontů a rostlin, v tomto pořadí, nebo mutanty. Tyto mutanty se mohou vyskytovat přirozeně, nebo mohou být získány mutagenezními technikami (viz výše). Alelické varianty mohou být přirozeně se vyskytující alelické varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vzniklé genetickým inženýrstvím (viz výše). Tak například aminokyselinové sekvence rostlinných SAT sdílí výraznou podobnost s bakteriálními serinacetyltransferasami (Vuorio, 1994; Bogdanova a Hell, 1997). Nejvíce konzervovaný úsek v rámci všech SAT • · · · · · • ·· ···· ·· · · ♦ ·· • ···· ··· • · · · · · · · · · ·· · · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ··' z bakterií i rostlin se nachází na C-konci a předpokládá se, že je zodpovědný za transferasovou aktivitu (Vaara, 1992; Vuorio, 1994). V tomto konzervovaném úseku se nachází hexapeptidový motiv, který byl u bakteriálních acetyltransferas označen za katalytickou doménu a v nedávné době byla také prokázána přítomnost tohoto motivu v místě styku OAS-TL/SAT u cysteinsyntetasoveho komplexu z Arabidopsis thaliana (Bogdanova a Hell, 1997). Navíc mohou být použity v souladu s tímto vynálezem molekuly nukleových kyselin, které kódují homology nebo analogy k výše zmíněným proteinům, které mají SAT nebo CyS aktivitu, ale jinak jsou těmto proteinům nepříbuzné. MalY z E.coli kóduje enzym, který je zapojen do příjmu a metabolismu maltosy a maltodextrinů maltosového systému E.coli, ale má navíc enzymovou aktivitu cystathionin-P-lyasy (viz Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5035 až 5039). Zmíněné proteiny však nejsou vzájemně, na základě porovnání aminokyselinových sekvencí, homologní. Takové proteiny, které nevykazují výraznou homologii k běžným proteinům SAT nebo CyS mohou být identifikovány odborníkem pomocí technik dobře známých v oboru, například komplementací mutantních genů zapojených v biosyntetické cestě cysteinu nebo methioninu, například v odpovídajících mutantních kmenech E.coli (viz také Zdych - viz výše). Proteiny kódované různými deriváty, variantami, homology nebo analogy výše zmíněných molekul nukleových kyselin mohou sdílet společné, specifické vlastnosti, např. molekulovou hmotnost, imunologickou reaktivitu, konformaci, atd., a také fyzikální vlastnosti, jako např. elektroforetickou mobilitu, chování při chromatografii, sedimentační koeficienty, pH optimum, teplotní optimum, stabilitu, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, atd. Všechny tyto molekuly a deriváty nukleových kyselin mohou být použity podle vynálezu, pokud druh enzymové aktivity kódovaného proteinu zůstává v podstatné míře neovlivněn, jmenovitě pokud výsledný protein má SAT a CyS aktivitu, samostatně, jak bylo definováno výše.

U výhodného provedení vynálezu je u rekombinantní molekuly DNA proteinem majícím CyS aktivitu cystein-y-syntetasa z brambor, tabáku, rajčete, řepky olejky nebo Arabidopsis (viz například Kim a Leustek, Plant. Mol. Biol. 32 (1996), 1117 až 1124).

Ve výhodném provedení vynálezu je u rekombinantní molekuly DNA molekula nukleové kyseliny z bodu (a) a/nebo (b) funkčně spojena s nukleotidovou sekvencí kódující tranzitní peptid, který je schopen nasměrovat protein (proteiny) do požadovaného buněčného kompartmentu. Molekula nukleové kyseliny přítomná ·· ···· *·♦· ♦♦ · · · ·· • · ♦ · · · · · • ···· ···· · • · ······· ·♦· ···· ·· ·· «φ _Μι v rekombinantní molekule DNA může být podle vynálezu modifikována takovým způsobem, aby byl kódovaný protein lokalizován do jakéhokoli požadovaného kompartmentu rostlinné buňky. Mezi ně patří endoplazmatické retikulum (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 až 793), vakuola (Neuhaus, PNAS 88 (1991), 10362 až 10366), mitochondrie (Chaumont, Plant Mol. Biol. 24 (1994), 631 až 641), plastidy (Fuhr, EMBO J. 5 (1986), 2063 až 2071), apoplast (von Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3033 až 3044), cytoplasma, atd. Odborníkům jsou dobře známy způsoby provádění těchto modifikací a signální sekvence, které určují lokalizaci do požadovaného kompartmentu. S výhodou je tímto kompartmentem plastid. Jak je popsáno v přiložených příkladech, byl protein se SAT aktivitou směrován do chloroplastu s pomocí translační fúze s 5’-signální sekvencí malé podjednotky rubisca. Je výhodou, když protein mající CyS aktivitu může být koexprimován ve stejném buněčném kompartmentu, například v chloroplastu a tím by měl také zajistit výrazné zvýšení obsahu methioninu v listech rostlin.

Rekombinantní molekula DNA z tohoto vynálezu zahrnuje řídicí sekvence, které umožňují expresi molekul nukleových kyselin v rostlinných buňkách. S výhodou zmíněné regulační úseky obsahují promotor aktivní v rostlinných buňkách. Exprese zahrnuje transkripci molekuly nukleové kyseliny do mRNA, která umožňuje translaci. Odborníkům v oboru jsou dobře známy regulační úseky umožňující expresi v rostlinných buňkách.

Tyto regulační úseky mohou být homologní nebo heterologní s ohledem na molekulu nukleové kyseliny, která má být exprimována, stejně tak jako s ohledem na rostlinný druh, který má být transformován. Obecně takové regulační úseky obsahují promotor aktivní v rostlinné buňce. K dosažení exprese ve všech pletivech transgenní rostliny jsou s výhodou použity konstitutivní promotory, jako je CaMV 35S promotor (Oděli, Nátuře 313 (1985), 810 až 812) nebo promotory polyubichitinových genů z kukuřice (Christensen, Plant. Mol. Biol. 18 (1982), 675 až 689). K dosažení exprese ve specifických pletivech transgenní rostliny lze použít tkáňově specifické promotory (viz například Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245 až 2251). Známé jsou také promotory, které jsou specificky aktivní v hlízách brambor nebo v semenech různých druhů rostlin, jako je např. kukuřice, Vicia, pšenice, ječmen, atd. Indukovatelné promotory mohou být použity za účelem schopnosti přesného řízení exprese. Příkladem indukovatelných promotorů jsou promotory genů kódujících proteiny tepelného šoku. Také regulační úseky specifické pro mikrospory spolu s jejich užitím byly •· ···· popsány (WO96/16182). Dále může být zahrnut chemicky indukovatelný testovací systém (Glatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229 až 237). Další vhodné a odborníkům známé promotory byly popsány (například ve Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361 až 366). Regulační úseky dále mohou obsahovat transkripční a/nebo translační zesilovače, které fungují v rostlinných buňkách. Často používaným rostlinným translačním zesilovačem je například CaMV omega sekvence a/nebo inkluze intronu (například intron-1 z Shrunken genu z kukuřice), u nichž bylo prokázáno až 100násobné zvýšení expresních hladin (Maiti, Transgenic Research 6 (1997), 143 až 156; Ni, Plant. Journal 7 (1995), 661 až 676). Dále mohou regulační úseky obsahovat terminační signály transkripce, jako je poly-A signál, které vedou k přidání póly A konce k transkriptu, což může zvýšit jeho stabilitu. Obvykle použité terminační signály pochází z genu pro nopalinsyntetasu nebo z CaMV 35S RNA genu.

Ve výhodném provedení vynálezu je u molekuly rekombinantní DNA zmíněný promotor indukovatelný nebo konstitutivně exprimovaný a/nebo se jedná o promotor buněčně, tkáňově nebo orgánově specifický. Výhodné je, když se jedná o promotor specifický pro hlízy, semena, endosperm, embryo nebo floém. Mezi nelimitující příklady patří promotor patatinu B33 (specifický pro hlízy, Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23), promotor fazeolinu (specifický pro semena, Karchi, Plant J. 3 (1993), 721 až 727), promotor HMW gluteninu (specifický pro endosperm, Helford, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 117 až 126), promotor a- a β-conglycinu (specifický pro embryo, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991), 602 až 606), promotor rolC (specifický pro floém, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259 až 270).

Tento vynález se také týká vektorů, zvláště pak plasmidů, cosmidů, virů, bakteriofágů a jiných vektorů používaných obecně v genovém inženýrství, které obsahují alespoň jednu molekulu rekombinantní DNA z tohoto vynálezu. Ke konstrukci různých plasmidů a vektorů mohou být použity metody dobře známé odborníkům (viz například techniky popsané v Sambrook, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates a Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Alternativně mohou být molekuly rekombinantní DNA a vektory rekonstituovány do lipozomů pro doručení do cílových buněk.

Výhodou je, když výše popsané vektory z tohoto vynálezu obsahují volitelný a/nebo označitelný signální znak. Geny s volitelným signálním znakem užitečné k selekci transformovaných rostlinných buněk, kalusů, rostlinných pletiv a rostlin jsou • ♦ ♦ ·«··#· ·· ·· · · 9 9 9 9 9 9 dobře známy odborníkům a obsahují například rezistenci k antimetabolitům jako základ selekce na dhfr, která dodává rezistenci vůči metotrexátu (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143 až 149); na npt, která dodává rezistenci vůči aminoglykosidům neomycinu, kanamycinu a paromycinu (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987 až 995) a hygro, která dodává rezistenci vůči hygromycinu (Marsh, Gene 32 (1984), 481 až 485). Byly popsány další volitelné geny, jmenovitě trpB, který umožňuje buňkám využívat indol místo tryptofanu; hisD, který umožňuje buňkám využívat histinol místo histidinu (Hartman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfátisomerasa, která umožňuje buňkám využívat manosu (WO94/20627) a ODC (ornitindekarboxylasa), která dodává rezistenci vůči inhibitorům ornitindekarboxylasy 2-(difluormetyl)-DL-ornitinu, DFMO (McConlogue, 1987, v: Current Communications in Molecular Biology, vydavatelství Cold Spring Harbor Laboratory) nebo deaminasa z Aspergillus terreus, která dodává rezistenci vůči Blasticidinu S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336 až 2338). Užitečné hodnotící znaky jsou také odborníkům dobře známy a jsou komerčně dostupné. S výhodou je užit coby hodnotící znak gen kódující luciferasu (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59 až 72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), zelený fluorescenční protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44 až 47) nebo β-glukuronidasu (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901 až 3907). Toto provedení je zvláště výhodná při jednoduchém a rychlém sledování buněk, pletiv a organizmů obsahujících vektor z tohoto vynálezu.

Zvláště výhodné použití pro molekuly rekombinantní DNA podle vynálezu tkví v jejich použití pro genetickou manipulaci rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin za účelem zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru a k získání rostlin s modifikovanými, s výhodou se zlepšenými nebo užitečnými fenotypy. Tento vynález tedy poskytuje metodu výroby transgenních rostlin, rostlinných buněk nebo rostlinného pletiva se zavedením alespoň jedné molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru z tohoto vynálezu do genomu zmíněných rostlin, rostlinných buněk nebo rostlinného pletiva.

Způsoby zavedení cizí molekuly DNA do rostlin jsou také velmi dobře známy v oboru. Patří sem například transformace rostlinných buněk, rostlinného pletiva nebo rostlin pomocí T-DNA při použití Agribacteria tumefaciens nebo Agrobacteria rhizogenes, fúze protoplastů, přímý přenos genů (viz například EP-A 164 575), injekce, elektroporace, bíolistické metody jako je bombardování částicemi a jiné způsoby známé v oboru. Vektory, které jsou použity ve způsobu podle vynálezu, mohou ob-

* ·· • · * ♦ • ·	4« ··«· • · · • · ·	• « ·
• · • ·	• · •
• ·	• · · ·	• ·	•
♦ · · ···♦	• « ♦ *	• <	• · ·

sahovat další funkční úseky, například sekvence „levého okraje“ a „pravého okraje“ T-DNA Agrobacteria, které umožní stabilní integraci do rostlinného genomu. Dále jsou odborníkům známy vektory a způsoby, které umožňují výrobu transgenních rostlin, které neobsahují signální znaky, tj. gen s volitelným nebo označitelným signálním znakem je ztracen v určité fázi vývoje rostliny nebo při křížení rostlin. Toho je možné dosáhnout například kotransformací (Lyznik, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151 až 161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91 až 104) a/nebo s použitím systémů, které využívají enzymy schopné podpořit homologní rekombinaci u rostlin (viz například WO97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353 až 361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653 až 657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170 až 176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373 až 6378). Způsoby přípravy vhodných vektorů jsou popsány například v Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. vydání (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Vhodné kmeny Agrobacteria tumefaciens a vektory stejně tak jako transformace Agrobacteria a vhodná růstová a selekční prostředí jsou odborníkům dobře známé a byly již dříve popsány (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383 až 396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467 až 8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963 až 976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies. v: Plant Molecular Biology Manual díl 2., Gelvin and Schilperoort (vydavatelé), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academie Publ. (1994), 1 až 22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector Systém, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), kapitola V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1 až 46; An, EMBO J. 4 (1985), 277 až 287). Přestože je výhodné použít Agrobacteria tumefaciens ve způsobu vynálezu, mohou být použity jiné kmeny Agrobacteria, jako Agrobacterium rhizogenes a to například tehdy, je-li požadován fenotypu daného kmene.

Metody transformace s použitím biolistických metod jsou odborníkům dobře známy; viz například Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37 až 48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553 až 1558 a Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423 až 431. Může být provedena mikroinjekce, jak je to popsáno v Potrykus a Spangenberg (vydavatelé), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

· • 4· 4* ·44*·· • ♦ · » · e ·· • · · · · *· t • 44*· « 4444 ·· »··«·<· • 44 ·«·♦· 44 4· 4« «φφ

Transformace většiny dvouděložných rostlin je možná s použitím výše popsaných metod. Ale také pro transformaci jednoděložných rostlin bylo vyvinuto několik úspěšných technik. Sem patří transformace s použitím biolistických metod, například jak byly popsány výše, podobně jako transformace protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, zavedení DNA s použitím skleněných vláken atd.

Obecně mohou být rostliny, rostlinné buňky a rostlinné pletivo, které je možné modifikovat rekombinantní molekulou DNA nebo vektorem podle vynálezu a které vykazují (vyšší) expresi proteinů se SAT, případně CyS aktivitou, samostatně, odvozeny od jakéhokoli rostlinného druhu. Mohou to být jednoděložné nebo dvouděložné rostliny. Ve výhodném provedení tyto patří do rostlinných druhů výhodných pro zemědělství, lesnictví, nebo okrasné květiny. Jedná se například o plodiny (tj. kukuřice, rýže, ječmen, pšenice, žito, oves, atd.), brambory, rostliny produkující olej (tj. řepka olejka, slunečnice, podzemnice olejná, sója, atd.), bavlník, cukrová třtina, cukrová řepa, luskové rostliny (tj. fazole, hrášek, atd.), rostliny produkující dřevo, s výhodou stromy, atd.

Tento vynález se tedy také týká transgenních rostlin obsahujících ve svém genomu stabilně integrovanou molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která je spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi nukleové kyseliny v rostlinné buňce, a kde molekula nukleové kyseliny je cizí pro transgenní rostlinu.

Termínem „cizí“ je zde myšleno, že daná molekula nukleové kyseliny je heterologní vzhledem k rostlinné buňce, to znamená, že je odvozena z jiného organismu s jiným genomovým původem, nebo je homologní vzhledem k rostlinné buňce, ale je lokalizována v jiném genomovém prostředí než je přirozeně se vyskytující protějšek této molekuly. To znamená, že jestliže je molekula nukleové kyseliny homologní vzhledem k rostlinné buňce, pak není umístěna v její přirozené pozici v genomu zmíněné rostlinné buňky, zejména je obklopena jinými geny. V tomto případě může být molekula nukleové kyseliny řízena jejím vlastním promotorem nebo je řízena heterologním promotorem. Vektor nebo rekombinantní DNA molekula z tohoto vynálezu, která je přítomna v hostitelské buňce, může být buď integrována do genomu hostitelské buňky nebo může být udržována v nějaké formě vně chromozomů.

Alternativně může být rostlinná buňka, která má molekulu (molekuly) nukleové kyseliny kódující protein se SAT a případně CyS aktivitou přítomnou ve svém genomu, použita a upravena tak, že zmíněná rostlinná buňka exprimuje endogenní gen(y) odpovídající těmto nukleovým kyselinám řízeným heterologním promotorem ·· · · 9 9 9 9 999 • 9 9 9 9 9 99 • 9 9 9 9 9 9 9 9· • · ·«····· ······· · · ·· ·a 99 9 a/nebo zesilovacími úseky. Zavedení heterologního promotoru a uvedených úseků, které neřídí přirozeně expresi nukleové kyseliny kódující jakýkoli z výše popsaných proteinů, s použitím například genově cílených vektorů, může být provedeno standardními metodami, viz výše a například Hayashi, Science 258 (1992), 1350 až 1353; Fritze a Walden, Gene activathion by T-DNA tagging. v: Methods in Molecular Biology 44 (Gartland, K.M.A. a Davey, M.R., vydavatelé). Totowa: Human Press (1995), 281 až 294) nebo transpozonovým značením (Chandlee, Physiologia Plantarum 78 (1990), 105 až 115). Mezi vhodné promotory a další regulační úseky, jako např. zesilovače, patří ty, které zde byly výše jmenovány.

Přítomnost a exprese molekul(y) nukleových kyselin přítomných v molekule rekombinantní DNA nebo vektoru v transgenní rostlinné buňce vede k syntéze proteinů, což má vliv například na odolnost rostlinných buněk vůči stresu a vede k odpovídajícím fyziologickým a fenotypovým změnám u rostlin, které obsahují takové buňky. Jak je popsáno v připojených příkladech, je u rostlin, které exprimují konstitutivně SAT z E.coli, vysoká hladina cysteinu. Navíc byl v porovnání s rostlinami divokého typu významně vyšší obsah tripeptidu glutathionu (γ-glutamylcysteinylglycin), protože tato sloučenina je hlavní zásobní formou redukované síry v rostlinné říši a slouží jako hlavní odvod vyrobeného cysteinu. Kromě toho, že glutathion hraje zásadní roli při regulaci příjmu sirných živin, je také důležitým faktorem při obraně rostlin proti různým druhům stresu, včetně vysokých intenzit osvětlení, sucha, zimy, tepla a nedostatku minerálů (Smith, 1990; Rennenberg a Brunold, 1994). Tento tripeptid je v rostlině, stejně jako v jiných organismech syntetizován ve dvou enzymově katalyzovaných reakcích ze základních aminokyselin (Meister a Anderson, 1983; Rennenberg, 1995).

Jak bylo zmíněno výše, cystein-y-syntetasa je schopna využívat cystein jako substrát obsahující síru. Jelikož bylo demonstrováno v tomto vynálezu, že transgenní rostliny vysoce exprimující protein se SAT aktivitou mají významně vyšší obsah cysteinu, koexprese molekuly nukleové kyseliny kódující protein s CyS aktivitou by tedy měla vést k synergickému účinku při tvorbě methioninu, protože jak klíčový enzym biosyntézy methioninu, tak jeho substrát jsou v rostlině produkovány v nadměrném množství. Proto ve výhodné podobě vynálezu zmíněná rostlina obsahuje rekombinantní molekulu (molekuly) DNA, která obsahuje:

(a) molekulu nukleové kyseliny kódující protein, který má serinacetyltransferasovou aktivitu (SAT) a • · « · · · ··· ··· ···· ·· ·· ·· ··· (b) molekulu nukleové kyseliny kódující protein, který má cystein-y-syntetasovou aktivitu (CyS);

kde zmíněná molekula (molekuly) nukleové kyseliny je Osou) funkčně propojena (propojeny) s regulačními úseky, které byly popsány výše.

Jak je odborníkovi okamžitě jasné, může rekombinantni molekula DNA z tohoto vynálezu nést molekuly nukleovýh kyselin definovaných v bodech (a) a (b) samostatně nebo v kombinaci. Totéž platí pro zmíněné vektory z tohoto vynálezu, stejně jako pro rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny jimi transformované. Podobně mohou být zmíněné molekuly nukleových kyselin řízeny stejnými regulačními úseky nebo může být samostatně řízena exprese. V tomto směru odborník ihned ocení, že molekuly nukleových kyselin kódující proteiny s aktivitami SAT a CyS, samostatně, mohou být exprimovány ve formě jediné mRNA jako trankripčních a případně translačních fúzí. To znamená, že proteiny s aktivitami SAT, respektive CyS, jsou produkovány jako jednotlivé polypeptidy, nebo v druhém případě v podobě fúzního polypeptidu, který je dále zpracovánán za vzniku jednotlivých proteinů, například štěpícím místem pro proteinasy, které bylo začleněno mezi aminokyselinové sekvence obou proteinů. Samozřejmě mohou být proteiny s SAT, respektive CyS aktivitou exprimovány jako bi- nebo multifunkční polypeptid, s výhodou propojený peptidovým spojovníkem, který výhodně poskytuje dostatečnou flexibilitu obou proteinů. S výhodou spojovník obsahuje více hydrofilních aminokyselin, které jsou navázány na peptid, a jeho délka je dostatečná k překlenutí vzdálenosti od C-konce jednoho ze zmíněných proteinů k N-konci druhého ze zmíněných proteinů, když tento polypeptid zaujme konformaci vhodnou pro biologickou aktivitu obou proteinů při umístění do vodného prostředí rostlinné buňky. Dále mohou molekuly rekombinantni DNA a vektory z tohoto vynálezu obsahovat další geny kódující jiné proteiny zapojené do biosyntézy cysteinu a/nebo methioninu. Příklady výše zmíněných expresních strategií lze nalézt v literatuře, např. pro dicistronické mRNA (reiniciace) v Hefferon, J. Gen. Virol. 78 (1997), 3051 až 3059, fúzní proteiny jsou popsány v Brinck-Peterson, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 611 až 620 a Hotze, FEBS Lett. 374 (1995), 345 až 350; bifunkční proteiny jsou popsány v Lamp, Biochem. Biophys. Res. Corn. 244 (1998), 110 až 114 a Dumas, FEBS Lett. 408 (1997), 156 až 160 a spojovací peptidy a proteasy jsou popsány v Doskeland, Biochem. J. 313 (1996), 409 až 414.

Ve výhodné podobě vynálezu obsahuje transgenní rostlinná buňka selekční znak. Jak bylo uvedeno výše, je možné užít různé selekční znaky podle vynálezu.

• · · ·

Výhodné je použití selekčních znaků, které jsou vhodné pro přímou selekci transfor movaných rostlin, např. gen pro fosfinotricin-N-acetyltransferasu, jehož produkt deto xifikuje herbicid L-fosfinotricin (glufosinát nebo BASTA); viz například De Block,

EMBO J. 6 (1987), 2513 až 2518 a Dróge, Planta 187 (1992), 142 až 151.

Dále se tento vynález vztahuje na transgenní rostliny a rostlinná pletiva, která obsahují výše popsané transgenní rostlinné buňky nebo buňky, které je možné získat s použitím výše popsaných metod. Ty mohou například vykazovat zvýšenou odolnost vůči stresu. Je výhodné, když je v transgenních rostlinách podle vynálezu zvýšená hladina glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu v porovnání s rostlinami divokého typu. Vzrůstem hladiny glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu se rozumí zvýšení hladiny kterékoli zmíněné sloučeniny obsahující síru, a to buď samostatně nebo v kombinaci v transgenních rostlinných buňkách, rostlinném pletivu nebo rostlinách podle vynálezu a to řádově alespoň o 10 % ve srovnání s odpovídajícími netransformovanými rostlinnými buňkami, pletivem nebo rostlinou divokého typu, které již poskytují užitečné účinky na vitalitu rostliny, jako je např. zvýšená odolnost vůči stresu. S výhodou je obsah výše zmíněných sloučenin zvýšen o nejméně 50 %, výhodněji o 75 %, ve zvláště výhodném provedení o nejméně 100 % nebo více a ještě výhodněji o více než asi 200 %. Vzhledem k celkovému obsahu cysteinu, methioninu a glutathionu je možné dosáhnout od 10- do 20násobného zvýšení obsahu látek obsahujících síru v porovnání s hladinou volného cysteinu u rostlin divokého typu, přestože se předpokládá možnost ještě většího zvýšení hladiny látek obsahujících síru u rostlin z tohoto vynálezu.

S výhodou hladina volného cysteinu u rostlin podle vynálezu dosahuje hodnoty vyšší než 20 nmol/g živé váhy (gfw) listového pletiva, výhodně vyšší než 30 nmol/gfw a výhodněji vyšší než 40 nmol/gfw (viz také Příklad 2). Dále obsah glutathionu u rostlin podle vynálezu může být s výhodou 350 nmol/gfw, výhodněji vyšší než 500 nmol/gfw. Obsah methioninu může být zvýšen asi 5krát, s výhodou více než 10křát.

V dalším ohledu se tento vynález týká zpracovatelných částí a propagačního materiálu transgenních rostlin podle vynálezu, které obsahují výše popsané transgenní rostlinné buňky, tj. alespoň jednu molekulu rekombinantní DNA nebo vektor podle vynálezu a/nebo které jsou odvozeny od výše popsaných rostlin a vykazují zvýšené hladiny obsahu sloučenin obsahujících síru, jak je popsáno výše. Zpracovatelné části mohou být v principu užitečné části rostliny, např. listy, stonky, plody, • · · · • · · · · · · · • * · · · · · · · 0 • · ···· ··· ······» »· ·· ·· ··· semena, kořeny, atd. Propagační materiál zahrnuje např. semena, plody, řízky, klíčky, hlízy, oddenky, atd.

Dále se tento vynález týká použití alespoň jedné molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru podle vynálezu k výrobě transgenních rostlin, které vykazují zvýšenou hladinu glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu. S výhodou se odráží zmíněná zvýšená hladina methioninu nebo cysteinu ve zrychlených procesech zrání, pozměněných květech a/nebo odolností k patogenům.

Konstitutivní exprese genu SAT cysE z E.coli v transgenních rostlinách brambor přímo ukazuje in vivo, že reakce katalyzovaná SAT je opravdu rychlosti imitující pro biosyntézu cysteinu u rostlin, jak je to ukázáno vysokými hladinami cysteinu u transformantů (viz přiložené příklady). Dále, jak bylo diskutováno výše, se očekává, že odpovídající vysoké hladiny glutathionu v transgenních rostlinách jsou schopny dodat odolnost vůči různým druhům stresu. U rostlin hraje glutathion důležitou roli při obraně proti aktivnímu kyslíku, xenobiotikům, těžkým kovům a jiným formám stresu, včetně sucha, tepla a nedostatku minerálů (Alscher, 1989; Smith, 1990; Schmidt a Jáger, 1992; Rennenberg a Brunoldt, 1994; Rennenberg, 1995). Znalost tohoto má také praktickou důležitost. Vyšší odolnost rostlin vůči aktivnímu kyslíku může v budoucnu hrát velmi důležitou roli, když bereme v úvahu zvýšenou koncentraci ozonu v atmosféře. Navíc i zvýšená odolnost proti xenobiotikům, například herbicidům, coby výsledek zvýšené hladiny glutathionu u rostlin podle vynálezu je přiměřená. Dále, možnou strategií je konstrukce transgenních rostlin, které jsou schopny růst na vysokých koncentracích těžkých kovů a které by tudíž byly použitelné při bioremediacích. Dále by mohly být rekombinantní molekuly DNA a vektory podle vynálezu užitečné pro úpravu nebo modifikaci interakcí patogenu a rostliny. Výraz „patogen“ zahrnuje například bakterie, viry, houby či protozoa.

Transgenní rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny podle vynálezu mohou být použity, jak již bylo popsáno výše, ke zmírnění toxických následků polutantů v půdě včetně vodní ekonomie. Přítomnost polutantů může být přirozená nebo může být způsobena těžbou, průmyslem nebo urbanistickými aktivitami. Mezi takové polutanty patří ty, které jsou schopny inaktivovat proteiny obsahující síru, zejména enzymy, nebo fungují jako antagonisti či inhibitory biosyntézy cysteinu a/nebo methioninu. Příklady takových antagonistů nebo inhibitorů jsou herbicidy, fungicidy, pesticidy a zvláště pak ionty kovů, například Hg²⁺. Zvýšená hladina GSH způsobená expresí molekul nukleových kyselin obsažených v rekombinantních DNA molekulách a • · · · • · · · · 9 · ··»» * ···» ··» • « · · · ··«· · • · · · · · · · · e·· ···· ·· ·· ·· ··· vektorech podle vynálezu ve výše popsaných rostlinách může například umožnit zemědělské využití půdy, která by byla jinak nevhodná kvůli přítomnosti toxických sloučenin, které např. interferují s enzymy obsahujícícmi síru a tudíž s rostlinným růstem. Toto platí zejména pro půdu, která obsahují velké množství těžkých kovů. Navíc mohou být rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny podle vynálezu využity k remediaci půd kontaminovaných polutanty. Výhodný vedlejší účinek tkví vtom, že například zvýšená odolnost rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin z tohoto vynálezu vůči kovům, způsobená přítomností molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru z tohoto vynálezu, může být využita k „biotěžbě“ (Cunningham, TIBTECH 13 (1995), 393 až 397). To znamená, že rostliny, rostlinná pletiva a rostlinné buňky z tohoto vynálezu mohou být využity k fytoextrakci kovů, např. rtuti, niklu a mědi. Navíc, jak bylo zmíněno výše, vyšší obsah GSH v rostlinných buňkách, rostlinných pletivech a rostlinách podle vynálezu může způsobit zvýšení odolnosti. Dále se očekává zlepšený růst klíčků a zlepšenou produkci biomasy v důsledku vysoké hladiny GSH přítomné u výše popsaných rostlinných buněk nebo rostlinných pletiv a rostlin. Souhrnně řečeno, zvýšení obsahu GSH má mnohočetný účinek na vitalitu rostlin a je velmi důležité pro pěstitele rostlin.

Navíc nadměrná exprese cystein-y-syntetasy u rostlin v kombinaci s molekulou nukleové kyseliny kódující SAT v transgenních rostlinných buňkách, rostlinném pletivu a rostlinách podle vynálezu má za následek zvýšení hladiny volného i vázaného methioninu v rostlinách, což je zvláště výhodné z hlediska potravin a krmiv, protože methionin je esenciální aminokyselina a je obvykle přítomen v potravě a krmivech pouze v nízkých množstvích, a tudíž tyto potraviny a krmivá nejsou vhodnými zdroji této aminokyseliny pro lidi a zvířata. Rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny, stejně jako jejich zpracovatelné části a/nebo propagační materiál, mohou být tedy použity jako potrava, krmivá nebo přísady do nich. Vzrůst obsahu methioninu může dále urychlovat procesy zrání a kvetení a také posilovat obranyschopnost proti patogenům. Vysoký obsah methioninu v rostlinách z tohoto vynálezu nebo v jejich zpracovatelných částech i v jejich propagačním materiálu také výrazně přispívá k atraktivní chuti různých potravinářských produktů, jako je upečený chleba, pražená káva atd.

Tento vynález se tedy v dalším provedení týká použití molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který má SAT aktivitu, nebo alespoň jedné molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru z tohoto vynálezu, rostlinných buněk, rostlinných tkání a ·· • •44 • · · 4 · · · * ·· · t· 4 · 4 4 4· • · 4 4 4 » 4 4· • 4 ·······

4444444 «4 44 «4444 rostlin z tohoto vynálezu, nebo jejich zpracovatelných částí nebo propagačního materiálu k výrobě potravin, krmiv pro zvířata, ke zlepšení obranyschopnosti proti patogenům, k vytvoření odolnosti vůči těžkým kovům nebo herbicidům, ke zlepšení tvorby biomasy, k posílení růstu klíčků, k vytvoření odolnosti vůči biotickému i abiotickému stresu nebo ke zlepšení chuťových vlastností a/nebo vůně potravin nebo krmiv. Použití molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru podle vynálezu k vytvoření odolnosti k herbicidům zahrnuje například jejich použití jako volitelných signálních znaků v rostlinách v souladu s jinými systémy, které využívají (nadměrnou) expresi enzymů schopných dodat odolnost (tj. rezistenci) vůči účinku herbicidu ničícímu rostlinnou buňku. Příkladem takového systému je vysoká exprese enzymu 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsytetasy (EPSPsytetasy), který navozuje odolnost vůči herbicidu glyfosfátu. Podobným způsobem mohou být použity molekuly rekombinantní DNA a vektory z tohoto vynálezu k navození odolnosti vůči sloučeninám, které působí na enzymy obsahující síru např. izolací sloučeniny zodpovědné za inhibici zmíněných enzymů vysokým obsahem cysteinu, GSH a/nebo methioninu nebo pomocí peptidů a proteinů přítomným ve vysokém obsahu díky zvýšenému obsahu aminokyselin obsahujících síru.

Jak bylo popsáno výše, nutriční hodnota rostlin, rostlinných pletiv a rostlinných buněk podle vynálezu, stejně jako nutriční hodnota zpracovatelných částí a propagačního materiálu takových rostlin je výrazně zlepšena v souvislosti se zvýšeným obsahem sloučenin obsahujících síru. Tento vynález se tedy také týká krmiv a potravin nebo jejich přísad, které obsahují rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny, zpracovatelné části nebo propagační materiál z tohoto vynálezu. Tyto potraviny, krmivá a přísady mají s výhodou zvýšený obsah cysteinu, methioninu a/nebo glutathionu, jak bylo popsáno výše.

Tyto a další provedení vynálezu jsou popsány a zahrnuty popisem a příklady tohoto vynálezu. Dále literatura týkající se kteréhokoli způsobu, použití a sloučeniny k využití podle tohoto vynálezu může být získána z veřejných knihoven, s použitím např. elektronických zdrojů. Může být použita například veřejná databáze „Medline“, která je přístupná na internetu, například na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Další databáze a adresy, jako např. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, jsou známy odborníkům a mohou být získány i prostřednictvím např. http://www.lycos.com. Přehled • ·· ··«··· ·· · • · · * · · · ···· • · ······· ······» · · · φ ·· · · · informací ο patentech z oblastí biotechnologie a přehled relevantních zdrojů informací o patentech, které jsou užitečné pro zpětné hledání a nejnovější znalosti je v Berks, TIBTECH 12 (1994), 352 až 364.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 (a) Analýza celkové RNA extrahované z listů pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT-65, 26, 48, 3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b) s pomocí Northern blotu. Blot byl testován DNA cysE z E.coli, značenou ³²P. Jednotlivé běhy obsahovaly každý 15 pg celkové RNA.

(b) Maximální katalytická aktivita SAT v listech pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT-65, 26, 48, 3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b). Specifická aktivita surových extraktů je dána v pmol vytvořeného CoA za minutu na pg celkového proteinu. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10 %). N = 4 nezávislá měření.

Obrázek 2 (a) Endogenní hladiny cysteinu v listech 6 týdnů starých transgenních rostlin (SAT-48 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Množství cysteinu je dáno v nmol na gfw. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 20). N = 18; 6 nezávislých rostlin na transgenní linii, 3 nezávislá měření na jednu rostlinu.

(b) Endogenní hladiny glutathionu v listech 6 týdnů starých transgenních rostlin (SAT-48 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Množství glutathionu je dáno v nmol na gfw. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10). N = 18; 6 nezávislých rostlin na transgenní linii, 3 nezávislá měření na jednu rostlinu.

Obrázek 3

Analýza celkové RNA extrahované z listů pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT-65, 26, 48, 3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b) s pomocí Northern blotu. Blot byl testován cDNA OAS-TL (p), značenou ³²P, a také cytosolickou isoformou (c). Jednotlivé běhy obsahovaly každý 15 pg celkové RNA.

• ·» · · ···· ·· • 9 9 · ·· 9 9 99

9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9999999 99 99 99999

Obrázek 4

Aktivita OAS-TL in vitro v listech transgenních rostlin (SAT-48 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Specifická aktivita surových extraktů je dána v pmol vytvořeného cysteinu za minutu na pg celkového proteinu. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10 %). N = 4 nezávislá měření na jednu rostlinu.

Příklady provedení vynálezu

Příkad 1

Hledání transgenní rostliny bramboru, který obsahuje mRNA SAT z E.coli

K nasměrování SAT z E.coli do chloroplastů rostlin byla zkonstruována fúze s transitním peptidem rubisca z Arabidopsis. SAT z genomové knihovny E.coli byl amplifikován s pomocí PCR s použitím dvou syntetických oligonukleotidů (EcSAT-N: 5'-GAG AGA CCA TGG CGT GTG AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C: 5'- GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA). Dvojřetězcová DNA byla štěpena enzymy Nco I a Xba I a klonována za transitní peptid. Fúzovaný genový produkt byl vložen jako Asp 718/Xho I fragment do binárního vektoru předem naštěpeného enzymy Asp718/Sa/I (Hófgen a Willmitzer, 1990) pod kontrolu promotoru 35S-CaMV. Plasmid byl vložen do brambor s použitím Agrobacteria tumefaciens (Solanum tuberosum cv Désirée), jak bylo popsáno v Rocha-Sosa a kol. (1989). Solanum tuberosum bylo získáno od Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, SRN). Rostliny divokého typu a transgenní rostliny byly drženy ve tkáňové kultuře, v cyklu 16 hod. světlo/8 hod. tma, na médiu podle Murashige a Skooga (Murashige a Skoog, 1962), ke kterému byla přidána 2% (hmotn./obj.) sacharosy při 22 °C. Ve skleníku byly rostliny kultivovány při 22 °C v průběhu světelné periody (16 hod) a při 15 °C v průběhu temné periody (8 hod.). Rostliny byly kultivovány v samostatných květináčích a kontinuálně zalévány.

Transgenní rostliny brambor uchovávané ve formě tkáňové kultury byly vizuálně nerozeznatelné od netransformovaných kontrolních rostlin. Při hledání rostlin exprimujících mRNA SAT z E.coli bylo náhodně vybráno padesát rostlin, kterým byl odebrán vzorek listu. Tyto vzorky byly podrobeny analýze za pomoci blotování RNA • · · ·· ···« ·· • · > · «· · » ♦ · · · * ♦ 9 9 • · · · · · ··· «······ 9 9 9 9 · · · · · gelu s použitím radioaktivně značené sondy z cDNA SAT z E.coli. Pro izolaci RNA byly vzorky listů zmraženy v tekutém dusíku ihned po odebrání. Celková RNA byla extrahována ze zmraženého materiálu podle Logemann a kol. (1987). Po denaturaci při 65 °C byla celková RNA separována za denaturujících podmínek gelovou elektroforézu (Lehrach, 1977) a poté přenesena na nylonové membrány. Northern hybridizace byla provedena při vhodné teplotě podle popisu v Amasino (1986). Northern bloty byly třikrát promyty po třiceti minutách při 55 °C v 0,5 x SSC; 0,2% SDS. Značení fragmentů fosforem ³²P bylo provedeno s použitím „Multiprime DNA-labellingKit“ (Amersham Buchler, Braunschweig, SRN). Pět nezávislých transformantů, které akumulovaly vysoké množství cizí SAT mRNA, bylo vybráno k dalším analýzám a přeneseno do skleníku. Opakované Northern analýzy ukázaly, že i ve skleníku akumulují transformanty velké množství cizí mRNA (Obr. 1a). Délka transkriptu detekovaného u transgenních rostlin bramboru («1050 párů bází) souhlasila s délkou zaznamenanou pro gen cysE, jmenovitě 819 pb (Denk a Bóck, 1987) a použitou sekvencí rubisca (« 240 pb). K měření enzymové aktivity SAT byla použita metoda podle Krediche a Tomkinse (1966). Tato metoda je založena na výměně disulfidu mezi CoA, uvolněným z acetylového zbytku v průběhu reakce katalyzované SAT, a 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou. Tvorba CoA byla analyzována v 50 mM Tris-HCI (pH 7,6), obsahující 1 mM 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoové) kyselině, 1 mM EDTA, 20 mM L-serinu a 100 μΜ acetylCoA. Reakce byla startována přídavkem 10 μΙ surového extraktu z listů (1,5 μ9/μΙ celkového proteinu), teplota inkubace reakce byla 25 °C. Tvorba thiobenzoové kyseliny byla monitorována spektrofotometricky při 412 nm (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) proti slepému kontrolnímu vzorku, který obsahoval veškerý materiál s výjimkou L-serinu. Kalibrační křivka byla sestrojena s kontrolními roztoky obsahujícími veškerý materiál a rozdílné koncentrace CoA (0 až 200 nmol/ml). Měření aktivity bylo nezávisle opakováno s různými objemy surového extraktu z listů, tj. 20, 40 a 60 μΙ. Analýza aktivity SAT v surových extraktech listů ukázala, že rostliny brambor, které exprimují gen z E.coli, konvertují serin na OAS mnohem efektivněji, než je tomu u netransformovaných kontrolních rostlin (Obr. 1b). Tento fakt naznačuje, že transformované rostliny disponují vyšší aktivitou SAT, a to pravděpodobně v důsledku cizí serinacetyltransferasy z E.coli. Navzdory silnému zvýšení aktivity SAT v listech transgenních rostlin nebyla vizuálně pozorována žádná dramatická změna ve fenotypu těchto rostlin s jedinou výjimkou: u transformantů 48 byla snížena apikální dominance, která měla · · · · · · · ·9 9 • 9 9 4 44 4 9 4· »«4· · · ·· φ • 4 44*···· ·····♦· 44 4* · * · 4 · za následek keřovitý fenotyp. Zajímavostí je, že transformant 48 měl ze všech transgenních rostlin nejvyšší aktivitu SAT.

Příklad 2

Exprese genu cysE vede ke vzrůstu endogenních hladin cysteinu a glutathionu

Biosyntéza cysteinu v rostlinách probíhá dvoustupňovou reakcí. Tvorba cysteinu ze sulfidu a O-acetyl-L-serinu je katalyzována O-acetylserin(thiol)lyasou. O-acetyl-L-serin je syntetizován serinacetyltransferasou z acetylkoenzymu A a šeřinu (Brunold a Rennenberg, 1997). Aby mohl být zjištěno, zda má exprese genu cysE v rostlinách brambor vliv na endogenní hladinu cysteinu, byla měřena koncentrace této aminokyseliny obsahující síru u transformovaných a netransformovaných rostlin. Thioly byly připraveny podle Ruegseggera a Brunolda (1992). Separace a kvantifikace byly provedeny na HPLC s obrácenými fázemi po derivatizaci monobromobimanem, jak je popsáno v Newton a kol. (1981). Jako modifikace byla provedena redukce disulfidů bis-2-merkaptoethylsulfonem a značící reakce s monobromobimanem byla zastavena 15% HCI.

Zmrazený materiál listů byl homogenizován na jemný prášek, a poté extrahován 20 min v 0,1 N HCI (2 ml/0,2 gfw) při 4 °C. Po centrifugaci směsi při 4 °C (20 min, 14 000 g) bylo přidáno 120 pl supernatantu přidáno k200pl 0,2 M

2-(cyklohexylamino)ethansulfonové kyselině (pH 9,3). Redukce všech disulfidů byla provedena přidáním 10 pl bis-2-merkaptoethylsulfonu v 9 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 8). Reakce byla ponechána 40 minut při pokojové teplotě, a pak byly volné thiolové skupiny obarveny monobromobimanem. Za tímto účelem bylo k reakční směsi přidáno 20 μΙ 15 mM monobromobimanu v acetonitrilu, a to bylo pak ponecháno 15 minut v temnu při pokojové teplotě. Reakce byla zastavena přídavkem 250 μΙ 15% HCI. Reakční směs byla 2 hodiny ponechána na ledu v temnu, pak znovu zcentrifugována při 4 °C (10 minut, 14 000 g). Supernatant byl zředěn vhodným množstvím 0,1 N HCI, aby mohla být provedena analýza cysteinu a glutathionu. Vzorky byly analyzovány metodou podle Schuppa a Rennenberga (1988) s použitím HPLC kolony s obrácenými fázemi (Cia, 250 x 4 mm, velikost částic 5 pm, Macherey-Nagel, Oensingen, Švýcarsko). Byl použit rozpouštědlový systém obsahující 10% methanol; 0,25% kyselinu octovou, pH 3,9 (NaOH) a 90% methanol; 0,25% kyselina octovou s průtokem 1,5ml/min. Po chromatografii následovala fluorescenční detekce (exci- • · · · · · · · · · · • · # ♦ · · · · · · • · 9 · · · » · · * ·· ···· · · · ······· ® · · * ·· · · · táce při 380 nm, emise při 480 nm, fluojjlcenční detektor SFM 25, Kontron, Zůrich, Švýcarsko). Chromatogramy byly kvantifikovány integrací ploch pod píky. K analýze cysteinu byly použity dva transformanty s nejvyšší hladinou aktivity SAT, tj. SAT-48 a SAT-26 (viz obr. 2b). Za tímto účelem byly zpracovány a extrahovány mladé, zelené listy z pět týdnů starých rostlin a obsah cysteinu byl změřen za pomoci HPLC. Trangenní rostliny brambor, které exprimovaly gen cysE z E.coli vykazovaly výrazně zvýšené hladiny cysteinu (viz obr. 3a). Hladiny u transformantu SAT-48 dosahovaly skoro trojnásobku (45+10 nmol na gram čerstvé váhy listového pletiva) a u transformanta SAT-26 dvojnásobku (33 ± 6 nmol/gfw) oproti hladinám nalezeným u netransformovaných kontrolních rostlin (17 ± 3 nmol/gfw), což ukazuje, že exprese cysE vede ke zvýšení endogenní hladiny aminokyseliny cysteinu.

Jedním z hlavních odvodů cysteinu, který je produkován asimilačně redukční kaskádou síranů, je tvorba glutathionu, tripeptidu složeného z aminokyselin: kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Když vezmeme v potaz, že cystein je jedním ze substrátů při produkci glutathionu, je možné, že by to mohlo mít účinek na biosyntézu glutathionu, protože rostliny exprimující SAT z E.coli obsahovaly zvýšenou hladinu cysteinu. Ke zjištění, zda se jedná o tento případ, byly anaylzovány hladiny glutathionu v listech transgenních linií SAT-48 a SAT-26 a rostlin divokého typu. Tato měření prokázala, že oba transformanty mají výrazně zvýšené hladiny glutathionu, a to až na dvojnásobnou hodnotu (500 až 600 nmol/gfw) než tomu je u rostlin divokého typu (300 až 350 nmol/gfw; viz obr. 2b). To ukazuje na to, že zvýšené hladiny cysteinu stimulují biosyntézu glutathionu.

Maje na mysli, že jedna molekula glutathionu obsahuje jednu molekulu cysteinu a že celková molární množství glutathionu v listech brambor více než desetinásobně převyšuje molární množství volné aminokyseliny cysteinu, je možné usuzovat, že kapacita syntézy cysteinu v rostlinách transgenních brambor je zvýšena mnohem více než jen dva až třikrát, jak by bylo možno vyvodit z pouhého porovnání hladin volného cysteinu. Absolutní nárůst o 200 až 300 nmol glutathionu na gram čerstvé váhy u transgenních rostlin, odpovídá tedy přibližně 10 až 18násobnému zvýšení biosyntetické kapacity cysteinu v případě, že je v listech rostlin divokého typu obsaženo okolo 15 až 20 nmol cysteinu/gfw. Když ktomu přidáme zvýšené hladiny volného cysteinu u transgenních rostlin dva až třikrát, biosyntéza cysteinu u transformantů je až 20násobně zvýšena ve srovnání s kontrolními rostlinami.

fc ·· fcfc fcfc fc fc ·· · ·♦·· ·· * fcfcfcfc • fc · · · fcfc·· « fcfc ······· »·····« fcfc ·· «· fcfc·

Příklad 3

Vzrůst endogenních hladin cysteinu a glutathionu neovlivňuje expresní profil isoforem OAS-TL

U enzymu melounu byla popsána metabolicky významná regulace aktivity SAT alosterickou inhibici cysteinu (Saito, 1995). Bakteriální enzymy SAT jsou na transkripční úrovni zpětně inhibovány mikromolárními koncentracemi cysteinu. Na druhou stranu je exprese bakteriálních SAT stimulována v situaci, kdy je množství cysteinu omezeno (Kredich, 1987). Navíc aktivita enzymu O-acetylserin(thiol)lyasy, což je enzym bezprostředně následující za SAT v reakční kaskádě při biosyntéze cysteinu, je také regulována cysteinem na transkripční úrovni. Byla zaznamenána stimulace exprese různých cDNA kódujících isoformy O-acetylserinlyas, specifických pro jednotlivé kompartmenty z Arabidopsis v podmínkách růstu rostlin s omezeným zdrojem síranů (Hell, 1994; Barroso, 1995; Hesse, 1997). Také u špenátu je mírně zvýšená exprese isoforem O-acetylserin(thiol)lyasy v podmínkách s omezeným příjmem síry (Takahashi a Saito, 1996). Aby bylo možné zjistit, zda zvýšené hladiny cysteinu u transgenních rostlin brambor exprimujících gen cysE z E.coli ovlivňují expresní profil endogenního OAS-TL u brambor, byly odebrány vzorky listů transgenních rostlin a rostlin netransformovaných, které byly následně podrobeny analýze RNA blotováním (viz příklad 1). Za účelem radioaktivního značení cDNA OAS-TL z brambor (Hesse a Hófgen, 1998), byla DNA štěpena příslušnými restrikčními enzymy a separována na 1 % agarosovém gelu. Fragmenty DNA byly izolovány z gelu s použitím „NucleoSpin Extractu“ od Marcherey-Nagel (Duřen, SRN). Tato analýza ukázala, že přestože transgenní rostliny obsahovaly výrazně více cysteinu ve svých listech, transkripční rychlost genů OAS-TL z bramboru (a to jak cytosolická, tak chloroplastová isoforma, Hesse a Hófgen, 1998) nebyla změněna v porovnání s expresní hladinou u rostlin divokého typu (obrázek 3). To ukazuje, že zvýšená hladina cysteinu u transgenních rostlin brambor nemá detekovatelný vliv na expresní profil OAS-TL z brambor na transkripční úrovni.

• ·· ····<·99 • · · 9 9 9 · 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

999 9999 99 99 99999

Příklad 4

Zvýšené endogenní hladiny cysteinu nemají vliv na aktivitu O-acetylserin(thiol)lyasy

Aktivita OAS-TL je regulována stavem síry v buňce. Tak například aktivita cytosolické O-acetylserin(thiol)lyasy z Arabidopsis thaliana je aktivována nedostatkem síry (Barroso, 1995; Hesse, 1997). Vzrůst specifické aktivity způsobený vyčerpáním síry byl také pozorován u kultury tabáku a u buněk C.reinhardtii a u kukuřičných listů (Bergmann, 1980; Passera a Ghisi, 1982; Leon, 1988). Na druhou stranu vysoké koncentrace síry, jak se zdá, snižují aktivitu OAS-TL. Například enzym z Datura innoxia je inhibován vyššími koncentracemi sulfidů (Kuske, 1994). U buněk C. reinhardtii \e aktivita OAS-TL inhibována nejen sulfidy, ale také OAS a cysteinem (Leon a Vega, 1991). Aby bylo možné zjistit, zda zvýšená aktivita SAT a změněné hladiny cysteinu a glutathionu u transgenních rostlin brambor mají účinek na aktivitu OAS-TL, byla testována aktivita tohoto enzymu v surových extraktech z listů. Aktivita O-acetyserin(thiol)lyasy byla stanovena měřením tvorby L-cysteinu. Každá reakce byla startována přídavkem 5 pl surového extraktu z listů (1 pg/μΙ celkového proteinu). Reakce byly prováděny v 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,5) v přítomnosti 5 mM DTT, 10 mM O-acetylserinu a 2 mM Na2S (celkový objem byl 100 μΙ). Reakce běžela 20 minut při 25 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 50 μΙ 20% trichloroctové kyseliny, a poté byla analyzována tvorba L-cysteinu s použitím Gaitondova činidla (Gaitonde, 1967). Obsah cysteinu byl měřen na spektrofotometru při 560 nm (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) proti slepému kontrolnímu vzorku, který obsahoval veškerý materiál s výjimkou O-acetylserinu. Pokusy byly třikrát opakovány. Přesto tato měření neprokázala žádný rozdíl v aktivitách OAS-TL v extraktech z listů transgenních rostlin a rostlin divokého typu (obrázek 4). Je tedy možné spekulovat, že vyšší hladiny cysteinu a glutathionu u transgenních rostlin nejen že nemají pozorovatelný vliv na úroveň exprese genů, ale také nemají vliv na aktivitu OAS-TL.

Příklad 5

Exprese u transgenních rostlin brambor, které obsahují SAT z E.coli a rostlinnou CyS mRNA

Dvě transgenní linie, které exprimují SAT z E.coli (např. SAT-48 a SAT-26), byly vybrány k superinfekci binárním plasmidovým konstruktem obsahujícím CyS • ·· A A MM·» • A A Α A A A » A · • A A A A A A AA

A A A A · A A AA

Α·Α MM ·· A· ····♦ cDNA, např. z brambor, pod kontrolou 35S promotoru, respektive B33 promotoru. Binární vektor byl odvozen od pBIN19 a umožnil např. rezistenci k hygromycinu u rostlinné selekce. Plasmidy byly zavedeny do transgenních linií SAT-48, respektive SAT-26 s použitím Agrobacteria tumefaciens, jak bylo popsáno (Racha-Sosa, 1989). Selekční podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Superinfikované transgenní linie exprimující SAT z E.coli a CyS byly hodnoceny z hlediska hladiny RNA (Northern blot), hladiny proteinu (Western blot) a enzymové aktivity. Pokusy s Northern blotem byly prováděny stejně jako v příkladu 1. Linie s vysokou expresí CyS byly vybrány pro obsah proteinu a enzymovou aktivitu. 10 pg proteinu z každého extraktu z listů bylo testováno s pomocí Western blotu, aby se zjistil vyšší obsah proteinu v porovnání s rostlinami divokého typu a původně použitou transgenní linií. Linie se zvýšeným obsahem proteinu byly navíc analyzovány z hlediska enzymové aktivity. 10 pg, 25 pg, 50 pg a 100 pg extraktu z listů bylo inkubováno spolu s10pCi ^S-cysteinu a 10 mM sukcinylhomoserinem po dobu 30 minut při 30 °C v celkovém objemu 200 pl v 50 mM Tris/HCI, pH 7,8 a 10 mM DTT. Reakce byly zastaveny přídavkem 50 pl 20% TCA. Po neutralizaci a centrifugaci bylo 5 pl z každého supernatantu analyzováno tenkovrstevnou chromatografií. Jako protékající rozpouštědlo byla použita směs methanolu/ethylesteru kyseliny octové:H2O = 60:30:10). U transgenních rostlin s vysokou aktivitou byl dále analyzován obsah GSH, CyS a obsah methioninu.

•· ····

Literární odkazy

Alscher, Physiol Plant 77 (1989), 457-464

Amasino, Anal Biochem 152 (1986), 304-307

Anderson, Sulfur metabolism in plants. V BJ Miflin, PJ Lea, vydavatelé, The

Biochemistry of Plants. Academie Press, New York (1990), 327-381

Barroso, FEBS Lett 363 (1995), 1-5

Bergmann, Z Naturforsch 35c (1980), 952-957

Bogdanova, FEBS Lett 358 (1995), 43-47

Bogdanova, Plant J 11 (1997), 251-262

Breton, J Biol Chem 265 (1990), 18248-18255

Brunold, Planta 155 (1982), 321-327

Brunold, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1993), 61-76

Brunold, Prog Bot 58 (1997), 164-186

Cook, Arch Biochem Biophys 178 (1977), 293-302

Delhaize, Plant Physiol 89 (1989), 700-706

Denk, J Gen Microbiol 133 (1987), 515-525

Droux, Arch Biochem Biophys 295 (1992), 379-390

Evans, J Bacteriol 173 (1991), 5457-5469

Gaitonde, Biochem J 104 (1967), 627-633

Ghisi, Plant Physiol 92 (1990), 846-849

Ghisi, Photosynthetica 29 (1993), 543-549

Giovanelli, The biochemistry of plants: A comprehensive treatise, amino acids and derivatives. Academie Press, New York 5 (1980), 453-505

Giovanelli, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1990), 33-48

Hell, FEBS Lett 351 (1994), 257-262

Hesse, WJ Cram a kol., vydavatelé, Sulphur Metabolism in Higher Plants. Backhuys

Publishers, Leiden, Nizozemí (1997), 227-230

Hesse, Plant Phys 116 (1998), 1604

Kredich, J Biol Chem 241 (1966), 4955-4965

Kredich, J Biol Chem 244 (1969), 2428-2439

Kredich, Cellular and Molecular Biology. Američan Society of Microbiology,

Washington DC (1987), 419-428

Kredich, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1993), 37-47

Kuske, J Biol Chem 269 (1994), 6223-6232

Kuske, Plant Physiol 112 (1996), 659-667

Lai, Gene 119(1992), 113-118

Lehrach, Biochem 16 (1977), 4743-4751 Leon, J Plant Physiol 132 (1988), 618-622 Leon, Plant Physiol Biochem 29 (1991), 595-599 Logemann, Anal Biochem 163 (1987), 21-26 Lunn, Plant Physiol 94 (1990), 1345-1352 Meister, Annu Rev Biochem 52 (1983), 711-760 Monroe, J Bacteriol 172 (1990), 6919-6929 Murashige, Physiol Plant 15 (1962), 473-479 Murillo, Cell Mol Biol 41 (1995), 425-433 Nakamura, Plant Cell Physiol 28 (1987), 885-891 Nakamura, Plant Cell Physiol 29 (1988), 689-693 Nakamura, Agric Biol Chem 54 (1990), 649-656 Neuenschwander, Plant Physiol 97 (1991), 253-258 Newton, Anal Biochem 114 (1981), 383-387 Ngo, Can J Biochem 52 (1974), 435-440 Noctor, Plant Physiol 112 (1996), 1071-1078 Noji, Mol. Gen. Genet. 244 (1994), 57-66 Nussbaum, Plant Physiol 88 (1988), 1407-1410 Ostrowski, J Bacteriol 171 (1989),130-140 Passera, J Exp Bot 33 (1982), 432-438 Rauser, Plant Physiol 97 (1991), 128-138 Ravanel, C R Acad Sci Paris 320 (1997), 497-504 Rennenberg, Plant Physiol 73 (1983), 560-565

Rennenberg, SPB Academie Publishers, The Hague (1990), 276

Rennenberg, Prog Bot 55 (1994), 142-156

Rennenberg, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1995), 155-171

Roberts, Plant Mol Biol 30 (1996), 1041-1049

Rocha-Sosa, EMBO J 8 (1989), 23-29

Rolland, Plant Physiol 98 (1992), 927-935

Rolland, Arch Biochem Biophys 300 (1993), 213-222

Rolland, Eur J Biochem 236 (1996), 272-282 • ·· ·♦ ···· ·· 4 ··♦· ♦· · · · · · • ···· ··· • ···· · · · · · • · · · · · · ♦ · ··· ··«· ·· ·· ·· ···

Ruegsegger, Plant Physiol 99 (1992), 428-433

Ruffet, Plant Physiol 104 (1994), 597-604

Ruffet, Eur J Biochem 227 (1995), 500-509

Saito, Proč Nati Acad Sci USA 89 (1992), 8078-8082

Saito, FEBS Lett 324 (1993), 247-252

Saito, J Biol Chem 269 (1994), 28187-28192

Saito, Plant Physiol 106 (1994), 887-895

Saito, J Biol Chem 270 (1995), 16321-16326

Schmidt, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43 (1992), 325-349

Schupp, Plant Sci 57 (1988), 113-117

Smith, Biochem Biophys Res Commun 35 (1969), 939-945

Smith, Biochim Biophys Acta 277 (1971), 288-295

Smith, Plant Physiol 50 (1972), 477-479

Smith, Alscher RG, Cumming JR (vydavatelé) Wiley-Liss, New York (1990), 201-215

Takahashi, Plant Physiol 112 (1996), 273-280

Vaara, FEMS Microbiol Lett 97 (1992), 249-254 von Arb, Physiol Plant 67 (1986), 81-86

Vuorio, FEBS Lett 292 (1994), 90-94

Youssefian, Plant J 4 (1993), 759-769 • ♦ · ·· ··♦·9 9 · 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

999 9999 99 99 99999

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rekombinantni molekula DNA obsahující:

(a) molekulu nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferasovou aktivitou (SAT), a případně (b) molekulu nukleové kyseliny kódující protein s cystein-y-syntetasovou aktivitou (CyS);

kde zmíněná molekula (molekuly) nukleové kyseliny jsou funkčně spojeny s regulačními úseky, což umožňuje expresi molekul(y) nukleové kyseliny v rostlinných buňkách.
2. Rekombinantni molekula DNA podle nároku 1, kde proteinem se SAT aktivitou je serinacetyltransferasa z říše prokaryontů nebo archaebacteria.
3. Rekombinantni molekula DNA podle nároku 1 nebo 2, kde proteinem s CyS aktivitou je cystein-y-syntetasa z brambor, tabáku, rajčat, řepky nebo Arabidopsis.
4. Rekombinantni molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde molekula nukleové kyseliny (a) a/nebo (b) je funkčně spojena se sekvencí nukleotidů kódující tranzitní peptid, který je schopný nasměrovat protein(y) do požadovaných buněčných kompartmentů.
5. Rekombinantni molekula DNA nároku 4, buněčným kompartmentem je plastid.
6. Rekombinantni molekula DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde regulační úseky obsahují promotor, který je aktivní v rostlinných buňkách.
7. Rekombinantni molekula DNA podle nároku 6, kde promotor je indukovatelný, konstitutivně exprimovaný a/nebo je promotorem specifickým pro buňku, pletivo nebo orgán.
8. Rekombinantni molekula DNA podle nároku 7, kde promotor je specifický pro hlízy, pro semena, pro endosperm, pro embryo nebo pro floem.
9. Vektor obsahující alespoň jednu molekulu rekombinantni DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.
10. Vektor podle nároku 9 obsahující volitelný znak.
11. Způsob zvýšení obsahu sirných sloučenin v transgenních rostlinách, rostlinných buňkách nebo rostlinných pletivech, vyznačující se tím, Že zahrnuje zavedení alespoň jedné molekuly rekombinantni DNA z kteréhokoli z nároků 1 až 8 nebo alespoň jednoho vektoru z nároku 9 nebo 10 do rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva.

•Φ ♦··♦

9 ΦΦΦΦ «ΦΦ φ «ΦΦΦ ΦΦΦΦ · φφ φφφφ ΦΦΦ

Φ Φ φ φ φ Φ Φ ΦΦ ΦΦ ·♦ ΦΦΦ
12. Transgenní rostlinná buňka, která obsahuje ve svém genomu stabilně integrovanou alespoň jednu molekulu rekombinantní DNA z kteréhokoli z nároků 1 až 8 nebo alespoň jeden vektor z nároku 9 nebo 10, nebo kterou lze získat způsobem podle nároku 11.
13. Transgenní rostlinná buňka podle nároku 12, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny z nároku 1 (b).
14. Transgenní rostlinná buňka podle nároku 12 nebo 13, která obsahuje volitelný znak.
15. Transgenní rostlina nebo rostlinné pletivo, které obsahuje rostlinné buňky podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, nebo které lze získat způsobem podle nároku 11.
16. Transgenní rostlina podle nároku 15, kde je zvýšena hladina glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu v porovnání s rostlinami divokého typu.
17. Zpracovatelné části rostliny podle nároku 15 nebo 16 obsahující rostlinné buňky podle kteréhokoli z nároků 12 až 14.
18. Propagační materiál transgenní rostliny podle nároku 15 nebo 16 obsahující rostlinné buňky podle kteréhokoli z nároků 12 až 14.
19. Použití molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 (a) nebo alespoň jedné rekombinantní molekuly DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 nebo alespoň jednoho vektoru podle nároku 9 nebo 10 k produkci transgenních rostlin, které vykazují zvýšenou hladinu glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu.
20. Použití podle nároku 19, kde zvýšená hladina methioninu nebo cysteinu má za následek urychlený proces zrání, změněné květy a/nebo odolností vůči patogenům.
21. Použití molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 (a) nebo alespoň jedné rekombinantní molekuly DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 nebo alespoň jednoho vektoru podle nároku 9 nebo 10, rostlinné buňky podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, rostliny nebo rostlinného pletiva podle nároku 15 nebo 16, zpracovatelných částí podle nároku 17 nebo propagačního materiálu podle nároku 18 pro výrobu potravin, zvířecích krmiv, ke zlepšení rezistence vůči patogenům, ke dodání odolnosti vůči těžkým kovům nebo herbicidům, ke zlepšení tvorby biomasy, k zesílení růstu klíčků, k dodání odolnosti vůči biotickému nebo abiotickému stresu, nebo ke zlepšení vůně a/nebo chuti potravin nebo krmiv.

44 44 ······

4 4 4 4 · 4· • · · · · · ···· · 4 4· • 4 · 4 · 4· • 4444 4444··
22. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi obsahující rostlinnou buňku podle kteréhokoli z nároků 12 až 14, rostlinu nebo rostlinné pletivo podle nároku 15 nebo 16, zpracovatelné části podle nároku 17 nebo propagační materiál podle nároku 18.