ES2394084T3

ES2394084T3 - Péptido de direccionamiento plastidial

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Publication number: ES2394084T3
Application number: ES03760745T
Authority: ES
Inventors: Stéphane MIRAS; Daniel Salvi; Norbert Rolland; Jacques Joyard; Myriam Ferro; Jérome GARIN; Didier Grunwald
Original assignee: Genoplante Valor SAS
Current assignee: Genoplante Valor SAS
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2003-06-19
Publication date: 2013-01-17
Anticipated expiration: 2023-06-19
Also published as: CA2489533A1; IL165856A; EP1539969A1; EP1539969B1; WO2004001050A1; FR2841247A1; AU2003255683A1; US7741073B2; FR2841247B1; US20060059587A1; AU2003255683B2; US20080263728A1; US7414025B2; IL165856A0

Abstract

Polipéptido de direccionamiento intraplastidial, caracterizado porque está constituido por:- un dominio A constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de almenos el 65 %, con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5;y al menos un dominio seleccionado entre:- un dominio B situado en el extremo N-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de lospolipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 49 a 59 de dichopolipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud deal menos el 65 %, con dicho fragmento;- un dominio C situado en el extremo C-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de lospolipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 101 a 111, y comomáximo los aminoácidos 101 a 151 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta unaidentidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.

Description

Péptido de direccionamiento plastidial

La presente invención se refiere a la producción de proteínas de interés en plantas, y en particular a su 5 direccionamiento hacia el compartimento del plastidio.

Los plastos son orgánulos intracelulares de las plantas clorofílicas (algas, musgos, y plantas superiores). Existen diversos tipos principales de plástidos, según su contenido en pigmentos, y su naturaleza: los amiloplastos, ricos en almidón, los cloroplastos en los que los pigmentos principales son las clorofilas, y los cromoplastos cuyos pigmentos principales son los carotenoides. Estas tres clases de plástidos procedentes de precursores comunes, los proplastos, poseen una estructura básica común constituida por una doble membrana que encierra el estroma del plastidio. En los cloroplastos, existe un tercer sistema de membrana que forma unos sáculos en el interior del estroma denominados tilacoides.

15 Aparte de su papel primordial en la fotosíntesis, los cloroplastos también están implicados en reacciones de óxidoreducción, por ejemplo, la reducción de nitritos en amonio. Los plastos también desempeñan un papel esencial en la biosíntesis y/o almacenamiento de numerosas moléculas, entre las que se pueden citar el almidón, lípidos, carotenoides, la mayoría de aminoácidos, hormonas vegetales (ácido abscísico, precursores de giberelinas, del jasmonato, etc.).

A pesar de que los plastos tienen su propio genoma que codifica una parte de sus proteínas, una gran parte de las enzimas que intervienen en las diferentes funciones plastidiales están codificadas por el genoma nuclear y son importadas al interior de los plastos.

25 Esta importación se lleva a cabo por un mecanismo específico, que se ha estudiado más específicamente en el caso de los cloroplastos (para una revisión, cf. CHEN y SCHNELL, Trends Cell Biol. 9, 222 – 227, 1999; KEEGSTRA y CLINE, The Plant Cell 11, 557 – 570, 1999; SCHLEIFF y SOLL, Planta 211, 449 – 456, 2000; JACKSON-CONSTAN y KEEGSTRA, Plant Physiol. 125, 1567 – 1676, 2001). Este mecanismo implica la intervención de un sistema de importación en cada una de las dos membranas plastidiales: en la membrana externa, el complejo TOC (translocón en la membrana externa del cloroplasto) que comprende al menos tres proteínas: Toc 86, 75 y 34 (KESSLER et al, Science 266, 1035 – 1039, 1994; PERRY y KEEGSTRA, Plant Cell 6, 93 – 105, 1994); en la membrana interna, el complejo TIC (translocón en la membrana interna del cloroplasto) que comprende al menos cuatro proteínas: Tic 110, 55, 22 y 20 (KESSLER y BLOBEL, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7684 – 7689, 1996; LÜBECK et al., EMBO J. 15, 4230 – 4238, 1996; CALIEBE et al., EMBO J. 16, 7342 – 7350, 1997; KOURANOV et al., J. Cell Biol., 143, 991 –

35 1002, 1998), y una proteína chaperona en el estroma: ClpC (AKITA et al., J. Cell Biol. 136, 983 – 994, 1997; NIELSEN et al., EMBO J. 16, 935 – 946, 1997).

Un elemento importante de este mecanismo es Toc75, que es la proteína más abundante en la membrana externa, y forma el poro central del canal de translocación situado en esta membrana (SCHNELL et al., Science 266, 1007 – 1012, 1994; TRANEL et al., EMBO J. 14, 2436 – 2446, 1995). Toc75 interactúa específicamente con una secuencia particular, denominada "péptido de direccionamiento" o "péptido de tránsito", que se encuentra en el extremo Nterminal de las proteínas importadas al interior de los plastos (MA et al, J. Cell Biol. 134, 315 – 327, 1996).

Muchos péptidos de direccionamiento han sido identificados en los precursores de proteínas dirigidas hacia el

45 espacio intermembrana, la membrana interna, el estroma, y en el caso de los cloroplastos, hacia la membrana del tilacoides.

Entre las proteínas que se sabe que poseen un péptido de direccionamiento intraplastidial escindible se pueden citar en particular proteínas dirigidas al espacio intermembrana, (Tic22: KOURANOV et al., 1998, mencionado anteriormente; KOURANOV et al., J. Biol. CHEM. 274, 25181 – 25194, 1999), proteínas dirigidas a la membrana interna (TPT (translocador de triosa-Pi/Pi): BRINK et al., J. Biol. Chem. 270, 20808 – 20815, 1995), proteínas dirigidas al estroma (subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco): DE CASTRO SILVA FILHO et al., Plant Mol. Biol. 30, 769 – 780, 1996, anhidrasa carbónica), proteínas dirigidas a la membrana del tilacoides (LHCP (complejo de captación de luz): LAMPPA et al, J. Biol. Chem. 263, 14996 – 14999, 1988; Cfo-II:

55 subunidad ATPasa) y al lumen del tilacoides (OEE1 (Oxygen Evolving Element 1): KO y CASHMORE, EMBO J. 8, 3187 – 3194, 1989).

Estos péptidos de direccionamiento en general contienen entre 40 y 100 aminoácidos, y en su mayor parte comprenden características comunes: están prácticamente desprovistos de aminoácidos cargados negativamente, como el ácido aspártico, el ácido glutámico, la asparagina o la glutamina; su región N-terminal está desprovista de aminoácidos cargados, y de aminoácidos como la glicina o la prolina; su región central contiene una proporción muy

elevada de aminoácidos básicos o hidroxilados, tales como la serina y la treonina; su región C-terminal es rica en arginina y tiene la capacidad de formar una estructura secundaria anfipática, en lámina beta.

En el caso de proteínas dirigidas al lumen del tilacoides, el péptido de direccionamiento consta de dos partes y contiene información adicional para atravesar la membrana del tilacoides (DE BOER y WEISBEEK, Biochim. Biophys. Acta. 1071, 221 – 253, 1991). En algunos casos, este péptido de direccionamiento que consta de dos partes también se puede encontrar en las proteínas dirigidas a la membrana del tilacoides (KARNAUCHOV y col., J. Biol. Chem. 269, 32.871 – 32.878, 1994).

En todos los casos, el péptido de direccionamiento se escinde después de su importación. Esta escisión se lleva cabo por proteasas específicas; se han descrito una proteasa localizada en el estroma (VANDERVERE et al, Proc Natl. Acad. Sci. 92, 7177 – 7181, 1995), y una proteasa localizada en el lumen del tilacoides (CHAAL et al, J. Biol. Chem. 273, 689 – 692, 1998).

Las proteínas dirigidas a la membrana externa generalmente no contienen el péptido señal escindible; la información de direccionamiento está contenida en la proteína madura (CLINE y HENRY, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12, 1 – 26, 1996); después de su síntesis en el citosol, estas proteínas se incorporan directamente a la membrana (VAN'T HOF et al, FEBS Lett. 291, 350 – 354, 1991 y J. Biol. Chem. 268, 4037 – 4042, 1993; PINADUWAGE y BRUCE, J. Biol. Chem. 271, 32907 – 32915, 1996) por medio de interacciones, cuya naturaleza aún no está clara, con la bicapa lipídica. La única excepción conocida hasta la fecha se refiere a la proteína Toc75 u (OEP75) en la que el direccionamiento hacia la membrana externa requiere de la presencia de un péptido de direccionamiento N-terminal escindible que consta de dos partes (TRANEL et al, 1995, anteriormente mencionada; TRANEL y KEEGSTRA, Plant Cell 8, 2093 – 2104, 1996).

Es sabido que es necesaria la utilización de péptidos de direccionamiento hacia los plastos para introducir en ellos proteínas de interés que permitan actuar sobre diversas funciones plastidiales, en particular, con el fin de mejorar las características de las plantas de interés agronómico, por ejemplo, la biosíntesis de lípidos, de almidón, de vitaminas, de hormonas o de proteínas por parte de dichas plantas, o su resistencia a enfermedades, insectos, o herbicidas. Por ejemplo, la Solicitud EP 189707, así como la Solicitud PCT WO 88/02402 proponen la utilización de péptidos de direccionamiento escindibles procedentes de precursores de proteínas cloroplásticas, y en particular del péptido de direccionamiento de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, para la importación de una proteína de interés hacia los cloroplastos; la Solicitud PCT WO 00/12732 propone la utilización de péptidos de direccionamiento de diferentes proteínas plastidiales para la importación de proteínas de interés hacia los plastos.

Las funciones plastidiales se pueden modificar de esta forma, y las características conferidas por estas modificaciones son muy diversas.

Con fines ilustrativos no limitantes, se pueden citar:

-: el aumento de la resistencia a herbicidas, mediante la expresión del precursor de la acetolactato sintetasa (ALS), (LEE et al EMBO J., 7, 1241 – 1248, 1988), de la acetolactato sintetasa mutada (PRESTON y POWLES, Heredity 88, 8 – 13, 2002); CHONG y CHOI, Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 462 – 467, 2000), o de la 3enolpiruvilsiquimato-5-fosfato sintetasa (EPSP sintetasa) (KLEE et al, Mol. Gen. Genet., 210, 437 – 442, 1987)

-: el aumento de la resistencia a diversas situaciones de estrés, mediante la expresión de la zeaxantina epoxidasa (SEO et al, Trends Plant Sci., 7, 41 – 48, 2002), de la colina monooxigenasa (SHEN et al, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 17, 1 – 6, 2001), del producto del gen ERD1_ARATH (KIYOSUE et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 15, 196, 1214 – 1220, 1993), de la ferroquelatasa (CHOW et al, J. Biol. Chem., 31, 272, 27565 – 27571, 1997), de la ácido graso omega-3 desaturasa (IBA et al, Tanpakushitsu Kakusan Koso, 39, 2803 – 2813, 1994; MURAKAMI et al, Science 21, 287 (5452), 476 – 479, 2000), de la glutamina sintetasa (FUENTES et al, J. Exp. Bot., 52, 1071 – 1081, 2001)

-: la modificación del metabolismo de los plastidios, para aumentar la captura de energía lumínica (GAUBIER et al, Mol. Gen. Genet., 1, 249, 58 – 64, 1995), la capacidad de fotosíntesis y de crecimiento (MIYAGAWA et al, Nature Biotech., 19, 965 – 969, 2001), el contenido en carotenoides (HUGUENEY et al, Eur. J. Biochem., 1, 209, 399 – 407, 1992; MANN et al, Nature Biotech., 18, 888 – 892, 2000), o el contenido en diversas sustancias de interés, tales como el almidón (Solicitud PCT WO 00/11144), en aminoácidos esenciales (MUEHLBAUER et al, Plant Physiol.,106, 1303 – 1312, 1994), en provitamina A (RÖMER et al, Nature Biotech., 18, 666 – 669, 2000), en hormonas (JOYARD et al, Plant Physiol. 118, 715 – 723, 1998), etc.

-: la sobreexpresión y el direccionamiento cloroplásticos de proteínas que se pueden utilizar para la biorremediación

(detoxificación o descontaminación de suelos contaminados), tales como la ferritina (LOBREAUX et al, Biochem. J., 15, 288 (Pt 3), 931 – 939, 1992), proteínas de la familia de las fitoquelatinas (CAZALE y CLEMENS, FEBS 507, 215

– 219, 2001; TSUJI et al, BBRC 293, 653 – 659, 2002), etc.

Todos los péptidos de direccionamiento intraplastidial conocidos en la técnica anterior permiten importar una proteína al interior de los plastos a través de los sistemas de importación de membrana TOC y TIC, como se ha indicado anteriormente. Se ha constatado que la utilización de estos péptidos para el direccionamiento de proteínas de interés al interior del cloroplasto podría presentar el inconveniente de saturar estos sistemas de importación, especialmente en el caso en el que la construcción péptido de interés / proteína de interés está situada bajo el control de un promotor fuerte tal como el promotor 35S, al entrar en competición con las proteínas dirigidas de forma natural hacia el cloroplasto. Por ello se producen "fugas" que se traducen, al cabo de unos días, en la presencia de la proteína de interés en otros compartimentos subcelulares como el citoplasma.

Sería deseable disponer de péptidos de direccionamiento intraplastidial, que no dependiesen del sistema de importación TOC/TIC, y permitiesen por tanto evitar los inconvenientes anteriormente mencionados.

En trabajos previos dirigidos a identificar, con un enfoque proteómico, las proteínas de preparaciones de membranas de cloroplastos de espinaca, los inventores han identificado, entre otros, péptidos que tienen una similitud de secuencia significativa con una proteína putativa de 41 kDa de Arabidopsis (número de acceso TrEMBL Q9SV68) (SEIGNEURIN-BERNY et al, Plant. J. 19, 217 – 228, 1999; FERRO et al, Electrophoresis 21, 3517 – 3526, 2000). Las secuencias de nucleótidos que codifican para esta proteína putativa de Arabidopsis también se mencionan en las solicitudes PCT WO 02/10210 y EP 1033405.

Prosiguiendo con sus trabajos con el fin de caracterizar mejor la proteína de Arabidopsis, y de su homóloga en espinacas, los inventores han constatado que aunque, de manera sorprendente, se trata de proteínas sintetizadas en el citoplasma e importadas a la membrana interna del cloroplasto, su importación se llevaría a cabo sin la escisión de un péptido de direccionamiento; además, el análisis de secuencias de estas proteínas revela que no existe ninguna secuencia que posea las características de los péptidos de direccionamiento plastidiales conocidos.

Las proteínas de la familia representada por la proteína de Arabidopsis de 41 kDa, y la proteína homóloga en espinaca se designan en lo sucesivo con la denominación IE41. (IE por Inner Envelope según la nomenclatura utilizada convencionalmente para este sistema de membrana).

La secuencia de la proteína IE41 de Arabidopsis está representada en el listado de secuencias anexo con la referencia SEQ ID NO: 1; la secuencia del ADNc que codifica la proteína IE41 de espinacas está representada en el listado de secuencias anexo con la referencia SEQ ID NO: 2, y la secuencia del polipéptido correspondiente está representada en el listado de secuencias anexo con la referencia SEQ ID NO: 3.

Los inventores han investigado cuáles son las regiones de la proteína IE41 implicadas en su direccionamiento plastidial, y han identificado una región de 41 aminoácidos (residuos 60 a 100) esencial para este direccionamiento.

La secuencia de esta región está representada en el listado de secuencias anexo con la referencia SEQ ID NO: 4 para la proteína IE41 de Arabidopsis, y con la referencia SEQ ID NO: 5 para la proteína IE41 de espinaca.

Además han constatado que cuando los fragmentos de IE41 que contienen esta región están fusionados por el extremo N-terminal de una proteína heteróloga, la proteína recombinante que resulta de esta fusión estaba dirigida hacia los cloroplastos de forma similar a la proteína IE41 completa.

La presente invención tiene por objeto un polipéptido de direccionamiento intraplastidial caracterizado porque está constituido por:

-: un dominio A constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, preferentemente de al menos el 70 %, de manera ventajosa de al menos el 80 %, y de manera más preferente de al menos el 90 % de identidad, o de al menos el 65 %, preferentemente de al menos el 75 %, de manera ventajosa de al menos el 85 %, y de manera más preferente de al menos el 95 % de similitud, con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y al menos un dominio seleccionado entre:

-: un dominio B situado en el extremo N-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 49 a 59, preferentemente al menos los aminoácidos 39 a 59, de manera ventajosa al menos los aminoácidos 29 a 59, y de

manera más preferente al menos los aminoácidos 19 a 59, y de forma particularmente ventajosa al menos los aminoácidos 9 a 59 de dicho polipéptido, o bien constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, preferentemente de al menos el 70 %, de manera ventajosa de al menos el 80 %, y de manera más preferente de al menos el 90 %, o una similitud de al menos el 65 %, preferentemente de al menos el 75 %, de manera ventajosa de al menos el 85 %, y de manera más preferente de al menos el 95 %, con dicho fragmento;

-: un dominio C situado en el extremo C-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 101 a 111, preferentemente al menos los aminoácidos 101 a 121, de manera ventajosa al menos los aminoácidos 101 a 131, de manera más preferente al menos los aminoácidos 101 a 141, y como máximo los aminoácidos 101 a 151 de dicho polipéptido, o bien constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, preferentemente de al menos el 70 %, de manera ventajosa de al menos el 80 %, y de manera más preferente de al menos el 90 %, o una similitud de al menos el 65 %, preferentemente de al menos el 75 %, de manera ventajosa de al menos el 85 %, y de manera más preferente de al menos el 95 %, con dicho fragmento.

Los porcentajes de identidad o similitud mencionados en el presente documento se determinan con la ayuda del software BLASTp (ALTSCHUL et al, Nucleic Acids Res. 25, 3389 – 3402, 1997), utilizando los parámetros por defecto.

Los dominios A, B y/o C definidos anteriormente pueden proceder de una misma proteína IE41; también pueden proceder de proteínas IE41 de orígenes diferentes.

La presente invención también tiene por objeto cualquier polipéptido quimérico que resulte de la fusión de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la invención con un polipéptido heterólogo. Dicho polipéptido heterólogo puede ser cualquier polipéptido de interés que se desea introducir en los plastos. Preferentemente, el polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la invención está situado en el extremo N-terminal del péptido heterólogo. No obstante también puede estar situado en su interior, o en su extremo C-terminal.

La presente invención también tiene por objeto la utilización de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la invención para la importación de una proteína de interés al interior de los plastos, y de manera ventajosa, para el direccionamiento de dicha proteína hacia la membrana plastidial interna.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, dicho polipéptido de direccionamiento intraplastidial se utiliza para la importación de dicha proteína de interés al interior de los cloroplastos.

En particular, la presente invención tiene por objeto un procedimiento para la importación de una proteína de interés al interior de los plastos caracterizado porque comprende la expresión, en una célula vegetal que contiene dichos plastos, de un polipéptido quimérico que resulta de la fusión de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la invención con un polipéptido heterólogo.

La presente invención también tiene por objeto:

-: cualquier polinucleótido que codifica un polipéptido de direccionamiento intraplastidial o un polipéptido quimérico de acuerdo con la invención;

-: cualquier casete de expresión recombinante que comprenda un polinucleótido de acuerdo con la invención situado bajo el control de secuencias de regulación de la transcripción adecuadas (en particular, promotores y terminadores de la transcripción);

-: cualquier vector recombinante que resulte de la inserción, en un vector hospedador adecuado, de un polinucleótido

o de un casete de expresión de acuerdo con la invención.

La presente invención también tiene por objeto células hospedadoras que alberguen un polinucleótido, un casete de expresión, o un vector recombinante de acuerdo con la invención.

La presente invención también comprende plantas transgénicas genéticamente modificadas por un polinucleótido o un casete de expresión de acuerdo con la invención, así como los descendientes de estas plantas. La invención también comprende células y tejidos vegetales, así como los órganos o partes de plantas, incluyendo hojas, tallos, raíces, flores, frutos y/o semillas obtenidas a partir de estas plantas.

En la puesta en práctica de la presente invención se pueden utilizar las técnicas convencionales de construcción de vectores recombinantes, de transformación de células o de organismos hospedadores, y de producción de proteínas recombinantes.

La selección del vector hospedador, y de las secuencias de regulación de la expresión particularmente se llevará a cabo en función del procedimiento de transformación y de la planta hospedadora seleccionados, y/o del tipo de célula o de tejido en el que se desea obtener la expresión.

Se conocen muchos promotores que se pueden utilizar para la expresión en células vegetales. A modo de ejemplo, se puede seleccionar un promotor constitutivo, como el promotor 35S de CaMV o sus derivados, o el promotor de la actina o de la ubiquitina, etc. También se puede seleccionar un promotor inducible o un promotor específico de tejido, con el fin de producir el direccionamiento plastidial de la proteína de interés sólo en ciertas fases del desarrollo de la planta, en ciertas condiciones medioambientales, o en ciertos tejidos diana.

Por ejemplo, si se desea obtener preferentemente un direccionamiento de la proteína de interés hacia los cloroplastos, se expresará un polipéptido quimérico de acuerdo con la invención bajo el control de un promotor específico de tejidos u órganos ricos en plastos. A modo de ejemplo, los promotores del virus de la Chlorella que regulan la expresión génica de la adenina metiltransferasa (MITRA y HIGGINS, Plant Mol. Biol. 26, 85 – 93, 1994) o el del virus del mosaico de la yuca (VERDAGUER et al, Plant Mol. Biol. 37, 1055 – 1067, 1998) se expresan principalmente en los tejidos verdes. Los elementos reguladores del promotor del gen 2A11 del tomate permiten una expresión específica en los frutos (VAN HAAREN y HOUCK, Plant Mol. Biol. 17, 615 – 630, 1991), etc.

Son muy conocidos los procedimientos de transformación de células vegetales o de plantas completas: a modo de ejemplos no limitantes, se citará la transformación de protoplastos en presencia de polietilenglicol, mediante electroporación, utilización de una pistola de partículas, microinyección citoplasmática o nuclear, o la transformación a través de Agrobacterium.

La presente invención se puede poner en práctica en las aplicaciones habituales de los péptidos de direccionamiento hacia plastos, y especialmente en las aplicaciones mencionadas anteriormente, para actuar sobre diversas funciones plastidiales. Se trata en particular de la modificación de las funciones propias de la membrana interna de la envuelta, por ejemplo, la biosíntesis de pigmentos, de quinonas, de ácidos grasos, de vitaminas y de precursores de hormonas vegetales, pero también, de la importación de todos los iones y metabolitos hacia los plastos.

Las características de los péptidos de direccionamiento plastidiales de acuerdo con la invención, que son muy diferentes de las de los péptidos de direccionamiento plastidiales conocidos permiten suponer que los péptidos de direccionamiento de acuerdo con la invención utilizan un sistema de importación diferente de aquel que implica a las proteínas TOC y TIC.

Por lo tanto, las proteínas de interés dirigidas hacia los plastos con la ayuda de un péptido de direccionamiento de acuerdo con la invención no compiten con las proteínas dirigidas de manera natural hacia el plasto a través del sistema TOC y TIC, y no lo saturan. En particular, esto permitiría evitar las fugas hacia los otros compartimentos subcelulares, y conservar las proteínas de interés dentro del cloroplasto, incluso después de varios días de expresión. Esto también permitiría dirigir proteínas hacia los plastos, para las cuales no sería funcional la importación convencional por medio de una secuencia de direccionamiento escindible en el N-término y la utilización del sistema TIC/TOC.

La presente invención se comprenderá mejor con ayuda de la descripción siguiente, que se refiere a ejemplos no limitantes que ilustran la obtención y caracterización de péptidos de direccionamiento plastidiales de acuerdo con la invención y su puesta en práctica para la importación de proteínas heterólogas al interior de los cloroplastos.

EJEMPLO 1: CARACTERIZACIÓN Y CLONACIÓN DE LA PROTEÍNA IE41 DE ARABIDOPSIS THALIANA

En trabajos previos dirigidos a identificar las proteínas más hidrófobas de preparaciones de membranas de cloroplastos de espinaca (SEIGNEURIN-BERNY et al, Plant. J., 19, p. 217 – 228, 1999; FERRO et al, Electrophoresis, 21, 3517 – 3526, 2000) se han puesto de manifiesto varios péptidos que derivan de una proteína de 41 kDa que presenta una gran similitud de secuencia con una proteína putativa de Arabidopsis (número de acceso TrEMBL Q9SV68).

Sin embargo, el análisis de la secuencia primaria de esta proteína de 41 kDa con la ayuda de la aplicación TMPred (HOFMANN y STOFFEL, Biol. Chem. Hoppe-Seyler., 347, 166, 1993), no ha permitido detectar segmentos transmembrana que puedan asegurar el anclaje de la proteína en una bicapa lipídica.

Para confirmar la localización de esta proteína en la envuelta del cloroplasto, se clonó el ADNc correspondiente y la proteína recombinantes se sobre-expresó en E. coli con el fin de obtener anticuerpos policlonales dirigidos contra esta proteína.

Expresión en E. coli

El ADNc que codifica para la proteína de Arabidopsis de 41 kDa se obtuvo por PCR, a partir de una librería de ADNc de Arabidopsis, utilizando los siguientes cebadores:

TCA CATATG GCTGGAAAACTCAATGCAC (SEQ ID NO: 10)

que permite la introducción de un sitio de restricción NdeI (subrayado) en el extremo 5' del ADNc;

ATG GATCC AACGCTCTTATGGCTCGAC (SEQ ID NO: 11)

que permite la introducción de un sitio de restricción BamHI (subrayado) en el extremo 3' del ADNc.

El fragmento de amplificación se clonó en el plásmido pBluescript KS-. El inserto se digirió con las enzimas de restricción NdeI y BamHI, y se insertó en el vector de expresión pET-15b (Novagen).

El vector resultante permite la expresión de una proteína recombinante que tiene una cola de polihistidina (His-tag) en su extremo N-terminal [(His-tag)-P41].

Este vector se utiliza para transformar la cepa BLR(DE3) de bacterias E. coli.

Las bacterias recombinantes se cultivaron en 500 ml de medio LB que contiene 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C. Cuando la densidad óptica a 600 nm (DO600) del cultivo de E. coli alcanzó 0,6, se añadió IPTG (isopropil-�-Dgalactotiopiranósido) a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de la proteína de 41 kDa.

Después de 3 horas de cultivo, las células se centrifugaron durante 2 min a 13.000 rpm (Eppendorf 5415D).

El sedimento se resuspendió en 20 ml de tampón de lisis (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8) y las bacterias se lisaron por sonicación (sonicador OMRON, tipo STP.YM.220.VAC, 6 x 1 min, 0 °C).

Después de la sonicación, el extracto de proteínas total se analizó por SDS-PAGE al 12 %. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie (R-250, Biorad).

Los resultados se muestran en la Figura 1A: Leyenda para la Figura 1A:

pET-15b = bacterias transformadas con el plásmido no recombinante (control negativo)

pET-15b + inserto = bacterias transformadas con el plásmido recombinante

-: = Sin inducción con IPTG

+ = Inducción con IPTG

* = Banda correspondiente a la proteína recombinante de 41 kDa

Después de la inducción con IPTG, la proteína recombinante se expresa intensamente en las bacterias transformadas con el plásmido pET-15b que comprende el inserto de ADNc de Arabidopsis.

Solubilización de la proteína recombinante

El sedimento bacteriano se suspendió en 1 ml de tampón Tris/HCl 20 mM, pH 6,8 y se lisó por sonicación (sonicador OMRON, tipo STP.YM.220.VAC, 6 x 1 min, 0 °C).

Después de la sonicación, una primera centrifugación (2 min, 13.000 rpm) del extracto de proteínas total permite aislar las proteínas solubles del sobrenadante. Las proteínas insolubles del sedimento se suspendieron en 1 ml de un tampón que contiene detergente (Tris/HCl 20 mM a pH 6,8, 0,5 % de Triton X-100). Una segunda centrifugación permite aislar las proteínas de membrana solubilizadas por el Triton X-100. Las proteínas no solubilizadas se resuspendieron en Tris/HCl 20 mM, pH 6,8 y se analizaron. Las diferentes fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE al 12 % como se ha descrito anteriormente.

Los resultados se muestran en la Figura 1B: Leyenda para la Figura 1B: pET-15b = bacterias transformadas con el plásmido no recombinante (control negativo)

pET-15b + inserto = bacterias transformadas con el plásmido recombinante

S = proteínas solubles

D = proteínas solubilizadas en Triton X-100

1 = proteínas no solubilizadas en Triton X-100

* = Banda correspondiente a la proteína recombinante de 41 kDa

Observamos que la proteína recombinante (*) se encuentra en 2 fracciones distintas: una fracción hidrosoluble presente en el citosol de E. coli y una fracción insoluble, que no se solubiliza en Triton X-100, lo que indica que es probable que se agregue en forma de cuerpos de inclusión.

Purificación de la proteína recombinante

La fracción soluble de la proteína (His_tag)-P41 recombinante se purifica por cromatografía de afinidad.

Después de la centrifugación (10 min a 6.000 rpm, Eppendorf 5415D), el sobrenadante se aplicó a una columna de afinidad "His-bind resin" (NOVAGEN) de 2,5 ml cargada con 13 ml de tampón de carga (NiSO4 50 mM) y se equilibró con 5 ml de tampón de equilibrio (Tris/HCl 20 mM a pH 7,9, imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M).

La columna se lavó con 2 volúmenes que contienen imidazol 35 mM, y 2 volúmenes de tampón de lisis que contiene imidazol 60 mM (L2). La proteína se eluyó con 6 volúmenes de tampón de lisis que contiene imidazol 250 mM. Las diferentes fracciones se analizaron por SDS-PAGE al 12 % y se revelaron con azul de Coomassie.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Leyenda de la Figura 2:

C = sedimento bacteriano diluido en tampón de lisis (10 μl)

S = proteínas bacterianas solubles (10 μl)

P = proteínas no unidas (10 μl)

L, L1, L2 = lavados con el tampón de lisis (imidazol 35 y 60 mM) (15 μl)

Elución = fracción eluida en presencia de imidazol 250 mM.

Producción de anticuerpos policlonales

La proteína recombinante (His_tag)-P41 purificada, se desaló (columna Sephadex G25) y se almacenó a -80 °C.

Esta proteína recombinante se utiliza para inmunizar conejos con el fin de producir anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína de 41 kDa de Arabidopsis.

EJEMPLO 2: LOCALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DE 41 KDA EN LOS CLOROPLASTOS

Durante el procedimiento de purificación, la proteína de 41 kDa se comporta como una proteína hidrosoluble y débilmente hidrófoba, lo que plantea la cuestión de su asociación eficaz con la envuelta del cloroplasto.

Su localización subcelular se ha verificado mediante el análisis de las diferentes fracciones del cloroplasto.

Se obtuvieron cloroplastos en bruto a partir de 3 – 4 kg de hojas de espinaca (Spinacia oleracea L.) y se purificaron por centrifugación isopícnica en gradiente de Percoll (DOUCE y JOYARD, Methods in chloroplast Molecular Biology. Edelman, M., Hallick, R. y Chua, N.-H., eds. (Amsterdam: Elsevier Science Publishers BV), 239 – 256, 1982). En esta etapa, se añadieron inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM y ácido aminocaproico 0,5 mM) para evitar la degradación de las proteínas. Los cloroplastos purificados se lisaron en medio hipotónico, y las membranas de la envuelta se purificaron a partir del lisado por centrifugación en un gradiente de sacarosa (DOUCE Y JOYARD, 1982, véase más arriba). Se obtuvieron subfracciones de la envuelta enriquecidas respectivamente en las membranas externas e internas de acuerdo con el protocolo descrito por BLOCK et al (J. Biol. Chem., 258, 13273

– 13280, 1983).

Todas las etapas anteriores se llevan a cabo entre 0 y 5 °C. Las fracciones obtenidas se almacenaron en nitrógeno líquido en MOPS-NaOH 50 mM, pH 7,8, en presencia de inhibidores de proteasas (benzamidina 1 mM y ácido aminocaproico 0,5 mM).

Análisis de las fracciones del cloroplasto

El análisis por SDS-PAGE de los cloroplastos totales, o de sus fracciones de membranas de la envuelta, estroma, membranas de los tilacoides (15 μg), así como de sub-fracciones de la envuelta de los cloroplastos (15 μg) se realizaron como se describe por CHUA (Methods Enzymol., 69, 434 – 436, 1980). Los geles de resolución y de concentración (12 – 15 % de acrilamida), como tampón de migración, contienen el 0,1 % de SDS. Los péptidos se revelan con azul de Coomassie (MANIATIS et al, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) o con nitrato de plata (MERRIL et al, Anal. Biochem., 110, 201 – 207, 1981).

Para los análisis de Western blot, se detectó la proteína de 41 kDa usando anticuerpos policlonales marcados con fosfatasa alcalina y dirigidos contra la proteína recombinante de Arabidopsis producida como se ha descrito en el

Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Figura 3A. Leyenda de la Figura 3A:

C = proteínas del cloroplasto

E = proteínas de membrana de la envuelta

S = proteínas del estroma

T = proteínas de las membranas de los tilacoides

Estos resultados muestran que la proteína de 41 kDa se asocia únicamente con la envuelta del cloroplasto y no se detecta ni en el estroma ni en los tilacoides.

Los cloroplastos intactos purificados están desprovistos de proteínas citosólicas que puedan contaminar la preparación (DOUCE y JOYARD, 1980, véase más arriba). Sin embargo, la proteína de 41 kDa podría interactuar específicamente con la membrana externa de la envuelta del cloroplasto y así se podría purificar simultáneamente con las preparaciones de la envuelta. Para descartar esta posibilidad, se trataron 20 μg de envuelta derivada de cloroplastos intactos con termolisina de Bacillus thermoproteolyticus (0, 20, 50 y 100 μg/ml) con el fin de digerir los polipéptidos localizados en la superficie externa de la membrana externa de la envuelta (JOYARD et al, J. Biol. Chem., 258, 10000 – 10006, 1983). A modo de control, las proteínas de la envuelta solubilizadas se sometieron al mismo tratamiento proteolítico.

La presencia de la proteína de 41 kDa se detectó por Western blot como se ha descrito anteriormente.

Los resultados se muestran en las Figuras 3B y 3C. Leyenda de las figuras 3B y 3C:

0 = ausencia de termolisina 20 = termolisina a 20 μg/ml 50 = termolisina a 50 μg/ml 100 = termolisina a 100 μg/ml

La proteína de 41 kDa no se ve afectada por el tratamiento con la termolisina (Figura 3B), mientras que el mismo procesamiento proteolítico realizado en proteínas de la envuelta solubilizadas muestran la sensibilidad de la proteína de 41 kDa al tratamiento con termolisina (Figura 3C). Este resultado descarta la hipótesis de que la proteína de 41 kDa esté localizada en la superficie externa de la membrana externa. De hecho, la proteína de 41 kDa no es una proteína del citosol que contamine preparaciones de la envuelta del cloroplasto.

Se utilizan subfracciones de la envuelta enriquecidas respectivamente en las membranas externas e internas para precisar la sub-localización de la proteína de 41 kDa en la membrana de la envuelta del cloroplasto. La naturaleza de estas subfracciones de la envuelta se confirmó mediante el uso de los marcadores IE18 y OEP24, que son respectivamente proteínas intrínsecas de la membrana interna y externa de la envuelta del cloroplasto. Las proteínas IE18 y OEP24 se detectan utilizando anticuerpos policlonales dirigidos específicamente contra cada una de estas proteínas.

Los resultados se muestran en la Figura 3D. Leyenda de la Figura 3D:

E = proteínas de las membranas de la envuelta

OM = proteínas de la membrana externa

IM = proteínas de la membrana interna

La proteína de 41 kDa se encuentra, al igual que la proteína IE18, únicamente en las preparaciones de las envueltas del cloroplasto enriquecidas en la membrana interna.

Todos los resultados representados en las Figuras 3A – 3D muestran que la proteína de 41 kDa está localizada en la membrana interna de la envuelta del cloroplasto.

De acuerdo con la nomenclatura convencional, esta proteína de la envuelta interna, que tiene una masa teórica mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de 41 kDa, se denomina IE41 (por "Inner Envelope Protein of 41 kDa").

Análisis de las interacciones entre la proteína IE41 y la membrana interna de la envuelta del cloroplasto

Para analizar con más precisión la forma de interaccionar de la proteína IE41 con la membrana interna de los cloroplastos, se sometieron a prueba diferentes hipótesis:

1) La proteína IE41 es una proteína soluble localizada en el espacio intermembrana situado entre las membranas externa e interna de la envuelta del cloroplasto. Esta proteína se purificaría simultáneamente con las preparaciones de la envuelta, y secuestrada en las vesículas de la envuelta. En este caso, la sonicación de las vesículas de la envuelta permitiría la liberación de IE41.

Para someter a prueba esta primera hipótesis, se solubilizaron proteínas de la envuelta (500 μg) en MOPS 50 mM, pH 7,8 (500 μl). Las vesículas de la envuelta se sometieron a sonicación durante 10 segundos y se centrifugaron (20 min a 72.000 g, Beckman L2 65B, rotor SW28) para separar las proteínas solubles y de membrana. Cada fracción (20 μl) se analizó por SDS-PAGE al 12 % (revelado: azul de Coomassie) y Western blot.

Los resultados se muestran en la Figura 4A. Leyenda de la Figura 4A:

-: = Sin sonicación

+ = Sonicación S = proteínas solubles I = proteínas de membrana

Los análisis por SDS-PAGE y Western blot de las fracciones tratadas de la envuelta muestran que la proteína IE41 no se solubiliza después de la sonicación de las vesículas de la envuelta. Por contra, las proteínas principales solubles del estroma (RbcL) que quedan secuestradas en las vesículas de la envuelta, y que se sabe que contaminan las fracciones de la envuelta, se solubilizan con este tratamiento. Esto demuestra que la proteína IE41 ni es una proteína soluble del espacio intermembrana, ni una proteína soluble del estroma que contamina la fracción purificada de la envuelta.

2) La proteína IE41 puede estar unida a la membrana interna:

-: mediante el anclaje a la bicapa lipídica o mediante su inserción parcial en la misma; en este caso, sólo el uso de detergente puede permitir la solubilización de la proteína IE41;

-: mediante interacciones electrostáticas con una o más proteínas de membrana o con la superficie polar de la bicapa lipídica; en este caso, estas interacciones se pueden romper, y la proteína IE41 se puede solubilizar, mediante un tratamiento alcalino o con elevadas concentraciones salinas.

Para determinar el tipo de interacciones implicadas en la unión de IE41 con la membrana interna, se llevaron a cabo los siguientes experimentos:

a) solubilización por Triton X-100:

Se diluyeron vesículas de la envuelta (0,8 mg) en 1 ml de MOPS 50 mM, pH 7,8 que contiene 0,05, 0,1 ó 0,2 % (v/v) de Triton X-100. Después de incubar durante 30 min a 4 °C, la mezcla se centrifugó para separar las proteínas solubles y de membrana. Todas las fracciones (20 μl) se analizaron mediante SDS-PAGE al 12 % (revelado: azul de Coomassie) y Western blot.

Los resultados se muestran en la Figura 4C. Leyenda de la Figura 4C:

Mix = vesículas de la envuelta purificadas

M = proteínas de membrana de la envuelta

S = proteínas solubles de la envuelta

Estos resultados muestran que la proteína IE41 se puede solubilizar completamente con concentraciones de Triton X-100 (0,2 %), muy inferiores a las necesarias (aproximadamente del 2 %) para solubilizar proteínas intrínsecas.

b) solubilización por tratamiento alcalino o tratamiento con una disolución salina.

Se incubaron vesículas de la envuelta purificadas (500 μg) durante 30 min a 4 °C en diferentes medios (500 μl):

1) MOPS 10 mM, pH 7,8 + NaCl 0,5 M;

2) MOPS 10 mM, pH 7,8 + KI 0,5 M;

3) Na2CO3 0,1 M, pH 11;

4) NaOH 0,1 N,

y a continuación se sometieron a sonicación y se centrifugaron como se ha descrito anteriormente con el fin de separar las proteínas solubles y de membrana.

Todas las fracciones se analizaron (20 μl) mediante SDS-PAGE al 12 % (revelado: azul de Coomassie) y Western blot (detección con anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína IE41 de Arabidopsis (dilución 1/5.000) o dirigidos contra la proteína IE18 (dilución 1/5000).

Los resultados se muestran en la Figura 4B. Leyenda de la Figura 4B:

+ = sonicación (10 segundos) NaCl 0,5 M = tratamiento 1 KI 0,5 M = tratamiento 2 Na2CO3 0,1 M, pH 11 = tratamiento 3 NaOH 0,1 N = tratamiento 4 S = fracción de proteínas solubles I = fracción de proteínas insolubles

Estos resultados muestran que la proteína IE41 se solubiliza al menos parcialmente con los tratamientos salinos (KI, NaCl) o alcalinos moderados (Na2CO3), que no tienen ningún efecto sobre la proteína intrínseca IE18, esta última que sólo se puede solubilizar mediante un tratamiento alcalino fuerte (NaOH).

Los resultados presentados en las figuras 4A, 4B y 4C muestran que la proteína IE41 es una proteína extrínseca cuya unión a la membrana interna de la envuelta del cloroplasto implica interacciones electrostáticas.

EJEMPLO 3: PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA IE41 DE ESPINACA

Sorprendentemente, la proteína IE41 purificada a partir de cloroplastos de espinaca y la proteína recombinante de Arabidopsis tienen un tamaño similar en SDS-PAGE y Western blot, lo que sugiere la posibilidad de que IE41 pueda ser dirigida a la membrana interna de la envuelta sin necesidad de la escisión de una secuencia de importación Nterminal.

Para probar esta hipótesis, la proteína IE41 presente en la envuelta de los cloroplastos de espinaca se purificó con el fin de secuenciar y comparar su secuencia con la del ADNc correspondiente.

Inmunopurificación de la proteína IE41 de espinaca

Se disolvieron las proteínas de la envuelta de cloroplastos (1 mg) en 1 ml de tampón Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CHAPS 6 mM y se centrifugó (20 min, 72.000 g, Beckman L2 65B, rotor SW28). Las proteínas solubles se incubaron durante 1 hora a 4 °C con 33 μl de suero policlonal dirigido contra la proteína recombinante IE41 de Arabidopsis. A continuación se añadieron 50 μg de agarosa-proteína A (Boehringer) y la mezcla se incubó durante 3 horas a 4 °C. Después de tres lavados sucesivos por centrifugación (Eppendorf 5415D, 12.000 rpm, 20 min, 4 °C) y la

resuspensión del sedimento en 1 ml de tampón de solubilización (MOPS 20 mM, NaCl 150 mM, CHAPS 6 mM, pH 7,8), se añadió un exceso (50 μg) de la proteína recombinante (His-tag)-IE41 en 200 μl de tampón de solubilización. La mezcla se incubó durante 1 hora a 4 °C, y se centrifugó durante 20 min a 12.000 rpm (Eppendorf 5415D). El sobrenadante se incubó durante 1 h con la resina Ni-NTA (QIAGEN) previamente equilibrada en tampón de solubilización, con el fin de eliminar la mayor parte de la proteína recombinante (His-tag)-IE41.

Cada fracción (20 μl) se analizó por SDS-PAGE al 12 % (revelado con nitrato de plata) y Western blot (usando los anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra IE41 descritos en el Ejemplo 1).

Los resultados se muestran en la Figura 5. Leyenda de la Figura 5:

A: análisis por SDS-PAGE;

B: Western blot; Mix = proteínas de la envuelta solubilizadas; C = proteínas insolubles; S = proteínas solubles; L1, L2, L3 = fracciones recogidas durante los tres lavados sucesivos; E1 = fracción eliminada por incubación con la resina Ni-NTA; E2 = proteína IE41 de espinaca purificada (So) + (His-tag)-IE41.

La fracción E2 que comprende la proteína IE41 natural de espinaca purificada (So) sigue estando contaminada por la proteína (His-tag)-IE41 recombinante de Arabidopsis.

La diferencia de tamaño entre estas dos proteínas corresponde a la cola de polihistidina (His-tag) presente en el extremo N-terminal de la proteína recombinante.

EJEMPLO 4: OBTENCIÓN DEL ADNc QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA IE41 DE ESPINACA

La secuenciación parcial de la proteína IE41 de espinaca eluida a partir del gel de electroforesis permitió obtener 9 secuencias peptídicas diferentes. Estas secuencias se utilizaron para definir los cebadores degenerados que han permitido aislar el ADNc que codifica la proteína IE41.

La secuencia completa de este ADNc (SEQ ID NO: 2), así como la secuencia polipeptídica deducida (SEQ ID NO: 3) se muestran en la Figura 6. El codón de iniciación de la traducción ATG está indicado en negrita y el codón de detención TAA está subrayado. Las 9 secuencias peptídicas obtenidas por secuenciación directa de la proteína IE41 de espinaca están resaltadas en gris. La correspondencia entre los péptidos obtenidos con la secuencia deducida del ADNc de la proteína IE41 de espinaca, particularmente en la región N-terminal, así como la presencia de un codón de detención en la posición 3' de la metionina de iniciación y en el mismo marco de lectura, demuestran que el ADNc predicho está completo y que esta proteína no está sometida a maduración post-traduccional durante su direccionamiento hacia la membrana interna de la envuelta del cloroplasto.

La proteína IE41 de espinaca presenta una identidad del 75,1 % y una similitud del 88,8 % con la proteína IE41 de Arabidopsis. Esta gran similitud, y el hecho de que Arabidopsis contiene un sólo gen ie41 por genoma haploide, permiten llegar a la conclusión de que estas proteínas están codificadas por los genes ortólogos de Arabidopsis y de espinaca.

Las proteínas IE41 de Arabidopsis y de espinaca se alinearon con proteínas homólogas de bacterias, de levaduras y de animales.

Los resultados se muestran en la Figura 7.

Arabidopsis thaliana: IE41 ATH (SEQ ID NO: 1) Espinaca: IE41 SOL (SEQ ID NO: 3)

Proteínas homólogas:

Escherichia coli: QORECOLI (SEQ ID NO: 6),

Saccharomyces cerevisiae: QORYEAST (SEQ ID NO: 7),

Cavia porcellus: QORCAVPO (SEQ ID NO: 8),

Ratón: QORMOUSE (SEQ ID NO: 9).

Los restos conservados en las 6 secuencias peptídicas están resaltados en color gris oscuro. Los restos conservados en la secuencia de IE41 y en al menos otra secuencia de proteínas homólogas están resaltados en gris. Las similitudes entre los restos se basan en los siguientes grupos: ASPTG, ILMV, KRH, NQ, DE, YWF y C.

Las búsquedas de homología indican que la proteína IE41 pertenece a la superfamilia de las deshidrogenasas, y más particularmente al grupo de las quinonas oxidorreductasas de tipo �-cristalino (JÖRNVALL et al, FEBS 3, 240 – 244, 1993). Además, la comparación de secuencias entre las proteínas IE41 y otras proteínas de la misma familia revela que los primeros 50 restos de la región N-terminal de estas proteínas están altamente conservados en bacterias, plantas y animales. Esta observación sugiere que la región N-terminal de la proteína IE41 de plantas no estaría implicada en el direccionamiento hacia el cloroplasto, y lo más probable es que estuviera conservada a causa de la presión selectiva ejercida durante el transcurso de la evolución sobre el dominio catalítico de la proteína.

EJEMPLO 5: ANÁLISIS DEL DIRECCIONAMIENTO PLASTIDIAL DE LA PROTEÍNA IE41 DE ARABIDOPSIS EN CÉLULAS DE ARABIDOPSIS Y DE TABACO

Para definir el dominio esencial para la importación de la proteína IE41, se expresan diferentes construcciones que codifican formas truncadas de esta proteína fusionadas a la GFP en células de Arabidopsis y de tabaco.

Construcción de vectores de expresión

Se han descrito anteriormente por CHIU et al (Curr. Biol., 6, 325 – 330, 1996) el plásmido [350-sGFP(S65T) usado para estas construcciones, que comprende la secuencia codificante de la GFP bajo el control del promotor 35S, y el plásmido [350-TP-sGFP(S65T)], que comprende la secuencia que codifica el péptido de direccionamiento (TP) de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, fusionada a la secuencia que codifica la GFP.

La secuencia que codifica la proteína IE41 de Arabidopsis se amplifica por PCR usando los siguientes dos cebadores:

XhoI-N-ter CCTCTCGAGATGGCTGGAAAACTCATGCAC (SEQ ID NO: 12), y NcoI-C-ter CAACCCATGGATGGCTCGACAATGATCTTC (SEQ ID NO: 13), que introducen respectivamente un sitio XhoI y un sitio NcoI (subrayados).

El producto de la PCR se clonó con los extremos romos en el vector pBluescript KS (Stratagene). El fragmento XhoI-NcoI escindido del plásmido así obtenido se insertó en el plásmido 350-sGFP(S65T) previamente digerido con SalI-NcoI para crear el vector 350-IE41-sGFP(S65T), que comprende la región codificante de la proteína IE41 de Arabidopsis fusionada a la GFP. Se utilizó un protocolo similar para otras construcciones:

* La secuencia que codifica la proteína IE41 de Arabidopsis desprovista de los primeros 31 aminoácidos se obtiene mediante amplificación por PCR usando los siguientes dos cebadores:

SalI-N-ter CGGTTGTCGACATGAAGAGTAATGAGGTTTGCCTG (SEQ ID NO: 14)

NcoI-C-ter CAACCCATGGATGGCTCGACAATGATCTTC (SEQ ID NO: 13).

El plásmido 350-L(1-31)IE41-sGFP(S65T) se obtiene mediante la inserción de esta secuencia en el plásmido 350-sGFP(S65T).

* La secuencia que codifica la proteína IE41 de Arabidopsis desprovista de los primeros 59 aminoácidos se amplifica por PCR usando los siguientes dos cebadores:

SalI-N-ter GAATGGTCGACATGTTTCTGCCCCGCAAGTTC (SEQ ID NO: 15), y NcoI-C-ter CAACCCATGGATGGCTCGACAATGATCTTC (SEQ ID NO: 13).

El plásmido 350-L(1-59)IE41-sGFP(S65T) se obtiene mediante la inserción de esta secuencia en el plásmido 350-sGFP(S65T).

* La secuencia que codifica la proteína IE41 de Arabidopsis desprovista de los primeros 99 aminoácidos se amplifica por PCR usando los siguientes dos cebadores:

SalI-N-ter GGTTGTCGACATGCTAGGTGGAGGTGGACTTG (SEQ ID NO: 16) NcoI-C-ter CAACCCATGGATGGCTCGACAATGATCTTC (SEQ ID NO: 13).

El plásmido 350-L(1-99)IE41-sGFP(S65T) se obtiene mediante la inserción de esta secuencia en el plásmido 350-sGFP(S65T).

* La secuencia que codifica los aminoácidos 6-100 de la proteína IE41 de Arabidopsis se amplifica por PCR usando los siguientes dos cebadores:

XhoI-N-ter CCTCTCGAGATGGCTGGAAAAACTCATGCAC (SEQ ID NO: 17)

NcoI-C-ter ACCCATGGCTAGATGGCTAAGAACCGCTAC (SEQ ID NO: 18).

El cebador SEQ ID NO: 17 comprende un nucleótido adicional con respecto al cebador SEQ ID NO: 15, que crea un desplazamiento en el marco de lectura en el producto de amplificación, cuya traducción se inicia en el codón ATG correspondiente a la metionina en posición 6 de la proteína IE41.

El plásmido 350-(6-100)IE41-sGFP(S65T) se obtiene mediante la inserción de esta secuencia en el plásmido 350-sGFP(S65T).

* La secuencia que codifica los aminoácidos 60-100 de la proteína IE41 de Arabidopsis se amplifica por PCR usando los siguientes dos cebadores:

SalI-N-ter GAATGGTCGACATGTTTCTGCCCCGCAAGTTC (SEQ ID NO: 15)

NcoI-C-ter ACCCATGGCTAGATGGCTAAGAACCGCTAC (SEQ ID NO: 18).

El plásmido 350-(60-100)IE41-sGFP(S65T) se obtiene mediante la inserción de esta secuencia en el plásmido 350-sGFP(S65T).

Estas distintas construcciones se muestran en la Figura 8.

Leyenda de la Figura 8:

IE41 = plásmido 350-IE41-sGFP(S65T)

L(1-31)IE41 = plásmido 350-L(1-31)IE41-sGFP(S65T)

L(1-59)IE41 = plásmido 350-L(1-59)IE41-sGFP(S65T)

L(1-99)IE41 = plásmido 350-L(1-99)IE41-sGFP(S65T)

(6-100)IE41 = plásmido 350-(6-100)IE41-sGFP(S65T)

(60-100)IE41 = plásmido 350-(60-100)IE41-sGFP(S65T)

Bombardeo de células de Arabidopsis y de tabaco

Las células de Arabidopsis se cultivan con luz durante 3 días en medio B5 de Gamborg (Sigma, pH 5,8) suplementado con sacarosa al 1,5 % y ANA 1 μM (ácido naftalenacético). Se transfirieron 15 ml de suspensión de células (correspondiente a 0,5 g aproximadamente) a placas Petri que contenían el mismo medio de crecimiento suplementado con Bacto-agar al 0,8 % y se incubaron durante 18 – 36 h a la luz.

Se cultivaron células BY2 de tabaco durante 5 días a 27 °C en medio de Murashige y Skoog (medio MS, Duchefa, pH 5,8) suplementado con sacarosa al 3 %, 0,2 % de KH2PO4, 0,2 % de mioinositol, 2.4D 1 μM (ácido 2,4diclorofenoxiacético) y tiamina 3 μM. Se transfirieron 2,5 ml de suspensión de células (correspondiente a 0,3 g aproximadamente) a placas Petri que contenían el mismo medio de crecimiento suplementado con Bacto-agar al 1 % y se pusieron a 27 °C durante 18 – 24 h.

Los plásmidos que contienen las construcciones a probar utilizadas para el bombardeo tisular se preparan usando el "QIAfilter Plasmid Midi Kit" (Qiagen, Alemania).

El plásmido [350-sGFP(S65T)] (GFP) y el plásmido [350-TP-sGFP(S65T)] (TP-GFP) se utilizan respectivamente como control negativo y control positivo.

Los plásmidos (1 μg) se introdujeron en las células utilizando una pistola de partículas neumática (PDS-1000/He, BioRad). Las condiciones de bombardeo son las siguientes: se utilizó una presión de helio de 1.350 psi, discos de ruptura de 1.100 psi (Biorad); una distancia al objetivo de 10 cm; y microportas de oro de 1 μm (Biorad). Después del bombardeo, las células se incubaron en placas de Petri durante 18 – 36 h (a la luz para las células de Arabidopsis), y a continuación se transfirieron a portaobjetos de vidrio antes de la microscopía de fluorescencia.

Microscopía de fluorescencia

La localización de la GFP y de los péptidos de fusión a la GFP se analizó en las células transformadas por microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2 y una cámara digital CCD (Hamamatsu). Los juegos de filtros utilizados son: Juego de filtros Zeiss 13, 488013 – 0000 (excitador BP 470/20, divisor de haz FT 493, emisor BP 505 – 530) y juego de filtros Zeiss 15, 488015 – 0000 (excitador BP 546/12, divisor de haz FT 580, emisor LP 590) para la GFP y la autofluorescencia de las clorofilas, respectivamente.

En estas condiciones, la presencia de clorofila (específicamente localizada en los cloroplastos) y la localización de la GFP en la célula se visualizan por una fluorescencia intensa.

En las células de Arabidopsis transformadas con las construcciones GFP, L(1-99)IE41, y (60-100)IE41, la fluorescencia de la GFP es difusa y localizada en el citosol y el núcleo, no se observa la co-localización con la clorofila.

En las células de Arabidopsis transformadas con las construcciones IE41, L(1-31)IE41, L(1-59)IE41, (6-100)IE41, y con el control positivo de localización TP-GFP, por el contrario se observa una co-localización, en los cloroplastos, entre la fluorescencia de GFP y la autofluorescencia de la clorofila.

Los resultados son similares en las células BY2 del tabaco no clorofílicas: los marcajes fluorescentes observados con las construcciones IE41, L(1-59)IE41 y (6-100)IE41, y con el control positivo de localización TP-GFP, corresponden a una localización plastidial; sin embargo, los marcajes fluorescentes observados con las construcciones GFP, L(1-99)IE41, y (60-100)IE41 corresponden a la localización citosólica y nuclear.

Estos experimentos muestran que el direccionamiento también es eficaz en plástidos no clorofílicos.

Todos los resultados anteriores demuestran que:

-: la proteína IE41 completa fusionada a la GFP está dirigida hacia el cloroplasto;

-: los 59 restos localizados en el extremo N-terminal no son esenciales para la importación;

-: los 99 restos localizados en la región N-terminal contienen una región esencial para la importación;

-: una secuencia de 94 restos, que corresponde a los aminoácidos N-terminales 6-100 es suficiente para catalizar la importación, los 223 restos (101-323) C-terminales no son esenciales para la importación.

La secuencia interna de 40 aminoácidos que se extiende entre los restos 60 y 100, corresponde al dominio esencial para la importación. Sin embargo, este dominio, que debe estar presente para dirigir la proteína a los plástidos, no es suficiente para un buen direccionamiento.

EJEMPLO 6: ANÁLISIS EN LA PLANTA DEL DIRECCIONAMIENTO PLASTIDIAL DE LA PROTEÍNA IE41

Los plásmidos 350-IE41-sGFP(S65T), 350-L(1-31)IE41-sGFP(S65T), 350-L(1-59)IE41-sGFP(S65T), 350-L(199)IE41-sGFP(S65T), 350-(6-100)IE41-sGFP(S65T), y 350-(60-100)IE41-sGFP(S65T), así como los plásmidos control 350-sGFP(S65T) y 350-TP-sGFP(S65T), se digirieron con EcoRI/HindIII para recuperar los casetes de expresión.

Éstos se insertaron en el plásmido binario pEL103 (derivado del plásmido pBI121 (AF485783), que contiene un gen de resistencia a la kanamicina), y el plásmido resultante se utilizó para transformar la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens mediante electroporación. Las bacterias transformadas se utilizaron para transformar plantas de Arabidopsis WS mediante la técnica de "inmersión floral" (The Plant Journal 1998; 16: 735 – 743). Las plantas transgénicas se seleccionaron en base a su resistencia a la kanamicina.

Para analizar la expresión de las proteínas de fusión en las plantas transgénicas, se extrajeron las proteínas totales a partir de 10 mg de hojas de cada una de las plantas sometidas a ensayo, y se disolvieron en el tampón siguiente: pirofosfato tetrasódico (13,4 g/l), Tris-HCl pH 6,8 (50 mM), SDS (1 %).

El extracto de proteínas se analizó por SDS-PAGE (12 % de acrilamida) y transferencia de Western utilizando un anticuerpo dirigido contra GFP (anticuerpo 2A5 (Euromedex) a 1/4000e en TBST/ 5% de leche; anticuerpo secundario: IgG dirigido contra ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Promega) diluido a 1/10000 e en TBS-Triton),

o anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra IE41 descritos en el Ejemplo 1 (a 1/5000 e en TBS-Triton/5 % de leche; anticuerpo secundario IgG dirigido contra conejo conjugado con fosfatasa alcalina (Promega) diluido a 1/10000 e en tampón TBS-Triton).

Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 9;

Leyenda de la Figura 9:

-: A: análisis por SDS-PAGE;

-: B: transferencia de Western con anticuerpos dirigidos contra GFP: las flechas negras indican la presencia de la proteína GFP en las fusiones expresadas en Arabidopsis;

-: C: transferencia de Western con un anticuerpo dirigido contra IE41: las flechas negras indican la presencia de la proteína IE41 en las fusiones expresadas en Arabidopsis, el diamante blanco indica la posición de la proteína IE41 natural presente en todos los extractos;

-: WT = planta no transformada;

-: M = marcadores de pesos moleculares;

-: GFP = plásmido 350-sGFP(S65T);

-: TP GFP = plásmido 350-TP-sGFP(S65T);

-: IE41 GFP = plásmido 350-IE41-sGFP(S65T);

-: L(1-59)IE41 GFP = plásmido 350-L(1-59)IE41-sGFP(S65T);

-: L(1-99)IE41 GFP = plásmido 350-L(1-99)IE41-sGFP(S65T);

-: (6-100)IE41 GFP = plásmido 350-(6-100)IE41-sGFP(S65T);

-: (60-100)IE41 GFP = plásmido 350-(60-100)IE41-sGFP(S65T).

Estos resultados muestran que las proteínas de fusión se expresan en todas las plantas transformadas.

La localización subcelular de las proteínas expresadas por las diferentes construcciones se visualizó por microscopía de fluorescencia como se describe en el Ejemplo 5 anterior.

Los resultados se muestran en la Figura 10; leyenda de la Figura 10:

-: GFP = plásmido 350-sGFP(S65T);

-TP-RBCS GFP = plásmido 350-TP-sGFP(S65T);

-: IE41 GFP = plásmido 350-IE41-sGFP(S65T);

-: (6-100)IE41 GFP = plásmido 350-(6-100)IE41-sGFP(S65T);

Sucede que en las condiciones de expresión utilizadas anteriormente, es la región N-terminal de la proteína IE41 (restos 6-100) la que confiere una mayor especificidad de direccionamiento al plástido. De hecho, la construcción (6100) IE41-GFP, que sólo expresa esta región, permite el direccionamiento sistemático de toda la fluorescencia hacia los plástidos. Por contra, la proteína IE41 completa (construcción IE41-GFP) induce un direccionamiento plastidial menos específico. En estas condiciones, la proteína IE41 también parece dirigirse a otros compartimentos intracelulares.

LISTADO DE SECUENCIAS

<: 110 > GENOPLANTE-VALOR MIRAS, Stéphane SALVI, Daniel ROLLAND, Norbert JOYARD, Jacques FERRO, Myriam GARIN, Jérome GRUNWALD, Didier

<: 120 > PEPTIDO DE DIRECCIONAMIENTO PLASTIDIAL

<: 130 > MJPbv1516/7

<: 150 > FR 02 07729

<: 151 > 2002-06-21

<: 160 > 18

<: 170 > PatentIn version 3.1

<: 210 > 1

<: 211 > 329

<: 212 > PRT

< 213 > Arabidopsis thaliana

<: 400 > 1

<: 210 > 2

<: 400 > 2

<: 210 > 4

< 211 > 41

<: 210 > 6

<: 212 > ADN

<: 213 > Spinacia oleracea

<: 211 > 329

<: 212 > PRT

<: 213 > Spinacia oleracea

<: 400 > 3

<: 212 > PRT

<: 213 > Arabidopsis thaliana

<: 210 > 5

<: 211 > 41

<: 212 > PRT

<: 211 > 327

<: 212 > PRT

<: 213 > Escherichia coli

<: 400 > 6

<: 210 > 7

<: 400 > 7

<: 210 > 8

<: 400 > 8

<: 210 > 9

<: 400 > 9

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 10 tcacatatgg ctggaaaact caatgcac 28

<: 210 > 11

<: 211 > 27

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 11 arggatccaa cgctcttatg gctcgac 27

<: 210 > 12

<: 211 > 30

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 12 cctctcgaga tggctggaaa actcatgcac 30

<: 210 > 13

<: 211 > 30

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 13 caacccatgg atggctcgac aatgatcttc 30

<: 210 > 14

<: 211 > 35

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 14 cggttgtcga catgaagagt aatgaggttt gccth 35

<: 210 > 15

<: 211 > 32

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 223 > Cebador de la PCR

<: 400 > 15 gaatggtcga catgtttctg ccccgcaagt tc 32

<: 210 > 16

<: 211 > 32

<: 212 > ADN

<: 213 > Secuencia artificial

<: 220 >

<: 212 > PRT

<: 212 > PRT

<: 213 > Cavia porcellus

<: 212 > PRT

<: 213 > Mus musculus

<: 211 > 28

< 223 > Cebador de la PCR

< 400 > 16 ggttgtcgac atgctaggtg gaggtggact tg 32

< 210 > 17 5 < 211 > 31

< 212 > ADN

< 213 > Secuencia artificial

< 220 >

< 223 > Cebador de la PCR10 < 400 > 17 cctctcgaga tggctggaaa aactcatgca c 31

< 210 > 18

< 211 > 30

< 212 > ADN 15 < 213 > Secuencia artificial

< 220 >

< 223 > Cebador de la PCR

< 400 > 18 acccatggct agatggctaa gaaccgctac 30 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido de direccionamiento intraplastidial, caracterizado porque está constituido por:

-

un dominio A constituido por un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5;

y al menos un dominio seleccionado entre:

-

un dominio B situado en el extremo N-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 49 a 59 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento;

-

un dominio C situado en el extremo C-terminal del dominio A, y constituido por un fragmento de uno de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende al menos los aminoácidos 101 a 111, y como máximo los aminoácidos 101 a 151 de dicho polipéptido, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.
2.

Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio B está constituido de un fragmento que comprende al menos los aminoácidos 39 a 59 de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.
3.

Polipéptido de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el dominio C está constituido por un fragmento que comprende al menos los aminoácidos 101 a 121 de los polipéptidos de las SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o alternativamente de un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 60 %, o una similitud de al menos el 65 %, con dicho fragmento.
4.

Polipéptido quimérico, que comprende un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionado con una proteína heteróloga.
5.

Polipéptido quimérico de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido de direccionamiento intraplastidial está situado en el extremo N-terminal de la proteína heteróloga.
6.

Uso de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la reivindicación 1 para la importación de una proteína de interés hacia plástidos.
7.

Uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho polipéptido de direccionamiento intraplastidial se utiliza para importar dicha proteína de interés hacia los cloroplastos.
8.

Procedimiento para la importación de una proteína de interés hacia plástidos, caracterizado porque comprende la expresión, en una célula vegetal que contiene dichos plástidos, de un polipéptido quimérico que resulta de la fusión de un polipéptido de direccionamiento intraplastidial de acuerdo con la reivindicación 1 con dicha proteína de interés.
9.

Polinucleótido codificante para un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10.

Casete de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 situado bajo el control de secuencias para regular la transcripción.
11.

Vector recombinante que resulta de la inserción de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o de un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 en un vector hospedador.
12.

Planta transgénica transformada mediante, y que comprende, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o un casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.