ES2648259T3 - Plantas transgénicas que tienen alterada la actividad de la sintetasa DAHP - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que comprende al menos una célula vegetal que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde dicha al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y en la que la planta transgénica comprende una cantidad incrementada de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a plantas transgénicas y métodos para alterar la actividad de la sintasa de 3Desoxi-D-Arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHP) en plantas que llevan a una mayor producción de fenilalanina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La vía de shikimato, presente en muchos organismos, incluyendo plantas, enlaza el metabolismo de hidratos de carbono para la biosíntesis de compuestos aromáticos. En una secuencia de varios pasos metabólicos, el carbono primario se convierte a través de shikimato en corismato (parte superior de la Fig. 1). Corismato luego sirve como un precursor para la síntesis de los tres aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano (parte inferior de la Fig. 1). En las plantas, los productos de la propia vía del shikimato, así como los aminoácidos aromáticos producidos aguas abajo, están involucrados en la producción de múltiples metabolitos secundarios, como alcaloides, flavonoides, lignina, cumarinas, derivados de indol y otros compuestos fenólicos. Por lo tanto, la vía Shikimato sirve como un puente entre el metabolismo primario y secundario.

[0003] La primera enzima comprometida de la vía de shikimato es sintasa de 3-Desoxi-D-Arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHPS), que convierte hosfoenolpiruvato (PEP) y Eritrosa 4-Fosfato (E-4P) en 3-Deoxi-D-Arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHP) (Fig. 1). Escherichia (E.) coli tiene tres diferentes isoenzimas DAHPS codificadas por los genes AroF, AROG y ArOH, que codifican proteínas que son retroalimentación inhibida por los aminoácidos aromáticos individuales tirosina (Tyr) fenilalanina (Fe) y triptófano (Trp), respectivamente (Brown, K. Genetics, 1968. 60 (1): 31 -48). La principal isoforma DAHPS Fe-sensible, lo que hace que hasta el 80% de la actividad total E. coli DAHPS, es una proteína homo-tetrámera codificada por el gen AroG (Hu, C. et al., J Basic Microbiol, 2003. 43 (5): páginas 399 -406; Wallace, B. y J. Pittard, J Bacteriol, 1967. 93: 237 -244). También se ha sugerido que el Nterminal, así como las regiones interiores de este AROG codificado con DAHPS están involucradas en su inhibición por retroalimentación por fenilalanina (Hu et al 2003, supra;. Xu, J. et al, J Basic Microbiol., 2004. 44 (5): 400 -406: Ger, Y. et al., J Biochem, 1994. 116 (5): 986 -990). Las mutaciones que sustituyen a un número de aminoácidos en el AROG codificados con DAHPS, incluyendo prolina en la posición 150 a leucina, leucina en la posición 175 a glutamina, leucina en la posición 179 en ácido aspártico y fenilalanina en la posición 209 a alanina, significativamente reducidos en la medida de la inhibición de retroalimentación de 1 mM de fenilalanina mientras que muestra propiedades cinéticas similares a las de tipo salvaje (Xu et al. 2004, supra). Estas mutaciones también se asociaron con la sobreproducción significativa de la fenilalanina en las células bacterianas (Hu et al. 2003, supra).

[0004] Patente Europea Nº 1270721 da a conocer secuencias de ADN recombinante por retroalimentación que codifican enzimas liberadas por inhibición, en particular un gen AROG mutado de codificación de sintasa de 3Desoxi-D-ácido arabinoheptulónico-7-fosfato, en el que el residuo de prolina 150 está sustituido por un residuo de leucina, plásmidos que contienen estas secuencias de ADN recombinante, microorganismos transformados con estos plásmidos y un proceso para preparar L-triptófano, L-fenilalanina y L-tirosina por fermentación.

[0005] En contraste con E. coli, y muchas otras especies bacterianas, la regulación alostérica de la planta DAHPS es todavía cuestionable. (Gilchrist, D. y T. Kosuge, In: B.N. Miflin, ed, the Biochemistry of Plants, Academic Press, Nueva York, 1980. 5: 507-531; Herrmann, K.M. y L.M. Weaver, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1999. 50: 473 -503). Se ha descrito que las actividades in vitro de DAHPS de diferentes especies de plantas pueden ser débilmente inhibidas por Trp y Tyr o débilmente activadas por cualquiera de Trp o Tyr. Además, la actividad del frijol (Vigna radiata) DAHPS está débilmente inhibida por prefenato y arogenato, los precursores de la biosíntesis de Fe y Tyr. Todavía se desconoce, sin embargo, si esta retroalimentación se debe a la inhibición de la expresión de la enzima o la inhibición de su actividad.

[0006] Plantas de arabidopsis poseen dos genes de DAHPS, DHS1 (At4G39980) y DHS2 (At4G33510) además de un gen putativo (At1g22410) con alta similitud con DHS1. La expresión de DHS1 en Arabidopsis es inducida por heridas físicas o por la infiltración con cepas patógenas Pseudomonas syringae (Keith, B. et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1991. 88 (19): 8821 a 8825). La presencia de extensiones amino-terminales características de péptidos de tránsito del cloroplasto en las proteínas de Arabidopsis codificadas por DHS1 y DHS2 apoya la noción de que ambas proteínas se localizan en el cloroplasto. El tomate (Solanum esculentum) también contiene dos DHAPS distintos que codifican los genes que contienen los péptidos de tránsito de plastidio y se expresan diferencialmente (Gorlach, J. et al, Plant Mol Biol, 1993. 23 (4): 707-16). Sin embargo, a pesar de la información disponible sobre la expresión y actividad de DAHPS en plantas, aún se desconoce si esta enzima sirve como un regulador principal del flujo a través de la vía Shikimato y por lo tanto si DAHPS es una enzima reguladora clave que une el metabolismo primario y secundario.

[0007] La patente de EE.UU. Nº 5.906.925 da a conocer métodos para incrementar el rendimiento de 3-Desoxi-Darabino-Heptulosonato 7-fosfato (DAHP) en los microorganismos a través de alteraciones genéticas, particularmente

por la sobreexpresión de sintasa de piruvato de fosfenol.

[0008] La patente de EE.UU. Nº 6.911.331 da a conocer fragmento de ácido nucleico aislado que codifica una sintetasa DAHP. La patente también describe la construcción de un gen quimérico que codifica todo o una parte de la sintetasa de DAHP, en orientación sentido o antisentido, en donde la expresión del gen quimérico da como resultado la producción de niveles alterados de la sintetasa de DAHP en una célula hospedadora transformada, que incluye células vegetales.

[0009] La patente de EE.UU. Nº 5.776.736 da a conocer las enzimas de sintasa 3-deshidroquinato, quinasa de siquimato, sintasa de 5-enolpiruvoil-shikimato-3-fosfato y sintasa de corismato como enzimas limitantes de la velocidad en la ruta común de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos en procariotas. La transformación de células procarióticas con secuencias exógenas de ADN que codifican estas enzimas dio como resultado un aumento significativo en la producción del producto final.

[0010] La patente de EE.UU. Nº 7.790.431 da a conocer enzimas y rutas enzimáticas para la síntesis basada en piruvato de shikimato o al menos un intermedio del mismo o derivado del mismo. La Patente también describe ácidos nucleicos que codifican las enzimas, células transformadas con los mismos, y kits que contienen dichas enzimas, células o ácido nucleico. Una aldolasa KDPGal se usa para realizar la condensación de piruvato con Deritrosa 4-Fosfato para formar 3-Desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHP); se usa una sintasa de 3deshidroquinato para convertir el DAHP en 3-deshidroquinato (DHQ); deshidratasa DHQ puede convertir el DHQ en el intermediario clave del shikimato, 3-dehidroshikimato.

[0011] US 2007/118916 da a conocer la expresión de genes de sintetasa DAHP bacterianos o del gen de sintetasa de levadura DAHP en plastidios o las mitocondrias de una planta para la producción de productos químicos finos tales como triptófano, fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, ácido esteárico, vitamina E, triglicéridos, lípidos, aceites o similares. Se informa que la expresión de b0754 bacteriano da como resultado niveles aumentados de fenilalanina en un 28 a 122%.

[0012] Publicación de Solicitud Internacional (PCT) Nº WO2009/072118 da a conocer que la transformación de células vegetales con polinucleótido que codifica mutasa de corismato de retroalimentación insensible y prefenato deshidrata resultados en contenido alterado de materias de al menos uno de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. Sin embargo, estas enzimas se encuentran aguas abajo de la vía Shikimato, y por lo tanto la cantidad de corismato disponible es un "cuello de botella" que dicta los niveles máximos de ácidos aromáticos que pueden producirse.

[0013] Por lo tanto, medios para la modulación de la vía de shikimato en las plantas hacia la producción de mayores tasas de aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano es altamente deseada, ya que estos aminoácidos son componentes esenciales de la síntesis de proteínas y también sirven como precursores para una amplia gama de metabolitos secundarios que son importantes para el crecimiento de las plantas, así como para la nutrición y la salud humana.

RESUMEN

[0014] La presente invención da a conocer que la atenuación de la inhibición por retroalimentación de sintasa de 3Desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-Fosfato (DHAPS), la primera enzima de la vía de shikimato en las plantas, desencadena la acumulación de los productos directos de la vía Shikimato y del aminoácido aromático fenilalanina. Los niveles de triptófano y tirosina también se incrementan, aunque en menor medida en comparación con el nivel de fenilalanina.

[0015] La presente invención se basa en parte en el descubrimiento inesperado de que la expresión en una célula vegetal del gen AROG mutante E. coli, que codifica DAHPS habiendo reducido la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina (también denominado aquí como "DAHPS insensible a retroalimentación"), resultó en la sobreproducción de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, triptófano y tirosina. Sin desear estar sujeto a ninguna teoría o mecanismo de acción específico, el aumento observado en los contenidos de aminoácidos aromáticos puede atribuirse a la sobreproducción de shikimato y/o corismato, que liberan el "cuello de botella" en la producción de metabolitos secundarios derivados de corismato, así como de fenilalanina, triptófano y tirosina. Una ventaja de las enseñanzas de la presente invención se basa en la regulación de una de las primeras enzimas que limitan la velocidad en la ruta de Shikimato, de manera que se incrementa la cantidad de metabolitos precursores. Tener cantidades elevadas de los metabolitos precursores permite la producción de metabolitos secundarios en cantidades elevadas.

[0016] Así, según un aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica que comprende al menos una célula vegetal que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-Desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tiene al menos mutación de un punto en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 de E. coli tipo salvaje AROG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a inhibición

de retroalimentación por fenilalanina, y en la que la planta transgénica comprende una cantidad incrementada de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente. [0017] De acuerdo con aspectos adicionales, la presente invención proporciona una semilla de planta producida por la planta transgénica, un cultivo de tejido que comprende al menos una célula transgénica de la planta transgénica, y un método para inducir la síntesis de fenilalanina en una planta.

[0018] Aspectos adicionales y realizaciones específicas de la presente invención se describen en las reivindicaciones pendientes.

[0019] Los inventores de la presente invención han descrito previamente que una parte significativa de la síntesis de los productos de fenilalanina en una célula vegetal ocurren dentro de los plástidos celulares. Por tanto, los polinucleótidos que codifican la AROG DAHPS insensible a la retroalimentación como se describe en la presente memoria pueden comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio. Por consiguiente, el polinucleótido que codifica el péptido de tránsito de plástido puede comprender una secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 6. Típicamente, los polinucleótidos se diseñan de modo que el péptido de tránsito de plastidio codificado se fusione en el extremo amino del polipéptido codificado.

[0020] Los polinucleótidos descritos en este documento pueden incorporarse en un constructo de ADN que permite su expresión en la célula vegetal. La construcción de ADN puede comprender al menos un elemento regulador de la expresión seleccionado del grupo que consiste en un promotor, un potenciador, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una señal de poliadenilación y similares.

[0021] La construcción de ADN también puede comprender un promotor. El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducido o específico de tejido como se conoce en la técnica. El promotor puede ser un promotor constitutivo operable en una célula vegetal. La construcción de ADN puede comprender además señales de terminación de transcripción y secuencia de poliadenilación.

[0022] Opcionalmente, el constructo de ADN comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de detección que permite una detección conveniente de los polipéptidos recombinantes expresados por la célula vegetal. La construcción de ADN puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica tres repeticiones de etiqueta de epítopo de hemaglutinina (HA). Este epítopo permite la detección del polipéptido recombinante usando anticuerpos producidos contra la etiqueta del epítopo de HA, teniendo dicha etiqueta la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 7. La construcción de ADN puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene el péptido de tránsito de plastidio de rbcS3, L175Q AroG DAHPS y tres repeticiones de la etiqueta de epítopo de HA, teniendo dicho polipéptido la SEQ ID Nº: 8. La construcción de ADN puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que contiene el péptido de tránsito de plastidio de guisante rbcS3, F209A AroG DAHPS y tres repeticiones de la etiqueta de epítopo de HA, teniendo dicho polipéptido la SEQ ID Nº: 9.

[0023] Los polinucleótidos descritos en este documento y/o los constructos de ADN que comprenden el mismo pueden incorporarse en un vector de transformación de plantas.

[0024] La presente invención también abarca semillas de plantas de la planta transgénica, en las que las plantas cultivadas a partir de dichas semillas comprenden al menos una célula que tiene una cantidad aumentada de la fenilalanina en comparación con las plantas cultivadas a partir de semillas de la correspondiente planta no transgénica. También se describen frutos, hojas o cualquier parte de la planta transgénica, así como cultivos de tejidos derivados de los mismos y plantas regeneradas a partir de los mismos.

[0025] De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para inducir la síntesis de fenilalanina en una planta, que comprende (a) transformar al menos una célula vegetal con un DAHPS que codifica polinucleótido exógeno teniendo al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 de tipo salvaje E. coli AROG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde dicha al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y (b) regenerar al menos una célula transformada en una planta transgénica que comprende al menos una célula que tiene un contenido aumentado de dicha fenilalanina en comparación con una célula correspondiente de una planta no transgénica.

[0026] De acuerdo con otro aspecto, el polinucleótido codifica una DAHPS mutante seleccionada del grupo que consiste en L175Q AROG DAHPS y F209A AROG DAHPS.

[0027] El polinucleótido exógeno que codifica L175Q o F209A AROG DAHPS de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención se puede introducir en una construcción de ADN para incluir los elementos enteros necesarios para la transcripción y la traducción, como se describe anteriormente, de tal manera que los polipéptidos se expresan dentro de la célula de la planta.

[0028] La transformación de plantas con un polinucleótido o una construcción de ADN se puede realizar por diversos

medios, como es conocido para un experto en la técnica. Los métodos comunes se ejemplifican por, pero no se limitan a, transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo con microproyectiles, transferencia mediada por polen, transformación mediada por virus de ARN de planta, transformación mediada por liposoma, transferencia directa de genes (por ejemplo, mediante microinyección) y la electroporación de callos embriogénicos compactos. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden por ejemplo ser producidas utilizando transformación mediada por Agrobacterium.

[0029] Las plantas transgénicas que comprenden los polinucleótidos descritos en este documento pueden seleccionarse empleando métodos estándar de genética molecular, como son conocidos para una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Las plantas transgénicas se pueden seleccionar de acuerdo con su resistencia a un antibiótico. El antibiótico que sirve como un marcador seleccionable puede ser uno del grupo que consiste en Cefotaxima, Vancomicina y Kanamicina. Las plantas transgénicas también se pueden seleccionar de acuerdo con su resistencia a un herbicida. El herbicida puede ser amonio de glufosinato (Basta).

[0030] Cualquier planta puede transformarse con los polinucleótidos descritos en este documento para producir las plantas transgénicas que tienen cantidad elevada de fenilalanina en comparación con la planta no transgénica. La planta puede ser una planta de cultivo, preferiblemente una planta de tomate.

[0031] Otros objetos, características y ventajas de la presente invención quedarán claras a partir de la siguiente descripción y los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0032]

FIG. 1 muestra el diagrama esquemático de la red metabólica de aminoácidos de siquimato y aromáticos en las plantas. Una flecha continua representa una reacción enzimática de un paso y una serie de flechas representa reacciones de varios pasos enzimáticos. Las líneas grises discontinuas con signos menos o más representan inhibición de retroalimentación y ciclos de activación, respectivamente. Abreviaturas: DAHPS, sintasa de 3-Desoxi-darabino-2-heptulosonato 7-fosfato; AS, sintasa de antranilato; CM, mutasa de corismato; PDT, deshidratasa de prefatan; PAT, aminotransferasa de prefatan; AAAAT, aminotransferasa de aminoácido aromática; ADT, dehidratasa de arogenato y ADS, dehidrogenasa de arogenato.

FIG. 2 muestra la expresión del gen AroG bacteriano en Arabidopsis transgénica. La Fig. 2A -Fig 2C muestran diagramas esquemáticos de los genes AroG quiméricos. 35S: PRO-Ω: promotor 35S de virus mosaico de coliflor fusionado a potenciador de traducción Ω o E8: regiones reguladoras de maduración y etileno en un promotor específico del fruto del tomate (Lycopersicon esculentum); TP: péptido de tránsito de plástidos; AroG: las DAHPS bacterianas que incluyen (A) WT (secuencia original), (B) variante mutante en aminoácidos situados en posición 175 y (C) variante mutante en aminoácido situado en posición 209; HA, tres copias de la etiqueta del epítopo de hemaglutinina; OCS: terminador de sintasa de octopina. Fig. 2D muestra el análisis de inmunotransferencia de extractos proteicos de líneas transformadas independientemente que reaccionan con anticuerpos anti HA. La banda superior (TP-AroG-HA) representa el polipéptido precursor, mientras que la banda inferior (AroG-HA) representa el polipéptido maduro. El control de carga mostró niveles comparables de proteínas teñidas en los diferentes carriles.

FIG. 3 demuestra los perfiles metabólicos de las plantas de Arabidopsis que expresan los genes AROGWT, AROG175 y AROG209 son marcadamente diferentes en comparación con el control. El diagrama de conjuntos de datos del Análisis de Componentes Principales (PCA) se obtuvo a partir de 90 metabolitos dirigidos. Triángulos marcan las plantas que expresan el gen AROGWT (cinco líneas); los círculos marcan las plantas que expresan el gen AROG175 (cinco líneas); óvulos marcan las plantas que expresan el gen AROG209 (una línea); y los cuadrados marcan las plantas de control. Cada punto de datos representa una muestra independiente. Los porcentajes combinados de la primera varianza de dos dimensiones se dan en este panel. Las muestras se extrajeron de tejidos aéreos de plántulas de Arabidopsis de 10 días de edad.

FIG. 4 muestra las diferencias en los niveles de metabolitos en las plantas transgénicas que expresan los genes AROGWT, AROG175 y AROG209. Cada histograma individual representa el nivel relativo de shikimato, prefenato o fenilalanina en un único fraccionamiento GC-MS derivado de un único extracto (100 mg de tejido derivado de diez plantas de hojas de Arabidopsis de 20 días de edad). Estos histogramas representan aumento de metabolito derivado de líneas transformadas independientemente de AroGWT (cinco líneas), AroG175 (cinco líneas), AroG209 (una línea) con tres réplicas por plantas del genotipo y de control con cinco repeticiones. El nivel relativo de metabolitos en cada análisis de GC-MS individual se calculó como el área de selección del metabolito dividido por el área de selección del Ribitol estándar interno. Los histogramas de cada genotipo se ordenan (de izquierda a derecha) en un nivel de metabolito relativo incrementado.

FIG. 5 demuestra el nivel relativo de los metabolitos detectados por GC-MS y LC-MS en el control y las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan el gen AroG175. Los niveles de metabolitos representan el cambio múltiplo de dos líneas AroG175 (AroG175-2, A2 y AroG175-21, A21) en comparación con plantas de control (Con) (n = 5-6). Las

muestras se extrajeron de tejidos aéreos de plántulas de Arabidopsis de 10 días de edad y los metabolitos se detectaron por GC-MS (Fig. 5A -Fig. 5E) y LC-MS (Fig. 5F -Fig. 5AL). Las barras en la parte superior de los histogramas indican el error estándar. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa entre las dos líneas AroG175 y el genotipo de control utilizando la prueba t de Student; con corte FDR (valor P<0,05). Abreviaturas: Cianidina*, cianidina3-O-([2-(6-O-(sinapoil)-(xilosilo)-6-O-(p-O(glucosilo)-p-coumaroil-glucósido]-5-O-[6-O (malonilo); Con, control; A2, AroG175-2; A21, AroG175-21.

FIG. 6 muestra el efecto de 5-metilo-Trp (5MT) sobre el crecimiento de plantas de Arabidopsis que expresan el gen AroG175. Las semillas fueron germinadas en medios que contienen tres concentraciones de 5MT: 75, 100, 150 µM y medios sin tratamiento. Los diferentes genotipos probados están indicados cerca de la ubicación de las plántulas en las placas.

FIG. 7 muestra un mapa metabólico que describe los cambios en los niveles de metabolitos específicos en plantas de Arabidopsis que expresan el gen AroG175 en comparación con el control.

Los metabolitos cuyos niveles aumentados están marcados en cuadrados pequeños que tienen patrones diferentes, como se indica en la figura. Las flechas rotas representan varios pasos enzimáticos consecutivos. Las flechas negras y grises representan pasos enzimáticos conocidos y desconocidos, respectivamente.

FIG. 8 muestra la caracterización metabólica de las plantas de tomate transgénicas que expresan una enzima AroG insensible de retroalimentación bacteriana. Se recogieron muestras de frutos de tomate maduros de generación T1, se extrajeron y se analizaron utilizando la plataforma LC-MS. Los genotipos transgénicos independientes son: AroG175-6, AroG175-11, AroG209-4, AroG209-8, AroG209-9 y (WT) de tipo salvaje. Fig. 8A: Se obtuvo un diagrama de conjuntos de datos de PCA a partir de 3.094 señales de masa en modo de iones negativos. Cada punto de datos representa una muestra independiente (4-5 repeticiones). Las primeras dos varianzas dimensionales se dan en este panel. Fig. 8B: nivel relativo de Fe, Trp y Tyr. Los asteriscos indicaron diferencias estadísticamente significativas entre los genotipos AroG y el WT, utilizando la prueba t de Student. Las barras en la parte superior de los histogramas indican errores estándar.

FIG. 9 muestra los perfiles de metabolitos de desarrollar fruto de tomate que expresa el gen AroG209-9 y (WT) de tipo salvaje. Fig. 9A: gráfico de PCA de perfiles metabólicos obtenidos por análisis GC-MS (125 metabolitos detectados). Fig. 9B: gráficos PCA de perfiles metabólicos obtenidos mediante análisis UPLC-qTOF-MS. Se tomaron muestras de la fruta en tres etapas de desarrollo: verde maduro (MG; ~ 42 días después de la antesis (DPA)); interruptor (Br; ~ 44 DPA) y rojo (rojo; ~ 48 DPA) y separado de corteza y pulpo (n = 5-6).

FIG. 10 muestra un esquema metabólico que resume los cambios metabólicos en fruto de tomate que expresan el gen AroG209-9. Los metabolitos que sus niveles significativamente aumentaron o disminuyeron en la fruta transgénica (cáscara y pulpo) en comparación con la fruta de control están marcados en dos grupos de tres cuadrados: primer grupo con respecto a la cáscara y segundo grupo con respecto al pulpo. Los círculos marcan compuestos volátiles, que se detectaron solo en la etapa de desarrollo roja. Las flechas rotas representan varios pasos enzimáticos consecutivos.

FIG. 11 demostró el perfil sensorial de fruta de tomate maduro rojo obtenido a partir de plantas transgénicas que expresan el gen AroG209-9. Cada descriptor se calificó en una escala de 0-5 puntos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0033] La presente memoria da a conocer plantas transgénicas transformadas con ácido nucleico exógeno que codifica sintasa de 3-Desoxi-d-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tienen una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por un producto de su actividad, el aminoácido aromático fenilalanina, en comparación con un DAHPS de tipo salvaje. La presente especificación muestra por primera vez que la liberación de esta inhibición de retroalimentación en una célula vegetal da como resultado una acumulación aumentada de shikimato y los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. Además, la presente especificación muestra ahora que la expresión del DAHPS insensible a la realimentación desencadena la expresión de genes asociados con el estrés biótico, incluidos los genes relacionados con la patogénesis, así como los genes asociados con el metabolismo de la pared celular, el metabolismo secundario y el estrés biótico. El metabolismo de la hormona (etileno y ácido salicílico que se produce a través de las vías de biosíntesis de Shikimato y fenilalanina), regulación del estado redox, factores de transcripción y genes de señalización.

[0034] La presente invención muestra ahora que las plantas transgénicas que expresan el gen DAHPS insensible a retroalimentación producen más cantidad de fenilalanina en comparación con las correspondientes plantas no transgénicas. Además, la presente especificación muestra ahora que la expresión de un polipéptido DAHPS bacteriano que tiene sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación en plantas transgénicas, particularmente dentro del plástido de la célula vegetal, conduce a una producción excesiva de metabolitos secundarios, que requieren fenilalanina y/o tirosina y/o triptófano y/o compuestos intermedios producidos a través de la ruta de la fenilalanina para su biosíntesis. Particularmente, los segundos metabolitos incluyen fenilpropanoides

seleccionados del grupo que consiste en lignina, que es un componente esencial de la pared celular; ácido clorogénico (3-cafeoilquinato), un antioxidante e inhibidor de la actividad promotora de tumores de ésteres de forbol; y flavonoides, que son pigmentos vegetales que contribuyen a la coloración de las plantas y a la protección UV. La alteración de la vía Shikimato también puede conducir a la producción de la clase fenilpropanoides de benceniodes, que son compuestos volátiles esenciales para sabores dulces, florales y afrutados.

[0035] La presente memoria también proporciona un método de producción de plantas transgénicas que tienen mayores cantidades de al menos uno de shikimato, corismato y un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, el triptófano y la tirosina en comparación con una planta no transgénica correspondiente. También se proporcionan células vegetales, que comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican DAHPS que es insensible a la inhibición por retroalimentación, particularmente a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y semillas de plantas y progenies obtenidas de las plantas transgénicas.

[0036] La presente memoria hace una contribución significativa a la técnica proporcionando nuevas estrategias para diseñar plantas que tienen la capacidad de modificar la producción de metabolitos secundarios. La presente invención utiliza enzimas primarias en la ruta Shikimato, que no se ha demostrado previamente que sean manipuladas en plantas mediante la liberación de la inhibición por retroalimentación, para la superproducción de shikimato y aminoácidos aromáticos así como metabolitos secundarios derivados de los mismos.

[0037] Las plantas son capaces de sobreproducción de metabolitos secundarios que tienen efectos beneficiosos sobre las características de plantas, por ejemplo sabor de frutas y aroma. Además, las plantas sobreproducen metabolitos secundarios requeridos para sus caracterizaciones beneficiosas, que son producidas naturalmente por la planta en cantidades insuficientes para ser utilizadas comercialmente.

Definiciones

[0038] Tal como se usa en el presente documento, los términos "que tienen reducida sensibilidad a la inhibición por retroalimentación", "insensible a la inhibición por retroalimentación" o "retroalimentación insensible" con respecto a la actividad DAHPS refieren a alivio completo o esencial de la inhibición por retroalimentación en 1 mM de Fe, mientras que muestra actividad similar específica enzimática como el tipo salvaje (Hu et al. 2003, supra).

[0039] El término "planta" se usa en el presente documento en su sentido más amplio. Incluye, pero no se limita a, cualquier especie de planta leñosa, herbácea, perenne o anual. También se refiere a una pluralidad de células vegetales que se diferencian en gran medida en estructura que está presente en cualquier etapa del desarrollo de una planta. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a, una raíz, tallo, brote, hoja, flor, pétalo, fruta, etc.

[0040] Tal como se utiliza aquí, el término "inhibición por retroalimentación" se refiere a un mecanismo de control celular de la actividad enzimática, en la que una enzima que cataliza la producción de una sustancia en particular en la célula se inhibe cuando dicha sustancia se ha acumulado hasta un cierto nivel.

[0041] El término "producto catabólico fenilalanina" se refiere a clases de compuestos orgánicos derivados de plantas que son biosintetizados a partir del aminoácido fenilalanina, en particular los fenilpropanoides. Los fenilpropanoides tienen una amplia variedad de funciones en la planta, que incluyen defensa contra herbívoros, ataque microbiano u otras fuentes de daño; como componentes estructurales de las paredes celulares; como protección contra la luz ultravioleta; como pigmentos; y como moléculas de señalización.

[0042] El término "sintasa de 3-Desoxi-D-arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHPS)" tal como se utiliza aquí se refiere a una proteína que tiene la actividad enzimática de la conversión de fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa 4-Fosfato (E-4P) en 3-Desoxi-d-Arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHP) (Fig. 1).

[0043] El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende las secuencias necesarias para la producción de ARN o un polipéptido de codificación. Un polipéptido puede estar codificado por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier parte de la misma. El término "partes del mismo" cuando se usa en referencia a un gen se refiere a fragmentos de ese gen. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde unos pocos nucleótidos a toda la secuencia del gen menos un nucleótido. De este modo, "una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos una parte de un gen" puede comprender fragmentos del gen o del gen completo.

[0044] El término "gen" también abarca las regiones codificantes de un gen estructural e incluye secuencias localizadas adyacentes a la región codificante en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb en cada extremo de tal manera que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias que están ubicadas en 5' de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que están situadas 3' o aguas abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas.

[0045] Los términos "polinucleótido", "secuencia de polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" y "polinucleótido

aislado" se usan indistintamente en este documento. Estos términos abarcan secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o ADN o un híbrido del mismo, que es monocatenario o bicatenario, lineal o ramificado, y que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Los términos también abarcan híbridos de ARN/ADN.

[0046] Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una que está separada sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico aislado está libre de algunas de las secuencias que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. Un ácido nucleico también se considera aislado si ha sido alterado por la intervención humana, o colocado en un lugar o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula mediante agroinfección. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", como una molécula de ADNc, puede estar libre de parte del otro material celular con el que está asociado de forma natural, o un medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando químicamente sintetizados.

[0047] El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos separados de otro modo de secuencia, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.

[0048] El término "constructo", como se usa aquí se refiere a una molécula de ácido nucleico ensamblado artificialmente o aislado que incluye el gen de interés. En general, una construcción puede incluir el gen o genes de interés, un gen marcador que en algunos casos también puede ser el gen de interés y secuencias reguladoras apropiadas. Debe apreciarse que la inclusión de secuencias reguladoras en una construcción es opcional, por ejemplo, tales secuencias pueden no ser necesarias en situaciones en las que se van a usar las secuencias reguladoras de una célula huésped. El término construcción incluye vectores, pero no debe verse como limitado a ellos.

[0049] El término "unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno está regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación se pueden unir operativamente a secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la invención pueden unirse operablemente, directa o indirectamente, 5' al ARNm diana, o 3' al ARNm diana, o dentro del ARNm diana, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al ARNm diana.

[0050] Los términos "elemento promotor", "promotor" o "secuencia promotora" como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN que se encuentra en el extremo 5' (es decir, precede) la proteína región de un polímero de ADN que codifica. La ubicación de la mayoría de los promotores conocidos en la naturaleza precede a la región transcrita. El promotor funciona como un interruptor, activando la expresión de un gen. Si el gen está activado, se dice que se transcribe o participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm del gen. El promotor, por lo tanto, sirve como un elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen en el ARNm. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que los diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Se reconoce además que, dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de alguna variación pueden tener una actividad promotora idéntica. Los promotores que causan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de los casos se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Nuevos promotores de diversos tipos útiles en las células vegetales se están descubriendo constantemente; se pueden encontrar numerosos ejemplos en Okamuro J K y Goldberg R B (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82.

[0051] Tal como se utiliza aquí, el término "potenciador" se refiere a una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o especificidad tisular de un promotor.

[0052] El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la producción de un ejemplo del producto final funcional, un ARNm o una proteína.

[0053] El término "transgénico" cuando se usa en referencia a una planta o semilla (es decir, una "planta transgénica" o una "semilla transgénica") se refiere a una planta o semilla que contiene al menos un polinucleótido transcribible heterólogo en una o más de sus celulas El término "material vegetal transgénico" se refiere ampliamente a una planta, una estructura vegetal, un tejido vegetal, una semilla vegetal o una célula vegetal que

contiene al menos un polinucleótido heterólogo en al menos una de sus células. Una "planta transgénica" y una "planta no transgénica correspondiente" como se usa en el presente documento se refieren a una planta que comprende al menos una célula que comprende un polinucleótido heterólogo transcripcional y a una planta del mismo tipo que carece de dicha transcripción heteróloga.

[0054] Los términos "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula transformada primaria y los cultivos derivados de esa célula independientemente del número de transferencias. Toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma funcionalidad que el cribado en la célula originalmente transformada se incluye en la definición de transformantes.

[0055] La transformación de una célula puede ser estable o transitoria. El término "transformación transitoria" o "transitoriamente transformado" se refiere a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula en ausencia de integración del polinucleótido exógeno en el genoma de la célula huésped. La transformación transitoria puede detectarse, por ejemplo, mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), que detecta la presencia de un polipéptido codificado por uno o más de los polinucleótidos exógenos. Alternativamente, la transformación transitoria se puede detectar mediante la detección de la actividad de la proteína (por ejemplo, βglucuronidasa) codificado por el polinucleótido exógeno.

[0056] El término "transformante transitorio" se refiere a una célula que ha incorporado transitoriamente uno o más polinucleótidos exógenos. En contraste, el término "transformación estable" o "transformado de forma estable " se refiere a la introducción y la integración de uno o más polinucleótidos exógenos en el genoma de una célula. La transformación estable de una célula se puede detectar mediante hibridación transferencia Southern de ADN genómico de la célula con secuencias de ácido nucleico que son capaces de unirse a uno o más de los polinucleótidos exógenos. Alternativamente, la transformación estable de una célula también se puede detectar mediante la actividad enzimática de un gen integrado en el tejido en crecimiento o mediante la reacción en cadena de la polimerasa del ADN genómico de la célula para amplificar las secuencias de polinucleótidos exógenos. El término "transformante estable" se refiere a una célula que ha integrado de manera estable uno o más polinucleótidos exógenos en el ADN genómico u orgánico. Debe entenderse que una planta o una célula vegetal transformada con los ácidos nucleicos, construcciones y/o vectores de la presente invención pueden transformarse transitoriamente así como de manera estable. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.

[0057] Según un aspecto, la presente memoria proporciona una planta transgénica que comprende al menos una célula vegetal que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato7-fosfato DAHPS) que tiene sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación, en la que la planta transgénica comprende una cantidad incrementada de al menos uno de un aminoácido aromático, shikimato, corismato o un producto catabólico del mismo en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

[0058] El polinucleótido puede codificar una DAHPS bacteriana. Preferiblemente, el polinucleótido codifica isoenzima DAHPS de E. coli insensible a retroalimentación. El polinucleótido puede comprender gen aroG de E. coli que codifica una DAHPS que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación.

[0059] El gen de E. coli que codifica los AROG DAHPS insensibles a retroalimentación tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AROG DAHPS, teniendo la secuencia de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 1. De acuerdo con una realización, la prolina en la posición 150 se reemplaza por leucina (P150L). De acuerdo con otras realizaciones, la leucina en la posición 175 se reemplaza por glutamina (L175Q). De acuerdo con otras realizaciones, la leucina en la posición 179 se reemplaza por ácido aspártico (L179D). De acuerdo con realizaciones aún adicionales, la fenilalanina en la posición 209 se reemplaza por alanina (F209A).

[0060] El gen codifica una AROG DAHPS que muestra sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina. De acuerdo con estas realizaciones, el polinucleótido codifica DAHPS que tienen la mutación L175Q (designada en lo sucesivo AROG175). De acuerdo con otras realizaciones actualmente preferidas, el gen AroG codifica un DAHPS que es insensible a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina. De acuerdo con estas realizaciones, el polinucleótido codifica DAHPS que tiene la mutación de F209A (designada en lo sucesivo AROG209).

[0061] A pesar de la gran importancia del metabolismo de los aminoácidos aromáticos en producción primaria y secundaria de plantas, aún se conoce muy poco acerca de la regulación de la conversión de los metabolitos de carbono y nitrógeno primarios a través de la vía de shikimato en la biosíntesis de los tres aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano.

[0062] La presente memoria muestra ahora que las plantas de Arabidopsis y tomate que expresan el AROG175 o

AROG209 han mejorado los niveles de los tres aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. En Arabidopsis, los niveles de fenilalanina y triptófano se encontraron elevados de manera más significativa, mientras que en el tomate el aumento en los niveles de fenilalanina y tirosina fue más prominente. Este hallazgo implica que DAHPS es una enzima limitante que regula su actividad de conversión de metabolitos primarios de carbono mediante la conversión de corismato a aminoácidos aromáticos, así como a metabolitos que se derivan directamente del corismato. Curiosamente, entre los dos aminoácidos aromáticos, la acumulación de fenilalanina fue estimulada a un grado mucho más alto que el triptófano en el AROG175 expresando plantas de arabidopsis (Fig. 5). Estos resultados son concomitantes con estudios previos de consumo de carbono que sugieren que aproximadamente el 30% del carbono fijado en la fotosíntesis se dirige a la rama de fenilalanina y hacia la biosíntesis de lignina mientras que el flujo hacia la rama de tirosina es mucho más pequeño (Rippert P. y M. Matringe, 2002. European Journal of Biochemistry 269 (19): 4753 -4761; Pribat A. et al., 2010. Plant cell 22 (10): 3410 -22). Sin desear estar sujetos a ninguna teoría o mecanismo de acción específico, estos resultados sugieren que bajo condiciones de crecimiento favorables (sin estrés) la ruta de biosíntesis de fenilalanina compite eficientemente con la ruta de biosíntesis de triptófano sobre su precursor común corismato metabólico (Fig. 7). La dirección hacia la fenilalanina puede deberse a la expresión elevada y/o a la actividad enzimática superior de la mutasa de corismato que conduce a la biosíntesis de fenilalanina sobre la expresión de la sinteasa de atrenilato que conduce a la biosíntesis de triptófano (Fig. 1).

[0063] La planta transgénica comprende una mayor cantidad de fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

[0064] La planta transgénica puede comprender una mayor cantidad de al menos un producto catabólico de la fenilalanina en comparación con la planta no transgénica correspondiente. El producto catabólico de la fenilalanina se puede seleccionar de varias clases de metabolitos que incluyen, pero no se limitan a: terpenoides; glicoalcaloides (deshidrolcoperosida G, F o A); carotenoides (fitoeno, fitoflueno o licopeno); fenilpropanoides; lignina (cafeato, ferulato); coumarato y cafeoilquinato; flavonoides (Kaempferol, derivados de quercetina y antocianinas); glucosinolato derivado de fenilalanina (glucosinolato de 2-feniletilo y fenilacetonitrilo); y derivados de salicilato (hexosa de hidroxibenzoato y hexosa de dihidroxibenzoato). La presente invención muestra además que la cantidad de clases adicionales de metabolitos está elevada en la planta transgénica en comparación con una planta no transgénica correspondiente, que incluye, pero no se limita a: monosacárido (manosa, fructosa, guanosina, fructosa6-fosfato); oligosacárido (maltosa, rafinosa, trehalosa y celobiosa); aminoácidos adicionales (glicina, glutamina, treonina, aspargina); poliaminas (putrecina); conjugados de jasmonato (12-hidroxi jasmonato-hexosa); glucosinolatos derivados de metionina (glucosinolato de 3-benzoiloxipropilo, glucosinolato de 8-metiltiooctilo, glucosinolato de 7metiltioheptilo y glucosinolato de metilsulfoniloctilo); y combinaciones de los mismos.

[0065] La presente memoria muestra además que la expresión AroG175 desencadena un aumento significativo en la acumulación de shikimato, así como de prefenato, el precursor de la biosíntesis de fenilalanina (Fig. 1, Fig. 4 y Fig. 5A-B). Sin querer limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción específico, estos resultados sugieren que los pasos enzimáticos que implican quinasa shikimato y aminotransferasa de prefenato, convirtiendo los metabolitos de shikimato y prefenatos en sus respectivos metabolitos aguas abajo, shikimato-3-fosfato y arogenato/fenilpiruvato representan enzimas reguladoras del cuello de botella novedosas de las rutas de biosíntesis de aminoácidos aromáticos y Shikimato.

[0066] En Arabidopsis, la expresión AROG175 aumentó los niveles de una serie de metabolitos secundarios derivados de fenilalanina, incluyendo precursores de lignina y sus derivados, antocianinas, flavonoides, glucosinolatos derivados de fenilalanina, glucosinolatos derivados de triptófano, glucosinolatos derivados de metionina, auxina, conjugados de jasmonato y salicilato (Figs. 5, 7). El salicilato se puede sintetizar a partir de corismato o cinamato o benzoato y sus conjugados incluyen varias formas glucosiladas, como el éster de saliciloilglucosa y el glucósido de saliciloilo. La producción alterada de metabolitos secundarios derivados de fenilalanina se observó previamente tras la expresión de un gen bacteriano de PheA bifuncional (publicación de solicitud internacional nº WO2009/072118). En el fruto del tomate, la expresión AroG209 aumentó los niveles de una serie de metabolitos secundarios derivados de fenilalanina incluyendo antocianinas, flavonoides, cumarato y derivados de cafeoilquinato así como monosacáridos y oligosacáridos (Fig. 10 y Tabla 1).

[0067] En conjunto, estos resultados implican la presencia de una interacción transversal de regulación entre los flujos de siquimato y las vías de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y su posterior metabolismo en varios metabolitos secundarios. Los resultados también indican que DAHPS funciona como una enzima reguladora importante en la conversión del metabolismo primario en secundario en las plantas. La manipulación de la expresión de combinaciones de genes, particularmente mutasa de corismato, (CM), deshidratasa de prefenato (PDT) y sintasa de 3-Deoxy-D-Arabino-Heptulosonato 7-Fosfato (DAHPS), que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición de la retroalimentación por fenilalanina, puede dar como resultado un efecto sinérgico sobre la acumulación de los aminoácidos aromáticos fenilalanina y tirosina y metabolitos derivados de los mismos.

[0068] Como se muestra en la sección de Ejemplos a continuación, la modulación del gen DAHPS desencadena cambios de expresión significativos en un número moderado de genes (109 genes). Parece que un subconjunto considerable de estos genes podría asociarse con estreses bióticos, incluidos los involucrados en el metabolismo hormonal (citoquinina, ácido absicisico, salicilato y jasmonato), varias clases de factores de transcripción (TF) (MYB,

WRKY y APETALA2/proteínas de unión a elementos sensibles al etileno), transportes, genes implicados en señalización (genes AAR de calcio y citoquinina), genes que codifican proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) que incluyen proteínas resistentes a la enfermedad (proteínas TIR-NB) y genes implicados en la regulación redox. Estos resultados son concomitantes con los resultados de informes previos que muestran que el ataque de patógenos y la herida física estimulan la expresión de los genes DAHPS endógenos en varias plantas, incluida Arabidopsis (Keith B. et al., 1991. Proceedings of the National Academy of Sciences 88 ( 19): 8821-8825), tomate (Gorlach J. y col., 1993. Plant Molecular Biology 23 (4): 707-716) y patata (Muday GK y KM Herrmann, 1992. Plant Physiology 98 (2): 496 -500; Jones JD y otros, 1995. Plant Physiology 108 (4): 1413-1421). Estudios adicionales también sugieren que la inhibición antisentido de transcripción de DAHPS de patata redujo el contenido de lignina en la pared celular (Jones et al. 1995, supra).

[0069] La presente memoria muestra que en el genotipo AroG175, el cambio en el nivel de expresión de genes asociados con la síntesis de metabolitos secundarios derivados de fenilalanina, incluyendo fenilpropanoides y metabolitos asociados con la pared celular y el metabolismo de salicilato correlacionado con los cambios en los niveles de estas clases de metabolitos.

[0070] En particular, los niveles de indol-glucosinolatos, glucosinolatos alifáticos y glucosinolatos de fenilalanina se incrementaron significativamente en las líneas AroG175 en correlación con el aumento de los niveles de ARNm de los siguientes genes: (i) el gen que codifica Flavin-Monooxigenasa (glucosinolato s-oxigenasa de tipo FMO (AT1G65860; 2,1 veces mayor) que cataliza la conversión de glucosinolatos de metiltioalquilo a glucosinolatos de metilsulfinilalquilo y (ii) el gen que codifica CYP81F2, una enzima del citocromo P450 (AT5G57220; 2,7 veces mayor), implicado en el metabolismo de los glucosinolatos de indol. Sin desear estar ligado por ninguna teoría específica o mecanismo de acción, la transcriptom alterada y metaboloma en plantas transgénicas de AroG175 soporta un enlace de regulación entre el metabolismo de glucosinolatos y la vía de shikimato.

[0071] El nivel de expresión de 16 genes, categorizados como genes asociados con el reloj circadiano, también fue inducido en el transcriptoma AroG175-2. Estos genes circadianos relacionados con el reloj incluyen aquellos que codifican los factores de transcripción de MYB (At1G01060 y At2G46830) y las proteínas de unión a ADN de dedo de zinc que regulan la expresión génica (At2G31380 y At5G15850). Anteriormente se descubrió que los grupos de genes regulados circadianos conectaban importantes redes de señalización que coordinan el crecimiento de las plantas con cambios rítmicos en el ambiente, que incluyen la auxina, la biosíntesis de fenilpropanoides y el metabolismo del almidón. Además, mediante expresión del factor de transcripción PRODUCCIÓN DE PIGMENTO DE ANTOCIANINA 1 (PAP1), que regula la expresión de varios genes que codifican enzimas de flavonoides clave, se ha demostrado que estos genes diana están regulados por el reloj circadiano. La co-regulación de PAP1 con los genes de la biosíntesis de los fenilpropanoides también ha sugerido que PAP1 actúa como un regulador maestro de la transcripción de reloj controlado de estos genes (Harmer SL et al, 2000. Science 290 (5499): 2110-2113). Por lo tanto, los hallazgos de la presente especificación apoyan la presencia de un nuevo enlace regulador entre la expresión de genes que controlan procesos fisiológicos que están asociados con el reloj circadiano y la conversión de metabolitos primarios a secundarios.

[0072] Otra categoría de genes enriquecidos presenta el aumento de expresión asociado con la asimilación de nitrato, ya que incluía los genes que codifican un transportador de nitrato (At3g21670; NTP3) y dos reductasas de nitrato (At1g77760; NIA1 y At1g37130; NIA2). La regulación del metabolismo del nitrógeno está fuertemente asociada con la regulación de la glucólisis y la vía de fosfato de pentosa que sirven como donantes de PEP y E-4P, los dos sustratos de DAHPS (Stitt M., 1999. Current Opinion in Plant Biology 2 (3): 178-186). Además, el metabolismo y la translocación del nitrógeno en las células vegetales tiene un papel regulador importante en la competencia entre los patógenos y sus plantas hospedadoras por la disponibilidad de nitrógeno. En el transcriptoma AroG175, se indujeron genes asociados con la asimilación de nitrato y resistencia a enfermedades, incluyendo genes que codifican proteínas PR. Sin desear estar ligado a ninguna teoría o mecanismo de acción específico, los resultados de la presente invención sugieren que la actividad de DAHPS, y quizás la actividad de otras enzimas de la ruta de Shikimato, influyen en la red que conecta el metabolismo de nitrógeno con la respuesta de patógenos en plantas de Arabidopsis.

[0073] Varios genes que codifican factores de transcripción putativamente estaban regulados hacia abajo en la línea de AroG175-2, incluyendo por ejemplo las proteínas de tipo dedo de zinc B-caja con un dominio CCT (At3G07650, AT5G48250, At1G28050, At3G20810, At1G07050). La expresión de otros tres genes, que codifican proteínas asociadas con la cascada de reloj circadiano, se redujeron, incluyendo TOC1 (momento de la expresión CAB 1; At5G61380), regulador de Pseudo-respuesta (At5G60100) y ELF4 (floración temprana 4; At2G40080).

Producción de plantas transgénicas

[0074] La clonación de un polinucleótido que codifica el AroG DAHPS puede realizarse por cualquier método tal como es conocido para una persona experta en la técnica. Se pueden usar diversas construcciones de ADN para expresar el AroG DAHPS en una planta deseada.

[0075] La presente memoria proporciona una construcción de ADN o un vector de expresión que comprende un

polinucleótido que codifica AroG DAHPS, que puede comprender, además, elementos reguladores, incluyendo, pero no limitado a promotor, un potenciador, y una señal de terminación. [0076] Entre los promotores más comúnmente utilizados están el promotor de sintasa de nopalina (NOS) (Ebert et al, 1987 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 84: 5745-5749), el promotor de sintasa de octapina (OCS), promotores de caulimovirus tal como el promotor 19S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) (Lawton et al., 1987 Plant Mol Biol. 9: 315-324), el promotor CaMV 35S (Odell et al., 1985 Nature 313: 810-812), y el promotor 35S del virus mosaico figwort, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de rubisco, el promotor Adh (Walker et al., 1987 Proc Natl Aca. Sci EE.UU. 84: 6624-66280, el promotor de la sintasa de sacarosa (Yang et al., 1990 Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 87: 4144-4148), el promotor del complejo del gen R (Chandler et al., 1989. Plant Cell 1: 1175-1183), el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b, etc. Otros promotores comúnmente utilizados son los promotores de los genes ADPGPP del tubérculo de la patata, el promotor de la sintasa de sacarosa, el promotor de la sintasa de almidón unida al gránulo, el promotor del gen de la glutelina, promotor ceroso de maíz, promotor del gen Brittle y promotor Shrunken 2, el promotor del gen de quitinasa ácida, y los promotores del gen zein (15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, y 27 kD; Perdersen y col., 1982 Cell 29: 1015 -1026). Una plétora de promotores se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nº WO 00/18963. La construcción descrita en este documento puede comprender el promotor constitutivo CaMV 35S o el promotor E8 (Deikman J. y col., Plant Physiol 100: 20132017).

[0077] Las "Secuencias no codificantes 3'" se refieren a secuencias de ADN localizadas aguas abajo de una secuencia codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación generalmente se caracteriza por afectar la adición de tractos de ácido poliandiamílico al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias 3' no codificantes se ejemplifica por Ingelbrecht I L et al. (1989. Plant Cell 1: 671 -680).

[0078] Los siguientes elementos se utilizaron para ensamblar las construcciones de ADN descritas en este documento:

1.

Una secuencia de ADN que contiene un promotor 35S de virus del mosaico de coliflor (CaMV) además de un potenciador de traducción omega CaMV corriente arriba de la iniciación de traducción codón de ATG, que contiene secuencias de enzimas de restricción, denominado 35S:PRO-Ω (Shaul O. y G. Galili, 1993. Plant Mol Biol 23: 759 -768).

2.

Una secuencia de ADN que contiene E8, un gen relacionado con la biosíntesis de etileno que es inducido por etileno y activado para expresarse al comienzo de la maduración de la fruta. La expresión del gen E8 se regula espacialmente y temporalmente en fruto de tomate maduro (Zhao et al, 2009 J Biosci. 34: 71-83).

3.

Una secuencia de ADN que contiene la terminación 3' de la transcripción y señales de poliadenilación del gen de sintasa de octopina de Agrobacterium tumefacience, denominada OCS-TER, con secuencias de enzimas de restricción (Shaul y Galili 1993, supra). Las secuencias descritas anteriormente se usan como elementos reguladores que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico codificante dentro de una célula vegetal.

4.

Una secuencia de ADN que codifica un péptido de guisante rbcS3 plastidio de tránsito (SEQ ID NO: 6), incluyendo las secuencias de enzimas de restricción necesarias (Shaul y Galili 1993, supra). El péptido codificado, cuando se unió al polipéptido AroG DAHPS, causó la migración de los últimos al plástido.

5.

Una secuencia de ADN del gen de E. coli AroGWT (SEQ ID NO: 16) que codifica la enzima de E. coli AroGWT DAHPS (que tiene la SEQ ID NO: 1), o una secuencia de ADN de un E. coli AroG175 mutado (SEQ ID NO: 3) que codifica la enzima mutada AroG175 DAHPS (SEQ ID NO: 2) que no es esencialmente sensible a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina o una secuencia de ADN de E. coli AroG209 mutado (SEQ ID NO: 5) que codifica la enzima AroG209 DAHPS mutada (SEQ ID NO: 4) que no es esencialmente sensible a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina.

6.

Una secuencia de ADN que codifica tres copias de una etiqueta de epítopo de hemaglutinina (HA) (SEQ ID NO: 7). Este epítopo permite la detección del polipéptido AroG DAHPS recombinante mediante inmunotransferencias con anticuerpos para la etiqueta del epítopo HA (Shevtsova et al., 2006. Eur J Neurosci 23: 1961-1969).

[0079] Los expertos en la técnica apreciarán que los diversos componentes de las secuencias de ácidos nucleicos y los vectores de transformación descritos en este documento están unidos operativamente, con el fin de resultar en la expresión de dicho ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico. Las técnicas para unir operativamente los componentes de los constructos y vectores son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de conectores, tales como enlazadores sintéticos, por ejemplo que incluyen uno o más sitios de enzimas de restricción.

[0080] De acuerdo con todavía otro aspecto, la presente memoria proporciona un método de inducir la síntesis de al menos uno de shikimato, corismato y un aminoácido aromático en una planta, que comprende (a) transformar una célula vegetal con un polinucleótido exógeno que codifica DAHPS insensible a la retroalimentación y (b) regeneración de la célula transformada en una planta transgénica que comprende al menos una célula que tiene un contenido alterado de al menos uno de shikimato, corismato y un ácido aromático en comparación con una célula correspondiente de una planta no transgénica.

[0081] Los métodos para transformar una célula vegetal con secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son conocidos en la técnica. Como se utiliza en el presente documento, el término "transformación" o "transformar" describe un proceso mediante el cual un ADN extraño, tal como una construcción de ADN, entra y cambia una célula receptora en una célula transformada, genéticamente modificada o transgénica. La transformación puede ser estable, en donde la secuencia de ácido nucleico está integrada en el genoma de la planta y como tal representa un rasgo heredado o estable, o transitorio, en donde la secuencia de ácido nucleico se expresa mediante la célula transformada pero no está integrada en el genoma, y tal representa un rasgo transitorio. La secuencia de ácido nucleico tal como se utiliza en el contexto de la presente memoria descriptiva se puede transformar de manera estable en una célula vegetal.

[0082] Hay varios métodos de introducción de genes extraños en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (por ejemplo, Potrykus I. 1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 42: 205-225; Shimamoto K. et al, 1989. Nature 338 : 274-276).

[0083] Los principales métodos de la integración estable de ADN exógeno en el ADN genómico de la planta incluye dos enfoques principales:

Transferencia de genes mediada por Agrobacterium: El sistema mediado por Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de la especie de planta y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un enfoque ampliamente utilizado es el procedimiento de disco de hoja, que se puede realizar con cualquier explante de tejido que proporcione una buena fuente para iniciar la diferenciación de toda la planta (Horsch et al., 1988. Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht). Un enfoque complementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente útil en la generación de plantas dicotiledóneas transgénicas.

[0084] La captación de ADN directa: Existen varios métodos de transferencia directa de ADN en células de plantas. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo eléctrico, abriendo miniporos para permitir el ingreso del ADN. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las células utilizando micropipetas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en células

o tejidos vegetales.

[0085] Transformación de las construcciones de ADN utilizadas en el contexto de la presente invención en una célula vegetal se puede realizar usando el sistema de Agrobacterium.

[0086] La planta transgénica se cultiva entonces bajo condiciones adecuadas para la expresión de la construcción de ADN recombinante o constructos. La expresión de la construcción o construcciones de ADN recombinante altera la cantidad de al menos uno de shikimato, corismato y un ácido aromático de la planta transgénica en comparación con su cantidad en una planta no transgénica.

[0087] La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos vegetales solo

o de varios explantes transformados se conoce bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, In.: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), 1988 Academic Press, Inc., San Diego, CA). Este proceso de regeneración y crecimiento típicamente incluye los pasos de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas habituales de desarrollo embrionario a través de la etapa de plántulas enraizadas. Los embriones y semillas transgénicas se regeneran de manera similar. Los brotes arraigados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento vegetal apropiado tal como tierra.

[0088] Selección de plantas transgénicas transformadas con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, tal como para proporcionar plantas transgénicas que tienen cantidad alterada de shikimato, corismato, aminoácidos aromáticos y los metabolitos secundarios derivados de los mismos se lleva a cabo empleando métodos estándar de genética molecular, conocidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. La secuencia de ácido nucleico comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto que confiere resistencia a antibiótico, y plantas así transgénicas se seleccionan según su resistencia al antibiótico. El antibiótico que sirve como un marcador seleccionable puede ser uno del grupo aminoglucósido que consiste en paromomicina y kanamicina. La secuencia de ácido nucleico puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto que confiere resistencia a un herbicida, incluyendo, pero no limitado a, resistente al glufosinato

de amonio. La secuencia de ácido nucleico puede comprender además un polinucleótido que codifica al menos una copia de la etiqueta de epítopo de hemaglutinina (HA), unido operativamente al polinucleótido que codifica AroG DAHPS. La secuencia de ácido nucleico puede comprender un polinucleótido que codifica tres copias del epítopo de hemaglutinina (HA). Las proteínas se extrajeron entonces y las plantas transgénicas se seleccionaron de acuerdo con los extractos de proteínas que reaccionaron con anticuerpos de epítopo HA.

[0089] La extracción y detección de los metabolitos sintetizados por las células de plantas transgénicas se pueden realizar por métodos estándar que son conocidos para un experto en la técnica. Los metabolitos mencionados en este documento pueden ser extraídos y analizados por GC-MS como se describe por Mintz-Oron et al, 2008 (Plant Physiol 147 (2): 823-51)., LC-MS y HPLC como se describe por Fraser et al. 2000 (Plant J 24 (4): 551-558) y como se describe en la sección ejemplar a continuación.

[0090] El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen foráneo, exógeno que codifica una proteína de interés es bien conocido en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas son auto-polinización para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas. De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas cosechadas de semilla de líneas agronómicamente importantes, o polen de plantas de estas líneas importantes se utiliza para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva utilizando métodos bien conocidos para un experto en la técnica.

[0091] Existe una variedad de métodos en la técnica para la regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie de planta particular a regenerar.

[0092] También se describen semillas o partes de plantas obtenidas a partir de las plantas transgénicas. Partes de la planta incluyen tejidos diferenciados y no diferenciados, incluyendo, pero no limitados a, raíces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y diversas formas de células y cultivo tales como células individuales, protoplastos, embriones y tejido calloso. El tejido de la planta puede estar en la planta o en órgano, tejido o cultivo celular.

[0093] Los siguientes ejemplos describen a continuación los medios y métodos para la producción de las plantas transgénicas de la presente memoria descriptiva. A menos que se indique otra cosa en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN y ARN recombinantes, así como métodos hortícolas, se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como es conocido por una persona con una experiencia ordinaria en la técnica.

EJEMPLOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Construcción de plásmidos y transformación de plantas

[0094] La secuencia de ADN de codificación del gen de E. coli AroG, que codifica la DAHPS, se amplificó por PCR con los siguientes oligonucleótidos: hacia 5' CATGCATGCTGATGAATTATCAGAACGACGA -3' delantero (SEQ ID NO: 10) que introduce un sitio de restricción SphI (subrayado); y 5'-GGAATTC CCCGCGACGCGCTTTTACTG -3' inverso (SEQ ID NO: 11) que introduce un sitio de restricción EcoRI (subrayado). Se construyeron dos tipos de genes recombinantes: AroGWT (la secuencia original), que codifica la enzima sensible a la retroalimentación, y AroG175, que tiene una mutación puntual en el 524bp (que conduce a la sustitución Leu175Glu), que codifica la enzima insensible de retroalimentación. AroG175 se construyó usando PCR con los oligonucleótidos siguientes: 5'-GTGCACCGCGAACAGGCATCAGGGCTT-3 directo (SEQ ID NO: 12) y 5'-AAGCCCTGATGCCTGTTCGCGGTGCAC -3' inverso (SEQ ID NO: 13). El AroG209, que tiene una mutación puntual en el 625-626bp (que conduce a la sustitución Phe209Ala), que codifica la enzima insensible de retroalimentación. AroG209 se construye utilizando PCR con los oligonucleótidos siguientes: 5'-GCGCCGCACTGCGCCCTGTCCGTAACG-3 directo (SEQ ID NO: 14) y 5 'CGTTACGGACAGGGCGCAGTGCGGCGC -3' inverso (SEQ ID NO: 15). El péptido de tránsito de plastidio de subunidad 3A pequeña RuBisCO (Shaul, O. y G. Galili Plant Mol Biol, 1993. 23: p. 759-768) se fusionó en marco al extremo 5' del marco de lectura abierto AroG. El AroG 3' se fusionó a tres copias de una etiqueta de epítopo HA fusionado a un terminador de la sintasa de octopina. El gen quimérico y el vector se digirieron con las enzimas de restricción NotI (BioLab) respectivamente y se combinaron por ligasa T4 ADN (Biolabs) y todo el fragmento se subclonó en el plásmido Ti pBART, un derivado de pART27 (Gleave, AP, Plant Mol Biol 1992 20 (6): 1203-7). Para la alineación de secuencias, se utilizó la base de datos NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). La cepa EHA-105 Tumefacies Agrobacterium (A. tumefacies) se transformó con los plásmidos por electroforesis usando el aparato Gene Pulser (Bio Rad).

[0095] (WT) de tipo salvaje Arabidopsis thaliana, plantas de ecotipo Colombia se inocularon sumergiendo inflorescencias en el cultivo A. tumefacies transformado como se describe anteriormente (Clough, S.J. y A.F. Bent, 1998. Plant J 16 (6): 735-43).

[0096] Tomate de tipo salvaje, plantas de ecotipo M82 se inocularon sumergiendo cotiledón en el cultivo A. tumefacies transformado como se describe anteriormente (McCormic S., Plant Tissue Manual. 1991. B6:109; Fillati,

J.J. et al, 1987. Bio/Technology 5: 726-730).

Material vegetal y condiciones de crecimiento

[0097] Se recogieron semillas de Arabidopsis, se secaron y se sembraron en suelo. Se seleccionaron plántulas jóvenes para la selección de plantas transgénicas mediante pulverización con Basta (glufosinato de amonio; Bayer CropScience). Las semillas de tomate esterilizadas y sembradas en placas de Petri que contienen medio completo Nitsch pH 6 (Duchefa, Haarlem, Países Bajos) suplementado con 1% de sacarosa y 1% de agar planta. Para la selección de las plantas de tomate transgénico, 50 µg/ml kanamicina se añadió al medio de crecimiento. Las semillas se embebieron durante 48 horas a 4°C y se transfirieron a una sala de crecimiento de clima controlado con un régimen de 16 h de luz/oscuridad de 8 h (condiciones de día largo) en 22°C.

[0098] Se midieron las plantas de generación T2 de prueba de progenie y las líneas con una sola inserción de genes fueron seleccionados sobre la base de 3:1 segregación genética. El ensayo de resistencia al análogo de 5MT Trp (Sigma/Aldrich) se realizó como se ha descrito anteriormente (Li J. y R.L. Last, 1996. Plant Physiol 110 (1): 51-59; Tzin V. et al, 2009. Plant Journal 60 (1): 156-167).

[0099] Las plántulas resistentes se retiraron al suelo y se cultivaron en el invernadero a 22°C bajo condiciones de día largo. Para ensayar la respuesta de crecimiento de las plantas a 5MT (Sigma/Aldrich), semillas de plantas homocigotos para AroG175 y plantas de control fueron germinadas en un medio Nitsch como se describe anteriormente suplementado con 75, 100 o 150 µM de 5MT (Li y Last 1996, supra)

Selección de líneas transformadas

[0100] El análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos de etiqueta anti-HA con el fin de identificar las plantas mutadas que traducen el gen quimérico (Stepansky, A. y G. Galili Plant Physiol, 2003. 133 (3): p 1407-1415). Además, plantas de generación T2 se midieron para la prueba de progenie y las líneas con un gen de inserción solo se seleccionaron sobre la base de segregación genética 3:1.

Análisis de la metabolómica

Preparación de muestras de líneas transgénicas de arabidopsis

[0101] El análisis metabólico se realizó con tejidos aéreos de las plantas de semillero de Arabidopsis (100 mg de polvo congelado) expresando AroGWT y AroG175 y líneas de control (n = 5-6). Para el análisis UPLCqTOF-MS, las muestras de Arabidopsis se extrajeron en 450 µl de metanol 80%. Se describieron anteriormente la preparación de la muestra y las condiciones de inyección (Mintz-Oron, S. et al, Plant Physiol, 2008. 147 (2): 823-51). Para el análisis de GC-MS, se recogieron las plántulas, se congelaron, se molieron y se extrajeron en 450 µl de metanol, 750 µl de metanol, 750 µl de agua y 375 µl de cloroformo como se ha descrito previamente (Malitsky, S. et al., Plant Physiol, 2008. 148 (4): 2021-2049). Para evaluar si las diferentes líneas en el análisis varían en su composición de metabolitos, se realizó la prueba t de Student (software JMP). Los valores P resultantes se controlan para pruebas hipótesis múltiple utilizando un FDR de corte 5% (Hochberg Y. y Y. Benjamini 1990. Statistics in Medicine 9 (7): 811818). Las parcelas de PCA se generaron usando el software TMEV4 (Saeed, AI et al, Biotechniques, 2003. 34 (2): 374-378; Scholz, M. et al, 2004. Bioinformatics, 20 (15): 2447-2454).

Preparación de muestras de líneas transgénicas de tomate

[0102] El análisis no específico metabólico se realizó con tres etapas de desarrollo de los frutos de tomate (500 mg de polvo congelado) que expresan el AroG175 y AroG209 y WT (n = 5), se extrajo en 1,5 ml de metanol al 100%. Las condiciones de preparación e inyección ejemplares se realizaron como se ha descrito previamente (Mintz-Oron, S., et al Plant Physiol, 2008. 147 (2): P 823-51).

Análisis UPLC-qTOF-MS-y GC-MS

[0103] El análisis de los datos UPLC-QTOF-MS en bruto se realizó usando el software XCMS que realiza la alineación de cromatograma, detección de señal de masa y la integración de picos (Smith, C. et al, Anal Chem, 2006. 78: 779 -787) desde el paquete bioconductor (v. 2.1) para el lenguaje estadístico R (v. 2.6.1). XCMS se usó con los siguientes parámetros: FWHM = 10,8, paso = 0,05, pasos = 4, mzdiff = 0,07, snthresh = 8, max = 1000. Las inyecciones de muestras en los modos de ionización positivo y negativo se realizaron en los conjuntos de inyección separados y pre-procesamiento se hizo para cada modo de ionización de forma independiente. Iones de masas diferenciales se determinaron utilizando la prueba t de Student (software JMP). El análisis GC-MS se realizó como se ha descrito previamente (Malitsky, S. et al, Plant Physiol, 2008. 148 (4): 2021-2049), (n = 5-6) El software Xcalibur

v.1.4 (Thermo Finnigan; http://www.thermo.com/) fue utilizado para el análisis de datos y los compuestos se identificaron por comparación de su índice de retención (RI) y el espectro de masa a las generadas por patrones

auténticos analizadas en el mismo instrumento. En los casos en que las normas no estaban disponibles, los compuestos se identifican putativamente por comparación de su RI y espectro de masas a los presentes en la biblioteca de espectros de masas de Max-Planck-Institute for Plant Physiology, Golm, Alemania (Q_MSRI_ID, http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/msri/gmd msri.html) y la biblioteca de espectros de masas comercial NIST05 (www.nist.gov). Los valores de respuesta para metabolitos resultantes del método de procesamiento de Xcalibur se normalizaron al estándar interno ribitol. El análisis de la prueba t de Student se realizó en el nivel de metabolitos con cambios significativos en los dos genotipos transformados AroG175 utilizando el software JMP. A continuación, las parcelas de PCA se generaron usando el software TMEV4 (Saeed et al 2003,., Supra; Scholz et al 2004. Supra).

Extracción de ARN y Análisis de Microensayo

[0104] Todos los experimentos que analizan los niveles de expresión de ARN se realizaron usando dos réplicas de tejidos aéreos de plántulas de Arabidopsis de 10 días de edad a partir de plantas cultivadas en condiciones de ambiente controlado. El ARN total se extrajo como se ha descrito anteriormente (Chomczynski P., 1993. Biotechniques 15 (3): 532-537) y se trató con ADNasa RQ-1 (Promega). A continuación, el ARN se amplificó usando etiquetado Affimetrix de 1 ciclo utilizando el protocolo estándar de Affymetrix. La hibridación, el etiquetado, escaneo y la extracción de datos se realizaron de acuerdo a los protocolos estándar de Affymetrix. El análisis del transcriptoma se llevó a cabo utilizando el software Partek Genome Suite (www.partek.com). El pre-procesamiento se llevó a cabo usando el algoritmo de Robust Microarray Averaging (RMA) (Irizarry R.A. et al, 2003. Biostatistics 4 (2): 249-264). Se realizó un análisis ANOVA unidireccional, se calculó el cambio entre las líneas (dos veces) y FDR se aplicó para corregir la forma de comparaciones múltiples (Hochberg y Benjamini 1990, supra). El análisis de exceso de representación se realizó mediante la herramienta PageMan (http://mapman.mpimpgolm.mpg.de/general/ora/ora.shtml) (Usadel B. et al, 2006. BMC Bioinformatics. 7: 535). La visualización de las rutas metabólicas y otras categorías funcionales se preformó con la herramienta de software MapMan (Usadel B. et al, 2005. Plant Physiol 138 (3): 1195-1204). Se utilizó el número locus común (AGI) de nomenclatura TAIR (http://www.arabidopsis.org). Para una RT-PCR cuantitativa de dos pasos, RT-PCRs de Platinum SYBR SuperMix (Invitrogen) se midieron en un instrumento ABI 7300 (Applied Biosystems). Cada muestra se amplificó por PCR usando la misma cantidad de molde de ADNc en reacciones por triplicado como se ha descrito previamente (Mintz-Oron et al. 2008, supra).

Ejemplo 1: Generación de plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan una enzima DAHPS insensible a la retroalimentación bacteriana y análisis metabólicos iniciales

[0105] Para estudiar la importancia de DAHPS en la regulación de los flujos haciendo puente con metabolismo primario y secundario en las plantas, las plantas de Arabidopsis se transformaron con ya sea un AroGWT quimérico o genes AroG175 o AroG209 (Fig. 2, paneles A, B y C respectivamente) que codifica el WT dirigido al plástido y las enzimas DAHPS insensibles a la retroalimentación bacteriana, respectivamente (Hu et al., 2003, supra). Al orientar las enzimas bacterianas en el plástido, donde la vía de shikimato opera en las plantas, se obtuvo mediante una fusión en el marco de un ADN que codifica un péptido de tránsito de plastidio en el extremo 5' de las secuencias de ADN codificantes de los dos genes quiméricos. Los genes quiméricos también se fusionaron en el marco en su 3' a una etiqueta de epítopo ADN que codifica la hemaglutinina (HA) (Fig. 2 AC), para permitir la detección de los genes recombinantes en las plantas transgénicas. Para examinar los polipéptidos producidos por los transgenes AroG quiméricas, proteínas de plantas transformadas de forma independiente se sometieron a análisis de inmunotransferencia con anticuerpos anti-HA. Como se muestra en la figura 2D, el análisis de inmunotransferencia revelaron que las plantas transgénicas que expresan los constructos plastídicos AroG produjeron dos bandas de polipéptidos derivadas de AroG: (i) la banda inferior correspondiente en tamaño al polipéptido AroG bacteriano maduro (42,5 kD); y (ii) la banda superior, que corresponde en tamaño a la AroG no procesada que contiene el péptido de tránsito de plastidio (48,1 kD). Esto indicó que una porción importante de los polipéptidos AroGWT, AroG175 y AroG209, producidos por estos transgenes, se procesaron para eliminar el péptido de tránsito de plastidio y se translocaron en los plástidos. Plantas T2 homocigóticas se generaron que contenía una sola inserción, en función de su segregación 3:1 para la resistencia a la selección Basta en el estado heterocigoto, y se utilizaron para el análisis adicional. Las plantas que expresan AroGWT y AroG175 transgénicos tenían fenotipos comparables a las plantas de control (datos no mostrados) y eran completamente fértiles.

[0106] Una visión global del efecto de la expresión de los transgenes AroGWT, AroG175 y AroG209 sobre el metabolismo de la planta se obtuvo mediante la realización de cromatógrafo de gas-espectrometría de masas de análisis (GC-MS) de compuestos polares de extractos derivatizados; plantas de 20 días de edad de cuatro plantas transformadas de forma independiente de cada uno de los genotipos (2-3 análisis independientes de cada genotipo, cada uno derivado de extractos hechos de ~ 7 plantas), así como plantas WT (cinco análisis independientes) se tomaron para el análisis. El conjunto de datos se analizó primero por un Análisis de Componentes Principales (PCA). En este análisis, los perfiles metabólicos de control y genotipos AroGWT se gruparon, y fueron completamente separados de los genotipos AroG175 y AroG209 (Fig. 3). Curiosamente, también había una cierta separación entre los cinco genotipos AroG175 (Fig. 3), lo que implica un efecto de los diferentes niveles de expresión AroG175 en cada uno de estos genotipos en la medida de la alteración metabólica.

[0107] A fin de probar si expresión AroGWT, AroG175 y AroG209 altera los niveles de metabolitos asociados con el siquimato y rutas de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (Fig. 1), las señales de masa asociadas con tales metabolitos que podrían ser detectadas en el GC-MS (véase la sección material y métodos) se examinó específicamente. Como se muestra en la Fig. 4, los niveles de shikimato, prefenato y fenilalanina (véase las ubicaciones de metabolitos en la Fig. 1) fueron mayores en las diferentes líneas AroG175 y AroG209, pero no en los genotipos AroGWT, en comparación con las plantas de control. Esto sugirió que el rasgo de retroalimentación de insensibilidad de enzima AroG175 es esencial para la mejora del flujo del metabolismo de carbono primario a través de la vía de shikimato en la producción de aminoácidos aromáticos. Las plantas que expresan el AroG175 por lo tanto polipéptido se estudiaron adicionalmente.

Ejemplo 2: Análisis metabólico de plantas de Arabidopsis que expresan el gen AroG175

[0108] El efecto de expresión AroG175 en una amplia gama de metabolitos primarios y secundarios se examinó en dos línea AroG175, AroG175-2 y AroG175-21 homocigotos transformadas independientemente. Estas líneas expresan nivel medio (AroG175-2) o relativamente alto (nivel AroG175-21) del polipéptido AroG175 (Fig 2D.), y contenían una única inserción, en función de su segregación 3:1 para la resistencia a antibióticos. Tejidos aéreos de plántulas de 10 días de edad de estas dos líneas, así como el genotipo de control se sometieron a GC-MS y análisis de cromatografía líquida-espectroscopía de masas dirigidos y no dirigidos (LC-MS). Gráfico PCA de los datos GC-MS visualizó separación significativa entre los dos genotipos AroG175 y el genotipo de control (Fig. 3). Además, PCA de los datos de LC-MS demostró una relativamente pequeña separación entre el AroG175-2 y la línea de control, mientras que una separación considerablemente mayor entre la AroG175-21 y las líneas tanto de control como AroG175-2 (datos no mostrados). El análisis de los niveles de metabolitos específicos por la GC-MS y LC-MS (Fig. 5) también mostró que, como se esperaba, los cambios en los niveles de metabolitos específicos fueron principalmente más fuertes en la línea AroG175-21 que la línea AroG175 -2. Análisis GC-MS mostró que los niveles de cinco metabolitos se incrementaron significativamente en las líneas AroG, incluyendo los metabolitos primarios shikimato, prefenato y fenilalanina (Fig. 5A-C), así como metabolitos de fenilacetonitrilo secundarios (isotiocianato) y homogentisato (derivado de Tyr que es un precursor de los tocoferoles y tocotrienoles) (Fig. 5D, E).

[0109] En el análisis LC-MS, la línea AroG175-2 generalmente mostrará cambios más suaves en los niveles de los diferentes metabolitos en comparación con la línea AroG175-21 (datos no mostrados). Por lo tanto, el análisis de LC-MS no específica se centró sólo en metabolitos que su nivel fue significativamente diferente entre la línea AroG175-21 y el control, pero también mostró dirección similar de cambio en la línea AroG175-2. El análisis de LC-MS no específica de línea AroG175-2 reveló un total de 4473 señales de masa, de los cuales los niveles de 2414 se alteraron significativamente (regulados hacia arriba o abajo) en comparación con el control. Suponiendo un promedio de cinco señales de masa por solo metabolito (Malitsky S. et al, 2008. Plant Physiology 148 (4): 2021-2049), expresión AroG175 en la línea AroG175-21 resultó en niveles alterados de ~ 500 metabolitos. En lo que respecta a los otros dos aminoácidos aromáticos, este análisis mostró que el nivel de triptófano era 2,6 veces mayor en la línea AroG175-2, en comparación con el control, mientras que su nivel en la línea AroG175-2 no fue significativamente diferente del control (Fig. 5F). El nivel de tirosina no fue alterado en estas dos líneas transgénicas en comparación con el control (datos no mostrados). Estos resultados implican que las plantas de semillero de Arabidopsis poseen: (i) canalización más fuerte de corismato en la rama Phe/Tyr que hacia la rama Trp y (ii) canalización más fuerte de la rama Phe/Tyr hacia Phe que hacia la biosíntesis de Tyr (véase Fig. 1).

[0110] El análisis LC-MS también mostró que el nivel de una serie de metabolitos secundarios de fenilpropanoides derivados de fenilalanina es significativamente mayor en AroG175-21 en comparación con las plantas de control (Fig. 5G-Z). Estos metabolitos secundarios incluyen: Phe-3-carboxi-2-hidroxi, hexosa de cumarato (I-III), hexosa de ferulato (I-III), un derivado de ácido ferúlico (I-III), hexosa de sinapoil, keampferol desoxihexosa-hexosadesoxihexosa, sinapato, coniferina, alcohol sinapílico, malato de sinapoil, desoxihexosa-desoxihexosa de kaempferol, desoxihexosa de kaempferol, cianidina 3-O-[2-(2-(sinapoil)xilosilo)-6-O-(4(glucosilo)-pcumaroil)glucósido]glucósido]5-[6-O-(malonilo)-glucósido y glucosinolatos de 2-feniletilo. El nivel de algunos metabolitos secundarios derivados de triptófano también fueron significativamente mayores en la línea AroG175-2, incluyendo los glucosinolatos de triptófano derivados de glucosinolatos 4-hidroxi-indolilo-3-metilo, glucosinolatos de 1-metoxiindol, 1-(1H-indol-3-carboxilato de etilo)-glucopiranosa, y glucosinolato de 4-metoxiindol, así como el conjugado IAA; 4-O-(indol-3-acetilo)-dihexosa-(Fig. 5AA-AE). Metabolitos adicionales que sus niveles eran más altos en línea AROG175-21 incluyen los conjugados de hormona jasmonato (12-hidroxi-jasmonato de hexosa) y derivados de salicilato (hexosa de dihidroxibenzoato y hexosa de hidroxibenzoato), así como los glucosinolatos derivados de Met: glucosinolatos de metilsulfoniloctilo, glucosinolatos de 3-benzoiloxipropilo, glucosinolatos de 7-metiltioheptilo y glucosinolatos de 8-metiltiooctilo (Fig. 5AF-AL).

[0111] Dado que el nivel de triptófano fue mayor en el AroG175-21, pero no en el AroG175-2, en comparación con las líneas de control (Fig. 5F), decidimos examinar indirectamente si la expresión AroG175 también influye en el flujo de corismato para triptófano (Fig. 1). Para abordar esta cuestión se utilizó el análogo de triptófano 5-metilo-Trp (5MT) que ralentiza la velocidad de la biosíntesis de triptófano (Widholm JM, 1972. Biochimica et Biophysica Acta 279 (1): 48-57; Kisaka H. et al., 1996. Breeding Science 46: 221-226). Las plantas que son resistentes a 5MT normalmente muestran niveles de triptófano incrementados. Los inventores de la presente invención han demostrado previamente que la expresión del gen E. coli PheA* (que codifica una deshidratasa de mutasa/prefenato de corismato insensible a

retroalimentación bifuncional que convierte corismato a través de prefenato a fenilpiruvato) en Arabidopsis hacen las plantas más sensibles al crecimiento en medio que contiene 5MT (Tzin V. et al, 2009. Plant J. 60 (1): 156-67). Como se muestra en la figura 6, el crecimiento de las cuatro líneas que expresan AroG175 en medio que contiene 5MT era considerablemente mejor que el de las plantas de control, apoyando los datos analíticos que indican que la expresión de AroG175 regula hacia arriba la biosíntesis de triptófano.

Ejemplo 3: Generación de plantas de tomate transgénicas que expresan una enzima DAHPS insensible a retroalimentación bacteriana y análisis metabólicos iniciales

[0112] Para estudiar la importancia de DAHPS en la regulación de los flujos que hace puente de metabolismo primario y secundario en las plantas, las plantas de tomate fueron transformadas ya sea con genes quiméricos AroG175 o AroG209 (Fig. 2, paneles B y C, respectivamente) que codifica las enzimas de DAHPS bacterianas insensibles. Al orientar las enzimas bacterianas en el plástido, donde la vía de shikimato opera en plantas se obtuvo mediante una fusión en el marco de un ADN que codifica un péptido de tránsito de plastidio en el extremo 5' de las secuencias de ADN codificantes de los dos genes quiméricos. Los genes quiméricos también se fusionaron en el marco en su 3' a una etiqueta de epítopo ADN que codifica la hemaglutinina (HA) (Fig. 2 BC). Plantas de tomate T1 fueron probadas genéticamente para la presencia de inserción AroG y la resistencia a kanamicina (datos no mostrados). Las plantas que expresan AroG175 y AroG209 transgénicas tenían fenotipos comparables a las plantas de control y eran completamente fértiles (datos no mostrados).

[0113] En la primera etapa de estudiar el efecto de la expresión de los transgenes AroG175 y AroG209 sobre el metabolismo de la planta, se realizó el análisis LC-MS para la fruta de tomate maduro a partir de cinco genotipos transformados de forma independiente para cada una de las plantas transgénicas (5-6 análisis independientes de cada genotipo; cada derivado de extractos hechos de ~ 10 plantas), así como plantas WT (cinco análisis independientes). Para obtener una visión global sobre los efectos metabólicos de los genotipos AroG175 y AroG209, el conjunto de datos se analizaron por primera vez por una parcela de PCA. En este análisis, el perfil metabólico del control se separó completamente de los genotipos AroG175 y AroG209 (Fig. 8A). Curiosamente, también había una cierta separación entre las dos genotipos AroG175 (AROG175-6 y AroG175-11) y tres genotipos AroG209 (AROG209-4, AroG209-8 y AroG209-9) lo que implica un efecto de los diferentes niveles de expresión de la AroG insensible a retroalimentación en cada uno de estos genotipos en la medida de la alteración metabólica. Para probar además si expresión AroG175 y AroG209 altera los niveles de los aminoácidos aromáticos, sus señales de masa se examinaron específicamente. Los niveles de los tres aminoácidos aromáticos se incrementaron significativamente en los cinco genotipos (Fig 8B). Los metabolitos acumulados en el desarrollo de fruto de tomate obtenido a partir de plantas que expresan AroG209 se presentan en la Tabla 1. Se muestra un nivel aumentado de un número de metabolitos secundarios de fenilalanina derivados incluyendo antocianinas, flavonoides, cumarato y derivados de cafeoilquinato así como monosacáridos y oligosacáridos.

Tabla 1: La acumulación de metabolitos en el desarrollo de fruto de tomate obtenido a partir de plantas que expresan genes AroG209-9 y en la fruta obtenida a partir de plantas de tomate de tipo salvaje (WT).

60 10

Metabolito

Corteza Pulpo

MG

Br Maduro MG Br Maduro

Aminoácidos

Phe

1,0 4,7 89,0 0,9 2,4 22,1

Tyr

1,6 2,4 171,9 0,9 2,7 15,3

Trp

0,6 2,2 4,1 0,5 1,4 1,4

Asn

0,4 0,5 0,5 0,6 0,9 0,5

Gln

0,1 0,1 0,4 0,3 0,7 0,4

Gly

0,5 1,3 1,7 1,0 1,2 1,5

Ile

0,7 1,2 2,2 1,0 1,1 2,0

N-acetilo-glutamato

0,1 0,2 0,4 0,7 0,8 0,4

Thr

0,5 1,0 1,1 0,7 1,0 1,2

Ácido orgánico

Ácido fumárico

1,5 1,8 2,5 1,0 1,2 1,2

Ácido prefénico

7,6 354,3 604,8 3,4 276,3 235,9

Ácido shikímico

2,3 2,5 17,4 1,1 2,5 62,9

Azúcares

Celobiosa

0,9 1,3 8,0 1,0 1,2 22,0

Fructosa

1,7 1,0 1,0 1,2 1,0 1,1

Fructosa-6-fosfato

0,5 0,8 0,9 0,8 0,7 0,6

Maltosa

1,3 1,2 1,4 1,2 0,9 1,5

Manosa

1,7 1,2 1,2 1,1 1,0 1,1

Rafinosa

1,2 2,0 103,1 0,4 2,8 92,3

Trehalosa

0,5 0,7 73,6 1,8 0,9 5,3

Poliamina

Putrescina

1,1 0,6 0,3 0,8 0,8 0,2

Nucleósidos

Guanosina

0,8 0,9 1,9 1,0 0,7 1,6

Fenilpropanoides

Ácido 3-Cafeoilquínico

0,9 1,3 2,9 1,9 1,1 2,2

Ácido 4-Cafeoilquínico

0,7 1,0 2,1 1,3 0,8 1,4

Ácido coumárico

0,7 2,7 164,8 0,4 2,6 613,6

Ácido coumárico hexósido or deriv I

N,D N,D N,D 1,1 1,8 114,5

Fenilpropanoides

Ácido cumárico-hexosa

0,8 0,6 15,3 0,4 0,4 1,1

Metabolito

Corteza Pulpo

Kaempferol-glucosa-ramnosa

1,0 0,9 0,6 1,1 0,9 108,7

Naringenina

0,9 0,4 0,6 0,5 10,1 1,8

Naringenina calcona-hexosa IV

0,8 0,7 5,2 N,D N,D N,D

Quercetina

0,4 0,7 2,6 0,2 0,7 1,1

Quercetina-hexosa-deoxihexosa-pentosa-p-ácido cumárico

1,0 1,1 3,9 N,D N,D N,D

Ácido tricafeoilquínico

0,9 0,7 2,3 0,6 1,2 2,0

Alcaloides esteroidales

Dehidrolicoperósido G, F, A

2,8 1,1 2,6 1,5 1,5 2,9

Cartenoides

Fitoeno

N,D N,D 0,2 N,D N,D 0,001

Fitoflueno

N,D N,D 0,1 N,D N,D 0,001

Tipo licopeno

N,D N,D 0,3 N,D N,D 0,55

[0114] Los niveles de metabolitos se muestran como cambio de veces + SE de cinco (análisis UPLC-qTOF-MS) o seis (análisis de GC-MS) o cuatro muestras independientes (UPLC) en comparación con el WT. Los niveles de metabolitos se presentan como cambio de veces (AROG209-2/WT) en cada etapa de desarrollo. Las tres etapas de desarrollo son: verde maduro (MG; ~ 42 días después de la antesis (DPA)), interruptor (Br; ~ 44 DPA) y rojo (rojo; ~ 48 DPA) y se separaron a corteza y pulpo. Valores P se muestran como <0,05 (FDR). Términos en negrita indican un aumento estadísticamente significativo como analizados por ANOVA de dos vías y la prueba t de Student. N. D. no detectado.

Ejemplo 4: Análisis metabólico de los frutos de tomate que expresan el gen AroG209

[0115] El efecto de expresión AroG209 de generación T2 en una amplia gama de metabolitos primarios y secundarios se examinó en genotipos AroG209-9 homocigotos transformados seleccionados. Este genotipo contenía una sola inserción, basada en PCR y resistencia a los antibióticos. Con el fin de estudiar los efectos de expresión AroG209 sobre el metabolismo del fruto de tomate, fruto de tomate en tres etapas de desarrollo fueron sometidos a análisis Lc-MA: verde maduro (alrededor de 42 días después de la antesis (DPA); disyuntor (alrededor de 44 DPA); y rojo (aproximadamente 48 DPA). 5-6 análisis independientes de AroG209 y genotipos WT en cada etapa de desarrollo fueron examinados. Cada análisis se derivó de extractos hechos de tres frutas recolectadas a partir de 10 plantas. Para obtener una visión global de los efectos metabólicos de la expresión AroG209 en tejido piel de tomate, un PCA se realizó de conjuntos de datos obtenidos a partir de 2.725 señales de masas en modo de ión negativo. Curiosamente, la fase verde madura tanto de AroG209-9 como WT se combinan, una separación débil se produce en la etapa de interruptor y una separación completa se produce en la etapa roja (Fig. 9A). Parcelas de PCA de perfiles metabólicos obtenidos por análisis UPCL-QTOF se presenta en la Fig. 9B. El cambio de veces más significativamente se produjo en la etapa de desarrollo de color rojo y el nivel de señales de masa 1.000 únicas se incrementó significativamente. El nivel de los tres aminoácidos aromáticos fue significativamente mayor en la etapa de rojo de genotipo AroG209-9, con mayor aumento en el nivel de fenilalanina y tirosina (Fig. 10 y en la Tabla 1). El análisis metabólico también mostró que el aumento de los niveles de una serie de fenilpropanoides de fenilalanina derivados de metabolitos secundarios, así como el producto catabólico de la tirosina. El panel organoléptico que ensayó fruta roja madura obtenida a partir de planta AroG209-9 que expresa fruta determinó que la fruta poseía mejor sabor floral (Fig. 11).

Ejemplo 5: Efectos de la expresión AroG175 en las redes de expresión génica

[0116] Se estudió el efecto de la expresión AroG175 del transcriptoma mundial de Arabidopsis. Un análisis de micromatrices se realizó con muestras extraídas de tejidos aéreos de 10 días de control de edad y plántulas AroG1752, utilizando el Affymetrix ATH1 GeneChip. Se seleccionó la línea AroG175-2 que se mostró tener un cambio moderado en el metabolito, para reducir la posibilidad de efectos pleiotrópicos. El análisis ANOVA de los resultados de microensayos siguió múltiples hipótesis la prueba utilizando un corte de FDR al 5%, indicando que la expresión de un número relativamente pequeño de genes (109 genes) mostró un cambio significativo y por lo menos de 2 veces entre el control y línea AroG175-2, lo que indica un efecto relativamente moderado de expresión AroG en el transcriptoma de Arabidopsis.

[0117] Los genes que fueron consistentemente regulados hacia arriba (77 genes) y hacia abajo (32 genes) se clasificaron por análisis de representación excesiva usando las herramientas de software PageMan y MapMan (http://mapman.mpimpgolm.mpg.de/general/ora/ora.shtml; (Usadel et al 2006, supra). Los principales efectos del gen AroG175-2 incluía una estimulación de la expresión de 37 genes relacionados con el estrés biótico (Tablas 2 y 3).

Tabla 2: Categorías sobre representadas de gen reguladado hacia arriba (mínimo aumento en dos veces)

BIN (número de categoría) Página Man

Categoría principal Sub categoría (1) Sub categoría (2) número de conjunto de sonda Valor P (FDR)

10

Pared celular 3 1,2E-08

10,8

Pectinesterasas 2 5,4E-06

12

Metabolismo de nitrato 3 5,4E-06

12,1,1

Reductasa de nitrato 2 5,4E-06

16

Metabolismo segundario 7 2,9E-19

16,2

Fenilpropanoides 2 5,4E-06

16,4

N misc 3 1,2E-08

16,4,1

Tipo alcaloide 3 1,2E-08

17

Metabolismo de hormona 4 2,8E-11

17,4

Citoquinina 2 5,4E-06

17,4,2

Citoquinina-transducción de señal 2 5,4E-06

20

Estrés 10 2,7E-27

20,1

Estrés biótico 9 1,3E-24

21

Regulación de redox 3 1,2E-08

27

ARN 12 1,1E-32

27,3

Regulación de transcripción 12 1,1E-32

27,3,26

MYB -familia de factor de transcripción 2 5,4E-06

27,3,3

AP2/EREBP, APETALA2/ Etileno-familia de proteína de unión a elemento responsivo 2 5,4E-06

27,3,5

ARR-familia de factor de transcripción 2 5,4E-06

27,3,7

C2C2(Zn) familia de dedo de zinc tipo constans (reloj circadiano) 2 5,4E-06

29

Proteína 2 5,4E-06

29,4

modificación postranslacional 2 5,4E-06

30

Señalización 7 2,9E-19

30,2

Quinasas de receptor 3 1,2E-08

30,3

Calcio 4 2,8E-11

33

Desarrollo 3 1,2E-08

34

Transporte 5 6,2E-14

Tabla 3: Categorías sobre representadas de genes regulados hacia abajo (mínimo disminución en dos veces)

BIN (número de categoría) Página Man

Categoría principal Sub categoría (1) Sub categoría (2) número de conjunto de sonda Valor P (FDR)

11

Metabolismo lípido 2 9,2E07

27,3

ARN Regulación de transcripción 8 3,1E25

27,3,66

Familia de factor de transcripción Psudo ARR 2 9,2E07

27,3,7

C2C2(Zn) familia de dedo de zinc tipo constans (reloj circadiano) 3 8,4E10

29

Proteína 2 9,2E07

29,5

Degradación de proteína 2 9,2E07

[0118] La categoría de estrés biótico incluía genes asociados con el metabolismo de hormonas (citoquininas, ácido absicísico, salicilato y jasmonato), factores de transcripción (MYBs, WRKYs y APETALA2/proteínas de unión de elemento sensible a etileno), señalización (genes AAR de calcio y citoquinina), la patogénesis (proteínas PR), resistencia a las enfermedades (proteínas TIR-NB), los transportadores y la regulación redox. Además, se indujeron los genes que supuestamente codifican proteínas asociadas con el metabolismo secundario, incluyendo el metabolismo de fenilpropanoide, glucosinolatos Met-alifáticos y un gen asociado con indol-glucosinolatos Trpderivados. Otra categoría enriquecida muestra que una mayor expresión se asoció con la asimilación de nitrato. Notablemente, el nivel de expresión de 16 genes, categorizados como genes asociados con el reloj circadiano, también se indujo en el transcriptoma AroG175-2. Estos genes relacionados con reloj circadiano incluían los que codifican factores de trancripción MYB, las proteínas de tipo caja B de dedo de zinc con un dominio de unión de ADN-CCT y otros tres genes, que codifican proteínas asociadas con la cascada de reloj circadiano incluyendo TOC1, regulador de Pseudo-respuesta y ELF4 (floración temprana 4). Para corroborar los resultados de microensayos, un análisis cuantitativo de RT-PCR se realizó también en una muestra representativa de genes cuyo nivel de ARNm fue mayor en el AroG175-2 que en la línea de control en el análisis de microensayos. Este análisis, que se realizó en líneas tanto AroG175-2 como AroG175-21, confirmó los resultados de expresión génica obtenidos por el análisis de microensayos.

Ejemplo 6: Perfil aromático de fruta de AroG209-9 expresar plantas de tomate

[0119] Un panel de 10 expertos de sabor entrenados evaluaron el aroma de muestras de fruta obtenidas de plantas de tomate que expresan el gen AroG209-9. Las pruebas preliminares se llevaron a cabo para mejorar la capacidad de los evaluadores para reconocer defectos de olor y consistentemente cuantificar propiedades sensoriales. Los panelistas previamente habían sido entrenados en la descripción cuantitativa de los atributos de tomate de acuerdo con los ensayos de selección basados en normas francesas (ISO8586-1, AFNOR V09-003). Para cada muestra de fruta, aromas evaluaron las frutas enteras para elaborar perfiles de corteza y cortar las frutas -para la evaluación de la pulpa. La evaluación de aroma se llevó a cabo por oler las muestras de todos los miembros del panel. Varios atributos fueron elegidos: ácido floral, fresco, verde, mohoso metálico, maduro, especiado y dulce, además de la intensidad global de aroma. Los valores de puntuación fueron entre 0 (ninguno) a 5 (muy fuerte). Cuando se hayan completado, los miembros del grupo examinaron sus puntuaciones y coincidieron en la última puntuación de resumen de cada grupo de aroma. Los resultados se resumen en la Fig. 11, demostrando que varios atributos de aroma son más significativos en la fruta obtenida a partir de la planta transgénica en comparación con la fruta de plantas de tomate de tipo salvaje.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0120]

<110> YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE SINTETASA DAHP ALTERADA

<130> YEDA/0104 PCT

<150> 61/361549

<151> 2010-07-06

<160> 16

<170> PatentIn versión 3.5 5

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> Escherichia coli 10

<400> 1

<210> 2

<211> 350 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mutante de E. coli AroG175 45

<400> 2

<210> 3

<211> 1050

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> polinucleótido que codifica el mutante E. coli AroG175

15 <400> 3

<210> 4 50 <211> 350

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 55 <223> mutante E. coli AroG209

<400> 4

Secuencia artificial 15 <220>

<223> polinucleótido que codifica el mutante E. coli AroG209

<400> 5

<210> 6

<211> 187 55 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> polinucleótido que codifica péptido de tránsito de plastidio guisante rbcS3 60

<400> 6

<210> 7 10 <211> 105

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> secuencia polinucleotídica que codifica tres repeticiones de etiqueta de epítopo HA

<400> 7

<210> 8 25 <211> 445

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Polipéptido TP-AroG175-3HA

<400> 8

<210>

9

<211>

445

<212> PRT

20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido TP-AroG209-3HA

25

<400> 9

30

35

40

45

50

55

5

<210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 10 catgcatgct gatgaattat cagaacgacg a

31

15

<210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 11 gcgacgcgct tttactg ggaattcccc

27

25

<210> 12 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 12 gtgcaccgcg aacaggcatc agggctt

27

35

<210> 13 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador sintético

45

<400> 13 aagccctgat gcctgttcgc ggtgcac <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial 27

<220> <223> cebador sintético

55

<400> 14 gcgccgcact gcgccctgtc cgtaacg 27

<210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador sintético

65

<400> 15 cgttacggac agggcgcagt gcggcgc 27

<210> 16

<211> 1053

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 16

55 15

Claims (10)

1. Reivindicaciones

   1.

   Una planta transgénica que comprende al menos una célula vegetal que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde dicha al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y en la que la planta transgénica comprende una cantidad incrementada de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

2. 2.

   La planta transgénica de la reivindicación 1, en la que prolina en la posición 150 se sustituye por leucina (P150L), leucina en la posición 175 se sustituye por glutamina (L175Q), leucina en la posición 179 se sustituye por ácido aspártico (L179D) y fenilalanina en la posición 209 es reemplazada por alanina (F209A).

3. 3.

   La planta transgénica de la reivindicación 2, en la que el polinucleótido codifica mutante E. coli AroG DAHPS que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, en la que leucina en la posición 175 se sustituye por glutamina (L175Q), que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, preferiblemente en la que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 3; o en la que el polinucleótido codifica mutante E. coli AroG DAHPS que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, en la que la fenilalanina en la posición 209 se sustituye por alanina (F209A), que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, preferiblemente en la que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 5.

4. 4.

   Una semilla de planta producida por la planta transgénica de la reivindicación 1 y que comprende un polinucleótido exógeno que codifica la sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, donde dicha al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y en la que la semilla es capaz de cría de una planta transgénica que tiene una mayor cantidad de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

5. 5.

   Un cultivo de tejido que comprende al menos una célula transgénica de la planta de la reivindicación I o un protoplasto derivado del mismo, la planta o protoplastos que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfatasa (DAHPS) que tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en la que al menos un punto de mutación reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina.

6. 6.

   El cultivo de tejido de la reivindicación 5, en el que dicho cultivo de tejido regenera una planta transgénica que tiene una mayor cantidad de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.

7. 7.

   Una planta transgénica regenerada a partir de cultivo de tejido de la reivindicación 5, la planta transgénica que comprende un polinucleótido exógeno que codifica sintasa de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHPS) que tiene al menos una mutación puntual en una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en la posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en la que al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina.

8. 8.

   Un método para inducir la síntesis de fenilalanina en una planta, que comprende

   (a)

   transformar una célula vegetal con un polinucleótido exógeno que codifica DAHPS teniendo al menos una mutación puntual en una posición seleccionada del grupo que consiste de posición 150, 175, 179 y 209 del tipo salvaje de E. coli AroG DAHPS que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, donde al menos una mutación puntual reduce la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina, y

   (b)

   regenerar la célula transformada en una planta transgénica que comprende al menos una célula que tiene un mayor contenido de dicha fenilalanina en comparación con una célula correspondiente de una planta no transgénica.

9. 9.

   El método de la reivindicación 8, en el que la planta transgénica regenerada comprende un aumento de la cantidad de dicha fenilalanina en comparación con una planta no transgénica correspondiente.
10. 10. El método de la reivindicación 8, en el que prolina en la posición 150 se sustituye por leucina (P150L), leucina en la posición 175 se sustituye por glutamina (L175Q), leucina en la posición 179 se sustituye por aspartato (L179D) y fenilalanina en la posición 209 se sustituye por alanina (F209A).

    5 11. El método de la reivindicación 10, en el que, si prolina en la posición 150 se sustituye por leucina (P150L), leucina en la posición 175 se sustituye por glutamina (L175Q), leucina en la posición 179 se sustituye por aspartato (L179D) y fenilalanina en la posición 209 es reemplazada por alanina (F209A), el polinucleótido que codifica mutante E. coli AroG DAHPS que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina en el que leucina en la posición 175 se sustituye por glutamina (L175Q), que tiene

    10 la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, preferiblemente en el que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 3; o el polinucleótido que codifica mutante E. coli AroG DAHPS que tiene una sensibilidad reducida a la inhibición por retroalimentación por fenilalanina en el que la fenilalanina en la posición 209 se sustituye por alanina (F209A), que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, preferiblemente en el que polinucleótidos

    15 comprenden la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 5.

    Figura 1

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 6

    Figura 7

    Figura 7 (CONT)