CZ301853B6 - Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v rostlinách a potraviny, krmiva nebo jejich prímesi - Google Patents

Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v rostlinách a potraviny, krmiva nebo jejich prímesi Download PDF

Info

Publication number
CZ301853B6
CZ301853B6 CZ20010018A CZ200118A CZ301853B6 CZ 301853 B6 CZ301853 B6 CZ 301853B6 CZ 20010018 A CZ20010018 A CZ 20010018A CZ 200118 A CZ200118 A CZ 200118A CZ 301853 B6 CZ301853 B6 CZ 301853B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
plants
nucleic acid
sat
activity
Prior art date
Application number
CZ20010018A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ200118A3 (cs
Inventor
Hesse@Holger
Harms@Karsten
Höfgen@Rainer
Original Assignee
Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. filed Critical Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Publication of CZ200118A3 publication Critical patent/CZ200118A3/cs
Publication of CZ301853B6 publication Critical patent/CZ301853B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C12N15/8253—Methionine or cysteine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v transgenních rostlinách, rostlinných bunkách nebo rostlinném pletivu, který zahrnuje zavedení molekuly nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) aktivitou do rostliny, rostlinné bunky nebo rostlinného pletiva, kde molekula nukleové kyseliny je funkcne spojena s regulacními úseky, což umožnuje expresi molekuly nukleové kyseliny v rostlinných bunkách, pricemž rostlina, rostlinná bunka nebo rostlinné pletivo neexprimuje exogenne zavedenou molekulu nukleové kyseliny kódující protein s O-acetylserin(thiol)lyázovou (OASTL) aktivitou. Dále se rešení týká potravin, krmiv nebo jejich prímesí obsahujících transgenní rostlinné bunky, které obsahují ve svém genomu stabilne integrovanou výše uvedenou molekulu rekombinantní DNA osahující molekulu nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) aktivitou.

Description

Způsob zvýšení obsahu sirných sloučenin v rostlinách a potraviny, krmivá nebo jejich příměsi
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu zvýšení obsahu sirných sloučenin v transgenních rostlinách, rostlinných buňkách nebo rostlinném pletivu, který zahrnuje zavedení molekuly nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) aktivitou do rostliny, rostlinné buňky nebo rostlin* ného pletiva, kde molekula nukleové kyseliny je funkčně spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách, přičemž rostlina, rostlinná buňka nebo rostlinná tkáň neexprimuje exogenně zavedenou molekulu nukleové kyseliny kódující protein s O-acetylserin(thiol)lyázovou (OASTL) aktivitou. Dále se vynález týká rekombínantní molekuly DNA, která obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltrans15 ferázovou aktivitou (SAT), a případně molekulu nukleové kyseliny kódující protein s cystein-ysyntetázovou aktivitou (CyS). Zmíněná molekula (případně molekuly) je funkčně spojena s regulačními úseky, které umožňují expresi molekuly (respektive molekul) nukleové kyseliny v rostlinné buňce. Navíc se vynález týká použití výše zmíněných rekombinantních molekul DNA a vektorů v rostlinných buňkách, tkáňových kulturách, při šlechtění rostlin a/nebo v zemědělství.
Rovněž se týká výroby potravin, krmiv a přísad, které obsahují výše zmíněné rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny.
Dosavadní stav techniky
Vyšším rostlinám slouží anorganický síran z půdy jako hlavní zdroj síry pro syntézu síru obsahujících aminokyselin cysteinu a methioninu. Předpokládá se, že biosyntéza cysteinu u rostlin hraje zásadní roli v přírodním cyklu síry. Redukovaná síra ve formě cysteinu je potřebná k mnoha různým funkcím v rostlině (Rennenberg, 1990; Schmidt, 1992). Je důležitá i pro normální rostlinný metabolismus, protože propojuje metabolismus šeřinu a methioninu tím, že přenáší redukovanou síru potřebnou pro biosyntézu methioninu (Giovanelli, 1990; Ravanel, 1997; Brunold a Rennenberg. 1997). Dále cystein slouží jako substrát dalším molekulám, které obsahují síru, jako jsou určité kofaktory, sloučeniny vázané na membránu a jako esenciální aminokyselina sloužící k syntéze proteinů (Giovanelli, 1980; Schmidt, 1992). Cystein je také důležitý jako prekurzor při tvorbě glutathionu (GSH) a dalších metabolitů spojených se stresem. Potřeba cysteinu kolísá v průběhu rostlinného vývoje a je také závislá na změnách okolního prostředí včetně světla, dostupnosti síranů a některých druzích abiotíckého nebo biotického stresu (von Arb a Brunold, 1986; Nussbaum, 1988; Delhaize, 1989; Rauser, 1991; Ghisi, 1993; Hell, 1994).
V průběhu biosyntézy cysteinu musí být nejdříve L-serin aktivován přenosem acetylového zbytku z acetyl koenzymu A za vzniku intermediátu O-acetyl-L-serinu (OAS). Tato důležitá reakce je katalyzována enzymem serinacetyltransferázou (SAT). Aktivace šeřinu, klíčová reakce biosyntézy šermu, byla zkoumána na molekulární úrovni pouze u prokaryontů (Breton, 1990; Monroe, 1990; Evans, 1991; Lai a Baumann, 1992). Syntézy cysteinu u rostlin je dosaženo sul45 fhydrylací O-acetyl-L-serinu v přítomnosti volného nebo vázaného sulfidu, za katalýzy O-acetylserin(thiol)lyasy (OAS-TL, cysteinsynthasa, CSasa, EC 4.2.99.8) (Schmidt a JSger, 1990). Tato reakce byla podrobně studována (Saito, 1992, 1993 a 1994; Rolland, 1993 a 1996; Youssefian, 1993; Noji, 1994; Hell, 1994; Kuske, 1994 a 1996; Takahashi a Saito, 1996).
Saito a kol. Planí Physiol. 106, 887-895 a Youssefian a kol.: The Planí Journal, 4, 759-769 se týkají regulace metabolismu síry v rostlinách, avšak nepopisují ani nenaznačují transformaci rostlin pouze pomocí SAT (serinacetyl transferázy). Stejně tak Leish et al 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 892-898 popisuje experimenty, v nichž se myší buňky transformovaly pomocí SAT spolu s CSázou.
- 1 CZ 301853 B6
U bakterií tvoří SAT společně s OAS-TL komplex, který je nazýván cysteinsynthasa. V rámci tohoto komplexu je pouze malá část (5 %) O-acetylserin(thiol)lyasy asociována s veškerou aktivitou SAT (Kredich, 1969). Studie regulace biosyntézy cysteinu u bakterií navíc odhalily citlivost serinacetyltransferázy ke zpětné inhibici L-cysteinem a že O-acetylserin (nebo N-acetylserin) je zapojen v transkripční aktivaci několika promotorů z operonu cys (Ostrowski a Kredich, 1989; Kredich, 1993).
V nedávné době byly nakloňovány rostlinné cDNA kódující serinacetyltransferázy z různých druhů rostlin (Bogdanova, 1995; Murillo, 1995; Ruffet, 1995; Saito, 1995; Roberts and Wray, to 1996). SAT existuje u rostlin také v komplexu s OAS-TL, což nasvědčuje o efektivním metabolickém přenosu ze šeřinu na cystein, čímž se zabrání difúzi intermediátu O-acetyl-L-serinu (Nakamura, 1988; Nakamura a Tamura, 1990; Ruffet, 1994; Bogdanova a Hell, 1997; Hesle, 1997). Jak pro SAT, tak pro OAS-TL byla prokázána u několika rostlin lokalizace vplastidu, mitochondriích a cytosolu. To značí, že schopnost syntézy cysteinu se zdá být nepostradatelnou ve všech buněčných kompartmentech, které mají schopnost endogenní biosyntézy proteinů (Smith a Thompson, 1969; Smith, 1972; Brunold a Suter, 1982; Lunn, 1990; Rolland, 1992; Ruffet, 1994). Např. u Pisum sativum existují tri různé isoformy SAT a každá z těchto izoforem se zdá být specifickou pro daný vnitrobuněčný kompartment (Ruffet, 1995). Vedle těchto požadovaných umístění v buňce umožňuje fakt, že biosyntéza cysteinu je v komplexní interakci s příjmem a redukcí síranu, což je samo o sobě řízeno fotosyntézou a asimilací dusičnanu (Anderson, 1990; Brunold, 1993), předpokládat důležitou roli biosyntézy cysteinu v rámci metabolismu síry u vyšších rostlin.
Velice důležitým znakem sledu reakcí při tvorbě cysteinu je fakt, že aktivita SAT je mnoho25 násobně nižší v porovnání s aktivitou OAS-TL. V semenech a v klíčcích je aktivita OAS-TL deset- až dvacetkrát vyšší než SAT (Smith, 1971; Ngo a Shargool, 1974). V celých listech poměr aktivit obou enzymů dosahuje hodnoty 100 až 300násobek (Nakamura, 1987), zatímco v samotných chloroplastech dosahuje tento poměr hodnoty 340násobek (Ruffer, 1994). Jak bylo ukázáno na rodu Allium a u špenátu, je SAT v porovnání s OAS-TL málo se vyskytujícím enzymem (Nakamura a Tamura, 1990; Ruffet, 1994). Navíc bylo popsáno, že dostupnost OAS je limitujícím faktorem rychlosti syntézy cysteinu (Neuenschwander, 1991; Ghisi, 1990; Rennenberg, 1983; Brunold, 1993; Saito, 1994). Aktivita SAT u melounu je znatelně regulována zpětnou inhibicí cysteinu (Saito, 1995). Regulace SAT také probíhá na úrovni genové exprese. U Arabidopsis thaliana v odpověď na světelný a simý stres se mRNA hromadí asi dvojnásobně (Bogdanova,
1 995). Avšak zatímco funkce a role SAT, OAS a OAS-TL v řetězci reakcí při biosyntéze cysteinu byly podrobeny mnoha studiím, předchozí snahy změnit rychlost syntézy cysteinu byly neúspěšné (Saito, 1994). Stále tedy ještě nerozumíme plně přesnému řízení cesty biosyntézy cysteinu, které je součástí kontroverzní diskuse. Proto nebyly doposud dostupné prostředky kontroly obsahu síry v rostlinách, které mohou mít uplatnění v několika směrech v zemědělství.
Technickým problémem podkládajícím tento vynález bylo vyhovět potřebě mít prostředky a způsoby úpravy obsahu simých sloučenin v rostlinách.
Řešení tohoto technického problému se dosáhne poskytnutím provedení popsaných v nárocích.
Podstata vynálezu
Vynález se tedy mimo jiné týká rekombinantní molekuly DNA, která obsahuje: molekulu nukleo50 vé kyseliny kódující protein, který má serinacetyltransferázovou aktivitu (SAT), kde zmíněná molekula je funkčně spojena s regulačními úseky umožňujícími expresi této molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách.
-2CZ 301853 B6
Výraz „protein, který má serinacetyltransferázovou aktivitu (SAT)“, jak je zde užit, značí, že zmíněný protein je schopný přenosu acetylové skupiny z acetylkoenzymu A na L-serin za tvorby intermediátu biosyntézy cysteinu O-acetyl—L-serinu.
Výraz „protein, kteiý má cystein—y-syntetázovou aktivitu (CvS)“ podle vynálezu udává protein schopný katalýzy tvorby L-cystathioninu nebo L-homocysteinu v závislosti na substrátu obsahujícím síru, L-cysteinu nebo sulfidu. Tento protein je také znám jako cystathionin-y-syntetáza, Výrazy „cystein-y-syntetáza“ a „cystathionin-y-syntetáza jsou zde použity jako zaměnitelné. U rostlin obvykle CyS kata lyžuje první reakci specifickou pro syntézu methioninu, jmenovitě se jedná o záměnu fosforylového substituentu homoserin-O-fosfátu v gama pozici cysteinem. Cystein je tedy hlavním prekurzorem při biosyntéze methioninu u rostlin.
Podle vynálezu byla kódující sekvence genu cysE z Escherichia coli (Denk a Bóck, 1987), která kóduje enzym náležející do biosyntézy cysteinu, jmenovitě serinacetyltransferázu (SAT, EC
2.3.1.30), vložena do genomu rostlin brambor pod kontrolu promotoru viru mozaiky květáku (CaMV), Aby byl protein nasměrován do chloroplastů, byl cysE trans lačně fúzován s 5'-signální sekvencí malé podjednotky rubisca (viz příklad 1). U úspěšně transformovaných rostlin byla zaznamenána vysoká akumulace mRNA cysE. Navíc v surových extraktech připravených z listů těchto rostlin byla zaznamenána významně vyšší aktivita SAT, a to až 20krát vyšší v porovnání s rostlinami divokého typu. Transgenní rostliny brambor přeexprimující gen z E.coli vykazovaly dva až třikrát zvýšenou hladinu cysteinu a glutathionu (GSH) v porovnání s kontrolními rostlinami (viz příklad 2). Avšak zvýšení enzymové aktivity SAT a hladiny substrátu pro biosyntézu cysteinu O-acetyl-L-serinu (OAS) překvapivě nemělo žádný vliv na expresi a na aktivitu Oacetylserin(thiol)-lyasy (OAS-TL), což je enzym, který přeměňuje OAS, produkt SAT, na cys25 tein (viz příklady 3 a 4). Jak exprese tohoto genu na úrovni RNA, tak enzymová aktivita zůstaly nezměněny ve srovnání s divokým typem rostlin.
Z těchto pokusů byly vyvozeny následující závěry: na jednu stranu bakteriální SAT z E.coli exprimovaná v transgenních rostlinách brambor se hromadila jako katalyticky funkční protein v chloroplastech. Na druhou stranu buněčný obsah cysteinu a glutathionu byl výrazně zvýšený v listech transgenních rostlin. Hladiny cysteinu dosahovaly u jednoho z transformantů (SAT-48) téměř trojnásobné hodnoty a u jiného transformantů (SAT-26) dvojnásobně vyšší hodnoty než dosahovala množství nalezená u netransformovaných kontrolních rostlin. To naznačuje, že exprese cysE je zodpovědná za stimulaci syntézy cysteinu. Pokusy provedené v souladu s tímto vynálezem také ukázaly, že oba transformanty měly výrazně zvýšenou hladinu glutathionu, která dosahovala až dvojnásobné hodnoty v porovnání s rostlinami divokého typu. Tyto neočekávané výsledky ukazují, že za normálních podmínek bez jakéhokoli simého stresu je limitujícím krokem při biosyntéze cysteinu endogenní hladina SAT, alespoň v chloroplastech, kam byla SAT z E.coli směrována. To znamená, že za normálních podmínek je hladina OAS-TL dostatečně vysoká k tomu, aby konvertovala veškerý OAS vzniklý v buňce, takže není limitující pro normální průběh biosyntézy cysteinu. Fakt, že nadměrná exprese SAT v transgenních rostlinách brambor je schopna zvýšit obsah cysteinu a glutathionu, dále znamená, že kroky asimilace síranu, které předcházejí inkorporaci sulfidu do cysteinu, tj. příjem síranu, aktivace síranu a redukce adenosin-5-fosfos íranu (APS), také nejsou za normálních podmínek limitující pro biosyntézu cysteinu. Vypadá to, že rostliny mají dostatečnou kapacitu pro příjem síranu a aktivity pro konverzi síranu na sulfid, aby bylo poskytnuto dostatečné množství redukované síry potřebné k produkci cysteinu. Na závěr je vhodné zmínit, že výsledky prezentované podle vynálezu přímo ukazují spojení mezi volným cysteinem a glutathionem. Zvýšené hladiny cysteinu u transgenních rostlin brambor stimulují biosyntézu glutathionu, což vede k až dvojnásobným hladinám tripepti50 du v porovnání s rostlinami divokého typu. To naznačuje, že biosyntéza glutathionu v listech bramboru je limitována dostupností cysteinu. Tyto výsledky také potvrzují nedávné pokusy s topolem (Strohm, 1995;Noctor, 1996).
Jak bylo odhaleno při pokusech provedených podle vynálezu, rostliny disponují dostatečnou kapacitou přijmu síranu a aktivitami ke konverzi síranu na sulfid k poskytnutí dostatečného
-3CZ 301853 B6 množství redukované síry potřebné k biosyntéze sloučenin, které obsahují síru. Na základě objevů vynálezu tedy lze očekávat, že zavedení cystě in-y-syntetázy, prvního enzymu specifického pro biosyntézu methioninu v transgenních rostlinách, by mohlo vést k výraznému zvýšení obsahu methioninu v rostlinách v porovnání s rostlinami divokého typu. V tomto ohleduje třeba pozna5 menat, že zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru v rostlinách alespoň o 10% už prokazuje výhodné účinky na rostlinu, například zvýšenou odolnost k abiotickému stresu. Výhodné je, aby byl obsah těchto sloučenin zvýšen o nejméně 50 %, velmi výhodně o 100 % a zvláště výhodné je zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru více než 1 krát, s výhodou 2krát. Když byla exprimována v rostlinách CyS, bylo zaznamenáno zvýšení hladiny methioninu 3 až 5krát (Locke, ío Keystone meeting 6.-11.4.1997, Abstrakt 306 (1997)). Jelikož zavedení SAT má za následek přírůstek substrátu CyS, očekává se po zavedení CyS do rostlin exprimujících SAT z tohoto vynálezu nebo naopak nárůst obsahu sloučenin obsahujících síruje dále zvýšen 1 až lOnásobně, s výhodou 5 až lOnásobně nebo vyšší.
Ve výhodném provedení vynálezu je u molekuly rekombinantní DNA zmíněným proteinem majícím SAT aktivitu serinacetyltransferáza odvozená z prokaiyontů nebo archebakterií. Mezi prokaryontní organismy mohou být zahrnuty gramnegativní, stejně jako grampozitivní bakterie, jako jsou například E.coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Bacillus subtilis a různé druhy z rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, přestože mohou být využity i jiné. Napří20 klad molekuly nukleové kyseliny kódující proteiny s SAT aktivitou mohou být získány z dosavadní techniky (např. Bogdanova. FEBS Lett. 358 (1995), 43 až 47; Denk, J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 515 az 525; Evans. J. Bacteriol. 173 (1991), 5457 až 5469).
Dále molekuly nukleových kyselin mohou být použity k hybridizaci na výše popsané molekuly nukleových kyselin a kódování proteinu, který má SAT aktivitu. Takové molekuly nukleových kyselin mohou být izolovány, např. z knihoven jako je cDNA nebo genomové knihovny, technikami známými v oboru. Hybridizující molekuly nukleových kyselin mohou být například identifikovány a izolovány s použitím výše popsaných molekul nukleové kyseliny známých v oboru nebo jejich fragmentů nebo jejich komplementárních řetězců jako sond pro prohledávání kniho30 ven hybridizaci s uvedenými molekulami podle standardních způsobů. V úvahu také připadá izolace těchto molekul nukleových kyselin s pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), kde jako příměry jsou použity oligonukleotidy odvozené od výše zmíněných molekul nukleových kyselin. Mezi molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s kteroukoli zvýše zmíněných molekul nukleových kyselin, patří také fragmenty, deriváty a alelické varianty výše zmíněných molekul nukleových kyselin, které kódují protein s SAT aktivitou, nebo jejich biologicky aktivní fragmenty. Fragmenty jsou rozuměny části molekul nukleových kyselin, které jsou dostatečně dlouhé na to, aby kódovaly popsaný protein nebo jeho fragment mající výše definovanou biologickou aktivitu.
Výraz „derivát“ v tomto kontextu znamená, že sekvence nukleotidů se liší od výše popsaných molekul nukleových kyselin v jedné či více polohách nukleotidů a je vysoce homologní k výše zmíněným molekulám nukleových kyselin. Homologií je zde rozuměna identita sekvencí z alespoň 40 %, zejména identita z alespoň 60 %, s výhodou více než 80 % a ještě výhodněji 90 %. Odchylky od sekvencí výše zmíněných molekul nukleových kyselin mohou být například způso45 beny substitucí (substitucemi), deleci (delecemi), adicí (adicemi), inzercí (inzercemi) a/nebo rekombinací (rekombinacemi), a to buď jednotlivě, nebo v kombinaci. To může proběhnout přirozeně nebo to může být vytvořeno dobře známými technikami rekombinantní DNA (viz například techniky popsané v Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub50 lishing Associates a Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Homologie dále znamená, že příslušné molekuly nukleových kyselin nebo kódované proteiny jsou funkčně a/nebo strukturně ekvivalentní. Mezi molekuly nukleových kyselin, které jsou homologní k výše zmíněným molekulám nukleových kyselin a které jsou deriváty zmíněných molekul nukleových kyselin, patří například varianty zmíněných molekul nukleových kyselin, které představují modifikace se stejnou biolo55 gickou funkci, zvláště pak kódující protein se stejnou nebo v podstatné míře stejnou biologickou
-4CZ 301853 B6 aktivitou, jak je to zde definováno. Mohou to být přirozené varianty, jako například sekvence kódující SAT proteiny z jiných prokaryontů a rostlin, v tomto pořadí, nebo mutanty. Tyto mutanty se mohou vyskytovat přirozeně, nebo mohou být získány mutagenezními technikami (viz výše). Alelické varianty mohou být přirozeně se vyskytující alelické varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vzniklé genetickým inženýrstvím (viz výše). Tak například aminokyselinové sekvence rostlinných SAT sdílí výraznou podobnost s bakteriálními serinacetyltransferázami (Vuorio, 1994; Bogdanova a Hell, 1997). Nejvíce konzervovaný úsek v rámci všech SAT z bakterií i rostlin se nachází na C-konci a předpokládá se, zeje zodpovědný za transferázovou aktivitu (Vaara, 1992; Vuorio, 1994). V tomto konzervovaném úseku se nachází io hexapeptidový motiv, kteiý byl u bakteriálních acetyltransferáz označen za katalytickou doménu a v nedávné době byla také prokázána přítomnost tohoto motivu v místě styku OAS-TL/SAT u cystě insyntetázového komplexu z Arabidopsis thaliana (Bogdanova a Hell, 1997). Navíc mohou být použity v souladu s tímto vynálezem molekuly nukleových kyselin, které kódují homology nebo analogy k výše zmíněným proteinům, které mají SAT aktivitu, ale jinak jsou těmto protei15 nům nepříbuzné. MalY z E.coli kóduje enzym, který je zapojen do příjmu a metabolismu maltosy a maltodextrinu maltosového systému E.coli, ale má navíc enzymovou aktivitu cystathionin-Blyasy (viz Zdych, J. Bacteriol. 177 (1995), 5035 až 5039). Zmíněné proteiny však nejsou vzájemně, na základě porovnání aminokyselinových sekvencí, homologní. Takové proteiny, které nevykazují výraznou homologii k běžným proteinům SAT mohou být identifikovány odborníkem pomocí technik dobře známých v oboru, například komplementací mutantních genů zapojených v biosyntetické cestě cysteinu nebo methioninu, například v odpovídajících mutantních kmenech E.coli (viz také Zdych - viz výše). Proteiny kódované různými deriváty, variantami, homology nebo analogy výše zmíněných molekul nukleových kyselin mohou sdílet společné, specifické vlastnosti, např. molekulovou hmotnost, imunologickou reaktivitu, konformaci, atd., a také fyzi25 kální vlastnosti, jako např. elektroforetickou mobilitu, chování při chromatografií, sedimentační koeficienty, pH optimum, teplotní optimum, stabilitu, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, atd. Všechny tyto molekuly a deriváty nukleových kyselin mohou být použity podle vynálezu, pokud druh enzymové aktivity kódovaného proteinu zůstává v podstatné míre neovlivněn, jmenovitě pokud výsledný protein má SAT aktivitu, jak bylo definováno výše.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je u rekombinantní molekuly DNA molekula nukleové kyseliny funkčně spojena s nukleotidovou sekvencí kódující tranzitní peptid, který je schopen nasměrovat protein (proteiny) do požadovaného buněčného kompartmentu. Molekula nukleové kyseliny může být podle vynálezu modifikována takovým způsobem, aby byl kódovaný protein lokalizován do jakéhokoli požadovaného kompartmentu rostlinné buňky. Mezi ně patří endoplazmatické retikulum (KDEL, Schouten, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 až 793). vakuola (Neuhaus. PNAS 88 (1991), 10362 až 10366), mitochondrie (Chaumont, Plant Mol. Biol. 24(1994), 631 až 641), plastidy (Futr, EMBO J. 5 (1986), 2063 až 2071), apoplast (von Schaewen, EMBO J. 9 (1990), 3033 až 3044), cytoplasma, atd. Odborníkům jsou dobře známy způsoby provádění těchto modifikací a signální sekvence, které určují lokalizaci do požadovaného kompartmentu. S výhodou je tímto kompartmentem plastid. Jak je popsáno v přiložených příkladech, byl protein se SAT aktivitou směrován do chloroplastu s pomocí trans lační fúze s 5 '-signální sekvencí malé podjednotky rubisca.
Molekula nukleové kyseliny použitá ve způsobu podle vynálezu je funkčně připojena k řídicím sekvencím, které umožňují expresi molekul nukleových kyselin v rostlinných buňkách. S výhodou zmíněné regulační úseky obsahují promotor aktivní v rostlinných buňkách. Exprese zahrnuje transkripci molekuly nukleové kyseliny do mRNA, která umožňuje translaci. Odborníkům v oboru jsou dobře známy regulační úseky umožňující expresi v rostlinných buňkách.
Tyto regulační úseky mohou být homologní nebo heterologní s ohledem na molekulu nukleové kyseliny, která má být exprimována, stejně tak jako s ohledem na rostlinný druh, který má být transformován. Obecně takové regulační úseky obsahují promotor aktivní v rostlinné buňce. K dosažení exprese ve všech pletivech transgenní rostliny jsou s výhodou použity konstitutivní promotory, jako je CaMV 35S promotor (Oděli, Nátuře 313 (1985), 810 až 812) nebo promotory
-5 CZ 301853 B6 polyubikoitinových genů z kukuřice (Chrístensen, Plant. Mol. Biol. 18 (1982), 675 až 689). K dosažení exprese ve specifických pletivech transgenní rostliny lze použít tkáňově specifické promotory (viz například Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245 až 2251). Známé jsou také promotory, které jsou specificky aktivní v hlízách brambor nebo v semenech různých druhů rostlin, jako je např. kukuřice, Vicia, pšenice, ječmen, atd. Indukovatelné promotory mohou být použity za účelem schopnosti přesného řízení exprese. Příkladem indukovatelných promotorů jsou promotory genů kódujících proteiny tepelného šoku. Také regulační úseky specifické pro mikrospory spolu s jejich užitím byly popsány (WO 96/16 182). Dále může být zahrnut chemicky indukovatelný testovací systém (Glatz. Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229 až 237). Další vhodné a odborníkům známé promotory byly popsány (například ve Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361 až 366). Regulační úseky dále mohou obsahovat transkripční a/nebo translační zesilovače, které fungují v rostlinných buňkách. Často používaným rostlinným translačním zesilovačem je například CaMV omega sekvence a/nebo inkluze intronu (například intron-1 z Shrunken genu z kukuřice), u nichž bylo prokázáno až lOOnásobné zvýšení expresních hladin (Maíti, Transgenic Research 6 (1997), 143 až 156; Ni, Plant. Journal 7 (1995), 661 až 676). Dále mohou regulační úseky obsahovat terminační signály transkripce, jako je poly-A signál, které vedou k přidání póly A konce k transkriptu, což může zvýšit jeho stabilitu. Obvykle použité terminační signály pochází z genu pro nopalinsyntetázu nebo z CaMV 35S RNA genu.
Ve výhodném provedení vynálezu je u způsobu zmíněný promotor indukovatelný nebo konstitutivně exprimovaný a/nebo se jedná o promotor buněčně, tkáňově nebo orgánově specifický. Výhodné je, když se jedná o promotor specifický pro hlízy, semena, endosperm, embryo nebo floém. Mezi nelimitující příklady patří promotor patatinu B33 (specifický pro hlízy, Rocha—Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23), promotor fazeolinu (specifický pro semena, Karchi, Plant J. 3 (1993), 721 až 727), promotor HMW gluteninu (specifický pro endosperm, Helford, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 117 až 126), promotor a- a β-conglycinu (specifický pro embryo, Fujiwara, Plant Cell Reports 9 (1991), 602 až 606), promotor rolC (specifický pro floém, Lerchl, Plant Cell 7 (1995), 259 až 270).
Tento vynález také popisuje vektory, zvláště pak plasmidy, cosmidy, viry. bakteriofágy a jiné vektory používané obecně v genovém inženýrství, které obsahují molekulu nukleové kyseliny kódující protein mající SAT aktivitu. Ke konstrukci různých plasmidů a vektorů mohou být použity metody dobře známé odborníkům (viz například techniky popsané v Sambrook, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates a Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Alternativně mohou být molekuly rekombinantní DNA a vektory rekonstituovány do lipozomů pro doručení do cílových buněk.
Výhodou je, když výše popsané vektory obsahují selekční a/nebo označitelný markér. Geny pro selekční markéry užitečné k selekci transformovaných rostlinných buněk, kalusů, rostlinných pletiv a rostlin jsou dobře známy odborníkům a obsahují například rezistenci k antimetabolitům jako základ selekce na dhfr, která dodává rezistenci vůči metotrexátu (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143 až 149); na npt, která dodává rezistenci vůči aminoglykosidům neomycinu, kanamycinu a paromycinu (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987 až 995) a hygro, která dodává rezistenci vůči hygromycínu (Marsh, Gene 32 (1984), 481 až 485). Byly popsány další selekční geny, jmenovitě trpB, který umožňuje buňkám využívat indol místo tryptofanu; hisD, který umožňuje buňkám využívat histinol místo histidinu (Hartman, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6—fosfátisomeráza, která umožňuje buňkám využívat manosu (WO 94/20 627) a ODC (omitindekarboxyláza), která dodává rezistenci vůči inhibitorům omitindekarboxylázy 2-(d i fluormetyl)-DL—omitinu, DFMO (McConlogue, 1987, v: Current Communications in Molecular Biology, vydavatelství Cold Spring Harbor Laboratory) nebo deaminasa z Aspergillus terreus, která dodává rezistenci vůči Blasticidinu S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336 až 2338). Užitečné hodnotící markéry jsou také odborníkům dobře známy a jsou komerčně dostupné. S výhodou je užit coby hodnotící markér gen kódující luciferasu (Giacomin, PL Sci. 116(1996), 59 až 72; Scikantha, J. Bact. 178(1996), 121), zelený fluores-6CZ 301853 B6 cenční protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44 až 47) nebo B-glukuronidázu (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901 až 3907). Toto provedení je zvláště výhodné při jednoduchém a rychlém sledování buněk, pletiv a organizmů obsahujících vektor z tohoto vynálezu.
Způsob podle vynálezu je zvláště výhodný pro genetickou manipulaci rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin za účelem zvýšení obsahu sloučenin obsahujících síru a k získání rostlin s modifikovanými, s výhodou se zlepšenými nebo užitečnými fenotypy. Tento vynález tedy poskytuje metodu výroby transgenních rostlin, rostlinných buněk nebo rostlinného pletiva sestávající ze zavedení molekuly nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) io aktivitou do rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva, kde molekula nukleové kyseliny je funkčně spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách do genomu zmíněných rostlin, rostlinných buněk nebo rostlinného pletiva.
Způsoby zavedení cizí molekuly DNA do rostlin jsou také velmi dobře známy v oboru. Patří sem například transformace rostlinných buněk, rostlinného pletiva nebo rostlin pomocí T-DNA při použití Agrobacteria tumefaciens nebo Agrobacteria rhizogenes, fuze protoplastů, přímý přenos genů (viz například EP-A 164 575), injekce, elektroporace, biolistické metody jako je bombardování částicemi a jiné způsoby známé v oboru. Vektory, které jsou použity ve způsobu podle vynálezu, mohou obsahovat další funkční úseky, například sekvence „levého okraje“ a „pravého okraje“ T-DNA Agrobacteria, které umožní stabilní integraci do rostlinného genomu. Dále jsou odborníkům známy vektory a způsoby, které umožňují výrobu transgenních rostlin, které neobsahují markéry, tj. gen se selekčním nebo označitelným markérem je ztracen v určité fázi vývoje rostliny nebo při křížení rostlin. Toho je možné dosáhnout například kotransformací (Lyznik, Planí Mol. Biol. 13 (1989), 151 až 161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91 až 104) a/nebo s použitím systémů, které využívají enzymy schopné podpořit homologní rekombinaci u rostlin (viz například WO 97/08 331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353 až 361); Lloyd, Mol, Gen. Genet. 242 (1994), 653 až 657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170 až 176; Onouchi, Nucl. Acids Res, 19 (1991), 6373 až 6378). Způsoby přípravy vhodných vektorů jsou popsány například v Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. vydání (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Vhodné kmeny Agrobacteria tumefaciens a vektory stejně tak jako transformace Agrobacteria a vhodná růstová a selekční prostředí jsou odborníkům dobře známé a byly již dříve popsány (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383 až 396; C58C1 (pGV
3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984),
8711; Koncz. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467 až 8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20(1992), 963 až 976; Koncz, Specialized vectors for gene tagging and expression studies, v: Plant Molecular Biology Manual díl 2., Gelvin and Schilperoort (vydavatelé), Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academie Publ. (1994), 1 až 22; EP-A-120 516; Hoekema: The Bina40 ry Plant Vector Systém, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985). kapitola V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1 až 46; An, EMBO J. 4 (1985), 277 až 287). Přestože je výhodné použít Agrobacteria tumefaciens ve způsobu vynálezu, mohou být použity jiné kmeny Agrobacteria, jako Agrobacterium rhizogenes a to například tehdy, je-li požadován fenotyp daného kmene.
Metody transformace s použitím bíolistických metod jsou odborníkům dobře známy; viz například Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37 až 48; Vasil. Bio/Technology 11 (1993), 1553 až 1558 aChristou (1996) Trends in Plant Science 1, 423 až 431. Může být provedena mikroinjekce, jak je to popsáno v Potrykus a Spangenberg (vydavatelé), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).
Transformace většiny dvouděložných rostlin je možná s použitím výše popsaných metod. Ale také pro transformaci jednoděložných rostlin bylo vyvinuto několik úspěšných technik. Sem patří transformace s použitím bíolistických metod, například jak byly popsány výše, podobně jako transformace protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, zavedení DNA s použitím skleněných vláken atd.
-7CZ 301853 B6
Obecně mohou být rostliny, rostlinné buňky a rostlinné pletivo, které je možné modifikovat rekombínantní molekulou DNA nebo vektorem podle vynálezu a které vykazují (vyšší) expresi proteinů se SAT, případně CyS aktivitou, samostatně, odvozeny od jakéhokoli rostlinného druhu.
Mohou to být jednoděložné nebo dvoudě ložné rostliny. Ve výhodném provedení tyto patří do rostlinných druhů výhodných pro zemědělství, lesnictví, nebo okrasné květiny. Jedná se například o plodiny (tj. kukuřice, rýže, ječmen, pšenice, žito, oves, atd.), brambory, rostliny produkující olej (tj. řepka olejka, slunečnice, podzemnice olejna, sója, atd.), baví nik, cukrová třtina, cukrová řepa, luskové rostliny (tj. fazole, hrášek, atd.), rostliny produkující dřevo, s výhodou stromy, io atd.
Tento vynález také popisuje buňky transgenních rostlin obsahující ve svém genomu stabilně integrovanou molekulu nukleové kyseliny kódující protein se SAT aktivitou, která je spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi nukleové kyseliny v rostlinné buňce, a kde molekula nukleové kyseliny je cizí pro transgenní rostlinu.
Termínem „cizí“ je zde myšleno, že daná molekula nukleové kyseliny je heterologní vzhledem k rostlinné buňce, to znamená, že je odvozena zjiného organismu s jiným genomovým původem, neboje homologní vzhledem k rostlinné buňce, aleje lokalizována v jiném genomovém prostředí než je přirozeně se vyskytující protějšek této molekuly. To znamená, že jestliže je molekula nukleové kyseliny homologní vzhledem k rostlinné buňce, pak není umístěna v její přirozené pozici v genomu zmíněné rostlinné buňky, zejména je obklopena jinými geny. V tomto případě může být molekula nukleové kyseliny řízena jejím vlastním promotorem neboje řízena heterologním promotorem.
Přítomnost a exprese molekuly nukleové kyseliny kódující protein mající SAT aktivitu v transgenní rostlinné buňce vede k syntéze proteinů, což má vliv například na odolnost rostlinných buněk vůči stresu a vede k odpovídajícím fyziologickým a fenotypovým změnám u rostlin, které obsahují takové buňky. Jak je popsáno v připojených příkladech, je u rostlin, které exprimují konstitutivně SAT z E.coli, vysoká hladina cysteinu. Navíc byl v porovnání s rostlinami divokého typu významně vyšší obsah tripeptidu glutathionu (y-glutamylcysteinylglycin), protože tato sloučenina je hlavní zásobní formou redukované síry v rostlinné říši a slouží jako hlavní odvod vyrobeného cysteinu. Kromě toho, že glutathion hraje zásadní roli při regulaci příjmu simých živin, je také důležitým faktorem při obraně rostlin proti různým druhům stresu, včetně vysokých intenzit osvětlení, sucha, zimy, tepla a nedostatku minerálů (Smith, 1990; Rennenberg a Brunold, 1994). Tento tripeptid je v rostlině, stejně jako v jiných organismech syntetizován ve dvou enzymově katalyzovaných reakcích ze základních aminokyselin (Mister a Anderson, 1983; Rennenberg, 1995).
Jak bylo zmíněno výše, cystein-y-syntetáza je schopna využívat cystein jako substrát obsahující síru. Jelikož bylo demonstrováno v tomto vynálezu, že transgenní rostliny vysoce exprimující protein se SAT aktivitou mají významně vyšší obsah cysteinu, lze si představit, že koexprese molekuly nukleové kyseliny kódující protein s CyS aktivitou by tedy měla vést k synergickému účinku při tvorbě methioninu, protože jak klíčový enzym biosyntézy methioninu, tak jeho sub45 strát jsou v rostlině produkovány v nadměrném množství.
Popsaná transgenní rostlinná buňka může rovněž obsahovat selekční markér. Jak bylo uvedeno výše, je možné užít různé selekční markéry podle vynálezu. Výhodné je použití selekčních markérů, které jsou vhodné pro přímou selekci transformovaných rostlin, např. gen pro fosfinotricin50 N-acetyltransferázu, jehož produkt detoxifikuje herbicid L-fosfinotricin (glufosinát nebo BASTA); viz například De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513 až 2518 a Dróge, Planta 187 (1992), 142 až 151.
Dále tento vynález popisuje transgenní rostliny a rostlinná pletiva, která obsahují výše popsané transgenní rostlinné buňky nebo buňky, které je možné získat s použitím výše popsaných metod.
-8CZ 301853 B6
Ty mohou například vykazovat zvýšenou odolnost vůči stresu. Je výhodné, když je v transgenních rostlinách podle vynálezu zvýšená hladina glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu v porovnání s rostlinami divokého typu. Vzrůstem hladiny glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu se rozumí zvýšení hladiny kterékoli zmíněné sloučeniny obsahující síru, a to buď samostatně, nebo v kombinaci v transgenních rostlinných buňkách, rostlinném pletivu nebo rostlinách podle vynálezu, a to řádově alespoň o 10 % ve srovnání s odpovídajícími netransformovanými rostlinnými buňkami, pletivem nebo rostlinou divokého typu, které již poskytují užitečné účinky na vitalitu rostliny, jako je např. zvýšená odolnost vůči stresu. S výhodou je obsah výše zmíněných sloučenin zvýšen o nejméně 50 %, výhodněji o 75 %, ve zvláště výhodném provedení o nejméně io 100 % nebo více a ještě výhodněji o více než asi 200 %. Vzhledem k celkovému obsahu cysteinu, methioninu a glutathionu je možné dosáhnout od 10- do 20násobného zvýšení obsahu látek obsahujících síru v porovnání s hladinou volného cysteinu u rostlin divokého typu, přestože se předpokládá možnost ještě většího zvýšení hladiny látek obsahujících síru u rostlin z tohoto vynálezu.
S výhodou hladina volného cysteinu u popsaných rostlin dosahuje hodnoty vyšší než 20 nmol/g živé váhy (gfw) listového pletiva, výhodně vyšší než 30 nmol/gfw a výhodněji vyšší než 40 nmol/gfw (viz také Příklad 2). Dále obsah glutathionu u popsaných rostlin může být s výhodou 350 nmol/gfw, výhodněji vyšší než 500 nmol/gfw. Obsah methioninu může být zvýšen asi
5krát, s výhodou více než 1 Okřát.
Vynález dále popisuje zpracovatelné části a propagační materiál popsaných transgenních rostlin, které obsahují výše popsané transgenní rostlinné buňky, a/nebo které jsou odvozeny od výše popsaných rostlin a vykazují zvýšené hladiny obsahu sloučenin obsahujících síru, jak je popsáno výše. Zpracovatelné části mohou být v principu užitečné části rostliny, např, listy, stonky, plody, semena, kořeny, atd. Propagační materiál zahrnuje např. semena, plody, řízky, klíčky, hlízy, oddenky, atd.
Dále tento vynález popisuje použití molekuly nukleové kyseliny kódující protein se SAT aktivi30 tou k výrobě transgenních rostlin, které vykazují zvýšenou hladinu glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu. S výhodou se odráží zmíněná zvýšená hladina methioninu nebo cysteinu ve zrychlených procesech zrání, pozměněných květech a/nebo odolností k patogenům.
Konstitutivní exprese genu SAT cysE z E.coli v transgenních rostlinách brambor přímo ukazuje in vivo, že reakce katalyzovaná SAT je opravdu rychlosti imituj ící pro biosyntézu cysteinu u rostlin, jak je to ukázáno vysokými hladinami cysteinu u transformantů (viz přiložené příklady). Dále, jak bylo diskutováno výše, se očekává, že odpovídající vysoké hladiny glutathionu v transgenních rostlinách jsou schopny dodat odolnost vůči různým druhům stresu. U rostlin hraje glutathion důležitou roli při obraně proti aktivnímu kyslíku, xenobiotikům, těžkým kovům a jiným formám stresu, včetně sucha, tepla a nedostatku minerálů (Alscher, 1989; Smith, 1990; Schmidt a JSger, 1992; Rennenberg a Brunoldt, 1994; Rennenberg, 1995). Znalost tohoto má také praktickou důležitost. Vyšší odolnost rostlin vůči aktivnímu kyslíku může v budoucnu hrát velmi důležitou roli, když bereme v úvahu zvýšenou koncentraci ozonu v atmosféře. Navíc i zvýšená odolnost proti xenobiotikům, například herbicidům, coby výsledek zvýšené hladiny glutathionu u rostlin podle vynálezu je přiměřená. Dále, možnou strategií je konstrukce transgenních rostlin, které jsou schopny růst na vysokých koncentracích těžkých kovů a které by tudíž byly použitelné při bioremediacích. Dále by mohly být rekombinantní molekuly DNA avektoiy podle vynálezu užitečné pro úpravu nebo modifikaci interakcí patogenu a rostliny. Výraz „patogen“ zahrnuje například bakterie, viry, houby či protozoa.
Popsané transgenní rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny mohou být použity, jak již bylo popsáno výše, ke zmírnění toxických následků polutantů v půdě včetně vodní ekonomie. Přítomnost polutantů může být přirozená nebo může být způsobena těžbou, průmyslem nebo urbanistickými aktivitami. Mezi takové polutanty patří ty, které jsou schopny inaktivovat proteiny obsahu55 jící síru, zejména enzymy, nebo fungují jako antagonisti či inhibitory biosyntézy cysteinu a/nebo
-9CZ 301853 B6 methioninu. Příklady takových antagonistů nebo inhibitorů jsou herbicidy, fungicidy, pesticidy a zvláště pak ionty kovů, například Hg2+. Zvýšená hladina GSH způsobená expresí molekul nukleové kyseliny kódující protein mající SAT aktivitu ve výše popsaných rostlinách může například umožnit zemědělské využití půdy, která by byla jinak nevhodná kvůli přítomnosti toxických sloučenin, které např. interferují s enzymy obsahujícími síru a tudíž s rostlinným růstem. Toto platí zejména pro půdu, která obsahují velké množství těžkých kovů. Navíc mohou být rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny podle vynálezu využity k remediaci půd kontaminovaných polutanty. Výhodný vedlejší účinek tkví v tom, že například zvýšená odolnost rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin z tohoto vynálezu vůči kovům, způsobená přítomností molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru z tohoto vynálezu, může být využita k „biotěžbě“ (Cunningham, TIBTECH 13 (1995), 393 až 397). To znamená, že rostliny, rostlinná pletiva a rostlinné buňky z tohoto vynálezu mohou být využity k fytoextrakci kovů, např. rtuti, niklu a mědi. Navíc, jak bylo zmíněno výše, vyšší obsah GSH v popsaných rostlinných buňkách, rostlinných pletivech a rostlinách může způsobit zvýšení odolnosti. Dále se očekává zlepšený růst klíčků a zlepšená produkce biomasy v důsledku vysoké hladiny GSH přítomné u výše popsaných rostlinných buněk nebo rostlinných pletiv a rostlin. Souhrnně řečeno, zvýšení obsahu GSH má mnohočetný účinek na vitalitu rostlin a je velmi důležité pro pěstitele rostlin.
Tento vynález rovněž popisuje použití molekuly nukleové kyseliny kódující protein, kteiý má
SAT aktivitu, rostlinných buněk, rostlinných tkání a rostlin z tohoto vynálezu, nebo jejich zpracovatelných částí nebo propagačního materiálu k výrobě potravin, krmi v pro zvířata, ke zlepšení obranyschopnosti proti patogenům, k vytvoření odolnosti vůči těžkým kovům nebo herbicidům, ke zlepšení tvorby biomasy, k posílení růstu klíčků, k vytvoření odolnosti vůči biotickému i abiotickému stresu nebo ke zlepšení chuťových vlastností a/nebo vůně potravin nebo krm i v. Pop25 sáné použití molekuly rekombinantní DNA nebo vektoru k vytvoření odolnosti k herbicidům zahrnuje například jejich použití jako selekčních markérů v rostlinách v souladu s jinými systémy, které využívají (nadměrnou) expresi enzymů schopných dodat odolnost (tj. rezistenci) vůči účinku herbicidu ničícímu rostlinnou buňku. Příkladem takového systému je vysoká exprese enzymu 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntetázy (EPSPsytetasy), který navozuje odolnost vůči herbicidu glyfosfátu. Podobným způsobem mohou být použity popsané molekuly rekombinantní DNA a vektory k navození odolnosti vůči sloučeninám, které působí na enzymy obsahující síru např. navázáním sloučeniny zodpovědné za inhibici zmíněných enzymů vysokým obsahem cysteinu, GSH a/nebo methioninu nebo pomocí peptidů a proteinů přítomných ve vysokém obsahu díky zvýšenému obsahu aminokyselin obsahujících síru.
Jak bylo popsáno výše, nutriční hodnota rostlin, rostlinných pletiv a rostlinných buněk podle vynálezu, stejně jako nutriční hodnota zpracovatelných částí a propagačního materiálu takových rostlin je výrazně zlepšena v souvislosti se zvýšeným obsahem sloučenin obsahujících síru. Tento vynález se tedy také týká krmiv a potravin nebo jejich přísad, které obsahují popsané rostlinné buňky, rostlinná pletiva a rostliny, zpracovatelné části nebo propagační materiál. Tyto potraviny, krmivá a přísady mají s výhodou zvýšený obsah cysteinu, methioninu a/nebo glutathionu, jak bylo popsáno výše.
Tyto a další provedení vynálezu jsou popsány a zahrnuty popisem a příklady tohoto vynálezu.
Dále literatura týkající se kteréhokoli způsobu, použití a sloučeniny k využití podle tohoto vynálezu může být získána z veřejných knihoven, s použitím např. elektronických zdrojů. Může být použita například veřejná databáze „Medline“, která je přístupná na internetu, například na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Další databáze a adresy, jako např. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_- tools.html, http://www.tigr.org/, jsou známy odborníkům a mohou být získány i prostřednictvím např. http://www.lycos.com. Přehled informací o patentech z oblastí biotechnologie a přehled relevantních zdrojů informací o patentech, které jsou užitečné pro zpětné hledání a nej novější znalosti je v Berks, TIBTECH 12 (1994), 352 až 364.
55.
- 10CZ 301853 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 (a) Analýza celkové RNA extrahované z listů pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT-65, 26, 48, 3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b) s pomocí Northern blotu. Blot byl testován DNA cysE z E.coli, značenou 32P. Jednotlivé běhy obsahovaly každý 15 pg celkové RNA.
ío (b) Maximální katalytická aktivita SAT v listech pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT-65, 26, 48, 3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b). Specifická aktivita surových extraktů je dána v pmol vytvořeného CoA za minutu na pg celkového proteinu. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10 %). N = 4 nezávislá měření.
Obrázek 2 (a) Endogenní hladiny cysteinu v listech 6 týdnů starých transgenních rostlin (SAT-48 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Množství cysteinu je dáno v nmol na gfw. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 20). N - 18; 6 nezávislých rostlin na transgenní linii, 3 nezávislá měření na jednu rostlinu.
(b) Endogenní hladiny glutathionu v listech 6 týdnů starých transgenních rostlin (SATM8 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Množství glutathionu je dáno v nmol na gf\v. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10). N = 18; 6 nezávislých rostlin na transgenní linii, 3 nezávislá měření na jednu rostlinu.
Obrázek 3
Analýza celkové RNA extrahované z listů pěti nezávislých transgenních rostlin (SAT—65, 26, 48,
3 a 71) a dvou rostlin divokého typu (Kontrola a a b) s pomocí Northern blotu. Blot byl testován cDNA OAS-TL (p), značenou 32P, a také cytosolickou isoformou (c). Jednotlivé běhy obsahovaly každý 15 pg celkové RNA.
Obrázek 4
Aktivita OAS-TL in vitro v listech transgenních rostlin (SAT-48 a SAT-26) a rostlin divokého typu (Kontroly a a b). Specifická aktivita surových extraktů je dána v pmol vytvořeného cysteinu za minutu na pg celkového proteinu. Chybové úsečky představují standardní odchylku (< 10 %). N - 4 nezávislá měření na jednu rostlinu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Hledání transgenní rostliny bramboru, který obsahuje mRNA SAT z E.coli
K nasměrování SAT z E.coli do chloroplastů rostlin byla zkonstruována fuze s transitním pepti50 dem rubisca z Arabidopsis. SAT z genomové knihovny E.coli byl amplifikován s pomocí PCR s použitím dvou syntetických oligonukleotidů (EcSAT-N: 5'-GAG AGA CCA TGG CGT GTG
AAG AAC TGG AAA, EcSAT-C: 5 - GAG AGA TCT AGA TTA GAT CCC ATC CCC ATA). Dvoj řetězcová DNA byla štěpena enzymy Nco I a Xba I a klonována za transitní peptid. Fúzovaný genový produkt byl vložen jako Asp 718/Xho I fragment do binárního vektoru předem naštěpeného enzymy Asp 718/Sal í (Hófgen a Willmitzer, 1990) pod kontrolu promotoru
35S-CaMV. Plasmid byl vložen do brambor s použitím Agrobacteria tumefaciens (Solanum tuberosum cv Désirée), jak bylo popsáno v Rocha-Sosa a kol. (1989). Solanum tuberosum bylo získáno od Vereinigte Saatzuchten eG (Ebstorf, SRN). Rostliny divokého typu a transgenní rostliny byly drženy ve tkáňové kultuře, v cyklu 16 h světlo/8 h tma, na médiu podle Murashige a Skooga (Murashige a Skoog. 1962), ke kterému byla přidána 2% (hmotn./obj.) sacharosy při 22 °C. Ve skleníku byly rostliny kultivovány při 22 °C v průběhu světelné periody (16 h) a při 15°C v průběhu temné periody (8 h), Rostliny byly kultivovány v samostatných květináčích a kontinuálně zalévány.
Transgenní rostliny brambor uchovávané ve formě tkáňové kultury byly vizuálně nerozeznatelné od netransformovaných kontrolních rostlin. Při hledání rostlin exprimuj ících mRNA SAT z E.coli bylo náhodně vybráno padesát rostlin, kterým byl odebrán vzorek listu. Tyto vzorky byly podrobeny analýze za pomoci blotování RNA gelu s použitím radioaktivně značené sondy zcDNA SAT z E.coli. Pro izolaci RNA byly vzorky listů zmraženy v tekutém dusíku ihned po odebrání. Celková RNA byla extrahována ze zmraženého materiálu podle Logemann a kol. (1987). Po denaturaci při 65 °C byla celková RNA separována za denaturujících podmínek gelovou elektroforézou (Lehrach, 1977) a poté přenesena na nylonové membrány. Northern hybridizace byla provedena při vhodné teplotě podle popisu v Amasino (1986). Northern bloty byly třikrát promyty po třiceti minutách při 55 °C v 0,5 x SSC; 0,2% SDS. Značení fragmentů fosforem 32P bylo provedeno s použitím „Multiprime DNA-labelling-Kiť‘ (Amersham Buchler, Braunschweig, SRN). Pět nezávislých transformantů, které akumulovaly vysoké množství cizí SAT mRNA, bylo vybráno k dalším analýzám a přeneseno do skleníku. Opakované Northern analýzy ukázaly, že i ve skleníku akumulují transformanty velké množství cizí mRNA (Obr. la). Délka transkriptu detekovaného u transgenních rostlin bramboru (~ 1050 párů bází) souhlasila s délkou zaznamenanou pro gen cysE, jmenovitě 819 pb (Denk a Bdck, 1987) a použitou sekvencí rubisca (~ 240 pb). K měření enzymové aktivity SAT byla použita metoda podle Krediche a Tomkinse (1966). Tato metoda je založena na výměně disulfidu mezi CoA, uvolněným z acetylového zbytku v průběhu reakce katalyzované SAT, a 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou. Tvorba CoA byla analyzována v 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), obsahující 1 mM 5,5'dithiobis-(2-nitrobenzoové) kyselině, 1 mM EDTA, 20 mM L-serinu a 100 μΜ acetylCoA. Reakce byla startována přídavkem 10 μΐ surového extraktu z listů (1,5 pg/μΙ celkového proteinu), teplota inkubace reakce byla 25 °C. Tvorba thiobenzoové kyseliny byla monitorována spektrofotometricky při 412 nm (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) proti slepému kontrolnímu vzorku, který obsahoval veškerý materiál s výjimkou L-serinu. Kalibrační křivka byla sestrojena s kontrolními roztoky obsahujícími veškerý materiál a rozdílné koncentrace CoA (0 až 200 nmol/ml). Měření aktivity bylo nezávisle opakováno s různými objemy surového extraktu z listů, tj. 20, 40 a 60 μΙ. Analýza aktivity SAT v surových extraktech listů ukázala, že rostliny brambor, které exprimují gen z E.coli, konvertují serin na OAS mnohem efektivněji, než je tomu u netransformovaných kontrolních rostlin (Obr. lb). Tento fakt naznačuje, že transformované rostliny disponují vyšší aktivitou SAT, a to pravděpodobně v důsledku cizí serinacetyltransferázy z E.coli. Navzdory silnému zvýšení aktivity SAT v listech transgenních rostlin nebyla vizuálně pozorována žádná dramatická změna ve fenotypu těchto rostlin s jedinou výjimkou: u transformantů 48 byla snížena apikální dominance, která měla za následek keřovitý fenotyp. Zajímavostí je, že transformant 48 měl ze všech transgenních rostlin nej vyšší aktivitu SAT.
Příklad 2
Exprese genu cysE vede ke vzrůstu endogenních hladin cysteinu a glutathionu
Biosyntéza cysteinu v rostlinách probíhá dvoustupňovou reakcí. Tvorba cysteinu ze sulfidu a O-acetyl-L-serinu je katalyzována 0-acetylserin(thiol)lyasou. O-acetyl-L-serin je syntetizován serinacetyltransferázou z acety (koenzymu A a šeřinu (Brunold a Rennenberg, 1997). Aby mohl být zjištěno, zda má exprese genu cysE v rostlinách brambor vliv na endogenní hladinu
- 12CZ 301853 B6 cysteinu, byla měřena koncentrace této aminokyseliny obsahující síru u transformovaných a netransformovaných rostlin. Thioly byly připraveny podle Rtiegseggera a Brunolda (1992). Separace a kvantifikace byly provedeny na HPLC s obrácenými fázemi po derivatizaci monobromobimanem. jak je popsáno v Newton a kol. (1981). Jako modifikace byla provedena redukce disulfidů bis-2-merkaptoethylsulfonem a značící reakce s monobromobimanem byla zastavena 15% HCl.
Zmrazený materiál listů byl homogenizován nájemný prášek, a poté extrahován 20 min v 0,1 N HCl (2 ml/0,2 gfw) pri 4°C. Po centrifugací směsi při 4 °C (20 min, 14 000 g) bylo přidáno io 120 μΐ supematantu přidáno k200pl 0,2M 2-{cyklohexylamino)ethansulfcnové kyselině (pH
9,3). Redukce všech disulfidů byla provedena přidáním 10 μΐ bis-2-merkaptoethylsulfonu v 9 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (pH 8). Reakce byla ponechána 40 minut při pokojové teplotě, a pak byly volné thiolové skupiny obarveny monobromobimanem. Za tímto účelem bylo k reakční směsi přidáno 20 μ 1 15 mM monobromobimanu v acetonitrilu, a to bylo pak ponecháno 15 minut v temnu pri pokojové teplotě. Reakce byla zastavena přídavkem 250 μΐ 15% HCl. Reakční směs byla 2 hodiny ponechána na ledu v temnu, pak znovu zcentrifugována při 4 °C (10 minut. 14000 g). Supematant byl zředěn vhodným množstvím 0,1 N HCl, aby mohla být provedena analýza cysteinu a glutathionu. Vzorky byly analyzovány metodou podle Schuppa a Rennenberga (1988) s použitím HPLC kolony s obrácenými fázemi (C^, 250 x 4 mm, velikost částic 5 pm,
Macherey-Nagel, Oensingen, Švýcarsko), Byl použit rozpouŠtědlový systém obsahující 10% methanol; 0,25% kyselinu octovou, pH 3,9 (NaOH) a 90% methanol; 0,25% kyselina octovou s průtokem 1,5 ml/min. Po chromatografií následovala fluorescenční detekce (excitace při 380 nm, emise pri 480 nm, fluorescenční detektor SFM 25, Kontrol, ZUrich, Švýcarsko). Chromatogramy byly kvantifikovány integrací ploch pod píky. K analýze cysteinu byly použity dva transformanty s nejvyšší hladinou aktivity SAT, tj. SAT—48 a SAT-26 (viz obr. 2b). Za tímto účelem byly zpracovány a extrahovány mladé, zelené listy z pět týdnů starých rostlin a obsah cysteinu byl změřen za pomoci HPLC. Transgenní rostliny brambor, které exprimovaly gen cysE z E.coli vykazovaly výrazně zvýšené hladiny cysteinu (viz obr. 3a). Hladiny u transformantů SAT—48 dosahovaly skoro trojnásobku (45 ± 10 nmol na gram čerstvé váhy listového pletiva) a u trans30 formanta SAT-26 dvojnásobku (33 ± 6 nmol/gfw) oproti hladinám nalezeným u netransformovaných kontrolních rostlin (17 ± 3 nmol/gfw), což ukazuje, že exprese cysE vede ke zvýšení endogenní hladiny aminokyseliny cysteinu.
Jedním z hlavních odvodů cysteinu, který je produkován asimilačně redukční kaskádou síranů, je tvorba glutathionu, tripeptidu složeného z aminokyselin: kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Když vezmeme v potaz, že cystein je jedním ze substrátů při produkci glutathionu, je možné, že by to mohlo mít účinek na biosyntézu glutathionu, protože rostliny exprimující SAT z E.coli obsahovaly zvýšenou hladinu cysteinu. Ke zjištění, zda se jedná o tento případ, byly analyzovány hladiny glutathionu v listech transgenních linií SAT—48 a SAT-26 a rostlin divokého typu. Tato měření prokázala, že oba transformanty mají výrazně zvýšené hladiny glutathionu, a to až na dvojnásobnou hodnotu (500 až 600 nmol/gfw) než tomu je u rostlin divokého typu (300 až 350 nmol/gfw; viz obr. 2b). To ukazuje na to, že zvýšené hladiny cysteinu stimulují biosyntézu glutathionu.
Maje na mysli, že jedna molekula glutathionu obsahuje jednu molekulu cysteinu a že celková molámí množství glutathionu v listech brambor více než desetinásobně převyšuje molámí množství volné aminokyseliny cysteinu, je možné usuzovat, že kapacita syntézy cysteinu v rostlinách transgenních brambor je zvýšena mnohem více než jen dva až třikrát, jak by bylo možno vyvodit z pouhého porovnání hladin volného cysteinu. Absolutní nárůst o 200 až 300 nmol glutathionu na gram čerstvé váhy u transgenních rostlin, odpovídá tedy přibližně 10 až 18násobnému zvýšení biosyn tetické kapacity cysteinu v případě, že je v listech rostlin divokého typu obsaženo okolo 15 až 20 nmol cysteinu/gťw. Když k tomu přidáme zvýšené hladiny volného cysteinu u transgenních rostlin dva až třikrát, biosyntéza cysteinu u transformantů je až 20násobně zvýšena ve srovnání s kontrolními rostlinami.
- 13CZ 301853 B6
Příklad 3
Vzrůst endogenních hladin cysteinu a glutathionu neovlivňuje expresní profil isoforem OAS—TL
U enzymu melounu byla popsána metabolicky významná regulace aktivity SAT alosterickou inhibici cysteinu (Saito, 1995). Bakteriální enzymy SAT jsou na transkripční úrovni zpětně inhibovány mikromolámími koncentracemi cysteinu. Na druhou stranu je exprese bakteriálních SAT stimulována v situaci, kdy je množství cysteinu omezeno (Kredich, 1987). Navíc aktivita enzymu 0-acetylserin(thiol)lyasy, což je enzym bezprostředně následující za SAT v reakční kaskádě při io biosyntéze cysteinu, je také regulována cysteinem na transkripční úrovni. Byla zaznamenána stimulace exprese různých cDNA kódujících isoformy O-acetyl serin lyas, specifických pro jednotlivé kompartmenty z Arabidopsis v podmínkách růstu rostlin s omezeným zdrojem síranů (Hell, 1994; Barroso, 1995; Hesse, 1997). Také u špenátu je mírně zvýšená exprese isoforem Oacetylserín(thiol)lyasy v podmínkách s omezeným příjmem síry (Takahashi a Saito, 1996). Aby bylo možné zjistit, zda zvýšené hladiny cysteinu u transgenních rostlin brambor exprimujících gen cysE z E,coli ovlivňují expresní profil endogenního OAS-TL u brambor, byly odebrány vzorky listů transgenních rostlin a rostlin netransformovaných, které byly následně podrobeny analýze RNA blotováním (viz příklad 1). Za účelem radioaktivního značení cDNA OAS-TL z brambor (Hesse a Hofgen, 1998), byla DNA štěpena příslušnými restrikčními enzymy a separo20 vána na 1% agarosovém gelu. Fragmenty DNA byly izolovány z gelu s použitím „NucleoSpin Extraktu“ od Marcherey-Nagel (Diiren, SRN). Tato analýza ukázala, že přestože transgenní rostliny obsahovaly výrazně více cysteinu ve svých listech, transkripční rychlost genů OAS-TL z bramboru (a to jak cytosolická, tak chloroplastová isoforma, Hesse a Hófgen, 1998) nebyla změněna v porovnání s expresní hladinou u rostlin divokého typu (obrázek 3). To ukazuje, že zvýše25 ná hladina cysteinu u transgenních rostlin brambor nemá detekovatelný vliv na expresní profil OAS-TL z brambor na transkripční úrovni.
Příklad 4
Zvýšené endogenní hladiny cysteinu nemají vliv na aktivitu 0-acetyIserin(thiol)lyasy
Aktivita OAS-TL je regulována stavem síry v buňce. Tak například aktivita cytosolické O-acetyl serin(thiol)lyasy z Arabidopsis thalianaje aktivována nedostatkem síty (Barroso, 1995;
Hesse, 1997). Vzrůst specifické aktivity způsobený vyčerpáním síry byl také pozorován u kultury tabáku a u buněk C.reinhardtii a u kukuřičných listů (Bergmann, 1980; Passera a Ghisi, 1982; Leon, 1988). Na druhou stranu vysoké koncentrace síry, jak se zdá, snižují aktivitu OAS-TL. Například enzym z Datura innoxia je inhibován vyššími koncentracemi sulfidů (Kuske, 1994). U buněk C. reinhardtii je aktivita OAS-TL inhibována nejen sulfidy, ale také OAS a cysteinem (Leon a Vega, 1991). Aby bylo možné zjistit, zda zvýšená aktivita SAT a změněné hladiny cysteinu a glutathionu u transgenních rostlin brambor mají účinek na aktivitu OAS—TL, byla testována aktivita tohoto enzymu v surových extraktech z listů. Aktivita 0-acetyserin(thio!)lyasy byla stanovena měřením tvorby L-cysteinu. Každá reakce byla startována přídavkem 5 μί surového extraktu z listů (1 pg/μΐ celkového proteinu). Reakce byly prováděny v 50 mM K2HPO4/KH2PO4 (pH 7,5) v přítomnosti 5 mM DTT, 10 mM O-acetyl šeřinu a 2 mM Na2S (celkový objem byl 100 μί). Reakce běžela 20 minut při 25 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 50 μί 20% trichloroctové kyseliny, a poté byla analyzována tvorba L-cysteinu s použitím Gaitondova činidla (Gaitonde, 1967). Obsah cysteinu byl měřen na spektrofotometru při 560 nm (Ultraspec 2000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) proti slepému kontrolnímu vzorku, který obsahoval veš50 kerý materiál s výjimkou O-acetyl šeřinu. Pokusy byly třikrát opakovány. Přesto tato měření neprokázala žádný rozdíl v aktivitách OAS-TL v extraktech z listů transgenních rostlin a rostlin divokého typu (obrázek 4). Je tedy možné spekulovat, že vyšší hladiny cysteinu a glutathionu u transgenních rostlin nejen že nemají pozorovatelný vliv na úroveň exprese genů, ale také nemají vliv na aktivitu OAS-TL.
- 14CZ 301853 B6
Příklad 5
Exprese u transgenních rostlin brambor, které obsahují SAT z E.coli a rostlinnou CyS mRNA
Dvě transgenní linie, které exprimují SAT z E.coli (např. SAT-48 a SAT-26), byly vybrány k superinfekci binárním plasmidovým konstruktem obsahujícím CyS cDNA, např. z brambor, pod kontrolou 35S promotoru, respektive B33 promotoru, Binární vektor byl odvozen od pBIN19 a umožnil např. rezistenci k hygromycinu u rostlinné selekce. Plasmidy byly zavedeny do transgenních linií SAT-48, respektive SAT-26 s použitím Agrobacteria tumefaciens, jak bylo popsáio no (Racha-Sosa, 1989). Selekční podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Superinfikované transgenní linie exprimující SAT z E.coli a CyS byly hodnoceny z hlediska hladiny RNA (Northern blot), hladiny proteinu (Western blot) a enzymové aktivity. Pokusy s Northern blotem byly prováděny stejně jako v příkladu 1. Linie s vysokou expresí CyS byly vybrány pro obsah proteinu a enzymovou aktivitu. 10 pg proteinu z každého extraktu z listů bylo testováno s pomocí
Western blotu, aby se zjistil vyšší obsah proteinu v porovnání s rostlinami divokého typu a původně použitou transgenní linií. Linie se zvýšeným obsahem proteinu byly navíc analyzovány z hlediska enzymové aktivity. 10 pg, 25 pg, 50 pg a 100 pg extraktu z listů bylo inkubováno spolu s 10 pCi 3?S-cysteinu a 10 mM sukcinylhomoserinem po dobu 30 minut při 30 °C v celkovém objemu 200 pl v 50 mM Tris/HCl, pH 7,8 a 10 mM DTT. Reakce byly zastaveny přídavkem 50 pl 20% TCA. Po neutralizaci a centrifugaci bylo 5 pl z každého supematantu analyzováno tenkovrstevnou chromatografíí. Jako protékající rozpouštědlo byla použita směs methanolu/ethylesteru kyseliny octové:H2O = 60:30:10). U transgenních rostlin s vysokou aktivitou byl dále analyzován obsah GSH, CyS a obsah methioninu.
Literární odkazy
Alscher, Physiol Plant 77 (1989), 457-464 Amasino, Anal Biochem 152 (1986), 304—307
Anderson, Sulfur metabolism in plants. V BJ Miflin, PJ Lea, vydavatelé, The Biochemístry of
Plants. Academie Press, New York (1990), 327-381
Barroso, FEBS Lett 363 (1995), 1-5 Bergmann, Z Naturforsch 35c (1980), 952-957 Bogdanova, FEBS Lett 358 (1995), 43-47 Bogdanova, Plant J 11 (1997), 251-262
Breton, J Biol Chem 265 (1990), 18248-18255 Brunold, Planta 155 (1982), 321-327
Brunold, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1993), 61-76
Brunold, Prog Bot 58 (1997), 164-186
Cook, Arch Biochem Biophys 178 (1977), 293-302
Delhaize, Plant Physiol 89 (1989), 700-706 Denk, J Gen Microbiol 133 (1987), 515-525 Droux, Arch Biochem Biophys 295 (1992), 379-390 Evans, J Bacteriol 173 (1991), 5457-5469 Gaitonde, Biochem J 104 (1967), 627-633
Ghisi, Plant Physiol 92 (1990), 846-849 Ghisi, Photosynthetica 29 (1993), 543-549
Giovanelli, The biochemístry of plants: A comprehensive treatise, amino acids and derivatives. Academie Press, New York 5 (1980), 453-505
Giovanelli, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1990), 33-48
Hell, FEBS Lett 351 (1994), 257-262
Hesse, WJ Gram a kol., vydavatelé, Sulphur Metabolism in Higher Plants, Backhuys Publishers, Leiden, Nizozemí (1997), 227-230
Hesse, Plant Phys 116 (1998), 1604 Kredich, J Biol Chem 241 (1966), 4955^1965
Kredich, J Biol Chem 244 (1969), 2428-2439
- 15CZ 301853 B6
Kredich, Celiular and Molecular Biology. American Society of Microbiology, Washington DC (1987),419-428
Kredich, Academie Publishers, The Hague, Nizozemí (1993), 37—47 Kuske, J Biol Chem 269 (1994), 6223-6232
Kuske, Plant Physiol 112 (1996), 659-667 Lai, Gene 119(1992), 113-118 Lehrach, Biochem 16 (1977), 4743—4751 Leon, J Plant Physiol 132 (1988), 618-622 Leon, Plant Physiol Biochem 29 (1991), 595-599 io Logemann, Anal Biochem 163 (1987), 21-26 Lunn, Plant Physiol 94 (1990), 1345-1352 Meister, Annu Rev Biochem 52 (1983), 711-760 Monroe, J Bacteriol 172(1990), 6919-6929 Murashige, Physiol Plant 15 (1962), 473^479
Murillo, Cell Mol Biol 41 (1995), 425^33
Nakanuta, Plant Cell Physiol 28 (1987), 885-891 Nakamura, Plant Cell Physiol 29 (1988), 689-693 Nakamura, Agric Biol Chem 54 (1990), 649-656 Neuenschwander, Plant Physiol 97 (1991), 253-258
Newton, Anal Biochem 114 (1981), 383-387
Ngo, Can J Biochem 52 (1974), 435-440 Noctor, Plant Physiol 112 (1996), 1071-1078 Noji, Mol. Gen. Genet. 244 (1994), 57-66
Nussbaum, Plant Physiol 88 (1988), 1407-1410 Ostrowski, J Bacteriol 171 (1989), 130-140
Passera, J Exp Bot 33 (1982), 432-438 Rauser, Plant Physiol 97 (1991), 128-138 Ravanel, C R Acad Sci Paris 320 (1997), 497-504 Rennenberg, Plant Physiol 73 (1983), 560-565 Rennenberg, SPB Academie Publishers, The Hague (1990), 276
Rennenberg, Prog Bot 55 (1994), 142-156
Rennenberg, Cambridge University Press, Cambridge, UK (1995), 155-171 Roberts, Plant Mol Biol 30 (1996), 1041-1049
Rocha-Sosa, EMBO J 8 (1989), 23-29 Rolland, Plant Physiol 98 (1992), 927-935
Rolland, Arch Biochem Biophys 300 (1993), 213-222 Rolland, Eur J Biochem 236 (1996), 272-282 Ríiegsegger, Plant Physiol 99 (1992), 428-433 Ruffet, Plant Physiol 104 (1994), 597-604 Ruffet, Eur J Biochem 227 (1995), 500-509
Saito, Proč Nati Acad Sci USA 89 (1992), 8078-8082 Saito, FEBS Lett 324 (1993), 247-252 Saito, J Biol Chem 269 (1994), 28187-28192 Saito. Plant Physiol 106 (1994), 887-895 Saito, J Biol Chem 270 (1995), 16321-16326
Schmidt, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43 (1992), 325-349 Schupp, Plant Sci 57 (1988), 113-117 Smith, Biochem Biophys Res Commun 35 (1969), 939-945 Smith, Biochim Biophys Acta 277 (1971), 288-295 Smith, Plant Physiol 50 (1972), 477-479
Smith, Alscher RG, Cumming JR (vydavatelé) Wiley-Liss, New York (1990), 201-215 Takahashi, Plant Physiol 112 (1996), 273-280 Vaara, FEMS Microbiol Lett 97 (1992), 249-254 von Arb, Physiol Plant 67 (1986), 81-86 Vuorio, FEBS Lett 292 (1994), 90-94
Youssefían, Plant J 4 (1993), 759-769

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Způsob zvýšení obsahu simých sloučenin v transgenních rostlinách, rostlinných buňkách nebo rostlinném pletivu, vyznačující se tím, že sestává ze zavedení molekuly nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) aktivitou do rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinného pletiva, kde molekula nukleové kyseliny je funkčně spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách, přičemž io rostlina, rostlinná buňka nebo rostlinné pletivo neexprimuje exogenně zavedenou molekulu nukleové kyseliny kódující protein s O~acetylserin(thiol)lyázovou (OASTL) aktivitou.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteinem se SAT aktivitou je serinacetyltransferáza z říše prokaryontů nebo archaebacteria,
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je funkčně spojena se sekvencí nukleotidů kódující tranzitní peptid, který je schopný nasměrovat protein do požadovaných buněčných kompartmentů.
    20
  4. 4. Způsob podle nároku3, vyznačující se tím, že buněčným kompartmentem je plastid.
  5. 5. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž4, vyznačující se tím, že regulační úseky obsahují promotor, který je aktivní v rostlinných buňkách.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že promotor je indukovatelný, konstitutivně exprimovaný a/nebo je promotorem specifickým pro buňku, pletivo nebo orgán.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že promotor je specifický pro hlízy,
    30 pro semena, pro endosperm, pro embryo nebo pro floem.
  8. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž7, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je umístěna na vektoru, který dále obsahuje selekční markér.
    35
  9. 9. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi, vyznačující se tím, že obsahují transgenní rostlinné buňky, které obsahují ve svém genomu stabilně integrovanou molekulu rekombinantní DNA obsahující molekulu nukleové kyseliny kódující protein se serinacetyltransferázovou (SAT) aktivitou, která je funkčně spojena s regulačními úseky, což umožňuje expresi molekuly nukleové kyseliny v rostlinných buňkách, nebo obsahují rostlinu nebo rostlinné pletivo
    40 obsahující uvedené transgenní rostlinné buňky, zpracovatelné části rostliny nebo propagační materiál rostliny, přičemž zpracovatelné části nebo propagační materiál obsahuje uvedené rostlinné buňky, a přičemž uvedené rostlinné buňky neexprimují exogenně zavedenou molekulu nukleové kyseliny kódující protein s 0-acetylserin(thiol)lyázovou (OASTL) aktivitou.
    45
  10. 10. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi podle nároku 9, vyznačující se tím, že transgenní rostlinné buňky obsahují selekční markér.
  11. 11. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že v transgenní rostlině je zvýšená hladina glutathionu, cysteinu a/nebo methioninu
    50 v porovnání s rostlinami divokého typu.
  12. 12. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi podle kteréhokoli z nároků 9ažll, vyznačující se tím, že transgenní rostlinou je kukuřice.
    - 17CZ 301853 B6
  13. 13. Potraviny, krmivá nebo jejich příměsi podle kteréhokoli z nároků 9 až 12, vyznačující se t í m , že propagačním materiálem je semeno.
CZ20010018A 1998-07-07 1999-07-07 Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v rostlinách a potraviny, krmiva nebo jejich prímesi CZ301853B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98112553 1998-07-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200118A3 CZ200118A3 (cs) 2001-07-11
CZ301853B6 true CZ301853B6 (cs) 2010-07-14

Family

ID=8232233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010018A CZ301853B6 (cs) 1998-07-07 1999-07-07 Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v rostlinách a potraviny, krmiva nebo jejich prímesi

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6608239B1 (cs)
EP (1) EP1095155B1 (cs)
AT (1) ATE319847T1 (cs)
AU (1) AU773973B2 (cs)
CA (1) CA2336893A1 (cs)
CZ (1) CZ301853B6 (cs)
DE (1) DE69930270T2 (cs)
ES (1) ES2260926T3 (cs)
HU (1) HUP0203469A3 (cs)
PL (1) PL205174B1 (cs)
WO (1) WO2000001833A1 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2260926T3 (es) * 1998-07-07 2006-11-01 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Medios y metodo para potenciar el contenido de compuestos de azufre en plantas.
US7038109B1 (en) 2001-03-29 2006-05-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enzymatic methods for modulating the levels of organic sulfur compounds in plants
FR2844142B1 (fr) 2002-09-11 2007-08-17 Bayer Cropscience Sa Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
DE10260871A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-08 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Veränderung des Serin-Acetyltransferase-Gehalts
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
PL389131A1 (pl) * 2009-09-25 2011-03-28 Instytut Biochemii I Biofizyki, Polska Akademia Nauk Rekombinowana molekuła DNA, wektor, komórka oraz materiał roślinny dostarczający duże ilości enzymatycznie aktywnej syntazy cysteinowej, oraz ich zastosowanie
WO2011095460A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Bayer Cropscience Ag Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents
JP6843590B2 (ja) * 2016-11-09 2021-03-17 サントリーホールディングス株式会社 ロースト香が増強された焙煎コーヒー豆、コーヒー抽出物、コーヒー製品、及びその製造方法
CN114214341B (zh) * 2021-12-30 2023-12-26 山西大学 番茄SlSERAT1;1基因或其片段在植物发育过程中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1095155A1 (en) * 1998-07-07 2001-05-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Means and methods for enhancing the content of sulfur compounds in plants

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ231821A (en) * 1988-12-19 1991-09-25 Luminis Pty Ltd A eukaryotic plasmid for cysteine biosynthesis in sheep
JP3232619B2 (ja) * 1992-02-05 2001-11-26 三菱商事株式会社 システイン合成酵素をコードする遺伝子
FR2787466B1 (fr) 1998-12-17 2001-02-16 Rhone Poulenc Agrochimie Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues
AU3763100A (en) 1999-03-18 2000-10-04 Rutgers, The State University Transgenic plants having imroved flavor properties

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1095155A1 (en) * 1998-07-07 2001-05-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Means and methods for enhancing the content of sulfur compounds in plants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Leish a kol. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 892-898 *
Saito a kol. (1994) Plant Physiol. 106, 887-895 *
Saito a kol. (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26 *
Youssefian a kol. (1993) The Plant Journal 4, 759-769 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2260926T3 (es) 2006-11-01
US6608239B1 (en) 2003-08-19
WO2000001833A1 (en) 2000-01-13
AU5370399A (en) 2000-01-24
DE69930270D1 (de) 2006-05-04
AU773973B2 (en) 2004-06-10
PL205174B1 (pl) 2010-03-31
EP1095155B1 (en) 2006-03-08
PL345346A1 (en) 2001-12-17
DE69930270T2 (de) 2006-11-30
ATE319847T1 (de) 2006-03-15
CA2336893A1 (en) 2000-01-13
CZ200118A3 (cs) 2001-07-11
HUP0203469A2 (hu) 2003-01-28
EP1095155A1 (en) 2001-05-02
HUP0203469A3 (en) 2004-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Migge et al. Leaf-specific overexpression of plastidic glutamine synthetase stimulates the growth of transgenic tobacco seedlings
Saito et al. Modulation of cysteine biosynthesis in chloroplasts of transgenic tobacco overexpressing cysteine synthase [O-acetylserine (thiol)-Iyase]
Tabe et al. Overexpression of serine acetlytransferase produced large increases in O-acetylserine and free cysteine in developing seeds of a grain legume
EP2257630B1 (en) Biosynthetic engineering of glucosinolates
Urano et al. Molecular cloning and functional characterization of cDNAs encoding cysteine synthase and serine acetyltransferase that may be responsible for high cellular cysteine content in Allium tuberosum
EP2231862A1 (en) Genetically modified plants displaying reduced accumulation of cadmium
CZ301853B6 (cs) Zpusob zvýšení obsahu sirných sloucenin v rostlinách a potraviny, krmiva nebo jejich prímesi
CA2586048A1 (en) Protection against herbivores
AU773031B2 (en) Method for increasing the content in sulphur compounds and particularly in cysteine, methionine and glutathione in plants and plants obtained
WO2012031203A2 (en) Reduction of post-harvest physiological deterioration
Matityahu et al. Transgenic tobacco plants overexpressing the Met25 gene of Saccharomyces cerevisiae exhibit enhanced levels of cysteine and glutathione and increased tolerance to oxidative stress
WO2000070016A2 (en) Genetically modified plants tolerant of stress conditions
EP1153135B1 (en) Methods for modulating the levels of organic sulfur compounds in plants
AU2004210597B2 (en) Means and methods for enhancing the content of sulfur compounds in plants
US20060021085A1 (en) Method for producing transgenic plants having an elevated vitamin E content by modifying the serine-acetyltransferase content
WO2000055303A2 (en) Transgenic plants having imroved flavor properties
Hoefgen et al. Sulfur and cysteine metabolism
WO2004001028A1 (en) Plant-derived transferase genes
Riemenschneider Isolation and characterization of cysteine-degrading and H2S-releasing proteins in higher plants
EP1970442B1 (en) Transgenic high tryptophan plants
Tomaszewska Glutathione and thiol metabolism in metal exposed plants
US6821781B1 (en) Method for selecting transformed plant cells using ethionine and cystathionine gamma synthase as the selection agent and marker gene
Chronis Sulfur metabolism in Glycine max [L.] Merr: characterization of serine acetyletransferase and O-acetylserine (thiol) lyase
Brugière et al. AMMONIUM ASSIMILATION IN HIGHER PLANTS
Desaturase 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid–

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 19990707