FR2810994A1 - Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications, notamment pour l'amélioration de la digestibilité des aliments pour animaux.

Description

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La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications.

Cette invention concerne plus précisément des séquences d'acides nucléiques de maïs, de riz et de blé codant pour une MIPP.

L'importance du rôle du phosphore dans la nutrition animale a été, depuis longtemps, reconnue. Le phosphore est essentiel à la croissance de l'animal ; 80% du phosphore est localisé dans le squelette. Le reste du phosphore est contenu dans les tissus mous où il intervient dans de nombreuses réactions biochimiques comme la synthèse des acides nucléiques, des phospholipides et de certaines vitamines B.

Le phosphore est fourni à l'animal par l'alimentation, principalement par les plantes. La plus grande partie du phosphate présent dans les plantes, notamment dans les semences, se trouve sous la forme de phytine, sel complexe de myo-inositolacide hexakisphosphorique ou acide phytique. La phytine constitue donc une réserve de phosphore, de sucres, mais aussi de divers cations (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe3+).

Dans les grains de maïs, le phosphore du phytate représente jusqu'à 88 % du phosphore total (O'Dell et al., 1972). La dégradation de la phytine est assurée par des phosphatases spécifiques, dont les phytases, enzymes capables d'hydrolyser le phosphate à partir de l'acide phytique (Gibson et Ullah, 1990) en libérant du myoinositol et du phosphate inorganique.

Toutefois les phosphatases de type phytase végétale sont produites en quantités insuffisantes dans les parties des plantes utilisées pour l'alimentation de certains animaux.

En particulier, la phytine et l'acide phytique provenant de farines de semences sèches, ne sont pas digérés par les animaux monogastriques (comme le porc et le poulet) en l'absence de phosphatase exogène, et sont donc excrétés tels quels. Ils contribuent ainsi à la pollution des sols et des eaux, par le phosphate, dans les zones d'élevages intensifs. De plus, l'acide phytique est considéré comme un facteur antinutritionnel car il chélate les éléments minéraux et provoque l'agrégation des protéines.

Par conséquent, ces minéraux et protéines ne seront pas correctement assimilés lors du transit intestinal, par les animaux monogastriques (Graf, 1986).

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Des recherches ont été entreprises afin de permettre une meilleure digestibilité de la phytine et de l'acide phytique chez les animaux monogastriques. De nombreux travaux se sont portés principalement sur les phosphatases ou d'autres types d'enzymes intervenant dans la mobilisation de la phytine. Par exemple, des gènes codant pour des phytases de céréales ont été isolés. L'identification des gènes Phyt I et Phyt II, provenant du maïs a ainsi permis d'obtenir des plantes de maïs présentant une teneur accrue en phytase (WO 98/05785).

Les auteurs de la présente invention, quant à eux, se sont intéressés à une autre famille d'enzymes, qui ne présentent pas d'homologie significative avec Phyt I ou Phyt II : les MIPP - Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatases, apparentées aux histidine phosphatases répertoriées uniquement dans le règne animal. Elles jouent un rôle important dans les processus d'ossification, notamment dans le développement et la différenciation des chondrocytes (Romano et al., 1998). Ces phosphatases sont également connues comme étant les seules enzymes animales qui hydrolysent les molécules d'inositol-tétra,'-penta- et-hexaphosphate (Chi et al., 1999).

Alors que ces enzymes étaient jusqu'alors reconnues comme spécifiques de l'espèce animale, les auteurs de la présente invention sont parvenus à caractériser des séquences d'acides nucléiques de plantes présentant une homologie significative avec les gènes codant pour les MIPP animales. Aussi les enzymes codés par ces acides nucléiques de plantes seront par la suite appelées MIPP végétales.

La présente invention a donc pour objet un acide nucléique isolé codant pour une enzyme MIPP végétale à activité phytasique. Les enzymes MIPP des céréales sont particulièrement visées, en particulier celles du maïs, du riz et du blé. L'invention a plus particulièrement pour objet un acide nucléique isolé comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID n 1 (ADNc de maïs) ou SEQ ID n 3 (ADNc de riz).Les séquences complémentaires de ces séquences d'acides nucléiques font également partie de la présente invention.

L'invention a également pour objet, des fragments des séquences ci-dessus codant pour des peptides conservant l'activité mentionnée, ou les séquences complémentaires de ces fragments.

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L'invention concerne aussi les séquences homologues des séquences mentionnées plus haut.

Le terme "homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant une ou plusieurs modification (s) séquence par rapport à tout ou partie d'une séquence donnée.

Ces séquences homologues sont, de manière préférentielle, définies comme : i) des séquences similaires à au moins 70 % de la séquence SEQ ID n 1, ou n 3, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90%; ou ii) des séquences hybridant avec la séquence SEQ ID n 1, ou n 3 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) des séquences codant pour une enzyme MIPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou n 4, ou une séquence d'acides aminés homologue.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ ID n 1, ou n 3 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41 (%G+C)+16,6Log(concentration en cations) 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) + 2 (A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.

Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la

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ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.

Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la SEQ ID n
1, ou n 3 inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n 1, ou n 3 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un polypeptide présentant l'activité phytasique de la MIPP végétale.

Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de céréales autres que le maïs ou le riz, ainsi que les variants alléliques.

La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé, dénommé MIPP végétale, comprenant de préférence la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou n 4. Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies de manière avantageuse comme i) les séquences similaires à au moins 70% de la séquence SEQ ID n 2 ou n 4, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90% ; ouii) les séquences codées par une séquence d'acide nucléique homologue telle que définie précédemment c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou n 3 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.

Là encore, le terme "similaires" se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acidesaminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).

Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue , on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID n 2 ou n 4

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par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la MIPP végétale.

L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.

"L'activité biologique de la MIPP végétale" se réfère notamment à son activité phytasique, qui peut être déterminée par le dosage du phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium.

Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.

Une protéine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique selon l'invention, tel qu'un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou n 3 ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant. La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, etc.

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La présente invention a donc également pour objet une méthode de production de protéine MIPP végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de: a) transformation d'une cellule, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme, avec une cassette d'expression comportant des séquences régulatrices capables de commander l'expression d'une quantité accrue de MIPP dans ladite cellule hôte ; b) éventuellement culture de ladite cellule hôte ou, dans le cas où cette cellule hôte est une cellule végétale, croissance de la plante transformée ; c) extraction de la protéine MIPP de la culture cellulaire ou de la plante transformée.

La présente invention a donc aussi pour objet une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une des séquences ou fragments d'acide nucléique tels que définis précédemment, placé sous le contrôle de séquences régulatrices capables de commander l'expression de la protéine MIPP végétale.

Parmi ces séquences régulatrices, on peut citer les promoteurs, les activateurs et les introns et les terminateurs de transcription.

Un grand nombre de promoteurs sont utilisables pour la transformation des plantes selon la présente invention. A titre d'exemple on peut citer : - des promoteurs permettant une expression constitutive : - promoteur p35S (Kay et al., 1987) - promoteur pUbil du gène codant pour l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al. , 1992) - promoteur pActl du gène codant l'actine 1 de riz (Mc Elroy et al., 1991) - promoteurs des histones (EP 0 507 698) - promoteur CsVMV du virus de la mosaïque de la nervure du manioc (Verdaguer et al., 1996,1998) - les promoteurs spécifiques d'un organe ou d'un tissu de la plante, et plus particulièrement les promoteurs spécifiques des grains (Datla et al., 1997), comme les promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserve telles que : une gluténine de masse moléculaire élevée HMWG de blé ou d'orge (Roberts et al., 1989 ; Anderson

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O. D. et al., 1989), la napine, la phaséoline, l'hélianthinine, l'albumine, l'oléosine, GEAI et GEA6 d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), la y-zéine de maïs, - des promoteurs inductibles : - lors d'un stress hydrique (Kasuga et al., 1999) - par la lumière : promoteur du gène codant pour la petite sous unité de la
RUBISCO, Ribulose 1,5 BISphosphate Carboxylase Oxygénase, promoteur du gène codant pour la chlorophylle a/b, - des promoteurs des gènes codant la mannopine synthase, la nopaline synthase, l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, - des promoteurs de gènes codant pour des enzymes choisis de préférence parmi ceux-ci : l'alcool déhydrogénase 1 (Adhl) de maïs, la phénylalanine ammonia lyase (PAL), la HMG-CoA reductase (HMG), la chitinase, la glucanase, les inhibiteurs de protéases, les gènes de la famille PR1, le gène vspB (US 5,670,349), HMG2 (US
5,670,349), la béta-galactosidase (Abgl) de pomme, ou l'amino-cyclopropane carboxylate synthase (WO 98/45445).

De manière générale, on utilisera préférentiellement un promoteur constitutif tel que le promoteur pAct 1 du gène Act 1 de riz contenu dans le plasmide pActl-F4 (Mc Elroy et al., 1991) ou le promoteur p35S (Kay et al., 1987), ou un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (Roberts et al., 1989 ; Anderson O. D. et al., 1989 ; Depigny-This et al., 1992).

Conformément à l'invention, des éléments comme les activateurs et les introns peuvent également être insérés dans la cassette d'expression dans le but d'amplifier l'expression du gène d'intérêt.

Un exemple d'activateur est l'activateur de la traduction du virus TEV (Tobbaco Etch Virus) décrit par Carrington et Freed (1990). Parmi les introns utilisables, le premier intron du gène Adhl S de maïs, qui peut être placé entre le promoteur et la séquence codante. Cet intron lorsqu'il est inclu dans une construction génétique, augmente l'expression de la protéine désirée dans les cellules de maïs (Callis et al., 1987). On peut aussi utiliser le premier intron du gène shrunken 1 de maïs (Maas et al., 1991), le premier intron du gène de la catalase du pois, CAT-1(Ohta et al., 1990), le second intron du gène ST-LS1 de pomme de terre (Vancanneyt et al., 1990), l'intron

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du gène TobYDV du virus 'yellow dwarf(Morris et al., 1992), l'intron du gène Act 1 codant l'actine 1 du riz (Mc Elroy et al., 1990) ou encore l'intron 1 du gène codant pour la triosephosphate isomérase (Snowdon et al., 1996).

De manière avantageuse, la cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites 'leaders'. De telles séquences peuvent augmenter la traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer : - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis Virus 5' noncoding region) (Elroy-Stein et al., 1989), - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (Carrington and Freed, 1990), - le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (Macejack et al., 1991), - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (Jobling et al. 1987), - le leader du virus de la mosaïque du tabac (Gallie et al., 1989),
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment : - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al. (1980), - le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1992), - le terminateur du gène histone (EP 0 633 317),
Selon un mode de réalisation préférée, le terminateur de transcription est le terminateur nos du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1992) ou alors la séquence polyA 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al. (1980).

Dans une variante de réalisation de l'invention, lesdites séquences régulatrices comprennent également des signaux d'adressage capables de diriger l'expression spécifiquement dans un type particulier de compartiment cellulaire, par exemple l'espace extracellulaire ou l'apoplasme.

Comme exemple de signaux d'adressage chloroplastiques, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la petite sous-unité de la ribulose 1,5-bis-phosphate carboxylase oxygénase de Pisum sativum. Comme signaux d'adressage mitochondrial, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du

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précurseur de la sous-unité P de l'ATP-ase FI mitochondriale de Nicotiana plumbaginifolia.

Ces peptides transits, comprenant la méthionine N-terminale, sont normalement clivés dans les chloroplastes ou les mitochondries. L'expression des protéines dans ces organites a donc également la caractéristique de produire une molécule dépourvue de la méthionine N-terminale comme la molécule naturelle.

Selon une autre variante, les séquences d'adressage peuvent être des séquences codant pour un peptide signal N-terminal ("prépeptide"), éventuellement en association à un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique (signal du type KDEL), ou un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". La présence du peptide signal N-terminal ou prépeptide permet l'introduction du néopolypeptide dans le réticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de modifications post-traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les N-glycosylations, si la protéine en question présente des sites de Nglycosylation, et la formation des ponts disulfures. Parmi ces différents signaux, le prépeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le réticulum endoplasmique, est très utile. Il s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés et étant d'origine animale ou végétale. De préférence, il s'agit d'un prépeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de la protéine PR1 ou PR2.

Normalement, le peptide signal est clivé par une signal-peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du néopolypeptide dans la lumière du RER (Reticulum Endoplasmique Rugueux). La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale.

Pour obtenir la sécrétion, selon un mode de réalisation de l'invention, on peut par exemple utiliser le peptide signal de la sporamine A des racines tubérisées de la patate douce.

Les séquences d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, SEKDEL ou HEKDEL. Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et subsistent sur la protéine mature. La présence de ce signal a tendance à augmenter les rendements en protéines recombinantes.

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Les signaux d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, après passage dans le RER, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps protéiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines. L'adressage de la protéine vers les corps protéiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40 % des protéines par rapport à la matière sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps protéiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté.

Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant particulièrement préférés, par exemple la prosporamine. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTTP), ou C-terminal (CTTP). Dans la mesure où les propeptides sont normalement clivés dès l'entrée de la protéine dans la vacuole, ils ne sont pas présents dans la protéine mature.

L'utilisation du peptide signal ou prépeptide, peut conduire à la glycosylation de la protéine.

En l'absence de tout signal d'adressage, la protéine est exprimée dans le cytoplasme.

L'invention se rapporte aussi à un vecteur dans lequel est insérée la cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Ce vecteur peut être un plasmide qui peut en outre comprendre un gène marqueur permettant de distinguer une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN étranger transféré. Ainsi, conformément à l'invention, le vecteur peut inclure comme gène marqueur, aussi bien des gènes de sélection qui confèrent une résistance à un antibiotique ou à un herbicide, que des gènes rapporteurs. Parmi les gènes de sélection utilisables, on peut citer : - le gène sul conférant la résistance à l'herbicide sulfonamide Asulam (WO
98/49316), - le gène nptil conférant la résistance à la kanamycine (Bevan et al., 1983), - le gène hph conférant la résistance à l'hygromycine (Herrera-Estrella et al., 1983), - le gène bar conférant la tolérance au bialaphos (White et al., 1990),

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- le gène EPSPS conférant la tolérance au glyphosate (US 5,188,642), - le gène HPPD conférant la tolérance aux isoxazoles (WO 96/38567), le gène de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) qui détoxifie le chloramphénicol.

De même, on peut citer comme gènes rapporteurs : - le gène codant pour l'enzyme (3-glucuronidase (GUS), - le gène de la protéine de fluorescence verte GFP qui permet de visualiser, sous UV, les cellules transformées,
Conformément à l'invention, comme vecteur de clonage ou d'expression comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus etc... Les plasmides sont néanmoins préférés.

L'invention concerne aussi les hôtes cellulaires, notamment bactériens, contenant les vecteurs ci-dessus mentionnés.

L'invention propose également un procédé de production de plantes transgéniques comprenant, entre autres, les étapes de : - transformation de cellules de plante avec un vecteur d'expression contenant un fragment d'acide nucléique de la présente invention, - sélection des cellules transformées, - génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant le fragment d'acide nucléique inséré.

La transformation des plantes selon l'invention peut être réalisée par différentes méthodes, connues de l'homme du métier. On peut citer, tout d'abord, les méthodes de transfert direct de gènes telles que la micro-injection dans des cellules d'embryon de la plante (Neuhaus et Coll., 1987) ou l'électroporation (Chupeau et Coll., 1989), la précipitation directe avec le polyéthylèneglycol (Schocher et Coll., 1986) ou le bombardement par canon à particules (Mc Cabe et Coll., 1988).

On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et Van Montagu, 1983) ou d'Agrobacterium rhizogenes notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation (Chilton et Coll., 1982). La souche bactérienne peut comporterle gène

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codant pour l'enzyme MIPP végétale, sous le contrôle d'éléments assurant l'expression dudit gène. La souche bactérienne pourra être transformée par un vecteur dans lequel est insérée une séquence codant ladite enzyme sous le contrôle d'éléments assurant son expression. Cette séquence est insérée par exemple dans un vecteur binaire tel que pBIN19 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et Klee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides pTi et pRi. Elle peut aussi être utilement introduite par recombinaison homologue dans un plasmide pTi ou pRi désarmé, tel que pGV 3850 (Zambryski et Coll., 1983) avant la transformation de la plante.

Il a été montré récemment que des plantes monocotylédones telles que le riz et le maïs pouvaient être avantageusement transformées par Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al. 1994, Ishida et al., 1996).

Selon une méthode préférée de l'invention, les fragments d'acides nucléiques sont introduits dans les cellules par bombardement de particules recouvertes par lesdits fragments. Le bombardement de particules offre l'avantage d'une transformation rapide. Généralement les embryons immatures ne subissent qu'un unique bombardement. Toutefois un bombardement répété peut augmenter la fréquence de transformation (WO 98/49316).

Après l'étape de transformation, les cellules transformées sont sélectionnées selon les marqueurs phénotypiques utilisés dans le vecteur. Cette sélection s'effectue sur un milieu contenant un agent sélectif approprié. Les cellules transformées ainsi sélectionnées sont alors cultivées et les plantes sont régénérées. Une extraction d'ADN et un Southem blot avec des sondes spécifiques du gène d'intérêt permettent de confirmer la transformation. Les méthodes permettant d'isoler l'ADN à partir de matériels biologiques en culture et de vérifier la présence de l'insert sont bien connues de l'homme du métier, elles sont, entre autres, décrites par Southern et al., 1975 et Mullis et al., 1987.

La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé pour accroître l'activité phytasique d'une plante, caractérisé en ce qu'on induit une surexpression d'une MIPP, plus particulièrement de maïs, de riz ou de blé, dans ladite plante à l'aide d'une cassette d'expression telle que décrite auparavant et selon le procédé précédent.

On entend ici par "surexpression" aussi bien une augmentation du taux de MIPP par rapport au taux exprimé dans une plante normale, qu'une expression

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ectopique de cette enzyme, dans un tissu ou un compartiment et/ou à un stade de développement où celle-ci n'est normalement pas exprimée.

Conformément à la présente invention, la séquence étrangère peut être hétérologue, c'est-à-dire qu'elle provient d'une plante différente de la cellule hôte. Il peut aussi s'agir d'une séquence de la MIPP naturellement produite par la plante.

La présente invention a également pour objet des hôtes végétaux, consistant en des plantes ou organes végétaux, transformés avec un ou plusieurs acides nucléiques de l'invention et selon le procédé défini ci-dessus. Si la transformation implique plusieurs gènes d'intérêt, alors ceux-ci peuvent être insérés dans une même cassette d'expression ou alors dans des cassettes d'expression différentes.

Le terme de 'hôtes végétaux' englobe aussi bien les plantes que les cellules de plantes ou les différentes parties de la plante, telles que semence, fruit ou feuille.

On peut citer, comme exemples de plantes transgéniques selon l'invention, les céréales, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le seigle, le riz, préférentiellement le maïs, ainsi que le pois, le soja et la pomme de terre.

Ces plantes transgéniques de l'invention englobent aussi bien les plantes de première génération, que leurs descendants (lignées ou hybrides, notamment).

La présente invention a plus particulièrement pour objet des hôtes végétaux transgéniques dans lesquels une MIPP végétale, plus particulièrement de maïs, de blé ou de riz, peut être exprimée dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire où cette enzyme n'est pas produite naturellement ou seulement en faibles quantités. Ces hôtes végétaux sont caractérisés par un génome dans lequel on a introduit une cassette d'expression selon l'invention comportant des séquences régulatrices qui induisent une expression spécifique dans ladite partie de la plante ou ledit compartiment cellulaire. L'hôte végétal en question est avantageusement une céréale et plus avantageusement encore le maïs, le blé et le riz, ou leurs organes.

La présente invention concerne plus précisément une plante transgénique, selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle produit des semences transgéniques exprimant une quantité accrue d'enzymes à activité phytasique.

La présente invention comprend également les semences de cette plante transgénique et notamment les semences comportant une teneur en MIPP végétale accrue, obtenue par expression spécifique d'une des séquences d'acide nucléique selon la présente invention, dans la semence.

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Par ailleurs, la farine et tout produit susceptible d'être obtenu à partir de cette semence font aussi partie de l'invention.

Enfin, la présente invention a pour objet une composition pour l'alimentation humaine ou animale comprenant des semences, une farine de semences ou une MIPP végétale, produites selon la présente invention.

Selon un mode de réalisation, les acides nucléiques définis par l'invention peuvent être utilisés comme marqueur du phénotype lié à l'expression de protéines MIPP.

L'invention permet l'utilisation des fragments nucléotidiques comme marqueurs moléculaires dans des programmes de culture, notamment dans la sélection de variétés exprimant une protéine MIPP ou une plante transformée avec une séquence codant pour cette MIPP.

Selon la présente invention, ces séquences permettent l'obtention des ADN génomiques par des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par le criblage de banques génomiques suivant les indications de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). De même au moyen de sondes dégénérées elles permettent l'identification de gènes codant pour des protéines homologues aux MIPP végétales.

Les plantes transgéniques exprimant la MIPP végétale selon l'invention ou l'enzyme elle-même peuvent être utilisées à des fins variées, dans toute situation où l'activité phytasique de cette enzyme est nécessaire ou désirée.

La MIPP végétale est ainsi utile dans les procédés de préparation alimentaire ou dans les procédés d'extraction de l'amidon (procédé de trempage). Par exemple, avec cette enzyme, il est possible d'augmenter l'extractibilité des amidons des grains où elle s'exprime. Le phytate fait précipiter les protéines avec l'amidon de sorte que si l'on réduit le taux de phytate, l'extraction de l'amidon s'en trouve facilitée.

L'ajout d'une enzyme à activité phytasique aux grains de plantes à partir desquels on souhaite extraire l'amidon permet de pallier la précipitation des protéines par les phytates.

Une plante transformée avec une séquence codant pour une MIPP végétale selon le procédé défini par l'invention, ou une partie de celle-ci, peut être utilisée pour

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améliorer la digestibilité du phytate, dans la ration alimentaire d'animaux monogastriques, et par conséquent, réduire le taux de phytate dans le fumier ou lisier.

L'activité phytasique de la MIPP végétale peut être également mise à profit pour valoriser les eaux de trempage récupérées ou les eaux de brassage, lors de préparations alimentaires. En particulier, la disponibilité accrue du phosphore rend ces eaux très utiles comme additifs pour milieux de culture ou supports de fermentation.

En outre, l'activité phytasique générée permet une meilleure récupération de l'inositol et de ses dérivés à partir des eaux de trempage ou de brassage.

L'invention concerne également l'utilisation d'une MIPP végétale selon l'invention ou l'utilisation de tout ou partie de plantes contenant une MIPP selon l'invention, pour la production de myo-inositol à des fins thérapeutiques ou diététiques.

Le myo-inositol, forme nutritionnelle active de l'inositol, est un constituant du phospholipide phosphatidylinositol. Il est connu pour ses vertus dans le domaine de la santé. On lui a souvent attribué des effets sur la diminution de la concentration des triglycérides et du cholestérol dans le sang, et plus généralement pour la protection contre les maladies cardiovascùlaires. De plus, il est reconnu que les composés issus d'un phospholipide tel que le myo-inositol ont des effets bénéfiques sur l'insomnie et l'anxiété. Par ailleurs, la névropathie périphérique du diabétique est une des complications les plus paralysantes du diabète. Or, on suppose depuis déjà plusieurs années qu'une diminution du taux de myo-inositol est associée aux dégâts des fibres nerveuses des diabétiques souffrant d'une telle complication.

L'invention concerne enfin l'utilisation de la MIPP végétale, selon l'invention, pour obtenir une meilleure disponibilité du calcium, par exemple à des fins alimentaires.

LEGENDES DES FIGURES
La Figure 1 représente un alignement des séquences nucléiques codant pour les MIPP de maïs et de riz.

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La Figure 2 représente un alignement des séquences protéiques de MIPP de riz et de maïs.

La Figure 3 représente une comparaison des séquences d'acides aminés des MIPP de riz et de maïs avec des MIPP animales, des phophatases acides et des phytases fongiques
La Figure 4 est une carte de restriction du plasmide pRD-257.

La Figure 5 est une carte de restriction du plasmide p3214.

LISTE DES SEQUENCES SEQ ID N 1 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de maïs SEQ ID N 2 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de maïs (ZmMIPP) SEQ ID N 3 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de riz SEQ ID N 4 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de riz (OsMIPP) SEQ ID N 5 : Oligonucléotide 5'olZMPl utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc ZmMIPP.

SEQ ID N 6 : Oligonucléotide 3'olZMP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc ZmMIPP.

SEQ ID N 7 : Oligonucléotide interne olMIPPl.

SEQ ID N 8 : Oligonucléotide interne oIMIPP2.

SEQ ID N 9 : Oligonucléotide 5'olOSP utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.

SEQ ID N 10 : Oligonucléotide 3'olOSP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.

SEQ ID N 11 : Oligonucléotide 5'olOSPl utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.

SEQ ID N 12 : Oligonucléotide olMIPP9 utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.

SEQ ID N 13 : Oligonucléotide olMIPP10 utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.

SEQ ID N 14 : Séquence nucléique de l'EST 3'TaMIPP.

SEQ ID N 15 : Peptide signal putatif SEQ ID N 16 : Peptide signal putatif

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EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Isolement des clones d'ADNc codant pour une protéine MIPP végétale.

Les séquences de MIPP végétales peuvent être obtenues en réalisant une étude de bioanalyse à partir de séquences codant pour des MIPP animales, présentées par Caffrey et al. (1999). Ces séquences permettent ainsi de définir des homologies avec des séquences ADNc référencées, par exemple, dans des bases de données spécifiques au maïs, au blé et au riz. En identifiant les EST spécifiques aux séquences homologues desdites séquences animales, des oligonucléotides peuvent alors être définis et utilisés comme amorces pour isoler par PCR ces ADNc d'intérêt à partir de banques d'ADNc ou d'ADNc.

1.1 - MIPP de maïs (ZmMIPP)
1.1.1 -Choix de la variété
Deux lignées de Zea Mays ont été utilisées : la lignée B73 et l'hybride Hill (un de ses parents étant la lignée B73). L'extraction d'ARN totaux a été réalisée sur des feuilles immatures pour la lignée B73 et sur des cals pour l'hybride HiII (Armstrong et al., 1991) Conditions de culture Feuilles immatures
40 graines B73 sont mises dans du terreau et placées en serre. Pour la récolte des feuilles immatures, on attend le stade où 7-8 feuilles sont visibles soit environ 3-4 semaines en serre. Les feuilles immatures sont encore dans le cornet. Un prélèvement à 3 semaines et à 4 semaines a été effectué.

Des feuilles immatures ont été également prélevées à 2 semaines après germination.

Obtention de cals de type II
Le prélèvement des épis est réalisé lorsque les embryons immatures ont atteint une taille de 1,5 mm à 2 mm c'est à dire 10 jours après la fécondation. Les épis récoltés sont débarrassés de leurs spathes et de leurs soies puis sont désinfectés au

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Domestos 20% (v/v) pendant 15 minutes sous agitation. Les épis sont rincés trois fois à l'eau stérile. La partie supérieure du grain est coupée de façon à découvrir l'albumen, puis une légère pression sur le grain permet de dégager l'albumen. L'embryon immature qui se trouve encore dans le grain est extrait puis déposé sur le milieu de callogénèse N6P6 (Sels N6 3,98 % (p/v) (Sigma C1416) ; vitamines N6 5ml/L ; L-proline 0,7 % (p/v) ; hydrolysat de caséine 0,1 % (p/v) ; saccharose 20 % (p/v) ; 2,4-D 0,001 % (p/v) ; phytagel 2,5 % (p/v), pH 5,8) en l'orientant côté plat sur la gélose. Les embryons sont mis en culture pendant 15 jours en chambre de culture à 26 C et à l'obscurité. Les embryons sont séparés de leur radicule puis repiqués sur un nouveau milieu N6P6. Le cal qui prolifère est repiqué toutes les 2 à 3 semaines sur milieu N6P6 (boîte de 16 cals). Les cals sont multipliés en chambre de culture à 26 C et à l'obscurité.

1.1.2. - Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc
L'extraction des ARN totaux a été réalisée selon la méthode décrite par Verwoerd et al. (1989).

Pour chaque tissu deux extractions d'ARN totaux ont été faites.

Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit SMART PCR cDNA synthesis Kit, commercialisé par Clontech, ont été suivies.

1.1.3 - Isolement d'un clone d'ADNc ZmMIPP de maïs
Les oligonucléotides, utilisés comme amorces PCR pour le criblage des ADNc sont présentés en annexe.

Les oligonucléotides ont été déterminés à partir des séquences nucléiques des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MIPP animales. Les oligonucléotides qui encadrent la séquence codante du gène ZmMIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : NcoI ou NdeI et en 3' : BamHI, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b (Novagen). Les oligonucléotides internes olMIPP1 et olMIPP2 (SEQ ID N 7 et 8), qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.

Amplification PCR
La manipulation a été répétée sur deux pools différents d'ARN totaux pour une même espèce et un même tissu.

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La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux.

Le couple d'oligonucléotides 5'olZMPl-3'olZMP (SEQ ID N 5 et 6) sur les ADNc de feuilles immatures et de cals a permis l'amplification d'un fragment de
1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides
5'oIZMPl-olMIPP2 (SEQ ID N 5 et 8), et olMIPPl-3'olZMP (SEQ ID N 7 et 6), olMIPPl et olMIPP2 étant des oligonucléotides internes spécifiques de la séquence consensus RHGXRXP, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans le fragment de 1,6 kb. Par conséquent, il a été cloné dans pGEM-T (Promega) et séquence.

1.1.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse
La séquence d'acide nucléique et la séquence d'acides aminés sont présentées en annexe, respectivement par SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. Elles sont valables pour le clone d'ADNc de feuilles immatures et le clone d'ADNc de cals de mais. En effet le séquençage a montré qu'elles sont identiques. L'analyse des séquences nucléotidiques a été réalisée avec le logiciel MAC VECTORTM 6. 5.3 - Oxford Molecular.

Caractéristiques biochimiques de ZmMIPP (par le logiciel MAC VECTORTM 6. 5.3 Oxford Molecular)
Masse moléculaire calculée 58,6 kDa pi 8,95 Avec les logiciels de détection de motifs protéiques (SEQWEB version 1.1 - Wisconsin Package Genetic Computer Group), identification de : - un peptide signal putatif de 25 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine : MGMAAPRAPLPLPQLLLLLVAALLA (SEQ ID N 15) - un signal de rétention putatif dans le réticulum endoplasmique à l'extrémité C- terminale de la protéine : KTEL
1. 2 - MIPP de Riz (OsMIPP)
1. 2.1 - Choix de la variété

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Le matériel végétal est Oryza sativa japonica, variété Nipponbare.

L'extraction d'ARN est réalisée à partir de cals de riz.

Conditions de culture :
Induction des cals de riz. Les grains de riz à maturité sont débarrassés de leurs enveloppes externes, désinfectés 1 min dans l'éthanol 70% (v/v) et 30 min dans le domestos 50% (v/v). Les grains sont rincés dans de l'eau distillée stérile et déposés sur le milieu N6P6 contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont scellées et placées 21 jours dans l'étuve à 28 C à l'obscurité. A partir du scutellum de l'embryon, un cal primaire se développe. Autour du cal primaire, des petites unités embryogènes s'individualisent, elles sont transférées dans des boîtes de Pétri contenant le milieu N6P6 et incubées pendant 14 jours à 28 C et à l'obscurité. Pendant cette période, leur taille va augmenter. Les cals sont ensuite prélevés pour l'extraction d'ARN.

1.2.2 - Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc
L'extraction d'ARN totaux a été réalisée selon la méthode décrite par Verwoerd et al. (1989).

A partir des cals, deux extractions d'ARN totaux ont été réalisées.

Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit SMART PCR cDNA synthesis Kit, commercialisé par Clontech, ont été suivies.

1. 2.3 - Isolement d'un clone d'ADNc OsMIPP de riz
Les oligonucléotides utilisés ont été déterminés à partir des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MIPP animales. Les oligonucléotides qui devraient encadrer la séquence codante du gène MIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : NcoI ou NdeI et en 3' : BamHI, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b.

Les oligonucléotides internes qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.

Amplification PCR :
La manipulation a été répétée sur deux pools différents d'ARN totaux pour une même espèce et un même tissu.

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La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux.

La réaction d'amplification avec les couples d'oligonucléotides 5'olOSP- 3'oIOSP (SEQ ID N 9 et 10) ou 5'olOSPl-3'olOSP (SEQ ID N 11 et 10) sur les ADNc de cals génère un fragment de 1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides 5'olOSPl-olMIPP2 et olMIPPl-3'olOSP, olMIPPl et olMIPP2 étant des oligonucléotides internes, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans le fragment de 1,6 kb. Par conséquent, il a été cloné dans pGEM-T (Promega) et séquence.

1. 2.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse La séquence d'acide nucléique et la séquence d'acides aminés sont en annexe, respectivement par SEQ ID N 3 et 4.

Caractéristiques biochimiques de OsMIPP :
Masse moléculaire calculée 56,5 kDa pI 8,3 Avec les logiciels de détection de motifs protéiques, identification de : - un peptide signal putatif de 18 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine : MAAPRTPLPLVLLLVSAA (SEQ ID n 16) - un signal de rétention dans le réticulum endoplasmique à l'extrémité C-terminale de la protéine : KSEL
1. 3 - Analyse des séquences protéiques déduites des clones d'ADNc OsMIPP et ZmMIPP
1. 3.1 - Comparaison OsMIPP et ZmMIPP
Les séquences protéiques des protéines MIPP de riz et de maïs sont fortement homologues entre elles. Les résultats de cet alignement, obtenu au moyen du logiciel MAC VECTOR 6. 5.3 - Oxford Molecular, sont présentés en annexe, figure 1.

1. 3.2 - Comparaison entre OsMIPP/ZmMIPP et phosphatases acides

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Une bioanalyse avec les séquences protéiques clonées par les ADNc, comme précédemment, met en évidence des homologies avec deux familles de phosphatases acides : les MIPP animales et les phytases fongiques. Les résultats de cette étude sont présentés en annexe, figure 3.

Les MIPP sont des protéines décrites uniquement dans le domaine animal.

Ces protéines hydrolysent les composés inositol polyphosphate, particulièrement les tétra-, penta-, et hexa-inositol phosphate, par conséquent l'acide phytique (Craxton et al., 1997). Ceci suggère que les ADNc de maïs et de riz ainsi clonés codent pour des enzymes homologues des MIPP animales, avec notamment une activité phytasique.

1. 4 - Obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé
La comparaison des caractéristiques biochimiques des MIPP de riz et de maïs avec la phytase de blé met en évidence des similarités :
Riz* Maïs* Blé (Johansen et al., 1997) Masse moléculaire kDa 56.5 : 2. 5 58.6 ~ 3.5 47 pi 8. 3 8. 95 7. 4-8.2 * valeurs calculées.

valeurs apparentes.

De plus, il a été constaté que les MIPP des plantes sont homologues aux MIPP animales et aux phytases fongiques, protéines pour lesquelles une activité phytasique est décrite.

Ces deux constatations montrent fortement que la phytase de son du grain de blé est une MIPP.

Les grains de blé Triticum aestivum à différents stades de développement : 10, 20, 30 et 40 jours après anthèse (JAA) ont été utilisés comme matériel végétal.

Chez le blé, la fécondation a lieu dans la fleur encore fermée, par conséquent elle n'est pas visible. Lorsqu'elle a eu lieu, les anthères apparaissent, c'est la floraison. Cette étape correspond également à la fin de l'anthèse ou développement des anthères. C'est à partir de ce moment que sont comptés les jours correspondant à la période de développement du grain.

Les auteurs de l'invention réalisé une cinétique de l'activité phytasique d'une fraction du grain enrichie en son au cours du développement à 10,20, 30 et 40

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JAA. Cette activité phytasique augmente au cours du développement du grain. Cette augmentation peut s'expliquer par une activation des enzymes et/ou par une accumulation des enzymes dans le son au cours du développement du grain.

L'extraction des ARN totaux a ensuite été effectuée pour les 4 stades : 10, 20,30, 40 JAA. Des cinétiques d'expression, c'est à dire des Northem blots, avec la sonde OsMP (nucléotide 105 au nucléotide 1506 - séquence correspondant aux 467 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine) ou la sonde ZmMP nucléotide 1 au nucléotide 1572 - (séquence correspondant aux 524 acides aminés de la protéine), ont été réalisées sur les ARN totaux extraits à partir de son de grain prélevé à 10,20, 30 et 40 JAA.

Par ailleurs, les ADNc correspondant aux ARN totaux extraits de son prélevé aux 4 stades de développement du grain, ont été synthétisés.

L'isolement de l'ADNc MIPP de blé est effectué par RT-PCR ou par RACE-PCR. Les oligonucléotides utilisés pour les réactions d'amplification, sont déterminés à partir des séquences nucléiques des clones d'ADNc MIPP de riz et de maïs dans les zones où les homologies de séquences sont les plus fortes. On peut également utiliser des oligonucléotides dégénérés, déterminés à partir des séquences d'acides nucléiques, notamment celle de riz et de maïs, correspondant aux régions N et C-terminales des MIPP végétales.

Par ailleurs, la séquence nucléique de l'ADNc OsMIPP a été utilisée pour rechercher des séquences homologues dans des bases d'EST de blé Triticum aestivum.

Un EST issu d'ADNc de blé a été retenue, elle est nommée 3'TaMIPP (SEQ ID N 14).

La séquence protéique déduite de l'EST présente une forte homologie avec les 58 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine OsMIPP. Cette EST a été utilisée pour définir deux amorces olMIPP9 et olMIPP10 (SEQ ID N 12, SEQ ID N 13). Ces amorces combinées avec l'amorce Smart II oligonucléotideTM du kit SMART PCR cDNA synthesis Kit (Clontech), permettent d'isoler par PCR un ADNc codant pour une MIPP de blé. La PCR génère divers fragments qui sont séparés en gel d'agarose, transférés sur une membrane nylon et hybridés avec la sonde ZmMP. Les fragments reconnus par la sonde ZmMP sont homologues à ZmMIPP.

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EXEMPLE 2 : Production des protéines ZmMIPP et OsMIPP chez E.coli et évaluation de l'activité phytasique des protéines recombinantes
2. 1 - Clonage dans le vecteur d'expression pET-14b
Le site de restriction NdeI, amené par les oligonucléotides 5'olZMP1 et 5'olOSPl et le site de restriction BamHI, amené par les oligonucléotides 3'olZMPl et 3'olOSPl, encadrent les ADNc ZmMIPP et OsMIPP. Ils permettent le clonage orienté et en phase des ADNc aux sites de restriction NdeI et BamHI du vecteur d'expression bactérien pET-14b (Novagen). Les vecteurs obtenus pET-OsMIPP et pET-ZmMIPP ont été vérifiés par séquençage.

2. 2 - Production des MIPP chez E. coli
La production des protéines se fait selon les recommandations du fournisseur Novagen. Des bactéries E. coli souche BL21(DE3)pLysS ont été utilisées. Le vecteur pLysS permet d'éviter l'expression de la protéine recombinante alors que la production n'a pas été induite et facilite la lyse des cellules car il porte le gène codant pour le lysozyme du phage T7.

Des bactéries E. coli souche BL21 (DE3)pLysS transformées avec les vecteurs pET-OsMIPP et pET-ZmMIPP ; ces transformants bactériens servent respectivement pour la production des protéines OsMIPP et ZmMIPP. Des bactéries E. coli souche BL21(DE3)pLysS sont transformées avec pET-14b ; ces transformants bactériens servent de contrôle négatif de production. Des bactéries E. coli souche BL21 (DE3)pLysS sont utilisées également comme contrôle négatif de production.

Chaque transformant bactérien est mis en culture dans 5 ml de milieu LB (milieu de Luria-Bertani) en présence des antibiotiques adéquats à 37 C sous agitation (175 rpm) pendant 15 heures. Deux antibiotiques sont utilisés : la carbénicilline et le chloramphénicol. La résistance au chloramphénicol est apportée par le vecteur pLysS (concentration utilisée : 30 g/ml). La résistance à la carbénicilline est apportée par le vecteur pET-14b (concentration utilisée : 50 g/ml). L'utilisation appropriée d'un ou des deux antibiotiques permet de sélectionner les transformants bactériens qui contiennent les vecteurs pLysS et/ou pET-14b. Un volume de 1 ml de chaque préculture est utilisée pour ensemencer un volume de 100 ml de milieu LB avec les

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antibiotiques adéquats contenu dans un erlenmeyer de 500 ml. Les cultures sont incubées à 37 C, sous agitation (175 rpm), jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm soit de DO600nm = 0,6. Lorsque la DO600nm = 0,6 : les 100 ml de milieu LB sont répartis équitablement dans deux erlenmeyer de 250 ml. Le premier sert à la production de protéines. L'induction de la production se fait par ajout de 500 l d'IPTG 100 mM soit une concentration finale de 1 mM. La production se fait pendant 6 h à 30 C sous agitation (175 rpm). Le second erlenmeyer sert de témoin non induit. Il est incubé 6 h à 30 C sous agitation (175 rpm).

Après production, la culture bactérienne est centrifugée à 3000 rpm pendant 5 min à 4 C. Le culot bactérien est repris dans un volume de tampon TE pH 8,0 (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM) tel que le rapport volume TE/ volume culture soit de 1/20.

Les bactéries sont stockées à -80 C. Les bactéries sont lysées en deux étapes : une étape de congélation-décongélation (deux cycles congélation à -80 C / décongélation à 37 C), une étape d'ultrasons : 3 fois 15 s, 30 %, 4 pulses / s. Entre chaque cycle, l'échantillon est placé dans la glace. Un cocktail d'inhibiteurs de protéases est ajouté au lysat bactérien, qui contient les protéines bactériennes et les protéines hétérologues, afin de les préserver.

2.3 - Dosage protéique
La concentration en protéines totales des extraits est évaluée selon la méthode de Bradford (1976). Dans une plaque de microtitration, 2 l de lysat bactérien sont ajoutés à 200 l de réactif de Coomassie (Bio-Rad protein assay). Pour le témoin négatif, l'extrait protéique est remplacé par 2 l de tampon TE pH 8,0. Après homogénéisation, les absorbances sont lues à 595 nm avec un fluorimètre (Labsystems Genesis V2. 00) assisté du logiciel (Labsystems). La quantité de protéines est déterminée d'après une courbe étalon réalisée avec de l'albumine de sérum bovin (1 mg/ml).

2. 4 - Analyse des extraits protéiques par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)
Elle a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970) en suivant les instructions de Bio-Rad.

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Le gel de séparation est à 10 % de polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide, 29/1, p/v) contenant du Tris-HCI 0,38 M pH 8,8 et du SDS 0,1 (p/v). Le gel de concentration est à 4 % de polyacrylamide contenant du Tris-HCl 0,12 M pH 6,8 et du SDS 0,1% (p/v). La polymérisation du gel s'effectue en présence de persulfate d'ammonium 0,05 % (p/v) et de Temed 0,078 % (v/v). Une quantité de 40 g de protéines est utilisée pour l'analyse SDS-PAGE. Les protéines sont reprises dans le tampon de dépôt composé de Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, de glycérol 12,5 % (v/v), de SDS 1 % (p/v), de bleu de bromophénol 0,005 % (p/v), en présence de dithiothréitol 100 mM et/ou de 2-mercaptoéthanol 360. Les échantillons sont incubés à 100 C pendant 5 minutes avant dépôt en gel. Des protéines précolorées BENCHMARK prestained protein ladder (Gibco BRL) sont utilisées comme marqueurs de masses moléculaires. Le tampon de migration est composé de Tris-base 25 mM, de glycine 0,2 M et de SDS 0,1 % (p/v). L'électrophorèse est réalisée à voltage constant 150 volts pendant 1 heure à température ambiante. Après migration, le gel est rincé trois fois 10 minutes dans de l'eau, les protéines sont colorées par une solution de bleu de Coomassie G250 (Bio-Safe Coomassie, Bio-Rad) pendant 1 heure, le gel est ensuite rincé dans l'eau, à température ambiante.

L'analyse SDS-PAGE a été réalisée sur des extraits bactériens bruts. La présence de la protéine hétérologue dans la culture bactérienne après induction de la production est difficile à déterminer. Une analyse par Western blot avec un anticorps approprié permet de confirmer la présence de la protéine hétérologue. En effet, dans ce cas, la protéine hétérologue a l'avantage d'être synthétisée avec un peptide à son extrémité N-terminale. Des anticorps spécifiques de ce peptide sont commercialisés et peuvent être utilisés pour mettre en évidence la protéine hétérologue. Ceci va dans le sens des travaux de Craxton et al. (1997) : lors des essais de production chez E. coli d'une MIPP animale, la protéine n'a pu être détectée que par immunodétection.

2. 5 - Evaluation de l'activité phytasique
L'activité phytasique est déterminée par le dosage de phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium. La mesure de l'activité phytase est réalisée directement sur les lysats bactériens.

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Dans un tube Ependorf de 1,5 ml, on mélange 75 l de lysat bactérien avec 300 l d'une solution contenant du phytate de sodium 5 mM, de l'acétate de sodium 0,25 M pH 4,8, du CaCl2 1 mM. La réaction enzymatique se fait pendant 1 heure à 55 C. Pour chaque essai, un témoin identique est gardé à 0 C pendant l'incubation. Ce témoin utilisé comme zéro, permet d'éliminer les absorbances possibles dues aux extraits protéiques eux-mêmes. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 375 ul d'acide trichloroacétique 20 % (p/v), suivie d'une centrifugation à 8000 rpm pendant 15 minutes et à 4 C qui permet de précipiter les protéines. Le dosage du phosphate libre se fait sur le surnageant. A 750 l de surnageant, on ajoute 750 l du réactif suivant : FeS04 0,38 M, H2S04 0,16 N / molybdate d'ammonium 12 mM, H2S04 1 N, 1/4, v/v. L'absorbance est mesurée à 690 nm. La quantité de phosphate est déterminée à partir d'une courbe standard. L'activité phytasique est exprimée en nmoles de phosphate libéré par heure, par mg de protéines totales à 55 C.

L'activité phytasique a été réalisée sur des extraits bactériensUne étape de purification de la protéine hétérologue à partir des extraits bactériens bruts est néanmoins préférable pour améliorer l'interprétation des résultats. Ceci est aisément envisageable de part la présence du peptide à l'extrémité N-terminale de la protéine hétérologue qui permet de la purifier par chromatographie d'affinité.

EXEMPLE 3 : Construction de gènes chimériques.

3. 1 - Pour une expression ectopique constitutive de OsMIPP
Pour obtenir une expression constitutive, le promoteur pCsVMV (Verdaguer et al., 1996,1998) du virus de la mosaïque de la nervure du manioc est utilisé.

Le construit est réalisé de la façon suivante : - Le fragment ClaI-SacII de 556 pb du vecteur pRD 257 (figure 4) contient le promoteur pCsVMV. Ce fragment est cloné dans le vecteur p3214 (figure 5) digéré par ClaI et EcoRI. Le vecteur obtenu est nommé vecteur pBIOS 366. Il contient le promoteur pCsVMV et le terminateur ter nos.

- L'ADNc OsMIPP a été cloné dans le vecteur pGEM-T (Promega) donnant le vecteur pBIOS 367. Le vecteur pBIOS 367 est digéré par NotI générant un

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fragment de 1563 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est cloné dans le vecteur pBIOS 366 digéré par PstI. On obtient le vecteur pBIOS 368 qui contient la cassette : promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos.

Le vecteur pBIOS 368 est digéré par XhoI, ce qui permet de sortir la cassette : promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos. Elle est clonée au site
Xhol du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur pBIOS 273 contient l'ADN-T d'Arabidopsis thaliana dans lequel se trouvent le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz, la séquence codante du gène bar et le terminateur nos.

Le vecteur obtenu est le vecteur pBIOS 369. Le vecteur pBIOS 369 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pCsVMV et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 369 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli
3. 2 - Pour une expression ectopique tissu-spécifique de OsMIPP
Pour obtenir une expression albumen-spécifique, le promoteur pHMWG du gène codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée de blé (HMWG : High Molecular Weight Glutenin) est utilisé.

Le construit permettant l'expression de OsMIPP dans le cytoplasme des cellules de l'albumen est réalisé de la façon suivante : - La digestion par l'enzyme EcoRI du vecteur pBIOS 367 génère un fragment de 1547 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est cloné au site EcoRI du vecteur p3214 entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter nos. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 370.

- La digestion du vecteur pBIOS 370 par l' enzyme XhoI génère un fragment de 2287 pb qui est cloné au site XhoI du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur obtenu est nommé pBIOS 271. Le vecteur pBIOS 371 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActl et le premier intron du gène

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Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.

EXEMPLE 4 : Production de maïs transformé
4. 1 - Transformation du maïs par bombardement de particules
La transformation génétique du maïs par bombardement de particules se fait sur des cellules de cals friables embryogènes ou cals de type II. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill ou A188 x B73 selon la méthode décrite par Armstrong (1994). Les cals ainsi obtenus peuvent être multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals par modification de l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989).

Le transfert des gènes d'intérêt et de sélection par bombardement de particules dans les cals de type II se fait selon le protocole suivant. Quatre heures avant le bombardement, des fragments de cals de type II d'une surface de 10 à 20 mm2 sont disposés au centre d'une boîte de Pétri contenant le milieu d'initiation additionné de mannitol 0,2 M et de sorbitol 0,2 M, 16 fragments par boîte.

Les vecteurs porteurs des gènes d'intérêt et de sélection sont préparés à l'aide du système CONCERT selon les instructions du fournisseur (GIBCO BRL). Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide d'un canon à particules. L'optimisation des conditions de bombardement peut dépendre du type d'appareil utilisé et fait partie des techniques normalement maîtrisées par l'homme de l'art.

Après bombardement, les boîtes sont scellées à l'aide de Scellofrais# et placées à l'obscurité à 27 C. Les cals sont transférés sur un milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif 24 h après le bombardement.

Les cals sont maintenus sur ce milieu pendant 3 mois, le milieu est changé tous les 15 jours. Les cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif sont habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de

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sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cals par boîte bombardée.

Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.

Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.

4. 2- Transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens
La transformation du maïs par Agrobacterium se fait selon la méthode de lshida et al. (1996).

4.2.1- Obtention du vecteur superbinaire
Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation du maïs est issu de la recombinaison homologue entre deux vecteurs : le vecteur pBIOS 371 et le vecteur pSBl . Le vecteur pBIOS 371, construit comme précédemment (exemple 3. 2), comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli. Le vecteur pSB1contient les gènes virB, virC et virG du plasmide pTiBo542 présent dans Agrobacterium souche A281 (ATCC 37349), le gène de la résistance à la tétracycline, une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli et Agrobacterium. Les vecteurs pSBlet pBIOS 371 possèdent une région homologue qui leur permet de se recombiner et de générer le vecteur superbinaire pRec 371.

La recombinaison homologue entre les deux vecteurs se fait dans Agrobacterium. Le vecteur pBIOS 371 est introduit dans Agrobacterium souche LBA4404 contenant le vecteur pSBl par électroporation en utilisant l'appareil CELL PORATOR Voltage Booster (GIBCO BRL) selon la méthode décrite par Mattanovitch et al. (1989) et le protocole donné par le fournisseur (Life Technologies, USA).

Les agrobactéries contenant le vecteur superbinaire pRec 371 sont sélectionnées sur milieu YT en présence de CaCl2, de rifampicine et de spectinomycine.

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Le gène de résistance à la rifampicine est porté par le chromosome bactérien. La résistance à la spectinomycine, portée par le vecteur pBIOS 371 (origine de réplication fonctionnelle chez E. coli), ne pourra s'exprimer qu'après recombinaison homologue avec le vecteur pSB1(origine de réplication fonctionnelle chez Agrobacterium et E. coli).

Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression du gène Bar et de la séquence OsMIPPs (sous le contrôle du promoteur pHMWG pour une expression tissu spécifique), des origines de réplication fonctionnelles à la fois dans E. coli et Agrobacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la spectinomycine, et les gènes de virulence virB, virC et virG du plasmide pTiBo542.

4. 2.2 - Méthode de transformation du maïs et régénération des plantes transformées
Des embryons immatures sont co-cultivés avec A. tumefaciens souche LBA 4404, contenant le vecteur superbinaire pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25 C.

Les cals transformés sont sélectionnés sur un milieu de culture contenant l'agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Des cals de type I sont obtenus, à partir de ceux-ci, des plantules vont être régénérées sur un milieu culture contenant l'agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Les plantules ayant régénéré sont ensuite transférées sur un milieu de développement contenant l'agent sélectif.

Les plantes obtenues sont acclimatées au phytotron, puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.

4. 3 - Le gène Bar
La nature et la concentration de l'agent sélectif peuvent varier selon le gène utilisé. Les agents sélectifs utilisables sont généralement des composés actifs de certains herbicides (Basta, Round up#) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine,).

Le gène Bar de Streptomyces hygroscopicus code pour une phosphinothricine acétyl transférase (PAT) qui inactive par acétylation la

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phosphinotricine - molécule active de l'herbicide Basta . Les cellules portant ce gène sont donc rendues résistantes à cet herbicide et peuvent être sélectionnées par son intermédiaire.

Pour la transformation des céréales, la séquence codante du gène Bar est sous le contrôle d'une région régulatrice permettant une expression forte et constitutive dans les cellules végétales. Une telle région peut avantageusement être constituée par le promoteur et le premier intron du gène Actine 1 de riz (Mc Elroy et al., 1991).

4. 3.1 - Utilisation du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules
Le gène chimérique, composé du promoteur et du premier intron du gène Actine 1 de riz et du gène Bar, est cloné dans le plasmide pDM 302 permettant sa multiplication chez E. coli (Cao et al., 1992). Les milieux de cultures destinés à la sélection des cellules transformées sont additionnés de phosphinothricine 2 mg/1.

Pour l'introduction des construits OsMIPP devant conduire à une expression ectopique des protéines issues des gènes OsMIPP, une technique dite de cotransfonnation peut avantageusement être utilisée. On procède à une coprécipitation des deux plasmides (le plasmide porteur du gène Bar et le plasmide porteur du gène OsMIPP) sur les particules de tungstène, la quantité totale d'ADN précipité sur les particules restant identique à ce qu'elle est dans le protocole standard (5 g d'ADN pour 2,5 mg de particules), chaque plasmide représentera environ la moitié du total d'ADN utilisé.

L'expérience montre qu'avec cette méthode, la cointégration des plasmides dans les cellules végétales est l'événement le plus fréquent (de l'ordre de 90 %) c'est-àdire que pratiquement chaque plante ayant intégré le gène Bar et ayant été sélectionnée par son intermédiaire portera aussi le gène MIPP. Ainsi, le pourcentage de plantes sélectionnées exprimant le gène OsMIPP est d'environ 70 %.

Les gènes ainsi introduits sont généralement liés au sens génétique, le gène OsMIPP peut ainsi avantageusement être suivi dans les descendances grâce à la résistance à l'herbicide qui lui est étroitement associée.

4. 3.2 - Utilisation du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules

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Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression des gènes Bar et OsMIPP, des origines de réplication fonctionnelles à la fois dans E. coli et Agrobacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la spectinomycine, et les gènes de virulence virB, virC et virG du plasmide pTiBo542.

Des embryons immatures sont co-cultivés avec A. tumefaciens souche LBA 4404, contenant le vecteur superbinaire pRec 371 pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25 C. La sélection des cals de type 1 transformés et la régénération des plantules se fait sur un milieu contenant de la phosphinotricine 5 à 10 mg/1 et un agent bactériostatique, la céfotaxime. Le développement des plantules se fait sur un milieu contenant uniquement la phosphinotricine.

Les cals et les plantes qui ont intégré dans leur génome, l'ADN-T qui contient le gène OsMIPP et le gène Bar, peuvent être suivis dans les descendances grâce à la résistance à l'herbicide.

4. 4 - Mesure de l'activité phytasique du maïs transformé
L'objectif final de la production de maïs transformé avec le gène OsMIPP étant l'obtention d'une activité phytasique accrue, des mesures d'activité enzymatique sont prévus. Le dosage de l'activité phytasique se fait selon la méthode décrite précédemment dans l'exemple 2 paragraphe 2. 5. L'activité phytasique est mesurée sur les extraits protéiques de différents organes de maïs transgénique et de maïs non transgénique : feuilles, graines, jeunes plantules en cours de germination (5 ou 6 jours de germination). L'extraction des protéines totales à partir de ces tissus se fait selon la méthode décrite ci-après. Les tissus, prélevés et congelés à -80 C, sont broyés à l'état de poudre dans l'azote liquide. Une quantité de 100 mg de poudre végétale broyée est transférée dans 1 ml de tampon d'extraction (acétate de sodium 100 mM, pH 4,8, CaCl2 2 mM, DTT 1 mM, cocktail d'inhibiteurs de protéases 0,5 à 1 mM (Roche)). Les échantillons sont homogénéisés pendant 1 heure à 4 C et les extraits sont centrifugés à 8000 rpm pendant 20 min à 4 C. Le surnageant contenant les protéines totales, sert à la mesure de l'activité phytasique.

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EXEMPLE 5 : de riz transformé
La production de riz transformé peut être envisagée selon deux méthodes : via Agrobacterium tumefaciens selon le protocole décrit par Hiei et al. (1994), par bombardement de particules selon le protocole de Fauquet et al. (1996). Les vecteurs pBIOS 369 et pBIOS 371 décrits dans l'exemple 3, sont utilisés pour la transformation du riz via Agrobacterium tumefaciens.

EXEMPLE 6 : Production de blé transformé.

La transformation du blé (Triticum aestivum) peut se faire selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 B1.

6. 1 - Préparation des tissus à transformer
Les tissus utilisés pour le transfert de gènes ont été préparés selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 B1. Ce sont des cals de type M qui sont utilisés pour le bombardement. Ils peuvent être obtenus à partir d'embryons immatures prélevés des grains immatures de blé et placés sur un milieu MS décrit par Murashige et Skoog (1962) contenant du maltose.

6. 2 - Préparation des vecteurs à transférer
Les vecteurs utilisés pour la transformation du blé sont purifiés sur gradient de Césium puis concentré à 1 mg/ml dans le tampon TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM ; EDTA 1 mM) (Sambrook et al., 1989).

6. 3 - Préparation des particules d'or
Des particules d'or de 1 m sont enrobées d'ADN à transférer selon le procédé de Daines (1990). Les particules sont reprises dans de l'éthanol absolu, 60 mg de particules par ml d'éthanol. Un volume de 35 l de cette suspension est transféré dans un tube de micro-centrifugation de 1,5 ml, les particules sont récupérées par centrifugation à 14 000 g pendant 3 minutes. Elles sont lavées avec 1,5 ml d'eau distillée stérile et récupérées par centrifugation à 14 000 g pendant 3 minutes. Les

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particules sont reprises dans 25 l de tampon TE contenant 25 g du vecteur portant le gène d'intérêt et 25 g du vecteur portant le gène de sélection, le gène dhfr codant pour l'enzyme dihydrofolate réductase. On ajoute à cette préparation, dans l'ordre : 220 l d'eau distillée stérile, 250 l de CaCl2 2,5 M et 50 fil de spermidine 0,1 M. Le mélange est homogénéisé par agitation à 4 C pendant 15 minutes. Le mélange est centrifugé pendant 5 minutes à 14 000 g, le surnageant est éliminé et les particules lavées avec 200 (il d'éthanol absolu. Les particules d'or chargées d'ADN sont reprises dans 36 l d'éthanol absolu.

6. 4 - Etape de transformation
Le déroulement du bombardement des cellules s'est effectué telle que la demande de brevet EP 0 674 715 le décrit. Dans la chambre du canon, la boîte de Pétri contenant les explants à bombarder est placée sur la plate-forme au centre de l'ouverture d'où sont projetées les particules d'or enrobées d'ADN ou microprojectiles. Les microprojectiles sont placés sur un support au dessus des explants. La chambre est fermée et scellée, le vide de la chambre est réalisé et le réservoir d'hélium rempli avec une quantité appropriée de gaz. Le bombardement est déclenché permettant la projection des microprojectiles sur les explants. Les explants sont bombardés deux fois avec les microprojectiles. Après bombardement, les cals sont maintenus à l'obscurité pendant 15 heures puis placés sur le milieu MS pendant 15 jours.

6. 5 - Sélection des cals et régénération des plantes transgéniques.

La sélection des cals transformés se fait le milieu MS contenant l'agent sélectif, le méthotrexate pendant 4 mois.

Pour régénérer des plantes, les cals sont transférées sur un milieu MS contenant du 2,4-D à l'obscurité. Quand des structures embryogènes apparaissent, les cals sont transférés sur un milieu MS contenant des hormones (auxines et gibbérellines) à la lumière pendant 15 jours, cette étape permet l'induction de tiges. Les explants sont ensuite transférés sur un milieu MS sans hormone afin de permettre l'induction des racines.

Les plantules sont acclimatées en phytotron avant d'être cultivées en serre.

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Claims (14)

1. Phosphatase) végétale à activité phytasique.

   REVENDICATIONS 1. Acide nucléique isolé codant pour une MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate
2. 2. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n 1ou n 3.
3. 3. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il comprend une séquence homologue de la séquence SEQ ID n 1 ou n 3, ladite séquence homologue étant définie comme i) une séquence similaire à au moins 70 % de la séquence SEQ ID n 1, ou n 3 ; ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1, ou n 3 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) une séquence codant pour une enzyme MIPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou n 4.
4. 4. Enzyme isolée MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase) végétale à activité phytasique.
5. 5. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 4, comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4.
6. 6. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 4, comprenant une séquence d'acides aminés similaire à au moins 70% de la séquence SEQ ID N 2 ou SEQ ID

   N 4.
7. 7. Cassette d'expression contenant au moins une des séquences selon les revendications 1 à 3.
8. 8. Vecteur nucléotidique dans lequel est insérée une cassette d'expression telle que définie dans la revendication 7.
9. 9. Hôte cellulaire contenant un vecteur nucléotidique selon la revendication 8.
10. 10. Procédé de production de plantes transgéniques comprenant les étapes de : - transformation de cellules de plante avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, - sélection des cellules transformées,

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    MIPP végétale à activité phytasique codée par ladite séquence d'acide nucléique.

    - génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant une
11. 11. Plante transformée susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 10.
12. 12. Partie d'une plante, notamment semence, caractérisée en ce qu'elle provient d'une plante transformées selon la revendication 11.
13. 13. Produit, notamment farine, susceptible d'être obtenu à partir d'une plante transformée selon la revendication 11ou d'une partie d'une plante transformée selon la revendication 12.
14. 14. Utilisation d'une plante ou partie d'une plante selon les revendications 11ou 12, ou encore d'un produit selon la revendication 13, dans toute situation dans laquelle l'activité phytasique est nécessaire ou désirée.