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Die Erfindung betrifft transgene
Expressionskonstrukte und Verfahren zum Erhöhen des Vitamin E-Gehaltes
in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, durch transgene
Expression von ORF sll0832 aus Synechocystis sp. PCC6803. Die Erfindung
betrifft ferner transgene Expressionskonstrukte zur Expression von ORF
sll0832 in pflanzlichen Organismen, bevorzugt in Algen, transgene
pflanzlichen Organismen exprimierend ORF sll0832, sowie die Verwendung
von besagter transgener pflanzlichen Organismen zur Herstellung von
Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien,
insbesondere zur Herstellung von Vitamin E.
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Die in der Natur vorkommenden acht
Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität sind Derivate
des 6-Chromanols (Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft,
Chapter 4., 478–488,
Vitamin E). Die Gruppe der Tocopherole (1a–d) weist eine gesättigte Seitenkette
auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a–d) eine ungesättigte Seitenkette:
1a, α-Tocopherol:
R
1 = R
2 = R
3 = CH
3 1b, β-Tocopherol
[148-03-8]: R
1 = R
3 =
CH
3, R
2 = H 1c, γ-Tocopherol [54-28-4]:
R
1 = H, R
2 = R
3 = CH
3 1d, δ-Tocopherol
[119-13-1]: R
1 = R
2 =
H, R
3 = CH
3 2a, α-Tocotrienol
[1721-51-3] : R
1 = R
2 =
R
3 = CH
3 2b, β-Tocotrienol
[490-23-3] : R
1 = R
3 =
CH
3 , R
2 = H 2c, γ-Tocotrienol
[14101-61-2]: R
1 = H, R
2 =
R
3 = CH
3 2d, δ-Tocotrienol
[25612-59-3]: R
1 = R
2 =
H, R
3 = CH
3 In der vorliegenden
Erfindung werden unter Vitamin E alle acht vorstehend erwähnten Tocopherole
und Tocotrienole mit Vitamin-E-Aktivität verstanden.
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Vitamin E-Verbindungen haben einen
hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich,
in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
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Es gibt Versuche zur Erhöhung des
Stoffwechselflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes
in transgenen Pflanzen durch Überexpression
einzelner Tocopherol-Biosynthesegene (
WO 97/27285 ;
WO 99/04622 ;
WO 99/23231 ;
WO 00/10380 ; Shintani und Dellapenna,
Science 282 (5396): 2098–2100,
1998; Tsegaye et al. Jahrestreffen der American Society of Plant
Physiologists (24.–28.07.1999, Baltimore,
USA) Abstract No. 413).
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Synechocystis sp. PCC 6803 ist ein
einzelliges, nicht Stickstoff fixierendes Cyanobakterium, das genetisch
gut untersucht ist (Churin et al. (1995) J Bacteriol 177: 3337–3343),
leicht transformiert werden kann (Williams (1988) Methods Enzymol
167: 766–778)
und ein sehr aktives homologes Rekombinationsvermögen aufweist.
Der Stamm PCC 6803 wurde 1968 von R. Kunisawa als Aphanocapsa N-1
in Kalifornien, USA, aus Süßwasser
isoliert und ist heute über
die "Pasteur Culture
Collection of Axenic Cyanobacterial Strains" (PCC), Unite de Physiologie Microbienne,
Paris, Frankreich, erhältlich.
Die genomische Gesamtsequenz von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde
ab 1995 veröffentlicht
(Kaneko et al. (1995) DNA Research 2: 153–166; Kaneko et al. (1995)DNA
Research 2: 191–198;
Kaneko et al. (1996) DNA Research 3: 109–136; Kaneko et al. (1996)
DNA Research 3: 185–209;
Kaneko und Tabata (1997) Plant Cell Physiol 38: 1171–1176; Kotani
und Tabata (1998) Annu Rev Plant Physiol 49: 151–171) und ist über das
Internet (http://www.kazusa.or.jp/cyano/cyano.html) unter dem Namen "CyanoBase" veröffentlicht.
Effektive Expressionssysteme für
Synechocystis 6803 sind in der Literatur beschrieben (Mermet-Bouvier et al.. (1993)
Curr Microbiol 27: 323–327;
Mermet-Bouvier und Chauvat (1993) Curr Microbiol 28: 145–148; Murphy
und Stevens (1992) Appl Environ Microbiol 58: 1650–1655; Takeshima
et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 9685–9689; Xiaoqiang et al. (1997) Appl
Environ Microbiol 63: 4971–4975;
Ren et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 158: 127–132).
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Trotz einiger Erfolge besteht weiterhin
Bedarf an einer Optimierung der Vitamin E Biosynthese. Der Erfindung
lag die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Verfügung zu
stellen, die die Vitamin E-Biosynthese steigern und damit zu vorteilhaften
transgenen pflanzlichen Organismen führen.
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Diese Aufgabe wird durch die vorliegende
Erfindung gelöst.
Im Rahmen der Erfindung wurde das Protein kodiert durch ORF sll0832
aus Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank Acc.-No.: NP_442444; gi:16331716;
SEQ ID NO: 2) überraschenderweise
als Schlüsselfaktor
der Vitamin E-Biosynthese identifiziert (infolge Tocen-1 für "Tocopherol synthesis
enhancing protein"-1).
Tocen-1 ist in der GenBank als unbekanntes Protein ohne jegliche
Funktionsannotation klassifiziert. Das Protein weißt keine
signifikanten Homologien zu anderen Proteinen bekannter Funktion
auf. Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass die transgene Expression dieses Proteins,
den Vitamin E Gehalt in pflanzlichen Organismen erhöhen kann.
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Ein erster Gegenstand der Erfindung
umfasst Verfahren zum Erhöhen
des Vitamin E-Gehaltes in pflanzlichen Organismen, durch
- a) transgene Expression des Tocen-1 Proteins
kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes
desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten
in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ,
Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus, und
- b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen – im Unterschied
oder Vergleich zum Ausgangsorganismus – der Vitamin E-Gehalt in dem besagten
pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle
des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip
auf alle pflanzlichen Organismen angewendet werden, bevorzugt auf
solche die natürlicherweise
Vitamin E produzieren, ganz besonders bevorzugt auf solche die für industrielle
Produktion von natürlichem
Vitamin E eingesetzt werden.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft transgene Expressionskonstrukte zur Expression einer Nukleinsäuresequenz
kodierend für
das Tocen-1 Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes
desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten.
Besonders bevorzugt ist die Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 und die aufgrund der
Degeneration des genetischen Codes davon abgeleiteten Sequenzen
sowie funktionell äquivalente
Teile der vorgenannten.
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"Pflanzlicher
Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile
oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines Organismus, der
zur Photosynthese befähigt
ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen
und Arten höherer
und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone
und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife
Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete
Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) und
Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen.
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"Pflanze" im Rahmen der Erfindung
meint alle Gattungen und Arten höherer
und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter
dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie
davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe,
Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen,
sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu
funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint
Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings.
Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
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"Pflanze" umfasst alle einjährigen und
mehrjährige,
monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft
jedoch nicht einschränkend
solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria,
Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus,
Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus,
Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana,
Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca,
Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium,
Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis,
Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena,
Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
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Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender
Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae,
Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae,
Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae,
Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae,
Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
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Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind
insbesondere ausgewählt
aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie
der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie
Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr
sowie alle Arten von Gräsern.
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Die Erfindung wird ganz besonders
bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte
dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen,
wie zum Beispiel
- – Asteraceae wie Sonnenblume,
Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- – Compositae,
besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat)
und andere mehr,
- – Cruciferae,
besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps),
campestris (Rübe), oleracea
(z.B. Kohl, Blumenkohl oder Broccoli und weitere Kohlarten); und
der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse
oder Canola und andere mehr,
- – Cucurbitaceae
wie Melone, Kürbis
oder Zucchini und andere mehr,
- – Leguminosae
besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne)
Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere
mehr
- – Rubiaceae,
bevorzugt der Unterklasse Lamüdae
wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch)
und andere mehr,
- – Solanaceae
besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum
(Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum
(Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum,
ganz besonders die Art annum (Pfeffer), sowie Tabak oder Paprika
und andere mehr,
- – Sterculiaceae,
bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma
cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- – Theaceae,
bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia
sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- – Umbelliferae,
besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte))
und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie)) und
andere mehr;
sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs,
Gurke, Spinat, Möhre,
Zuckerrübe
und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane
und Kiwi.
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Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen,
Nutz- oder Zierbäume,
Blumen, Schnittblumen, Sträucher
oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen,
Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten
wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen,
Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose,
Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne
und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien,
Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut,
Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie
und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien,
Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron
und andere mehr.
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Pflanzliche Organismen im Sinne der
Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen,
wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen
sind Grünalgen, wie
beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum,
Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
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Insbesondere ist der pflanzliche
Organismus ausgewählt
aus der Gruppe der Ölpflanzen
bestehend aus Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica
napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos
nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guineensis, Ekeis
oleiferu, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense,
Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera
biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum,
Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.
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Am meisten bevorzugt sind pflanzliche;
Organismen, die zur Vitamin E-Produktion geeignet sind, wie beispielsweise
Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja,
Mais, Weizen oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss
oder Mandel.
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"Vitamin
E-Gehalt" meint
die Summe der Tocopherole und Tocotrienole in einem pflanzlichen
Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben.
Dabei umfassen Tocopherole und Tocotrienole bevorzugt die oben beschriebenen
8 Verbindungen α-Tocopherol, β-Tocopherol, γ-Tocopherol, δ-Tocopherol, α-Tocotrienol, ß-Tocotrieno,
?-Tocotrienol und ?-Tocotrienol. Besonders bevorzugt ist der Vitamin
E-Gehalt im Samen eines pflanzlichen Organismus erhöht.
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"Erhöhung" des Vitamin E-Gehaltes
meint die Steigerung des Gehaltes an Vitamin E in einem pflanzlichen
Organismus oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt
in den Samenorganen desselben. Dabei ist der Vitamin E-Gehalt im
Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen,
aber ansonsten unveränderten
Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens
5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 15%,
ganz besonders bevorzugt mindestens 20%, am meisten bevorzugt mindestens
25% erhöht.
Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung
oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima-
oder Lichtverhältnisse,
Düngung,
Bewässerung,
Pflanzenschutzmaßnahmen
usw.
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Funktionelle Äquivalente meint insbesondere
natürliche
oder künstliche
Mutationen des Tocen-1 Proteins gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe
Polypeptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus pflanzlichen Organismen,
die die gleichen wesentlichen Eigenschaften aufweisen.
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"Wesentliche
Eigenschaften" des
Tocen-1 Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 meint insbesondere
die Eigenschaft, bei transgener Expression in einem pflanzlichen
Organismus den Vitamin E Gehalt im Vergleich zu einem identischen
aber nicht transgenen pflanzlichen Organismus entsprechend oben
gegebener Definition zu erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
gelten als wesentliche Eigenschaften ferner mindestens eine Eigenschaft
ausgewählt
aus nachfolgender Gruppe:
- a) ein Molekulargewicht
in einem Bereich von ungefähr
10 bis ungefähr
25 kDa, bevorzugt ungefähr
15 bis ungefähr
20 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 17 kDa
- b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt in einem Bereich
von ungefähr
8 bis ungefähr
9,5, bevorzugt ungefähr
8,4 bis ungefähr
9,1, besonders bevorzugt ungefähr
pH 8,7
- c) einen sauren Charakter bevorzugt mit einer Gesamtnettoladung
bei neutralem pH in einem Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 3, bevorzugt
ungefähr
2,2 bis ungefähr
2,8, besonders bevorzugt ungefähr
2,6,
- d) eine helikale Sekundärstruktur
gemäß computergestützter Vorhersage
beispielsweise mit dem Programm zur Sekundärstrukturvorhersagen in GenomMax
v.3.1 (InforMax, Inc.) basierend auf den Arbeiten von Qian (Qian
N and Sejnowski T (1988) J Mol Biol 202: 865–884) und Sasgawa (Sasgawa
F and Tajima K (1993) Cabios 9: 147–152).
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Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen,
beispielsweise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz
ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis
thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum – können z.B.
durch Datenbanksuche in Sequenzdatenbanken wie GenBank oder Durchmustern
von Gen- oder cDNA-Banken – z.B.
unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1 oder eines teils derselben als Suchsequenz bzw. Sonde – aufgefunden
werden. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.
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Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente
eine Homologie von mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens
65%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens
90% zu dem Protein mit der SEQ ID NO: 2. Dabei erstreckt sich die
Homologie über
mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt
mindestens 60 Aminosäuren
besonders bevorzugt mindestens 90 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die
gesamt Länge
des Tocen-1 Polypeptides gemäß SEQ ID
NO: 2.
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Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden
wird die Identität
der Aminosäuresequenz über die
jeweilige Sequenzlänge
verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus
GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics
Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender
Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average
Match: 2,912 Average Mismatch: –2,003
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Beispielhaft wird unter einer Sequenz,
die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz
SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich
mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit
obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
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Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche
Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen
kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 50%, besonders
bevorzugt mindestens 65%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am
meisten bevorzugt mindestens 90% zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO:
1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt
mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am
meisten bevorzugt über
die gesamt Länge
der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1.
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Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen
wird die Identität
der beiden Nukleinsäuresequezen über die
jeweilige Sequenzlänge
verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus
GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics
Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic
Acids Res. 25: 3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet
wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10
Average Mismatch: 0
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Beispielhaft wird unter einer Sequenz,
die eine Homologie von mindestens 80% auf Nukleinsäurebasis mit
der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die
bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus
mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
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Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche
Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen
kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch
SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäuresequenz
oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen
Eigenschaften des Proteins beschrieben durch SEQ ID NO: 2 aufweisen.
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"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen
und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen.
Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook
J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory
Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,
Seiten 9.31–9.57)
oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),
6.3.1–6.3.6.
beschrieben.
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Beispielhaft können die Bedingungen während des
Waschschrittes ausgewählt
sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer
Stringenz (mit ungefähr
2X SSC bei 50°C)
und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt
bei 65°C)
(20X SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus
kann die Temperatur während
des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur,
ungefähr
22°C, bis
zu stärker
stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter,
Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert
werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und
nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch
denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt
werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt
bei 42°C
ausgeführt.
Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt
sind infolge gegeben:
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- (1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel
aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a) 4X SSC bei
65°C,
b)
6X SSC bei 45°C,
c)
6X SSC, 100 μg/ml
denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C,
f)
50% Formamid, 4X SSC bei 42°C,
h)
2X oder 4X SSC bei 50°C
(schwach stringente Bedingung),
i) 30 bis 40% Formamid, 2X
oder 4X SSC bei 42°C
(schwach stringente Bedingung).
- (2) Waschschritte können
zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
a)
0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C.
b)
0,1X SSC bei 65°C.
c)
0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C.
d)
0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C.
e) 0,2X SSC, 0,1% SDS
bei 42°C.
f)
2X SSC bei 65°C
(schwach stringente Bedingung).
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft transgene Expressionskonstrukte, die eine transgene Expression
des Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes
desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten
in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil
oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus gewährleisten
können.
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In besagten transgenen Expressionskonstrukten
steht ein Nukleinsäuremolekül kodierend
für ein
Protein beschrieben durch SEQ ID NO: 2 oder eines funktionellen Äquivalentes
desselben oder eines funktionell äquivalenten Teils der vorgenannten
bevorzugt in funktioneller Verknüpfung
mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise
einem Promotor), das eine transgene Expression in einem pflanzlichen Organismus
oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben gewährleistet.
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Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht
man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit
der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz
(zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem
Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion
bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann.
Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich.
Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen,
können
ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen
DNA-Molekülen
aus auf die Zielsequenz ausüben.
Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende
Nukleinsäuresequenz
hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so
dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt
ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen
zu exprimierende Nukleinsäuresequenz
geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100
Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
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Die Herstellung einer funktionellen
Verknüpfung
als auch die Herstellung eines transgenen Expressionskonstruktes
kann mittels gängiger
Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie
sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW
(1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols
in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience
und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual
beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen
positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers
mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides
haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von
Fusionsproteinen führen.
Bevorzugt kann das transgene Expressionskonstrukt, bestehend aus
einer Verknüpfung
von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem
Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches
Genom insertiert werden.
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Unter einem transgenen Expressionskonstrukt
sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die
Nukleinsäuresequenz
kodierend für
das Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent
desselben oder ein funktionell äquivalentes
Teil der vorgenannten – zum
Beispiel durch eine homologe Rekombination – so hinter einen endogenen
pflanzlichen Promotor platziert wird, dass dieser die transgene
Expression der besagten Nukleinsäuresequenz
gewährleistet.
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Pflanzenspezifische Promotoren meint
grundsätzlich
jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen,
in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern
kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar
oder entwicklungsabhängig
sein.
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Bevorzugt sind:
- a)
Konstitutive Promotoren
"Konstitutive" Promotoren meint
solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt
allen, Geweben über
einen größeren Zeitraum
der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung,
gewährleisten
(Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195–2202). Vorzugsweise verwendet man
insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der
einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor
des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al..
(1980) Cell 21: 285–294;
Odell et al.. (1985) Nature 313: 810–812; Shewmaker et al.. (1985)
Virology 140: 281–288;
Gardner et al.. (1986) Plant Mol Biol 6: 221–228) oder der 19S CaMV Promotor
( US 5,352,605 ; WO 84/02913 ; Benfey et al..
(1989) EMBO J 8: 2195–2202).
Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit
(SSU)"-Promotor
( US 4,962,028 ), der
LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. x03677), der Promotor der Nopalinsynthase
aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase)
Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et
al.. (1995) Plant Mol Biol 29: 637–649), den Ubiquitin 1 Promotor
(Christensen et al.. (1992) Plant Mol Biol 18: 675–689; Bruce
et al.. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692–9696), den Smas Promotor,
den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor ( US 5,683,439 ), die Promotoren der
vakuolärer
ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins
aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren
konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
- b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren
mit Spezifitäten
für die
Antheren, Ovarien, Blüten,
Blätter,
Stengel, Wurzeln und Samen.
Samenspezifische Promotoren wie
zum Beispiel der Promotor des Phaseolins ( US 5,504,200 ; Bustos MM et al.. (1989)
Plant Cell 1 (9): 839–53),
des 2S Albumingens (Joseffson LG et al.. (1987) J Biol Chem 262: 12196–12201),
des Legumins (Shirsat A et al.. (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326–331), des
USP (unknown seed protein; Baumlein H et al.. (1991) Mol Gen Genet
225 (3): 459–67),
des Napin Gens ( US 5,608,152 ;
Stalberg K et al.. (1996) L Planta 199: 515–519), des Saccharosebindeproteins
( WO 00/26388 ) oder der
Legumin B4-Promotor (LeB4; Baumlein H et al.. (1991) Mol Gen Genet
225: 121–128;
Baumlein H et al.. (1992) Plant J 2 (2): 233–9; Fiedler U et al.. (1995)
Biotechno-logy (NY)
13 (10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Bce4-Promoter aus
Brassica ( WO 91/13980 ).
Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene
kodierend für
das "High Molecular
Weight Glutenin" (HMWG),
Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase)
oder die Stärkesynthase.
Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression
in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben.
Vorteilhaft eingesetzt werden können
der Promoter des lpt2 oder lptl-Gen ( WO
95/15389 , WO 95/23230 )
oder die Promotoren beschrieben in WO
99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens,
des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens,
des Zein-Gens, des
Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). Weitere samenspezifische Promotoren
sind beschrieben in WO 89/03887 .
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren wie
beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor
des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel. Blattspezifische Promotoren
wie Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel ( WO 97/05900 ), der SSU Promotor (small
subunit) der Rubisco (Ribulose-l,5-bisphosphatcarboxylase) oder
der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al.. (1989) EMBO
J 8: 2445–2451).
Blütenspezifische
Promotoren wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor ( WO 92/16635 ) oder der Promotor
des P-rr Gens ( WO 98/22593 ).
Antheren-spezifische
Promotoren wie den 5126-Promotor ( US
5,689,049 , US 5,689,051 ),
den glob-1 Promotor und den γ-Zein Promotor.
- c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die transgenen Expressionskonstrukte
können
auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel:
Gatz et al.. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89–108), durch
den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten
Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B.
der PRP1 Promotor (Ward et al.. (1993) Plant Mol Biol 22: 361–366), durch
Salicylsäure
induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ),
ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor ( EP 0 388 186 ), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer
Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397–404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer
Promotor ( EP 0 335 528 )
bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanoninduzierbarer Promotor
( WO 93/21334 ) können ebenfalls
verwendet werden.
- d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Ferner
sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen
Stress induziert werden wie beispielsweise der pathogen-induzierbare
Promotor des PRP1-Gens (Ward et al.. (1993) Plant Mol Biol 22: 361–366), der
hitzeinduzierbare hsp70- oder hsp80-Promoter aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierare
alpha-Amylase Promoter aus der Kartoffel ( WO 96/12814 ), der licht-induzierbare
PPDK Promotor oder der verwundungsinduzierte pinII-Promoter ( EP375091 ).
Pathogen-induzierbare
Promotoren umfassen die von Genen, die infolge eines Pathogenbefalls
induziert werden wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR-Proteinen, ß-1,3-Glucanase,
Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al.. (1983) Neth J Plant
Pathol 89: 245–254;
Uknes, et al.. (1992) The Plant Cell 4: 645–656; Van Loon (1985) Plant
Mol Viral 4: 111-116; Marineau et al.. (1987) Plant Mol Biol 9:
335–342; Matton
et al.. (1987) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325–342; Somssich
et al.. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 2427–2430; Somssich et al.. (1988)
Mol Gen Genetics 2: 93–98;
Chen et al.. (1996) Plant J 10: 955–966; Zhang and Sing (1994)
Proc Natl Acad Sci USA 91: 2507–2511;
Warner, et al.. (1993) Plant J 3: 191–201; Siebertz et al.. (1989)
Plant Cell 1: 961–968
(1989). Umfasst sind auch verwundungs-induzierbare Promotoren wie
der des pinII Gens (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28: 425–449; Duan
et al.. (1996) Nat Biotech 14: 494–498), des wun1 und wun2-Gens
( US 5,428,148 ), des
winl- und win2-Gens (Stanford et al.. (1989) Mol Gen Genet 215:
200–208),
des Systemin (McGurl et al.. (1992) Science 225: 1570–1573),
des WIP1-Gens (Rohmeier et al.. (1993) Plant Mol Biol 22: 783–792; Eckelkamp
et al.. (1993) FEBS Letters 323: 73–76), des MPI-Gens (Corderok
et al.. (1994) The Plant J 6(2): 141–150) und dergleichen.
- e) Entwicklungsabhängige
Promotoren
Weitere geeignete Promotoren sind beispielsweise
fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische
Promotor aus Tomate (WO 94/21794, EP
409 625 ). Entwicklungsabhängige Promotoren schließt zum Teil
die Gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner
Gewebe naturgemäß entwicklungsabhängig erfolgt.
-
Besonders bevorzugt sind konstitutive,
samenspezifische sowie blattspezifische Promotoren.
-
Es können ferner weitere Promotoren
funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein,
die eine transgene Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in
anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen.
Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen
Promotoren in Frage.
-
Die in den erfindungsgemäßen transgenen
Expressionskonstrukten oder transgenen Expressionsvektoren enthaltenen
Nukleinsäuresequenzen
können
mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter
funktionell verknüpft
sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu
verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf
das Zustandekommen oder die Funktion eines erfindungsgemäßen transgenen
Expressionskonstruktes haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren
zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen
oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen
Expressionskonstrukte 5'-stromaufwärts von
der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz
einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz
als zusätzliche
genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative
Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden
Nukleinsäuresequenz.
-
Genetische Kontrollsequenzen umfassen
auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren,
die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So
kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische
Expression zusätzlich
abhängig
von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind
zum Beispiel für
Wasserstress, Abscisinsäure
(Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131–17135)
und Hitzestress (Schoffl F et al.. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2–3): 246–53) beschrieben.
-
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen
sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2,
in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH,
TEF, rp28, ADH.
-
Prinzipiell können alle natürlichen
Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten
für das
erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden. Darüberhinaus
können
auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
-
Genetische Kontrollsequenzen umfassen
ferner auch die 5'-untranslatierte
Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise
das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein:
The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer,
New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante
Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So
wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte
Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft
für Translationsverstärker sei
die 5'-Leadersequenz
aus dem Tabak-Mosaik-Virus
zu nennen (Gallie et al.. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693–8711) und
dergleichen. Sie können
ferner die Gewebsspezifität
fördern
(Rouster J et al.. (1998) Plant J 15: 435–440).
-
Das transgene Expressionskonstrukt
kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit
dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz
ermöglichen.
Auch am 3'-Ende
der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche
vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische
Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen
können
in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
-
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale
sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche,
die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium
tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase)
des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J
3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente
davon. Beispiele für
besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator
und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
-
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin
solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion
in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung
aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum
Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens
gegen die für
eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden. Methoden
wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter
Umständen
induzierbare Entfernung des transgenen Expressionskonstruktes aus
dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods 14 (4): 381–92). Hier
werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen),
die später
eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
-
Ein transgenes Expressionskonstrukt
und/oder die von ihm abgeleiteten transgenen Expressionsvektoren
können
weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement
ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen
Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transgenen
Expressionskonstrukte, der transgenen Expressionsvektoren oder der
transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien
zu nennen:
- a) Selektionsmarker, die eine Resistenz
gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat
( WO 98/45456 ), Antibiotika
oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G
418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen.
Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz
gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen,
die für Phosphinothricinacetyltransferasen
(PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar
und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP
Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin)
verleihen, das für
das Glyphosat® degradierende
Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen
(kodierend für
eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon
inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende
Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen
das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase
(SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt; das
Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen
Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase
(HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas
Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide
verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten
mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation).
- b) Reportergene, die für
leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung
der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes
gewährleisten. Ganz
besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz
D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29–44) wie das "green fluorescence
Protein" (GFP) (Sheen
et al..(1995) Plant Journal 8 (5): 777–784), die Chloramphenicoltransferase,
eine Luziferase (Ow et al.. (1986) Science 234: 856–859), das Aequorin-Gen (Prasher et al..
(1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259–1268), die β-Galactosidase,
ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson
et al.. (1987) EMBO J 6: 3901–3907).
- c) Replikationsursprünge,
die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskonstrukte
oder transgenen Expressionsvektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten.
Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der
pBR322 on oder der P15A on (Sambrook et al.: Molecular Cloning.
A Laboratory Manual, 2na ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, 1989).
- d) Elemente, die für
eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich
sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA
oder die vir-Region.
-
Zur Selektion erfolgreich homolog
rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich,
einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der
den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid
(zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-Phosphat
(
WO 98/45456 ) oder ein
Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion
der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al.
(1986) Plant Cell Reports 5: 81–84).
-
Zusätzlich können besagte transgene Expressionskonstrukte
oder transgenen Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die
nicht für
das Proteins kodiert durch SEQ ID NO: 2, ein funktionelles Äquivalent
desselben oder ein funktionell äquivalentes
Teil der vorgenannten kodieren, und deren transgene Expression zu
einer zusätzlichen
Steigerung der Vitamin E-Biosynthese führt (infolge pro-VitE). Diese
zusätzlich
transgen exprimierte pro-VitE Nukleinsäuresequenz kann – beispielhaft
aber nicht einschränkend – ausgewählt sein
aus Nukleinsäuren
kodierend für
Homogentisatphytyltransferase, 2-Methyl-6-plastochinonmethyltransferase,
Tocopherolcyclase, ?-Tocopherolmethyltransferase, Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase,
Tyrosinaminotransferase, tyrA, Geranylgeranylpyrophosphatreduktase.
Bei den vorgenannten wird der erwünschte Effekt durch eine Überexpression
gewährleistet.
Jedoch kann ein entsprechender Effekt auch durch Expression einer
einer pro-VitE Nukleinsäuresequenz
erreicht werden, die z.B. als antisense RNA oder doppelsträngige RNA
die Suppression der Expression bestimmter Gene bewirkt. Geeignete
Zielgene wären
hier – beispielhaft
jedoch nicht einschränkend – die Homogentisatdioxygenase.
Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken
oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich.
Dem Fachmann ist bewusst, dass auch mehrere unterschiedliche der
oben genannten zusätzlichen
Expressionen von pro-VitE Nukleinsäuresequenzen im Rahmen der
Erfindung kombiniert werden können.
-
Die Einführung eines erfindungsgemäßen transgenen
Expressionskonstruktes in einen Organismus oder Zellen, Geweben,
Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche
Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter
Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen
Expressionskonstrukte enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide,
Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. Das transgene
Expressionskonstrukt kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine
geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene transgene
Expressionsvektor wird zunächst
in E.coli eingeführt.
Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und
der kombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse
und Sequenzierung können
dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren,
die eine stabile Integration des transgenen Expressionskonstruktes
in das Wirtsgenom ermöglichen.
-
Die Herstellung eines transformierten
Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert,
dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor), RNA oder
Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen
Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet
wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al.. (1990)
Methods in Enzymology 185: 527–537).
So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion
oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden.
Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol,
permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle
gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen
DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder
Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode
zur Einführung
von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen
Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben
(beispielsweise bei Bilang et al.. (1991) Gene 100: 247–250; Scheid
et al.. (1991) Mol Gen Genet 228: 104–112; Guerche et al.. (1987)
Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al.. (1987) Theor Appl Genet
75: 30–36;
Klein et al.. (1987) Nature 327: 70–73 ; Howell et al.. (1980)
Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229–1231; DeBlock
et al.. (1989) Plant Physiology 91: 694–701; Methods for Plant Molecular
Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988);
and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.)
Academic Press Inc. (1989)).
-
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen
Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben
oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation
genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation
durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische
Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation
trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
-
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine
Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium
tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone
Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben
bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
-
Werden Agrobacterien verwendet, so
ist das transgene Expressionskonstrukt in spezielle Plasmide zu integrieren,
entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate
vector) oder einen binären Vektor.
Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Trans formation verwendet werden
soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte
und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende
Region mit dem einzuführenden
transgenen Expressionskonstrukt verbunden.
-
Bevorzugt werden binäre Vektoren
verwendet. Binäre
Vektoren können
sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten
in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker
flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie
können
direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al.. (1978)
Mol Gen Genet 163: 181–187).
Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria
und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin
verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium
sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist
für die Übertragung
der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes
Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet
werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher
Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (
EP 120 516 ; Hoekema, In: The Binary
Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam,
Chapter V; An et al.. (1985) EMBO J 4: 277–287). Verschiedene binäre Vektoren
sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2
oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
-
Weitere zur Expression in Pflanzen
geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al.. (1987) Meth in
Enzymol 153: 253–277;
Schardl et al.. (1987) Gene 61: 1–11; Berger et al.. (1989)
Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402–8406).
-
Direkte Transformationstechniken
eignen sich für
jeden Organismus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation
von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen
an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der
pUC-Reihe können
verwendet werden. Sollen vollständige
Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist
er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches
selektionierbares Markergen befindet.
-
Stabil transformierte Zellen d.h.
solche, die die eingeführte
DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von
untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer
Marker Bestandteil der eingeführten
DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass
eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin,
G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag
(s.o.).
-
Transformierte Zellen, die ein solches
Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen
eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben,
die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt
und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid
Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol
21 (5): 871–884),
das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt
Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen,
das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker
erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten
(McCormick et al.. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Die erhaltenen
Pflanzen können
in üblicher
weise gezüchtet
und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert
werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil
und vererblich ist.
-
Die oben genannten Verfahren sind
beispielsweise beschrieben in Jenes B et al. (1993) Techniques for
Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization,
herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128–143 sowie
in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205–225). Vorzugsweise
wird das zu transgene Expressionskonstrukt in einen Vektor kloniert,
der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise
pBin19 (Bevan et al.. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f).
-
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle
hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung
von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht
man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten
Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise
induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
-
Dem Fachmann sind such Verfahren
bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen
zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben
von Fennell et al.. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567–570; Stoeger
et al. (1995) Plant Cell Rep. 14: 273–278; Jahne et al. (1994) Theor
Appl Genet 89: 525–533
verwendet.
-
"Transgen" meint – zum Beispiel
bezüglich
einer Nukleinsäuresequenz,
einem Expressionskonstrukt oder einem Expressionsvektor enthaltend
besagte Nukleinsäuresequenz
oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz,
Expressionskonstrukt oder Expressionsvektor – alle solche durch gen technische
Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder
- a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Tocen-1
Protein gemäß SEQ ID
NO: 2, ein funktionelles Äquivalent
desselben oder ein funktionell äquivalentes
Teil der vorgenannten, oder
- b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell
verknüpfte
genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
- c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen,
genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden
modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen,
Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer
Nukleotidreste sein kann. Natürliche
genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus
in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen
Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche,
genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt
zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz
zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt
mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz
besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt – beispielsweise
die natürlich
vorkommende Kombination des Promotors eines Gens kodierend für ein Protein
gemäß SEQ ID
NO: 2 oder ein funktionelles Äquivalent
desselben mit seinen entsprechenden kodierenden Sequenzen wird zu
einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn diese durch nicht-natürliche,
synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise
einer Mutagenisierung geändert wird.
Entsprechende Verfahren sind beschrieben ( US 5,565,350 ; WO 00/15815 ; siehe auch oben).
-
"Transgen" meint in Bezug auf
eine Expression ("transgene
Expression") bevorzugt
all solche unter Einsatz eines transgenen Expressionskonstruktes,
transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus – entsprechend
dem oben gegebenen Definitionen – realisierten Expressionen.
-
Als transgene Organismen bevorzugte
Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem pflanzliche Organismen
gemäß der oben
genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung
alle Gattungen und Arten höherer
und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches, insbesondere Pflanzen,
die für
die Gewinnung von Ölen
verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja,
Mais, Weizen und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen
Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete
Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen
meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits
des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem
frühen
Entwicklungsstadium.
-
Die Herstellung der transgenen Organismen
kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder
Transfektion von Organismen realisiert werden.
-
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen
und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile – wie zum
Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. –, und transgenes
Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrangs-
oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere
von Vitamin E oder Vitamin E-Derivaten
wie beispielsweise Vitamin E Acetat.
-
Sequenzens
-
- 1. SEQ ID NO: 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das Tocen-1
Protein
- 2. SEQ ID NO: 2 Proteinsequenz kodierend für das Tocen-1 Protein
- 3. SEQ ID NO: 3 Oligonukleotidprimer sll0832-5
- 4. SEQ ID NO: 4 Oligonukleotidprimer sll0832-3
- 5. SEQ ID NO: 5 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
das SalI-PacI-ocs-HindIII Sequenzfragment
- 6. SEQ ID NO: 6 Oligosequenz kodierend für den sense-Strang eines SwaI-Linkers
- 7. SEQ ID NO: 7 Oligosequenz kodierend für den antisense-Strang eines SwaI-Linkers
- 8. SEQ ID NO: 8 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den Expressionsvektor pSUN2-1
- 9. SEQ ID NO: 9 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
das rbcS-Transitpeptid
- 10. SEQ ID NO: 10 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den Expressionsvektor pSUN2-2
- 11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotidprimer 0832ex1-5
- 12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotidprimer 0832ex1-3
- 13. SEQ ID NO: 13 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den Nitrilase-1 Promotor aus A.thaliana
- 14. SEQ 2D NO: 14 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/sll0832/ocs
- 15. SEQ ID NO: 15 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den transgenen Expressionsvektor pSUN2/NitP/rbcS/sll0832/ocs
- 16. SEQ ID NO: 16 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den USP-Promotor
aus Vicia faba in pUC-Vektor
- 17. SEQ ID NO: 17 Oligonukleotidprimer sll0832ex2-5
- 18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotidprimer sll0832ex2-3
- 19. SEQ ID NO: 19 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den transgenen Expressionsvektor pSUN2-USP-sll0832-catT
- 20. SEQ ID NO: 20 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
das rbcS-MCS-OCS-Fragment
(rbs: rbs-Transitpeptid; MCS: Multiple Klonierungsstelle; OCS: Terminationssignal
des Octopin-Synthase Gens.
- 21. SEQ ID NO: 21 Nukleinsäuresequenz
kodierend für
den transgenen Expressionsvektor pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs
-
Abbildungen
-
1:
Konstruktkarte von pCR-Script/sll0832 "A" representiert
das für
Tocen-1 kodierende DNA-Fragment (456 Basenpaare)
-
2:
Konstruktkarte von pCR-Script/sll0832::tn903 Fragment A' (268 Basenpaare)
beinhaltet den 5'-Bereich
von Tocen-1, Fragment B das Transposon 903 (1286 Basenpaare) und
Fragment 'A (194
Basenpaare) den 3'-Bereich
von Tocen-1. Die Kanamycin-Kassette des tn903 inserierte in pCR-Script/sll0832
derart, dass die Transkription des Kanamycinresistenzgens des Tn903
in entgegengesetzter Richtung zur Transkription des offenen Leserasters
von Tocen-1 verläuft.
-
3:
Tocopherolproduktion in Synechocystis/sll0832::tn903 Zwei unabhängige Tocen-1
Knockout Mutanten (1 und 2) zeigten im Vergleich zu den Synechocystis
spec. PCC 6803 Wildtypzellen (WT) eine signifikante Verminderung
in der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion.
-
4:
Konstrukkarte von pSUN2/NitP/sll0832/ocs (SEQ ID No: 14)
Fragment "A" (1894 bp):Nitrilase-1 Promotor
Fragment "B" (456 Bp): offenes Leseraster von Tocen-1
Fragment "C" (219 Bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
-
5:
Konstruktkarte von pSUN2/NitP/rbcS/sll0832/ocs
Fragment "A" (1894 bp): Nitrilase-1 Promoter
Fragment "B" (167 bp): Fragment kodierend für das rbcS
Transitpeptid
Fragment "C" (456 bp): offenes
Leseraster von Tocen-1
Fragment "D" (219
bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
-
6:
Konstruktkarte von pSUN2/USP/sll0832/3`cat
Fragment "A" (674 bp): Promotor des USP Gens aus
Vicia faba
Fragment "B" (456 Bp): offenes
Leseraster von Tocen-1
Fragment "C" (229
Bp): Terminationssignal des Cathepsin D Inhibitor Gens.
-
7:
Konstrukkarte von pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs
Fragment "A" (674 bp): Promotor des USP Gens aus
Vicia faba
Fragment "B" (174 Bp): Fragment
kodierend für
das rbcS Transitpeptiddas
Fragment C (459 Bp): offenes Leseraster
von Tocen-1
Fragment D (219 Bp): Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.
-
Beispiele
-
Alle Chemikalien, wenn nicht anders
erwähnt,
stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe),
5erva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme,
DNAmodifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den
Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen),
Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison,
Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen
(Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire,
United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend
der Angaben des Herstellers eingesetzt.
-
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden
kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode
(Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896–897) erfolgen.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte
wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung
von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und
Nylonmembranen, Verknüpfen
von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von
Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter
DNA werden wie bei Sambrook et al.. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter
DNA-Moleküle
erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI
nach der Methode von Sangen (Sangen et al.. (1977) Proc Natl Acad
Sci USA 74: 5463–5467).
-
Beispiel 1: Allgemeine
Verfahren
-
Die Pflanze Arabidopsis thaliana
repräsentiert
ein Mitglied der höheren
Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen
Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z.B. Brassica napus,
aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund
des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen
kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt
werden.
-
a) Anzucht von Arabidopsis
Pflanzen
-
Die Pflanzen werden entweder auf
Murashige-Skoog Medium mit 0,5% Saccharose (Opas et al.. (1997)
Science 277: 91–94)
oder auf Erde gezogen (Focks & Benning
(1998) Plant Physiol 118: 91–101).
Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten
zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf
Erde zwei Tage bei 4°C
stratifiziert. Nach der Blüte
werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden
dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.
-
b) Anzucht von Synechocystis
-
Die Zellen von Synechocystis sp.
PCC 6803 werden in BG11-Medium normalerweise autotroph kultiviert.
Sie haben einen Durchmesser von 2,3 bis 2,5 μm. Bei den hier geschilderten
Untersuchungen wurde der Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803
Stamm aus der Sammlung von Prof. Dr. Peter Wolk und Prof. Dr. Lee
McIntosh (Plant Research Laboratory, Michigan State University,
East Lansing, Michigan, USA) eingesetzt. Dieser ist Glukose-tolerant,
d.h. er kann auch heterotroph im Dunkeln, mit nur wenigen Minuten schwacher
Blaulicht-Beleuchtung pro Tag, wachsen. Diese Kulturbedingungen
wurden von Anderson und McIntosh (Anderson und Mclntosh (1991) J
Bacteriol 173: 2761–2767)
entwickelt und "Light-activated
heterotrophic growth" (LANG)
genannt. Damit ist es möglich,
diese Cyanobakterien ohne laufende Photosynthese und damit ohne
Produktion von Sauerstoff zu kultivieren.
-
BG 11 Kulturmedium für Synechocystis
Stammlösung 100 × BG11:
NaNO3 1,76 M = 149,58 g
MgSO4 × 7
H2O 30,4 mM = 7,49 g
CaCl2 × 2
H2O 24,5 mM = 3,6 g
Zitronensäure 3,12
mM = 0,6 g
Na EDTA pH 8 0,279 mM = 0,104 g
-
Die abgewogenen Substanzen werden
in 900 ml H2O gelöst und mit 100 ml des "Trace metal mix stock" 1000 × auf
1000 ml aufgefüllt.
Diese gewonnene Lösung
dient als Stammlösung.
-
Trace metall mix stock 1000 ×:
HB3O3 46,3 mM = 2,86
g/l
MnCl2 × 4H2O
4,15 mM = 1,81 g/l
ZnSO4 × 7H2O 0,77 mM = 0.222 g/l
Na2MoO4 × 2H2O
1,61 mM = 0,39 g/l
CuSO4 × 5H2O 0,32 mM = 0,079 g/l
Co(NO3)2 × 6H2O 0,17 mM = 0,0494 g/l
-
Für
1 Liter BG11 Kulturlösung
werden folgende Lösungen
benötigt:
- 1. 10 ml der Stammlösung 100 × BG 11
- 2. 1 ml Na2CO3 (189
mM)
- 3. 5 ml TES (1 M, pH 8)
- 4. 1 ml K2PO4 (175
mM)
-
Während
Lösung
2. und 3. steril filtriert werden sollten, muss Lösung 4 autoklaviert
werden. Die gesamte BG11 Kulturlösung
muß vor
Gebrauch autoklaviert und anschließend mit 1 ml Eisen-Ammonium-Citrat (6
mg/ml), das zuvor steril filtriert wurde, versetzt werden. Das Eisen-Ammonium-Citrat
sollte auf keinen Fall autoklaviert werden. Für Agarplatten werden 1,5% (w/v)
Bactoagar pro Liter BG11 Medium zugesetzt.
-
Beispiel 2: Amplifikation
und Klonierung von Tocen-1 aus Synechocystis spec. PCC 6803
-
Die DNA kodierend für Tocen-1
wurde mittels "Polymerase
Chain Reaction" (PCR)
aus Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Crispin
A. Howitt (Howitt CA (1996) BioTechniques 21: 32–34) unter Verwendung eines
sense spezifischen Primers (sll0832-5'; SEQ ID NO: 3) und eines antisense
spezifischen Primers (sll0832-3';
SEQ ID NO: 4) amplifiziert.
-
Primer sll0832-5':
5'-GGATCCATGGGACGTTGGCCCACTGG-3' (SEQ ID NO: 3)
-
Primer sll0832-3':
5'-GTCGACCTAGCAACGGCCGCTATCC-3' (SEQ ID NO: 4)
-
Die PCR erfolgte in einem 50 μl Reaktionsansatz
in dem enthalten war:
5 μl | einer
Synechocystis spec. PCC 6803 Zellsuspension |
0,2
mM | dATP,
dTTP, dGTP, dCTP |
1,5
mM | Mg(OAc)2 |
5 μg | Rinderserum-Albumin |
40
pmol | Oligonukleotidprimer
sll0832-5' |
40
pmol | Oligonukleotidprimer
sll0832-3' |
15 μl | 3,3X
rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems) |
5U | rTth
DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems) |
-
Die PCR wurde unter folgenden Zyklus-Bedingungen
durchgeführt:
Schritt
1: 5 Minuten 94°C
(Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minuten
52°C (Annealing)
Schritt
4: 1 Minuten 72°C
(Elongation) 35 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt
5: 10 Minuten 72°C
(Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)
-
Das Amplifikat (468 Basenpaare) wurde
unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor
pCR-Script (Stratagene) kloniert. Das Konstrukt hat die Bezeichnung
pCR-Script/sll0832. Die Identität
des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung
des T3- und des T7-Primers bestätigt
(vgl. SEQ 2D NO: 1). 1 stellt
pCR-Script/sll0832
dar, wobei "A" das für Tocen-1
kodierende DNA-Fragment
(456 Basenpaare) representiert.
-
Beispiel 2: Erzeugung
einer Tocen-1 Knock out Mutante
-
Ein DNA Konstrukt zur Erzeugung einer
Deletionsmutante von Tocen-1 in Synechocystis spec. PCC 6803 wurde
unter Anwendung von Standardklonierungstechniken erzeugt. Der Vektor
pCR-Script/ sll0832 wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms
NcoI partiell verdaut und die überstehenden
Enden des Restriktionsverdaus nach Standardmethoden in glatte Enden überführt. In
die mit stumpfen Enden versehene NcoI Schnittstelle des offenen
Leserasters von Tocen-1 wurde die Aminoglycosid-3'Phosphotransferase
des Transposons Tn903 kloniert. Dazu wurde das Tn903 als EcoRI Fragment
aus dem Vektor pUC4K (Vieira J und Messing J (1982) Gene 19: 259–268) isoliert,
die überstehenden
Enden des Restriktionsverdaus nach Standardmethoden in glatte Enden überführt und
in den NcoI geschnittenen Vektor pCR-Script/sll0832 ligiert (NcoI
mit geglätteten
Enden). Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E.coli
X11 Blue Zellen verwendet. Transformanden wurden durch Verwendung
von Kanamycin und Ampicillin selektioniert. Ein rekombinantes Plasmid
(pCR-Script/sll0832::tn903; siehe 2)
wurde isoliert und zur Transformation von Synechocystis spec. PCC
6803 gemäß der Methode
nach Williams (Williams (1987) Methods Enzymol 167: 776–778) eingesetzt.
-
Die Kanamycin-Kassette des tn903
inserierte in pCR-Script/sll0832 derart, dass die Transkription
des Kanamycinresistenzgens des Tn903 in entgegengesetzter Richtung
zur Transkription des offenen Leserasters von Tocen-1 verläuft.
-
In 2 beinhaltet
Fragment A' (268
Basenpaare) den 5'-Bereich
von Tocen-1, Fragment B das Transposon 903 (1286 Basenpaare) und
Fragment 'A (194
Basenpaare) den 3'-Bereich
von Tocen-1.
-
Synechocystis spec. PCC 6803 Transformanden
wurden auf Kanamycin haltigem (km) BG-11 Festmedium (Castenholz
(1988) Methods in Enzymology Seite 68–93) bei 28°C und 30 μmol Photonen*(m2*s)–1 selektioniert.
Acht unabhängige
Knockout Mutanten konnten nach fünf
Selektionsrunden (Passagen von Einzelkolonien auf frisches BG-11km
Medium) erzeugt werden. Der vollständige Verlust des Tocen-1 Endogens bzw.
der Austausch gegen die rekombinante Tocen-1::tn903 DNA wurde durch
PCR Analysen bestätigt.
-
Beispiel 3: Tocopherolproduktion
in Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen und den Tocen-1 Knockout
Mutanten
-
Die auf den BG-11km Agarmedium kultivierten
Zellen von jeweils zwei unabhängigen
Synechocystis spec. PCC 6803 Tocen-1 Knockout Mutanten sowie untransformierte
Wildtypzellen (auf BG11 Agar medium ohne Kanamycin) wurden zum Animpfen
von Flüssigkulturen
verwendet. Dazu wurden Zellen der Mutante bzw. des Wildtyps Synechocystis
spec. PCC 6803 von Platte in jeweils 10 ml Flüssigkultur überführt. Diese Kulturen wurden
bei 28°C
und 30 μmol
Photonen*(m2*s)–1 (30 μE) für ca. 3
Tage kultiviert. Nach Bestimmung der OD730 der
einzelnen Kulturen, wurde die OD730 aller
Kulturen durch entsprechende Verdünnungen mit BG-11 (Wildtypen)
bzw. BG-11km (Mutanten) synchronisiert. Diese auf Zelldichte synchronisierten
Kulturen wurden zum Animpfen von drei Kulturen der Mutante bzw.
der Wildtypkontrolle verwendet. Die biochemischen Analysen konnten
somit unter Verwendung von jeweils drei unabhängig gewachsenen Kulturen einer
Mutante und der entsprechenden Wildtypen durchgeführt werden.
Die Kulturen wurden bis zu einer optischen Dichte von OD730 = 0,3 angezogen.
-
Das Medium der Zellkultur wurde durch
zweimalige Zentrifugation bei 14000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge
entfernt. Der daran anschließende
Aufschluß der
Zellen und Extraktion der Tocopherole und Tocotrienole erfolgte
durch zweimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm
in 100% Methanol für
15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere
Inkubationsschritte ergaben keine weitere Freisetzung von Tocopherolen
oder Tocotrienolen.
-
Um Oxidation zu vermeiden, wurden
die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters
Allience 2690 HPLC-Anlage
analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine Reverse Phase Säule (ProntoSil
200-3-C30, Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt
und anhand von Standards (Merck) identifiziert. Als Detektionssystem
diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision
320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszensdetektors FP 920 nachgewiesen
wurde.
-
Die Tocen-1 Knockout Mutanten zeigten überraschenderweise
im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen einen
Verlust der Tocopherol- und Tocotrienolproduktion (3).
-
Beispiel 4: Manipulation
der Tocopherol-Biosynthese in Nicotiana tabacum Samsun NN, Arabidopsis
thaliana und Brassica napus durch transgene Expression von Tocen-1
-
Es werden transgene Pflanzen erzeugt,
die Tocen-1 zum einen unter Kontrolle des konstitutiven Promoters
des Nitrilase-1 (nitl) Gens aus A. thaliana (GenBank Acc.-No.: Y07648.2,
Nukleotide 2456–4340,
Hillebrand et al.. (1996) Gene 170: 197–200) und zum anderen unter
Kontrolle des samenspezifischen Promotors des USP (unknown seed
protein) Gens aus Vicia faba (Bäumlein
et. al.. (1991) Mol Gen Genet 225: 459–467) exprimieren. Darüber hinaus
wird Tocen-1 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins (Guerineau
et al.. (1988) Nucl Acid Res 16: 11380) sowohl konstitutiv als auch
samenspezifisch exprimiert. Als Expressionsvektor dienen Derivate
des pSUN-Vektors (
WO 02/00900 ).
-
Für
die konstitutive Expression wurde der Vektor pSUN2 unter Anwendung
von Standardmethoden so verändert,
dass der ocs-Terminator
(Gielen et al.. (1984) EMBO J 3: 835–846) als SalI-PacI-ocs-HindIII
Fragment (Sequenz ID No: 5) eingebracht wird. Durch Einführung eines
Linkers wird zusätzlich
eine SwaI Schnittstelle in den Polylinker eingeführt (SEQ ID No: 6 and SEQ ID
No: 7). Das resultierende Plasmid wird mit pSUN2-1 bezeichnet (Sequenz
ID NO: 8).
-
Für
die Expression als Fusionsprotein mit dem rbcS-Transitpeptid wird
das DNA-Fragment kodierend für
das rbcS-Transitpeptid als SacI-SwaI-Fragment amplifiziert (Sequenz
ID No: 9) und in den pSUN2-1 eingeführt. Der Vektor wird als pSUN2-2
bezeichnet (Sequenz ID NO: 10).
-
Zur Expression von Tocen-1 unter
konstitutiver Kontrolle wird der ORF als SwaI-PacI-Fragment unter Verwendung
von Standardmethoden mit Hilfe der Primer 0832ex1-5' und 0832ex1-3' (SEQ ID No. 11 und
SEQ ID No. 12) amplifiziert. Das entstehende 462 bp-Fragment wird
in den pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers
kloniert und mit Hilfe des T3- und T7-Primers sequenziert.
-
Ein korrekter Klon wird mit SwaI-PacI
geschnitten und unter Anwendung von Standardmethoden in einen SwaI-PacI
geschnittenen pSUN2-1 ligiert. In das resultierende Konstrukt, das
mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter als XhoI-Fragment
(SEQ ID No: 13), dessen überhängende Enden
mit Klenow-Polymerase nach Standardmethoden aufgefüllt werden,
kloniert. Dieses Plasmid wird mit pSUN2/NitP/sll0832/ocs bezeichnet
(SEQ ID No: 14) und zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet
(vgl. 4).
-
Zur Konstruktion eines Plasmides,
das Tocen-1 als Fusionsprotein mit dem Transitpeptid des rbcS-Proteins
unter Kontrolle des konstitutiven Promoters NitP exprimiert, wird
pSUN2-2 mit SwaI und PacI geschnitten. Der so geschnittene Vektor
wird mit dem Tocen-1 Fragment ligiert, das nach Verdau mit SwaI
und PacI aus pCR-Script/sll0832 isoliert wird. In das resultierende
Plasmid, das mit Ec1136II geschnitten wird, wird der Nitrilase-Promoter
(SEQ ID NO: 13) als XhoI-Fragment, dessen überhängende Enden mit Klenow-Polymerase
nach Standardmethoden aufgefüllt
werden, ligiert. Diese Klonierung erlaubt die Expression eines Fusionsproteins,
das das Transitpeptid des rbcS-Proteins und Tocen-1 enthält (vgl. 5, SEQ ID No. 15).
-
Zur Erzeugung eines Plasmides, welches
die samenspezifische Expression von Tocen-1 in Pflanzen ermöglicht,
wird der samenspezifische Promotor des USP Gens aus Vici faba verwendet,
der als EcoRI-NcoI-Fragment in einem pUC-Derivat vorliegt (SEQ ID
NO: 16).
-
Für
die Klonierung unter Kontrolle des USP-Promoters wird das offene
Leseraster von Tocen-1 unter Verwendung von Standard-PCR-Methoden so amplifiziert,
dass am 5'-Ende
eine BbsI-Schnittstelle und am 3'-Ende
eine EcoRV-Schnittstelle generiert werden. Dazu werden nachfolgende
der Oligonukleotidprimer verwendet:
sll0832ex2-5': (SEQ ID NO: 17)
und
S1l0832ex2-3':
(SEQ ID No: 18)
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Das Amplifikat wird in pCR4Blunt-TOPO
kloniert und sequenziert.
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Das PCR-Produkt wird als BbsI-EcoRV-Fragment
in den mit NcoI (überhängende Enden
kompatibel mit 5'-Überhang
des PCR-Produktes) und EcoRV geschnittenen Vektor ligiert. Das Expressionskonstrukt
wird als PmeI und AfeI-Fragment in den mit EcoRV geschnittenen pSUN2
ligiert. Das resultierende Plasmid heißt pSun2-USPsll0832-3'cat (vgl. 6, SEQ ID NO: 19).
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Für
die Konstruktion eines Plasmides, das die samenspezifische Expression
als Fusionsprotein mit dem rbcS Transitpeptid erlaubt, wird das
rbcS-Fragment zusammen mit dem ocs-Terminator als Ncol-HindIII-Fragment
(SEQ ID No: 20) aus pSUN2-2 amplifiziert und in das pUC-Derivat
kloniert, der den USP Promoter enthält. Promoter, rbcS und ocs
werden als PmeI-AfeI-Fragment in den mit EcoRV geschnittenen pSUN2
kloniert. In diesen Expressionsvektor wird Tocen-1 als SwaI-PacI-Fragment
kloniert. Das resultierende Plasmid heißt pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs
(7, SEQ ID No: 21).
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Beispiel 5: Herstellung
transgener A.thaliana Pflanzen
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Wildtyp A.thaliana Pflanzen (Columbia)
werden mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage
einer modifizierten Methode (Steve Clough und Andrew Bent (1998)
Plant J 16 (6): 735–743) der
Vacuum Infiltrationsmethode nach Bechtold et al. (Bechtold N et
al.. (1993) CRAcad Sci Paris 1144 (2): 204–212) transformiert.
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Die verwendeten A.tumefaciens Zellen
werden im Vorfeld mit den Plasmiden pSUN2/NitP/sll0832/ocs (SEQ
ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/sll0832/catT
(SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 21)
transformiert.
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Samen der Agrobacterium-transformierten
Primärtransformanden
werden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika
resistente Keimlinge werden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen
zur biochemischen Analyse verwendet.
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Beispiel 6: Herstellung
transgener Brassica napus Pflanzen
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Die Herstellung transgener Raps Pflanzen
orientiert sich an einem Protokoll von Bade JB und Damm B (in Gene
Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer
Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30–38), in welchem auch die Zusammensetzung
der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.
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Die Transformationen erfolgen mit
den Agrobacterium tumefaciens Stämmen
EHA105 bzw. GV3101. Zur Transformation werden die Plasmide pSUN2/NitP/sll0832/ocs
(SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/ rbcS/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/sll0832/catT
(SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 21)
verwendet.
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Samen von Brassica napus var. Westar
werden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensteril gemacht, 10 Minuten
bei 55°C
in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1%
v/v Tween 20) für
20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils
20 Minuten gewaschen. Die Samen werden drei Tage auf Filterpapier
getrocknet und 10 bis 15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium
zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) werden
die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle
in ca. 6 mm lange Stücke
geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate werden 30 Minuten
mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach
Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden
bei 100 U/min inkubiert.
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Vom den einzelnen mit den Plasmiden
pSUN2/NitP/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 14), pSUN2/NitP/rbcS/sll0832/ocs
(SEQ 2D NO: 15), pSUN2/USP/sll0832/catT (SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/ sll0832/ocs
(SEQ ID NO: 21) transformierten Agrobacterien Stämmen wird jeweils eine Übernachtkultur
bei 29°C
in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2
ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu
einer 0D600 von 0,4 bis 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der
Kultur bei 2000 U/min für
25 min wird das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration
der Bakterien in der Lösung
wird durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD600 von 0,3
eingestellt.
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Aus den Raps-Explanten wird das Kallus-Induktionsmedium
mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig
gemischt und für
20 min inkubiert. Die Agrobacterien-Suspension wird entfernt, die
Raps-Explante für
1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100
ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wird
für 24
h auf einem Rotiationsschüttler bei
100 U/min durchgeführt.
Die Co-Kultivierung wird durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums
gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und
zweimal für
60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das
Waschmedium mit den Explanten wird in 15 cm Petrischalen überführt und
das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
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Zur Regeneration werden jeweils 20
bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Spross-Induktionsmedium
mit Kanamycin enthalten. Die Petrischalen werden mit 2 Lagen Leukopor
verschlossen und bei 25°C
und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit
inkubiert. Alle 12 Tage werden die sich entwickelnden Kalli auf
frische Petrischalen mit Spross-Induktionsmedium überführt. Alle
weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen werden wie von
Bade JB und Damm B (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und
Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995,
30–38) beschrieben
durchgeführt.
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Beispiel 7: Herstellung
transgener Nicotiana tabacum Pflanzen
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10 ml YEB-Medium mit Antibiotikum
(5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose
und 2 mM MgSO4) werden mit einer Kolonie
der einzelnen mit den Plasmiden pSUN2/NitP/sll0832/ocs (SEQ ID NO:
14), pSUN2/NitP/rbcS/ sll0832/ocs (SEQ ID NO: 15), pSUN2/USP/sll0832/catT
(SEQ ID NO: 19) bzw. pSUN2/USP/rbcS/sll0832/ocs (SEQ ID NO: 21)
transformierten Agrobacterium tumefaciens Stämme beimpft und über Nacht
bei 28°C
kultiviert. Die Zellen werden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge
pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter
sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wird für die Transformation
eingesetzt.
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Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur
werden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wird nur die Spitze
der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles
Einweckglas überführt. Vom Rest
der Pflanze werden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen
der Blätter
entfernt. Die Blätter werden
mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm2 große Stücke geschnitten.
Die Agrobakterienkultur wird in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser
2 cm). Die Blattstücke
werden kurz durch diese Lösung
gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser
9 cm) gelegt, so daß sie
das Medium berührten.
Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C
werden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und
in der Klimakammer auf 28°C
temperiert. Das Medium muß alle
7 bis 10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, werden
die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sprossinduktionsmedium
mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose, 0,02
mg/l Naphtylessigsäure,
0,02 mg/l Gibberelinsäure,
0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt. Nach
etwa einem Monat tritt Organogenese ein und die gebildeten Sprosse
können
abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wird auf 2MS-Medium
mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen
gebildet hat, können
die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.
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Beispiel 8: Charakterisierung
der transgenen Pflanzen
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Um zu bestätigen, dass durch die Expression
von Tocen-1 die Vitamin E-Biosynthese in den transgenen Pflanzen
beeinflusst wird, werden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte
in Blätter
und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten
Pflanzen (Arabidopsis.thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum)
analysiert. Dazu werden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus
kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für Tocen-1 exprimieren auf Northern-Ebene
identifiziert. In Blättern
und Samen dieser Pflanzen wird der Tocopherolgehalt und der Tocotrienolgehalt
ermittelt. In allen Fällen
ist die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentration im Vergleich
zu nicht transformierten Pflanzen erhöht.
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