CA2414588A1 - Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications, notamment po ur l'amélioration de la digestibilité des aliments pour animaux.

Description

Acides nucléidues codant four un° ~hosphatase végétale de type MIPP à
activité
ph tique et a~pIications.
La présente~invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications.
Cette invention concerne plus précisément des séquences d'acides nucléiques de maïs, de riz et de blé codant pour une MIPP.
l0 L'importance du rôle du phosphore dans la nutrition animale a été, depuis longtemps, reconnue. Le phosphore est essentiel à la croissance de l'animal ;
80% du phosphore est localisé dans le squelette. Le reste du phosphore est contenu dans les tissus mous où il intervient dans de nombreuses réactions biochimiques comme la synthèse des acides nucléiques, des phospholipides et de certaines vitamines B.
Le phosphore est fourni à l'animal par l'alimentation, principalement par les plantes. La plus grande partie du phosphate présent dans les plantes, notamment. dans les semences, se trouve sous la forme de phytine, sel complexe de myo-inositol-acide hexakisphosphorique du acide phytique. La phytine constitue donc une réserve de phosphore, de sucres, mais aussi de divers cations (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe3+).
2o La phytine, sel d'acide phytique complexé à divers cations, représente donc la forme majeure de stockage du phosphate dans les graines mais elle est également présente dans le pollen, les organes de stockage tels que les tubercules ou dans les racines. Sa distribution dans les graines varie d'une espèce à l'autre - chez les dicotylédones (soja, ricin), elle est présente majoritairement dans les cotylédons et l'albumen ;
- chez les céréales (blé, riz), elle est présente surtout dans faleurone alors qu'elle est absente dans l'albumen ;
- chez le maïs, la majorité de la phytine présente dans le grain est stockée dans (embryon (O'Dell et al., 1972; Barba et al., 1997).
Dans les grains de maïs, le phosphore du phytate représente jusqu'à 88 % du phosphore total (O'Dell et al., 1972). La dégradation de la phytine est assurée par des phosphatases spécifiques, dont les phytases, enzymes capables d'hydrolyser le phosphate à
partir de l'acide phytique (Gibson et Ullah, 1990) en libérant du myo-inositol et du phosphate inorganique.

2 Toutefois les phosphatases de type phytase végétale sont produites en quantités insuffisantes dans les parties des plantes utilisées pour l'alimentation de certains animaux.
En particulier, la phytine et l'acide phytique provenant de farines de semences sëches, ne sont pas digérés par les animaux monogastriques (comme le porc et le poulet) en l'absence de phosphatase exogène, et sont donc excrétés tels quels. ¿ls contribuent ainsi à la pollution des sols et des eaux, par le phosphate, dans les zones d'élevages intensifs. De plus, l'acide phytique est considéré comme un facteur anti-nutritionnel car il chélate les éléments minéraux et provoque l'agrégation des protéines. Par conséquent, ces minéraux et protéines ne seront pas correctement assimilés lors du transit intestinal, par les animaux monogastriques i0 (Graf, 1986).
Des recherches ont été entreprises afin da permettre une meilleure digestibilité de la phytine et de l'acide phytique chez les animaux monogastriques. De nombreux travaux se sont portés principalement sur Ies phosphatases ou d'autres types d'enzymes intervenant dans la mobilisation de la phytine. Par exemple, des gènes codant pour des phytases de céréales ont été isolés. L'identification des gènes Phyt I et Phyt II, provenant du maïs a ainsi permis d'obtenir des plantes de maïs présentant une teneur accrue en phytase (W0 98/05785).
Les auteurs de la présente invention, quant à eux, se sont intéressés à une autre famille d'enzymes, qui ne présentent pas d'homologie significative avec Phyt I
ou Phyt II : les 2o MIPP - Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatases, apparentées aux histidine phosphatases répertoriées uniquement dans le règne animal. Elles jouent un rôle important dans les processus d'ossification, notamment dans le développement et la différenciation des chondrocytes (Romano et al., 1998). Ces phosphatases sont également connues comme étant les seules enzymes animales qui hydrolysent les molécules d'inositol-tétra, -penta- et -hexaphosphate (Chi et al., 1999).
Alors que ces enzymes étaient jusqu'alors reconnues comme spécifiques de l'espéce animale, les auteurs de la présente invention sont parvenus à
caractériser des séquences d'acides nucléiques de plantes présentant une homologie significative avec les gènes codant pour Ies MIPP animales. Aussi les enzymes codés par ces acides nucléiques de 3o plantes seront par la suite appelées MIPP végétales.
La phytine, un substrat privilégié pour les MIPP, libère ainsi du phosphate inorganique ainsi que Ies cations chelatés. Le phosphate inorganique et les différents cations libérés sont alors disponibles pour les voies métaboliques qui les requièrent.

3 La présente invention a donc pour objet un acide.nucléique isolé codant pour cule enzyme MIPP végétale à activité phytasique. Les enzymes MIPP des céréales sont particulièrement visées, en particulier celles du maïs, du riz et du blé.
L'invention a plus paxticulièrernent pour objet un acide nucléique isolé comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID n° 1 (ADNc de maïs), SEQ ID n°3 (ADNc de riz) ou SEQ ID
n° 17 (ADNc de maïs).
De manière préférentielle, (invention a pour objet un acide nucléique isolé
comprenant la séquence SEQ ID n° 17 ou une séquence homologue à la séquence SEQ ID n°
17.
Les séquences complémentaires de ces séquences d'acides nucléiques font 1o également partie de la présente invention.
L'invention a également pour objet, des fragments des séquences ci-dessus codant pour des peptides conservant l'activité mentionnée, ou les séquences complémentaires de ces fragments.
L'invention concerne aussi les séquences homologues des séquences mentionnées plus haut.
Le terme "homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant ime ou plusieurs modifications) de séquence par rapport à tout ou partie d'une séquence donnée.
Ces séquences homologues sont, de manière préférentielle, définies comme:
i) des séquences similaires à au moins 70 % de Ia séquence SEQ ID n° l, n° 3 ou n° 17, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90%;
ou ü) des séquences hybridant avec la séquence SEQ TD n° 1, n° 3 ou n°17, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou üi)des séquences codant pour une enzyme MIPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n°2,, n°4 ou n° 18, ou une séquence d'acides aminés homologue.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux sëquences complémentaires de la séquence SEQ m n° 1, n° 3 ou n° 17 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation 3o Tm=81,5+0,41(%G+C)+1(,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).

4 Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séqûences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10°C
en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
s Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfere à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que (on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucléotidique homologue à fORF représentée à la SEQ m n° 1, n°
l0 3 ou n° 17 inclut donc toute séquence nucléotidique qui differe de la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un polypeptide présentant l'activité phytasique de la MIPP végétale.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de 15 céréales autres que le maïs ou le riz, ainsi que Ies variants alléliques.
La présente invention a également pour obj et un polypeptide isolé, dénommé .
MIPP végëtale, comprenant de préférence la séquence d'acides aminés SEQ ID
n° 2, n° 4 ou n° 18. Plus particulièrement, le polypeptide comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID n°
20 18. II est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies de manière avantageuse comme i) les séquences similaires à au moins 70% de la séquence SEQ ID n° 2, n° 4 ou n° 18, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90%;
ou ü) Ies séquences codées par une séquence d'acide nucléique homologue telle que 25 définie précédemment c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n° l, n° 3 ou n° 17 ou sa séquence complémentaire,'dans des conditions stringentes d'hybridation.
Là encore, le terme "similaires" se réfere à la ressemblance parfaite ou identité
entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que (on qualifie 3o de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux. chaînes latérales non chargées (tels que (asparagine, la glutamine, la sérine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et fhistidine), d'acides aminés aux cha?ues latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ;
d'acides aminés aux chaires latérales apolaires (tels que la glycine, (alanine, la valine, la leucine, fisoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
Plus généralement, par « séquence d'acides aminés homologue », on entend donc

5 toute séquence d'acides aminés qui differe de la séquence SEQ ID n°
2, n° 4 ou n° 18 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la MIPP végétale.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A
cette fin, il peut z5 être nëcessaire d'introduire de maniëre artificielle des espaces (« gaps ») dans la séquence.
Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
"L'activité biologique de la MIPP végétale" se réfere notamment à son activité
2o phytasique, qui peut être déterminée par le dosage du phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium.
Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type 25 Mernfield qui est avantageuse pour des raisons de puretë, d'absence de produits secondaires non dêsirés et pour sa facilité de production.
Une protéine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur.contenant un acide nucléique selon l'invention, tel qu'un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ff~ n° l, n° 3 ou n° 17 ou une séquence homologue est transféré
3o dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote qui est mise en culture dans des conditions permettant (expression du polypeptide correspondant. La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. Les procédés de purification utilisés sont connus de (homme du métier.
Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifé à partir de lysats et extraits cellulaires, du

6 surnageant du milieu de sulfure, par des méthodes utilisées indïviduelleinent ou en combinaison, telles que le fractionnement, Ies méthodes de chromatographie, etc.
La présente invention a donc également pour objet une méthode de production de protéine MIPP végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de s a) transformation d'une cellule, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme, avec une cassette d'expression comportant des séquences régulatrices capables de commander l'expression d'une quantité accrue de MIPP dans ladite cellule hôte ;
b) éventuellement culture de ladite cellule hôte ou, dans le cas où cette cellule hôte est une cellule végétale, croissance de la plante transformée ;
1o c) extraction de la protéine MIPP de la culture cellulaire ou de la plante transformée.
La présente invention a donc aussi pour objet une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une des séquences ou fragments d'acide 15 nucléique tels que définis précédemment, placé sous le contrôle d'au moins une séquence régulatrice capable de commander l' expression de la protéine MIPP végëtale.
Parmi ces séquences régulatrices, on peut citer les promoteurs, les activateurs et les introns et les terminateurs de transcription.
Un grand nombre de promoteurs sont utilisables pour Ia transformation des 2o plantes selon la présente invention. A titre d'exemple on peut citer - des promoteurs permettant une expression constitutive - promoteur p35S (Kay et al., 1987) - promoteur pUbil du gène codant pour l'ubiquitine 1 da maïs (Christensen et al. , 1992) 25 - promoteur pActl du gène codant l'active 1 de riz (Mc Elroy et al., 1991) - promoteurs des histones (EP 0 507 698) - promoteur CsVMV du virus de Ia mosaïque de la nervure du manioc (Verdaguer et al., 1996, 1998) les promoteurs spécifiques d'un organe ou d'un tissu de la plante, et plus particulièrement 30 les promoteurs spécifiques des grains (Datla et al., 1997), comme les promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserve telles que : une gluténine de masse moléculaire élevée HMWG (High Molecular Weight Glutenin) de blé ou d'orge spëcifique de l'albumen (Roberts et al., 1989 ; Anderson O.D. et al., 1989), Ia napine, la phaséoline, l'hélianthinine, l'albumine, l'oléosine, GEAI et GEA6 d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), la ~y-zéine de maïs,

7 le promoteur du gène pHyPRP codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs (HyPRP : Hybrid Proline Rich Protein) qui est spécifique de l'embryon et plus particulièrement du scutellum (Josè-Estanyol et al, 1992), le promoteur Vpl du gène Viviparousl (activateur de transcription - Me Carty D.R et al (1989)) combiné
au premier intron Sh du gène Shrunken (Maas et al (1991)), qui est spécifique de l'aleurone.
- des promoteurs inductibles - lors d'un stress hydrique (Kasuga et al., 1999) - par la lumière : promoteur du gène codant pour la petite sous unité de la RUBISCO, Ribulose 1,5 BISphosphate Carboxylase Oxygënase, promoteur du gène codant pour 1o la chlorophylle a/b, - des promoteurs des gènes codant la mannopine synthase, la nopaline synthase, l'octopine synthase d'Agrobacte~ium tumefaciens, - des promoteurs de gènes codant pour des enzyriles choisis de préférence parmi ceux-ci l'alcool déhydxogënase 1 (Adhl) de maïs, la phénylalanine ammonia lyase (PAL), Ia HMG-CoA reductase (HMG), la chitinase, la glucanase, les inhibiteurs de protéases, les gènes de la famille PR1, le gène vspB (US 5,670,349), HMG2 (US 5,670,349), la béta-galactosidase (Abgl) de pomme, ou l'amino-cyclopropane carboxylate synthase (WO
98/45445).
Ainsi, l'expression ectopique tissu-spécifique ou organe-spécifique permet la 2o production de graines riches en phosphate inorganique ou enrichies en protéine MIPP
capables de dégrader la phytine tout en limitant les dommages physiologiques éventuels dus à
une variation de la teneur en phytine.
De manière générale, on utilisera préférentiellement un promoteur constitutif tel que le promoteur pAct 1 du gène Act 1 de riz contenu dans le plasmide pActl-F4 (Mc Elroy et al., 1991) ou le promoteur p35S (Kay et al., 1987), ou un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de Ia cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de 1a protéine d'intérêt dans les graines (Roberts et al., 1989 ; Anderson O.D. et al., 1989 ; Depigny-This et al., 1992).
Conformément à l'invention, des éléments comme les activateurs et les introns 3o peuvent également être insérés dans la cassette d'expression dans 1e but d'amplifier l'expression du gène d'intérêt.
Un exemple d'activateur est l'activateur de la traduction du virus TEV
(Tobbaco Etch Virus) décrit par Carrington et Freed (1990). Parmi les introns utilisables, 1e premier intron du gène AdhlS de maïs, qui peut être placé entre 1e promoteur et la séquence codante.

8 Cet intron lorsqu'il est inclu dans une construction génétique, augmente l'expression de la protéine désirée dans les cellules de maïs (Callis et al., 1987). On peut aussi utiliser le premier intron du gène shrunken 1 de maïs (Mass et al., 1991), le premier intron du gène de la catalase du pois, CAT-1 (Ohta et a1.,1990), le second iniron du gène ST-LSl de pomme de terre (Vançanneyt et al., 1990), l'intron du gène TobYDV du virus 'yellow dwarf (Morris et al., 1992), l'intron du gène Act 1 codant l'actine 1 du riz (Mc Elroy et al., 1990) ou encore l'intron 1 du gène codant pour la triosephosphate isomérase (Snowdon et al., 1996).
De manière avantageuse, la cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites 'leaders'. De telles séquences peuvent augmenter la 1o traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer - le leader EMCV (EncephaloMyoCarditis Virus 5' noncoding region) (Elroy-Stein et al., 1989), - le leader TEV (Tobacco Etch Virus) (Carrington and Freed, 1990), - le leader du gène BiP codant pour la protêine de liaison à la chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine (Macejack et al., I99I), - le leader AMV RNA 4 provenant de l'ARNm de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (Jobling et al. 1987), ~ , .
- le leader du virus de la mosaïque du tabac (Gallie et al., 1989), Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment - le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al. (1980), le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1992), - le terminateur du gène histone (EP 0 633 317), Selon un mode de réalisation préférée, le terminateur de transcription est le terminateur nos du gène de la nopaline synthase d'Ag~obacterium tumefaciehs (Depicker et al., 1992) ou alors la séquence polyA 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al. (1980).
Dans une variante de réalisation de l'invention, lesdites séquences régulatrices comprennent également des signaux d'adressage capables de diriger l'expression spécifiquement dans un type particulier de compartiment cellulaire, par exemple l'espace ' extracellulaire ou l'apoplasme.

9 Comme exemple de signaux d'adressage chloroplastiques, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la petite sous-unité
de Ia ribulose 1,5-bis-phosphate carboxylase oxygénase de Pisum sativum. Comme signaux d'adressage mitochondrial, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la ' sous-unité (3 de l'ATP-ase Fl mitochondriale de Nicotiana plumbaginifolia.
Ces peptides transits, comprenant la méthionine N-terminale, sont normalement clivés dans les chloroplastes ou les rnitochondries. L'expression des protéines dans ces organites a donc également la caractéristique de produire une molécule dépourvue de Ia méthionine N-terminale comme la molécule naturelle.
1o Selon une autre variante, les séquences d'adressage peuvent être des séquences codant pour un peptide signal N-terminal ("prépeptide"), éventuellement en association à un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique (signal du type KDEL ou KTEL), ou un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". La présence du peptide signal N-terminal ou prépeptide permet l'introduction du nëopolypeptide dans Ie réticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de modifications post-traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les N-glycosylations, si la protéine en question présente des sites de N-glycosylation, et la formation des ponts Bisulfures. Pàrmi ces différents signaux, le prépeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le réticulurn endoplasmique, est très utile. I1 s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal 2o hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés et étant d'origine animale ou végétale. De préférence, il s'agit d'un prépeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de la protéine PRl ou PR2.
Normalement, le peptide signal est clivé par une signal-peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du néopolypeptide dans la lumière du RER
(Reticulum Endoplasmique Rugueux). La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale.
Pour obtenir la sécrétion, selon un mode de réalisation de l'invention, on peut par exemple utiliser le peptide signal de Ia sporamine A des racines tubérisées de la patate douce.
Les séquences d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, KTEL, SEKDEL ou HEKDEL.
3o Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et peuvent subsister sur la protéine mature. La présence de ce signal a tendance à
augmenter les rendements en protéines recombinantes.
La présence de séquences de type KDEL ou KTEL à l'extrémité C-terminale des protéines conduit à la rétention de celles-ci dans le rëticulum endosplasmique et donc à une compartimentalisation cellulaire de ces protéines. Cette compartimentalisation peut dans certains cas bloquer l'accessibilité de l'enzyme à son substrat présent dans un compartiment cellulaire différent, conduisant à une inactivité de la protéine. Ainsi, selon une variante, il est possible d'envisager l'élimination de ce type de séquences d'adressage sans perdre l'activité
5 enzymatique de la protéine. L'élimination de ces séquences peut conduire à
une expression apoplastique de la protéine pouvant permettre une meilleure accessibilité de la protéine à son substrat. L'élimination peut conduire aussi à une expression de la protéine dans un autre compartiment que celui où s'exprime son substrat, évitant ainsi une dégradation rapide de l'acide phytique susceptible d'altérer le développement de la graine.
1o L'activité de (enzyme vis-à-vis de son substrat peut donc être contrôlée dans (espace et dans le temps. Eventuellement, une étape ultérieure de broyage de la graine peut être mise en oeuvre pour permettre à (enzyme d'accéder à son substrat.
L'élimination de la séquence KTEL ou KDEL peut être réalisée notamment par la technique d'amplification par PCR en utilisant des amorces spécifiques de la partie C-terminale de Ia protéine juste en amont de la séquence KTEL ou KDEL et en ajoutant sur l'amorce un codon stop.
Les signaux d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, après passage dans le RER, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps protéiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines.
L'adressage de la protéine vers les corps protéiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40 % des protéines par rapport à la matiére sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps protéiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté.
Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant particuliërement préférés, par exemple Ia pro-sporamine. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTTP), ou C-teiminal (CTTP). Dans la mesure où les propeptides sont normalement clivés dès l'entrée de la 3o protéine dans la vacuole, ils ne sont pas présents dans la protéine mature.
L'utilisation du peptide signal ou prépeptide peut conduiré à la glycosylation de la protéine.
En l'absence de tout signal d'adressage, Ia protéine est exprimée dans Ie cytoplasme.

L'invention se ~ rapporte aussi à un vecteur dans lequel est insérée la cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Ce vecteur peut être un plasmide qui peut en outre comprendre un gène marqueur permettant de distinguer une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN étranger transféré. Ainsi, .conformément à
l'invention, le vecteur peut inclure comme gène marqueur, aussi bien des gènes de sélection qui confèrent une résistance à un antibiotique ou à un herbicide, que des gènes rapporteurs.
Parmi les gènes de sélection utilisables, on peut citer - Ie gène sul conférant la résistance à l'herbicide sulfonamide Asulam (W0 98/49316), - le gène nptII conférant la résistance à la kanamycine (Bevan et al., 1983), 1o - le gène hph conférant la résistance à l'hygromycine (Herrera-Estrella et al., 1983), - le gène bar conférant Ia tolérance au bialaphos (White et al., 1990), - le gène EPSPS conférant la tolérance au glyphosate (LTS 5,188,642), le gène HPPD conférant la tolérance aux isoxazoles (W0 96/38567), le gène de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) qui détoxifie le chloramphénicol.
De même, on peut citer comme gènes rapporteurs - le gène codant pour l'enzyme (3-glucuronidase (GUS), - ~ le gène de la protéine de fluorescence verte GFP qui permet de visualiser, sous UV, les cellules transformées, Conformément à l'invention, comme vecteur de clonage ou d'expression comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN
contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des eosmides, des bactériophages, des virus etc... Les plasmides sont néanmoins préférés.
L'invention concerne aussi les hôtes cellulaires, notamment bactériens, contenant Ies vecteurs ci-dessus mentionnés.
L'invention propose également un procédé de production de plantes transgéniques comprenant, entre autres, les étapes de - transformation de cellules de plante avec un vecteur d'expression contenant un fragment d'acide nucléique de la présente invention, - sélection des cellules transformées, - génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant le fragment d'acide nucléique inséré.

La transformation des plantes selon l'invention peut être réalisée par différentes méthodes, connues de l'homme du métier. On peut citer, tout d'abord, les méthodes de transfert direct de gènes telles que la micro-injection dans des cellules d'embryon de la plante (Neuhaus et Coll., 1987) ou l'éleciroporation (Chupeau et Coll., 1989), la précipitation directe avec le polyéthylèneglycol (Schocher et Coll., 1986) ou le bombardement par canon à
particules (Mc Cabe et Coll., 1988).
On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Ag~obacteYium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et Van Montage, 1983) ou d'Agrobacterium rhiaogehes notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation 1o (Chilton et Coll., 1982). La souche bactérienne peut comporter le gène codant pour l'enzyme MIPP végétale, sous le contrôle d'éléments assurant l'expression dudit gène.
La souche bactérienne pourra être transformée par un vecteur dans lequel est insérée une séquence codant ladite enzyme sous le contrôle d'éléments assurant son expression.
Cette séquence est insérée par exemple dans un vecteur binaire tel que pBINl9 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et I~lee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides pTi et pRi. Elle peut aussi être utilement introduite par recombinaison homologue dans un plasmide pTi ou pRi désarmé, tel que pGV 3850 (Zambryski et CoIL, 1983) avant la transformation de la plante.
II a été montrë récemment que des plantes monocotylédones telles que le riz et le maïs pouvaient être avantageusement transformées par Ag~obacterium tumefaciens (Hiei et al.
1994, Ishida et al., 1996).
Selon une méthode préférée de l'invention, les fragments d'acides nucléiques sont introduits dans les cellules par bombardement de particules recouvertes par lesdits fragments.
Le bombardement de particules offre l'avantage d'une transformation rapide.
Généralement les embryons immatures ne subissent qu'un unique bombardement. Toutefois un bombardement répété peut augmenter Ia fréquence de transformation (W0 98/49316).
Après l' étape de transformation, les cellules transformées sont sëlectionnées selon Ies marqueurs phénotypiques utilisés dans le vecteur. Celte sélection s'effectue sur un milieu contenant un agent sélectif approprié. Les cellules transformées ainsi sélectionnées sont alors cultivées et les plantes sont régénérées. Une extraction d'ADN et un Southern blot avec des 3o sondes spécifiques du gène d'intérêt permettent de confirmer la transformation. Les méthodes permettant d'isoler l'ADN à pârtir de matériels biologiques en culture et de vérifier la présence de l'insert sont bien connues de l'homme du mëtier, elles sont, entre autres, décrites pax Southern et al., 1975 et Mullis et al., 1987.

La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé pour accroître l'activité phytasique d'une plante, caractérisé en ce qu'on induit une surexpression d'une MIPP, plus particulièrement de maïs, de riz ou de blë, dans ladite plante à
l'aide d'une cassette d'expression telle que décrite auparavant et selon le procédé
précédent.
On entend ici par "surexpression" aussi bien une augmentation du taux de MIPP
par rapport au taux exprimé dans une plante normale, qu'une expression ectopique de cette enzyme, dans un tissu ou un compartiment et/ou à un stade de développement où
celle-ci n'est normalement pas exprimée.
Conformément à la présente invention, la séquence étrangère peut être 1o hétérologue, c'est-à-dire qu'elle provient d'une plante différente de la cellule hôte. Il peut aussi s'agir d'une séquence de la MIPP naturellement produite par la plante.
La présente invention a également pour objet des hôtes végétaux, consistant en des plantes ou organes végétaux, transformés avec un ou plusieurs acides nucléiques de l'invention et selon le procédé défini ci-dessus. Si la transformation implique plusieurs gènes d'intérêt, alors ceux-ci peuvent être insérés dans une même cassette d'expression ou alors dans des cassettes d'expression diffërentes.
Le terme de 'hôtes végétaux' englobe aussi bien les plantes que les cellules de plantes ou les différentes parties de la plante, telles que seménce, fuit ou feuille.
On peut citer, comme exemples de plantes transgéniques selon l'invention, les céréales, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le seigle, le riz, préférentiellement le maïs, ainsi que le pois, Ie soja et Ia pomme de terre.
Ces plantes transgéniques de (invention englobent aussi bien les plantes de première génération, que leurs descendants (lignées ou hybrides, notamment).
La présente invention a plus particulièrement pour objet des hôtes végétaux transgéniques dans lesquels une MIPP végétale, plus particulièrement de maïs, de blé ou de riz, peut être exprimée dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire où cette enzyme n'est pas produite naturellement ou seulement en faibles quantités. Ces hôtes végétaux sont caractérisés par un génome dans lequel on a introduit une cassette d'expréssion selon l'invention comportant des séquences régulatrices qui induisent une expression spécifique dans ladite partie de la plante ou ledit compartiment cellulaire.
L'hôte végétal en question est avantageusement une céréale et plus avantageusement encore le maïs, le blé et le riz, ou leurs organes.

La présente invention concerne plus précïsément une plante transgénique, -selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle produit des semences transgéniques exprimant une quantité accrue d'enzymes à activité phytasique.
La présente invention comprend également les semences de cette plante transgénique et notamment les semences comportant une teneur en MIPP végétale accrue, obtenue par expression spëcifique d'une des séquences d'acide nucléique selon la présente invention, dans la semence.
Par ailleurs, la farine et tout produit susceptible d'être obtenu à partir de cette semence font aussi partie de l'invention.
1o Enhn, Ia prësente invention a pour objet une composition pour l'alimentation humaine ou animale comprenant des semences, une farine de semences ou une MIPP
végétale, produites selon la présente inventïon.
Selon un mode de réalisation, les acides nucléiques définis par l'invention peuvent être utilisés comme marqueur du phénotype lié à l'expression de protéines MIPP.
L'invention permet l'utilisation des fragments nucléotidiques comme marqueurs moléculaires dans des programmes de culture, notamment dans la sélection de variétés exprimant une protéine MIPP ou une plante transformée avec une séquencé codant pour cette MIPP.
Selon la présente invention, ces séquences permettent l'obtention des ADN
génomiques par des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par le criblage de banques génomiques suivant les indications de Sambrook et cil. (1989, Molecular cloning : a laboratory manuel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). De même au moyen de sondes dégénérées elles permettent l'identification de gènes codant pour des protéines homologues aux MIPP végétales.
Les plantes transgéniques exprimant la MIPP végétale selon l'invention ou l'enzyme elle-même peuvent être utilisées à des fins variées, dans toute situation où l'activité
phytasique de cette enzyme est nécessaire ou désirée.
3o La MIPP végétale est ainsi utile dans les procédés de préparation alimentaire ou dans les procédés d'extraction de l'amidon (procédé de trempage). Par exemple, avec cette enzyme, il est possible d'augmenter l'extractibilité des amidons des grains où
elle s'exprime.
Le phytate fait précipiter les protéines avec l'amidon de sorte que si l'on réduit le taux de phytate, l' extraction de l' amidon s' en trouve facilitée. L' aj out d'une enzyme à activité

phytasique aux grains de plantes à partir desquels on souhaite extraire l'amidon permet de pallier la précipitation des protéines par les phytates.
Une plante transformée avec une séquence codant pour une MIPP végétale selon le procédé défini par l'invention, ou une partie de celle-ci, peut être utilisée pour améliorer la 5 digestibilité du phytate, dans la ration alimentaire d'animaux monogastriques, et par conséquent, réduire le taux de phytate dans le fumier ou lisier.
L'activité phytasique de la MIPP végétale peut être également mise à profit pour valoriser les eaux de trempage récupérées ou les eaux de brassage, lors de préparations alimentaires. En particulier, la disponibilité accrue du phosphore rend ces eaux très utiles 1o comme additifs pour milieux de culture ou supports de fermentation.
En outre, l'activité phytasique générée permet une meilleure récupération de l'inositol et de ses dérivés à partir des eaux de trempage ou de brassage.
L'invention concerne également l'utilisation d'une MIPP végétale selon l'invention ou l'utilisation de tout ou partie de plantes contenant une MIPP
selon l'invention, 15 à des fins thérapeutiques ou diététiques, notamment pour la production de myo-inositol et/ou pour la diminution de l'acide phytique.
L'acide phytique a été tenu pour responsable de certains impacts sur la santé
humaine tels que la malformation des os, l'ostéosporose et les anémies causées par des carences en fer, ou des interférences avec l'assimilation du calcium, du magnésium et du zinc (Berlyne et al., 1973; Shan et al., 1979).
Le myo-inositol, forme nutritionnelle active de l'inositol, est un constituant du phospholipide phosphatidylinositol. Il est connu pour ses vertus dans le domaine de la santé.
On lui a souvent attribué des effets sur la diminution de la concentration des triglycérides et du cholestérol dans le sang, et plus généralement pour la protection contre les maladies cardiovasculaires. De plus, il est reconnu que les composés issus d'un phospholipide tel que le myo-inositol ont des effets bénéfiques sur l'insomnie et l'anxiété. Par ailleurs, la névropathie périphérique du diabétique est une des complications les plus paralysantes du diabète. Or, on suppose depuis déjà plusieurs années qu'une diminution du taux de myo-inositol est associée aux dégâts des fibres nerveuses des diabétiques souffrant d'une telle complication.
3o L'invention concerne enfin l'utilisation de la MIPP végétale, selon l'invention, pour libérer le phosphate inorganique directement assimilable par les monogastriques (Pointillard, 1994) et/ou améliorer la disponibilité des cations chélatés par Ia phytine tels que le fer, le calcium, le magnésium ou le zinc, Ceci évite des ajouts de compléments dans les râtions animales et permet d'augmenter la valeur nutritive de la graine.

LEGENDES DES FIGURES
La Figure 1 représente un alignement des séquences nucléiques codant pour les MIPP de maïs et de riz.
La Figure 2 représente un alignement des séquences protéiques de MIPP de riz et de maïs.
La Figure 3 représente une comparaison des séquences d'acides aminés des MIPP
de riz et de maïs avec des MIPP animales, des phophatases acides et des phytases fongiques l0 La Figure 4 est une carte de restriction du plasmide pRD-257.
La Figure 5 est une carte de restriction du plasmide p3214.
La Figure 6 est une carte de restriction du plasmide pBIOS 421.
La Figure 7 est une carte de restriction du plasmide pBIOS 422.
LISTE DES SE(?UENCES
SEQ ID N°1 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de maïs SEQ ID N°2' : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de maïs (ZxnMIPP) SEQ ID N°3 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de riz SEQ ID N°4 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de riz (OsMIPP) SEQ ID N°5 : Oligonucléotide 5'olZMPI utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de I'ADNc ZmMIPP.
SEQ ID N°6 : Oligonucléotide 3'oIZMP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc ZmMIPP.
SEQ ID N°7 : Oligonucléotide interne oIMIPP 1.
SEQ ID N°8 : Oligonucléotide interne oIMIPP2.
SEQ ID N°9 : Oligonucléotide 5'olOSP utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.
SEQ ID N°10: Oligonucléotide 3'olOSP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.
3o SEQ ID N°11: Oligonucléotide 5'oIOSPl utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.
SEQ ID N°12 : Oligonucléotide oIMIPP9 utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.
SEQ ID N°13 : Oligonucléotide oIMIPP10 utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.
SEQ ID N°14 : Séquence nucléique de l'EST 3'TaMIPP.
SEQ ID N°15 : Peptide signal putatif SEQ ID N°16 : Peptide signal putatif SECS ID N° 17 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de maïs SEQ ID N° 18 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de maïs (ZmMIPP) 1o EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Isolement des clones d'A.DNc codant pour une protéine MIPP
végétale.
Les séquences de MIPP végétales peuvent être obtenues en réalisant une étude-de bioanalyse à partir de séquences codant pour des MIPP animales, présentées par Caffrey et al.
(1999). Ces séquences permettent ainsi de définir des homologies avec des séquences ADNc référencées, par exemple, dans des bases de données spécifiques au maïs, au blé et au riz. En identifiant les EST spécifiques aux séquences homologues desdites séquences animales, des oligonucléotides peuvent alors être définis et utilisés comme amorces pour isoler par PCR ces 2o ADNc d'intérêt à partir de banques d'ADNc ou d'ADNc.
1.1- MIPP de maïs (ZmMIPP) 1.1.1 - Choix de la variété
Deux lignées de Zea Mays ont été utilisées : la lignée B73 et l'hybride HiII
(un de ses parents étant la lignée B73). L'extraction d'.A.RN totaux a été réalisée sur des feuilles immatures pour la lignée B73 et sur des cals pour l'hybride HiII (Armstrong et al., 1991) Conditions de culture Feuilles immatures 40 graines B73 sont mises dans du terreau et placées en serre. Pour la récolte des feuilles immatures, on attend Ie stade où 7-8 feuilles sont visibles soit environ 3-4 semaines en serre. Les feuilles immatures sont encore dans le cornet. TJn. prélèvement à 3 semaines et à
4 semaines a été effectué.
Des feuilles immatures ont été également prélevées à 2 semaines après germination.

Obtention de cals de t;r~e II
Le prélévement des épis est réalisé lorsque les embryons immatures ont atteint une taille de 1,5 mm à 2 mm c'est à dire 10 jours après la fécondation. Les épis récoltés sont débarrassés de leurs spathes et de leurs soies puis sont désinfectés au Domestos~ 20% (v/v) pendant 15 minutes sous agitation. Les épis sont rincés trois fois à Peau stérile. La partie supérieure du grain est coupée de façon à découvrir (albumen, puis une légère pression sur le grain permet de dégager (albumen. L'embryon immature qui se trouve encore dans le grain est extrait puis déposé sur le milieu de callogénèse N6P6 (Sels N6 3,98 %
(p/v) (Sigma C1416) ; vitamines N6 5ml/L ; L-proline 0,7 % (p/v) ; hydrolysat de caséine 0,1 % (p/v) ;
saccharose 20 % (p/v) ; 2,4-D 0,001 % (p/v) ; phytagel 2,5 % (p/v), pH 5,8) en (orientant côté
plat sur la gélose. Les embryons sont mis en culture pendant 15 jours en chambre de culture à
26°C et à (obscurité. Les embryons sont séparés de leur radicule puis repiqués sur un nouveau milieu N6P6. Le cal qui prolifère est repiqué toutes les 2 à 3 semaines sur milieu N6P6 (boîte de 16 cals). Les cals sont multipliés en chambre de culture à 26 °C et à (obscurité.
1.1.2. - Extraction des ARN totâux et synthèse des ADNc L'extraction des ARN totaux a été réalisée selon Ia méthode décrite par Verwoerd et al. (1989).
Pour chaque tissu deux extractions d'ARN totaux ont été faites.
Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit SMART PCR cDNA synthesis I~it, commercialisé par Clontech, ont été suivies.
1.1.3 - Isolement d'un clone d'ADNc ZmMIPP de maïs Les oligonucléotides, utilisés comme amorces PCR pour le criblage des ADNc sont présentés en annexe.
Les oligonucléotides ont été déterminés à partir des séquences nucléiques des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MIPP animales. Les oligonucléotides qui encadrent la séquence codante du gène ZmMIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : NcoI ou Ndel et en 3' :
BamHI, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b (Novagen). Les oligonucléotides internes oIMIPP1 et oIMIPP2 (SEQ ID N° 7 et 8), qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.
Amplification PCR

La manipulation a été répétée sur deux pools différents°~d'A.RN totaux pour une même espèce et un même tissu.
La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux.
Le couple d'oligonucléotides 5'oIZMPl-3'olZMP (SEQ m N° 5 et 6) sur Ies ADNc de feuilles immatures et de cals a permis l'amplification d'un fragment de 1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides 5'olZMP1-oIMIPP2 (SEQ ID N° 5 et 8), et olMIPPl-3'olZMP (SEQ DJ N°7 et 6), olMIPPl et oIMTPP2 étant des oligonucléotides internes spécifiques de la séquence consensus RHGXI~, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans Ie fragment de 1,6 kb. Par conséquent, iI a été cloné dans pGEM-T
(Promega) et séquencé.
1.1.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse La séquence d' acide nucléique et la~ séquence d' acides aminés sont présentées en annexe, respectivement par SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2. Elles sont valables pour le clone d'ADNc de feuilles immatures et le clone d'ADNc de cals de maïs. En effet le séquençage â
montré qu' elles sont identiques. L' analyse des séquences nucléotidiques a été réalisée avec le logiciel N1AC vECTOItTM 6.5.3 - Oxford Molecular.
Cas~actéristiques bioclainaiques de ZmMIPP (par le logiciel MAC VECTCRTI''' 6.5.3 - Oxford Molecular) Masse moléculaire calculée 58,6 kDa pI 8,95 Avec les logiciels de détection de motifs protéiques (SEQWEB version 1.1 -Wisconsin Package Genetic Computer Group), identification de - un peptide signal putatif de 25 acides aminés à l'extrémité N-terminale de Ia protéine MGMA.APRAPLPLPQLLLLLVAALLA (SEQ.>I3 N°15) - un signal de rétention putatif dans le réticulum endoplasmique à l'extrémité
C-terminale de la protéine : KTEL
1.2 - MIPP de Riz (OsMIPP) 1.2.1 - Choix de la variété

Le matériel végétal est Oryza sativa japonica, variété Nipponbare.
L'extraction d'ARN est réalisée à partir de cals de riz.
Conditions de culture 5 Induction des cals de riz. Les grains de riz à maturité sont dëbarrassés de leurs enveloppes externes, désinfectés 1 min dans l'éthanol 70% (v/v) et 30 min dans le domestos 50% (v/v). Les grains sont rincés dans de l'eau distillée stérile et déposés sur le milieu N6P6 contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont scellées et placées 21 jours dans l'étuve à
28°C à l'obscurité. A partir du scutellum de l'embryon, un cal primaire se développe. Autour 1o du cal primaire, des petites unités embryogènes s'individualisent, elles sont transférées dans des boîtes de Pétri contenant le milieu N6P6 et incubées pendant 14 jours à
28°C et à
l'obscurité. Pendant cette période, leur taille va augmenter. Les cals sont ensuite prélevés pour l'extraction d'ARN.
1.2.2 - Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc 15 L'extraction d'ARN totaux a été réalisée selon la méthode décrite par Verwoerd et al. (1989).
A partir des cals, deux extractions d'ARN totaux ont été réalisées.
Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit SMART PCR cDNA synthesis Kit, commercialisé par Clontech, ont été suivies.
1.2.3 - Isolement d'un clone d'ADNc OsMIPP de riz Les oligonucléotides utilisës ont étë déterminés à partir des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MIPP
animales. Les oligonucléotides qui devraient encadrer la séquence codante du géne MIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : NcoI ou NdeI et en 3' : BamHI, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b. Les oligonucléotides internes qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.
Amplification PCR
La manipulation a été répétée sur deux pools différents d'ARN totaux pour une même espèce et un même tissu.
La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux.

La réaction d'amplification avec les coûples d'oligonucléotides 5'olOSP-3'olOSP
(SEQ ID N° 9 et 10) ou 5'olOSPl-3'oIOSP (SEQ ID N° 11 et 10) sur les ADNc de cals génère un fragment de 1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides 5'olOSP1-oIMIPP2 et oIMIPP1-3'oIOSP, oIMIPP1 et oIMIPP2 étant des oligonucléotides internes, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans le fragment de 1,6 kb. Par conséquent, il a été cloné dans pGEM-T (Promega) et séquencé.
1.2.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse 1o La séquence d'acide nucléique et la séquence d'acides aminés sont en annexe, respectivement par SEQ ID N° 3 et 4.
Caractéristiques biochimiques de OsMIPP :
Masse moléculaire calculée 56,5 kDa pI 8,3 Avec les logiciels de dëtection de motifs protéiques, identification de - un peptide signal putatif de 18 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine MAAPRTPLPLVLLLVSA.A (SEQ ID n°16) - un signal de rétention dans le réticulum endoplasrnique à l' extrémité C-terminale de la protéine : KSEL
1.3 - Analyse des séquences protéiques déduites des clones d'ADNc OsMIPP et ZmMIPP
1.3.1 - Comparaison OsMIPP et ZmMIPP
Les séquences protéiques des protéines MIPP de riz et de maïs sont fortement homologues entre elles. Les résultats de cet alignement, obtenù au moyen du logiciel MAC
VECTORTM 6.5.3 - Oxford Molecular, sont présentés en annexe, figure 1.
1.3.2 - Comparaison entre OsMIPP/ZmMJPP et phosphatases acides 3o Une bioanalyse avec les séquences protéiques clonées par les ADNc, comme précédemment, met en évidence des homologies avec deux familles de phosphatases acides Ies MIPP animales et Ies phytases fongiques. Les résultats de cette étude sont présentés en annexe, figure 3.

Les MIPP sont des protéines décrites uniquement dans le domaine animal. Ces protéines hydrolysent les composés inositol polyphosphate, particulièrement les tétra-, penta-, et hexa-inositol phosphate, par conséquent l'acide phytique (Craxton et al., 1997). Ceci suggère que les ADNc de maïs et de riz ainsi clonés codent pour des enzymes homologues des MIPP animales, avec notamment une activité phytasique.
1.4 - Obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé
La comparaison des caractéristiques biochimiques des MIPP de riz et de maïs avec la phytase de blé met en évidence des similarités Riz* Maïs* Blé° (Johansen et al., 1997) Masse moléculaire kDa 56.5 ~ 2.5 58.6 ~ 3.5 47 pI 8.3 8.95 7.4-8.2 valeurs calculées.
° valeurs apparentes.
De plus, il a été constaté que les MIPP des plantes sont homologues aux MIPP
animales et aux phytases fongiques, protéines pour lesquelles une activité
phytasique est décrite.
Ces deux constatations montrent fortement que la phytase de son du grain de blé
est une MIPP.
Les grains de blé T~~iticum aestivum à différents stades de développement :

10, 20, et 40 jours après anthère (JA.A) ont été utilisés comme matériel végétal.
Chez le blé, la fécondation a lieu dans la fleur encore fermée, par conséquent elle 25 n'est pas visible. Lorsqu'elle a eu lieu, les anthères apparaissent, c'est Ia floraison. Cette étape correspond également à la fin de I'anthèse ou développement des anthères.
C'est à partir de ce moment que sont comptés les jours correspondant à la période de développement du grain.
Les. auteurs de l'invention réalisé une cinétique de l'activité phytasique d'une fraction du grain enrichie en son au cours du développement à 10, 20, 30 et 40 JAA. Cette 30 activité phytasique augmente au cours du développement du grain. Cettë
augmentation peut s'expliquer par une activation des enzymes et/ou par une accumulation des enzymes dans le son au cours du développement du grain.
L'extraction des ARN totaux a ensuite été effectuée pour les 4 stades : 10, 20, 30, JAA. Des cinétiques d'expression, c'est à dire des Northern blots, avec la sonde OsMP

(nucléotide 105 au nucléotide 1506 - séquence correspondant aux 467 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine) ou la sonde ZmMP nucléotide 1 au nucléotide (séquence correspondant aux 524 acides aminés de la protéine), ont été
rëalisées sur les ARN
totaux extraits à partir de son de grain prélevé à 10, 20, 30 et 40 JAA.
s Par ailleurs, les ADNc correspondant aux ARN totaux extraits de son prélevé
aux 4 stades de développement du grain, ont été synthétisés.
L'isolement de l'ADNc MIPP de blé est effectué par RT-PCR ou par RACE-PCR.
Les oligonucléotides utilisés pour les réactions d'amplification, sont déterminés à partir des séquences nucléiques des clones d'ADNc MIPP de riz et de maïs dans les zones oû les i0 homologies de séquences sont les plus fortes. On peut également utiliser des oligonucléotides dégénérés, déterminés à partir des séquences d'acides nucléiques, notamment celle de riz et de maïs, correspondant aux régions N et C-terminales des MIPP vëgétales.
Par ailleurs, la séquence nucléique de l'ADNc OsMIPP a été utilisée pour rechercher des séquences homologues dans des bases d'EST de blé Ti~iticum aestivum. Un 15 EST issu d'ADNc de bIé a été retenue, elle est nommée 3'TaMIPP (SEQ ID
N°14). La séquence protéique déduite de l'EST présente une forte homologie avec les 58 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine OsMIPP. Cette EST a été utilisée pour définir deux amorces oIMIPP9 et oIMIPP10 (SEQ ID N°12 , SEQ I17 N°13). Ces amorces combinées avec l'amorce Smart II oligonucléotideTM du kit SMART PCR cDNA synthesis Kit (Clontech), 2o permettent d'isoler par PCR un ADNe codant pour une MIPP de blé. La PCR
gënère divers fragments qui sont séparés en gel d'agarose, transférés sur une membrane nylon et hybridés avec la sonde ZmMP. Les fragments reconnus pax la sonde ZmMP sont homologues à
ZmMIPP.
EXEMPLE 2 : Production des protéines ZmMIPP et OsMIPP
chez E.coli et évaluation de l'activité~h tasidue des protéines recombinantes 2.1- Clonage dans le vecteur d'expression pET-14b 3o Le site de réstriction NdeI, amené par les oligonucléotides 5'olZMP1 et 5'oIQSPl et le site de restriction BamHI, amené par les oligonucléotides 3'olZMPl et 3'oIOSPl, encadrent les ADNe ZmMIPP et OsMIPP. Ils permettent le clonage orienté et en phase dés ADNc aux sites de restriction NdeI et BamHI du vecteur d'expression bactérien pET-14b (Novagen). Les vecteurs obtenus pET-OsMIPP et pET-ZmMIPP ont été vérifiés par séquençage.

2.2 - Production des MIPP chez E. coli La. production des protéines se fait selon les recommandations du fournisseur Novagen. Des bactéries E. coli souche BL21(DE3)pLysS ont été utilisées. Le vecteur pLysS
permet d'éviter l'expression de la protéine recombinante alors que la production n'a pas été
induite et facilite la lyse des cellules car il porte le gène codant pour le lysozyme du phage T7:
Des bactéries E. coli souche BL21(DE3)pLysS sont transformées avec les vecteurs pET-OsMIPP et pET-ZmMIPP ; ces transformants bactériens servent respectivement pour la production des protéines OsMIPP et ZmMIPP. Des bactéries E. coli souche BL21(DE3)pLysS sont transformées avec pET-14b ; ces transformants bactériens servent de contrôle négatif de production. Des bactéries E. soli souche BL21(DE3)pLysS
sont utilisées également comme contrôle négatif de production.
Chaque transformant bactérien est mis en culture dans 5 ml de milieu LB
(milieu de Luria-Bertani) en présence des antibiotiques adéquats à 37°C sous agitation (175 rpm) pendant 15 heures. Deux antibiotiques sont utilisés : la carbénicilline et le chloramphénicol.
La résistance au chloramphénicol est apportée par le vecteur pL~sS
(concentration utilisée 30 ~,g/ml). La résistance à la carbénicilline est apportée par le vecteur pET-14b (concentration 2o utilisée : 50 ~,g/rnl). L'utilisation appropriée d'un ou des deux antibiotiques permet de sélectionner Ies transformants bactëriens qui contiennent les vecteurs pLysS
et/ou pET-14b.
Un volume de 1 ml de chaque préculture est utilisée pour ensemencer un volume de 100 ml de milieu LB avec les antibiotiques adéquats contenu dans un erlenmeyer de 500 ml. Les cultures sont incubéés à 37°C, sous agitation (175 rpm), jusqu'à ce que la densité optique à
600 nm .soit de D06oonm = 0,6. Lorsque la D06oonm = 0,6 : les 100 ml de milieu LB sont répartis équitablement dans deux erlenmeyer de 250 ml. Le premier sert à la production de protéines. L'induction de la production se fait par ajout de 500 ~,1 d'IPTG
100 mM soit une concentration finale de 1 mM. La production sé fait pendant 6 h à 30°C
sous agitation (175 rpm). Le second erlenmeyer sert de témoin non induit. Il est incubé 6 h à
30°C sous 3o agitation (175 rpm).
Aprés production, la culture bactérienne est centrifugée à 3000 rpm pendant S
min à 4°C. Le culot bactérien est repris dans un volume de tampon TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) tel que le rapport volume TE l volume culture soit de 1120. Les bactéries sont stockées à -80°C. Les bactéries sont lysées en deux étapes : une étape de congélation-décongélation (deux cycles congélation à -80°C / décongélation à
37°C), une étape d'ultrasons : 3 fois 15 s, 30 %, 4 pulses / s. Entre chaque cycle, l'échantillon est placé dans la glace. Un cocktail d'inhibiteurs de protéases est ajouté au lysat bactérien, qui contient les protéines bactériennes et les protéines hétérologues, afin de les préserver.

2.3 - Dosage protéique La concentration en protéines totales des extraits est évaluée selon la méthode de Bradford (1976). Dans une plaque de microtitration, 2 ~,I de lysat bactérien sont ajoutës à
l0 200 ~,1 de réactif de Coornassie (Bio-Rad protein assay). Pour le témoin négatif, l'extrait protéique est remplacé par 2 ~1. de tampon TE pH 8,0. Aprés homogénéisation, Ies absorbances sont lues à 595 nm avec un fluorimètre (Labsystems Genesis V2.00) assisté du logiciel (Labsystems). La quantité de protéines est déterminée d'après une courbe étalon réalisée avec de l'albumine de sérum bovin (1 mg/ml).
2.4 - Analyse des extraits protéiques par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE) Elle a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970) en suivant les instructions de Bio-Rad.
2o Le gel de séparation est à 10 % de polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide, 29/l, p/v) contenant du Tris-HCl 0,38 M pH 8,8 et du SDS 0,1 (p/v). Le gel de concentration est à 4 % de polyacrylamide contenant du Tris-HCl 0,12 M pH 6,8 et du SDS 0,1 % (p/v). La polymérisation du gel s'effectue en présence de persulfate d'ammonium 0,05 %
(p/v) et de Temed 0,078 % (v/v). Une quantité de 40 qg de protéines est utilisée pour l'analyse SDS-PAGE. Les protéines sont reprises dans le tampon de dépôt composé de Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, de glycérol 12,5 % (v/v), de SDS 1 % (p/v), de bleu de bromophénol 0,005 % (p/v), , en présence de dithiothréitol 100 mM et/ou de 2-mercaptoéthanol 360 . Les échantillons sont incubés à 100°C pendant 5 minutes avant dépôt ~en gel. Des protéines précolorées BENCHMARK prestained protein ladder (Gibco BRL) sont utilisées comme marqueurs de 3o masses moléculaires. Le tampon de migration est composé de Tris-base 25 mM, de glycine 0,2 M et de SDS 0,1 % (p/v). L'électrophorèse est réalisée à voltage constant 150 volts pendant 1 heure à température ambiante. Après migration, le gel est rincé
trois fois 10 minutes dans de l'eau, les protéines sont colorées par une solution de bleu de Coomassie 6250 (Bio-Safe Coornassie, Bio-Rad) pendant Z heure, le gel est ensuite rincé
dans l'eau, à
température ambiante.
L'analyse SDS-PAGE a été réalisée sur des extraits bactériens bruts. La présence de la protéine hétérologue dans la culture bactérienne aprés ïnduction de la production est difficile â déterminer. Une analyse par Western blot avec un anticorps approprié permet de confirmer la présence de la protéine hétérologue. En effet, dans ce cas, la protéine hétérologue a l'avantage d'être synthétisée avec un peptide à son extrémité N-terminale.
Des anticorps spécifiques de ce peptide sont commercialisés et peuvent être utilisés pour mettre en évidence la protéine hétérologue. Ceci va dans le sens des travaux de Craxton et al.
(1997) : lors des 1o essais de production chez E. coli d'une MIPP animale, la protéine n'a pu être détectée que par irnmunodétection.
2.5 - EvaIuation de l'activité phytasique L'activité phytasique est déterminée par le dosage de phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium. La mesure de l'activité phytase est réalisée directement sur Ies lysats bactériens. .
Dans un tube Ependorf de 1,5 ml, on mélange 75 ~,1 de lysat bactérien avec 300 p,1 d'une solution contenant du phytate de sodium 5 mM, de l'acétate de sodium 0,25 M pH 4,8, du CaCl2 1 rnlVl. La réaction enzymatique se fait pendant 1 heure à
55°C. Pour chaque essai, un témoin identique est gardé à 0°C pendant l'incubation. Ce témoin utilisé comme zéro, permet d'éliminer les absorbances possibles dues aux exiraits protéiques eux-mêmes. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 375 ~,l d'acide trichloroacétique 20 % (p/v), suivie d'une centrifugation à 8000 rpm pendant 15 minutes et à 4°C qui permet de précipiter les protéines. Le dosage du phosphate libre se fait sur le surnageant. A 750 p,1 de surnageant, on ajoute 750 ~,1 du réactif suivant : FeS04 0,38 M, H2SO4 0,16 N / molybdate d'ammonium 12 mM, H2S04 1 N, 1 / 4, v/v. L'absorbance est mesurée à 690 nrn. La quantité
de phosphate est déterminée à partir d'une courbe standard. L'activité phytasique est exprïmée en nmoles de phosphate libéré par heure, par mg de protéines totales à 55°C.
L'activité phytasique a été réalisée sur des extraits bactériensUne étape de purification de la protéine hétérologue à partir des extraits bactériens bruts est néanmoins préférable pour améliorer l'interprétation des résultats. Ceci est aisément envisageable de part la présence du peptide à l'extrémité N-terminale de la protéine hétérologuetqui permet de la ._ purifier par chromatographie d'affinité.
EXEMPLE 3 : Construction de gènes chimériques.
3.1- Pour une expression ectopique constitutive de OsMIPP
Pour obtenir une expression constitutive, le promoteur pCsVMV (Verdaguer et al., 1996, 1998) du virus de la mosaïque de la nervure du manioc est utilisé.
I0 Le construit est réalisé de la façon suivante - Le fragment CIaI-sacII de 556 pb du vecteur pRD 257 (figure 4) contient le promoteur pCsVMV. Ce fragment est cloné dans le vecteur p3214 (figure 5) digéré par ClaI
et EcoRI. Le vecteur obtenu est nommé vecteur pBIOS 366. Il contient le promoteur pCsVMV et le terminateur ter nos.
- L'ADNc OsMIPP a été cloné dans le vecteur pGEM-T (Promega) donnant le vecteur pBIOS 367. Le vecteur pBIOS 367 est digéré par NotI génèrant un fragment de 1563 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est cloné dans le vecteur pBIOS

digéré par PstI. On obtient le vecteur pBIOS 368 qui contient la cassette :
promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos.
2o - Le vecteur pBIOS 368 est digéré par XhoI, ce qui permet de sortir la cassette : promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos. Elle est clonée au site .~hol du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur pBIOS 273 contient l'ADN-T d'Arabidopsis thaliana dans lequel se trouvent le promoteur pAct1 et le premier intron du gène Actl de riz, la séquence codante du gène bar et le terminateur nos. Le vecteur obtenu est le vecteur pBIOS 369. Le vecteur pBIOS 369 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pCsVMV et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 369 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une 3o origine de réplication fonctionnelle chez E. coli 3.2 - Pour une expression ectop~ue tissu-s~écifirlue de OsMIPP

Pour obtenir une expression albumen-spécifique, le promoteur pHMWG :du gène codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée de blé (HMWG : High Molecular Weight Glutenin) est utilisé.
Le construit permettant l'expression de OsMIPP dans le cytoplasme des cellules de l' albumen est réalisé de la façon suivante - La digestion par l'enzyme EcoRI du vecteur pBIOS 367 génère un fragment de 1547 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est cloné au site EcoRI du vecteur p3214 entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter nos. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 370.
- La digestion du vecteur pBIOS 370 par l'enzyme ~'hoI génère un fragment de 2287 pb qui est cloné au site XhoI du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur obtenu est nommé
pBIOS 271. Le vecteur pBIOS 371 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.
3.3 - Pour une expression ectopidue albumen-spécifidue de ZmMIPP
Pour obtenir une expression albumen-spécifique, le promoteur pHMWG du gène codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée de blé (HMWG : High Molecular Weight Glutenin) est utilisé.
Le construit permettant (expression de ZmMIPP dans les cellules de l'albumen est réalisé de la façon suivante - La digestion par les enzymes EcoRI et BarnHI du vecteur ZM4 (fragment ZmMIPP dans le vecteur pGEM-T easy) génère un fragment de 1600 pb contenant fADNc ZmMIPP complet. Ce fragment est cloné aux sites EcoRI et BamHI du vecteur P3214 (figure 5) entre le promôteur pHMWG et le terminateur ter NOS. Le vecteur obtenu est appelé
vecteur pBIOS 421 et décrit figure 6.
- La digestion du vecteur pBIOS 421 par les enzymes SacI et .SaII génère un fragment de 2335 pb. L'extrémité du fragment de 2335 .pb digéré par (enzyme SacI est rendue franche par un traitement à fexonucléase 3'-5' portée par (enzyme T4 DNA
polymérase de New England Biolabs. Ce fragment est ensuite cloné aux sites PmeI et XhoI d'un vecteur binaire dérivé de pSBl2 (Japan Tobacco, EP 672 752) dans lequel a été insérée une cassette d'expression du gène de sélection décrite ci-dessus. Le veoteur obtenu est nommé pHMWG-ZmMIPP-JT. Le vecteur pHMWG-ZmMIPP-JT comporte d'une part (ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène ZmMIPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter NOS, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar (White et al, 1990) inséré entre le promoteur pActlet le premier intron Actl de riz et le terminateur ter NOS. La cassette d'expression du gène de sélection est également insérée entre les éléments transposables Ac/Ds (Lechelt et al, 1989) qui permettent une excision de la cassette de sélection après action d'une transposase. D'autre part le vecteur pHMWG-ZmMIPP-JT
contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication 1o chez E. coli.
3.4 - Pour une expression ecto~pique embryon-spécificiue de ZmMIPP
Pour obtenir une expression embryon-spécifique, et plus particulièrement scutellum-spécifique, le promoteur pHyPRP du gène codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs (HyPRP : Hybrid Proline Rich Protein) est utilisé.
Le construit permettant l'expression de ZmMIPP dans les cellules de (embryon est réalisé de la façon suivante - La digestion par les enzymes ApaI et NdeI du vecteur pBIOS 413 (fragment pHyPRP dans vecteur pBluescript) génère un fragment de 2162 pb contenant le promoteur du gène pHyPRP décrit par Josè-Estanyol et al (1992). Ce fragment est cloné aux sites ApaI et NdeI du vecteur pBIOS 421 devant fADNc ZmMIPP complet et le terminateur ter NOS. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 422 décrit figure 7.
- La digestion du vecteur pBIOS 422 par les enzymes SacI et ApaI génère un fragment de 4050 pb. Les extrémités du fragment de 4050 pb sont rendues franches par un traitement à fexonucléase 3'-5' portée par (enzyme T4 DNA polymérase de New England Biolabs. Ce fragment est ensuite cloné aux sites PmeI et XhoI du vecteur binaire pBIOS
342, les extrémités du vecteur étant rendues franches par un traitement avec (enzyme T4 DNA polymérase de New England Biolabs. Ce fragment est ensuite cloné aux sites PmeI
et XhoI d'un vecteur dérivé depSB112 (Japan Tobacco EP 672 752) comme décrit dans (exemple précédent. Le vecteur obtenu est nommé pHyPRP-ZmMIPP-JT. Le vecteur pHyPRP-ZmMIPP-JT comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène ZmMIPP, inséré entre le promoteur pHyPRP et le terminateur ter NOS, la cassette d'expression du gène de sélection, Ie gène Bar inséré entre le promoteur pActlet Ie premier intron Actl de riz et Ie terminateur ter NOS. La cassette d'expression du géne de sélection est également insérée entre ,les éléments transposables Ac/Ds qui permettent une excision de la cassette de sélection après action d'une transposase. D'autre part le vecteur pHyPRP-ZmMIPP-JT contient également le gène de la résistance à
la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.

EXEMPLE 4 : Production de maïs transformé
4.1- Transformation du maïs par bombardement de particules La transformation génétique du maïs par bombardement de particules se fait sur 1o des cellules de cals friables embryogènes ou cals de type II. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype HiII ou A188 x B73 selon la méthode décrite par Armstrong (1994). Les cals ainsi obtenus peuvent être multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals par modification de l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode 15 décrite par Vain et al. (1989).
Le transfert des gènes d'intérêt et de sélection par bombardement de particules dans les cals de type II se fait selon le protocole suivant. Quatre heures avant le bombardement, des fragments de cals de type II d'une surface de 10 à 20 mmz sont disposés au centre d'une boîte de Pétri contenant le milieu d'initiation additionné de mannitol 0,2 M et 2o de sorbitol 0,2 M, 16 fragments par boîte.
Les vecteurs porteurs des gènes d'intérêt et de sélection sont préparés à
l'aide du système CONCERT selon les instructions du fournisseur (GIBCO BRL). Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide d'un canon 25 à particules. L'optimisation des conditions de bombardement peut dépendre du type d'appareil utilisé et fait partie des techniques normalement maîtrisées par l'homme de l'art.
Après bombardement, les boîtes sont scellées à l'aide de Scellofrais~ et placées à
l'obscurité à 27°C. Les cals sont transférés sur un milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif 24 h après le bombardement.
3o Les cals sont maintenus sur ce milieu pendant 3 mois, le milieu est changé
tous les 15 jours. Les cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif sont habituellement et majoritairement composés de cellules résultant ale la division d'une cellule ayant intégré

dans son patrimoine génétique uné ou plusieurs copies du .gène de sélection.
La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cals par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à
régénérer des plantules. Afm d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.
4.2- Transformation du maïs par Agrobacterium tumefacieus lo La transformation du maïs par Agr~obacterium se fait selon la méthode de Ishida et al. (1996).
4.2.1- Obtention du vecteur superbinaire Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation du maïs est issu de la recombinaison homologue entre deux vecteurs : le vecteur pBIOS 371 et le vecteur pSB 1. Le vecteur pBIOS 371, construit comme précédemment (exemple 3.2), comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMTPP, inséré entré le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la 2o spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli. Le vecteur pSBl contient les gènes vira, virC et vire du plasmide pTiBo542 présent dans AgYObacterium souche A281 (ATCC
37349), le gène de la résistance à la tétracycline, une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli et Agrobacterium. Les vecteurs pSBl et pBIOS 371 possèdent une région homologue qui leur permet de se recombiner et de générer le vecteur superbinaïre pRec 371.
La recombinaison homologue entre les deux vecteurs se fait dans Ag~obacte~ium.
Le vecteur pBIOS 371 est introduit dans Agrobactev~ium souche LBA4404 contenant le vecteur pSBl par ëlectroporation en utilisant l'appareil CELL PORATOR Voltage Booster (GIBCO BRL) selon la méthode décrite par Mattanovitch et al. (1989) et le protocole donné
par le fournisseur (Life Technologies, USA).
3o Les agrobactéries contenant le vecteur superbinaire pRec 371 sont sélectionnées sur milieu YT en présence de CaClz, de rifampicine et de spectinomycine. Le gène de résistance à la rifampicine est portê par le chromosome bactérien. La résistance à la spectinomycine, portée par le vecteur pBIOS 371 (origine de réplication fonctionnelle chez E.

coli), ne pourra s'exprimer qu'après recombinaison homologue avec le vecteur pSBl (origine de réplication fonctionnelle chez Agr~obacterium et E, coli).
Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression du gène Bar et de la séquence OsMIPPs (sous le contrôle du promoteur pHMWG pour une expression tissu spécifique), des origines de réplication fonctionnelles à la fois dans E. coli et AgYObacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la spectinomycine, et les gènes de virulence vira, virC et vire du plasmide pTiBo542.
4.2.2 - Méthode de transformation du maïs et régénération des plantes transformées l0 Des embryons immatures sont co-cultivés avec A. tumefaciens souche LBA
4404, contenant le vecteur superbinaire pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25°C.
Les cals transformés sont sélectionnés sur un milieu de culture contenant l' agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Des cals de type I sont obtenus, à partir de ceux-ci, des plantules vont être régénérées sur un milieu culture contenant l' agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Les plantules ayant régénéré sont ensuite transférées sur un milieu de développement contenant l'agent sélectif.
Les plantes obtenues sont acclimatées au phytotron, puis cultivées en serre où
elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.
4.3 - Le gène Bar La nature et la concentration de l'agent sélectif peuvent varier selon le gène utilisé. Les agents sélectifs utilisables sont généralement des composés actifs de certains herbicides (Basta~, Round up~) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanarnycine,).
Le gène Bar de St~eptomyces hyg~oseopicus code pour une phosphinothricine acétyl transférase (PAT) qui inactive par acétylation la phosphinotricine -molécule active de l'herbicide Basta~ . Les cellules portant ce gène sont donc rendues résistantes à cet herbicide et peuvent être sélectionnées par son intermédiaire.
Pour la transformation des céréales, la séquence codante du gène Bar est sous le contrôle d'une région régulatrice permettant une expression forte et constitutive dans les cellules végétales. Une telle région peut avantageusement être constituée par le promoteur et le premier intron du gène Actine 1 de riz (Mc Elroy et al., 1991).

4.3.1 - Utilisation ~du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules Le gène chimérique, composé du promoteur et du premier intron du gène Actine 1 de riz et du gène Bar, est cloné dans le plasmide pDM 302 permettant sa multiplication chez E. coli (Cao et al., 1992). Les milieux de cultures destinés à la sélection des cellules transformées sont additionnés de phosphinothricine 2 mg/1.
Pour l'introduction des construits OsMIPP devant conduire à une expression ectopique des protéines issues des gènes OsMIPP, une technique dite de cotransformation peut avantageusement être utilisée. On procède à une coprécipitation des deux plasmides (le 1o plasmide porteur du gène Bar et le plasmide porteur du gène OsMIPP) sur les particules de tungstène, la quantité totale d'ADN précipité sur les particules restant identique à ce qu'elle est dans le protocole standard (5 ~Cg d'ADN pour 2,5 mg de particules), chaque plasmide représentera environ la moitié du total d'ADN utilisé.
L'expérience montre qu'avec cette méthode, la cointégration des plasmides dans les cellules végétales est l'événement le plus fréquent (de l'ordre de 90 %) c'est-à-dire que pratiquement chaque plante ayant intégré le gène Bar et ayant été sélectionnée par son intermédiaire portera aussi le gène MIPP. Ainsi, le pourcentage de plantes sélectionnées exprimant le gène OsMIPP est d'environ 70 %.
Les gènes ainsi introduits sont généralement liés au sens génétique, le gène 2o OsMIPP peut ainsi avantageusement être suivi dans les descendances gràce à
la résistance à
l'herbicide qui lui est étroitement associée.
4.3.2 - Utilisation du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression des gènes Bar et OsMIPP, des origines de réplication fonctionnelles à
la fois dans E. colt et Agrobacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la .
spectinomycine, et les gènes de virulence vira, virC et vire du plasmide pTiBo542.
Des embryons immatures sont co-cultivés avec A. tumefaciens souche LBA 4404, 3o contenant le vecteur superbinaire pRec '371 pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25°C.
La sélection des cals de type I transformés et la régénération des plantules se fait sur un milieu contenant de la phosphinotricine 5 à 10 mg/1 et un agent bactériostatique, la céfotaxime. Le développement des plantules se fait sur un milieu contenant uniquement la phosphinotricine.

Les cals et Ies plantes qui ont intégré dans leur génome, l'ADN-T qui contient le gène OsMIPP et le gène Bar, peuvent être suivis dans les descendances grâce à
la résistance à
l'herbicide.
4.4 - Mesure de l'activité phytasique du maïs transformé
L'objectif final de la production de maïs transformé avec le gène OsMIPP étant l'obtention d'une activité phytasique accrue, des mesures d'activité
enzymatique sont prévus.
Le dosage de l'activité phytasique se fait selon la méthode décrite précédemment dans l'exemple 2 paragraphe 2.5. L'activité phytasique est mesurée sur les extraits protéiques de 1o différents organes de maïs transgénique et de maïs non transgénique :
feuilles, graines, jeunes plantules en cours de germination (5 ou 6 jours de germination). L'extraction des protéines totales à partir de ces tissus se fait selon la méthode décrite ci-après. Les tissus, prélevés et congelés à -80°C, sont broyés à l'état de poudre dans l'azote liquide.
Une quantité de 100 mg de poudre végétale broyée est transférée dans 1 ml de tampon d'extraction (acétate de sodium 100 mM, pH 4,8, CaCl2 2 mM, DTT 1 mM, cocktail d'inhibiteurs de protéases 0,5 à 1 mM
(Roche)). Les échantillons sont homogénéisés pendant 1 heure à 4°C et les extraits sont centrifugés à 8000 rpm pendant 20 min à 4°C. Le surnageant contenant les protéines totales, sert à la mesure de l'activité phytasique.
EXEMPLE 5 : Production de riz transformë
La production de riz transformé peut être envisagée selon deux méthodes : via Agrobactenium tumefaciens selon le protocole décrit par Hiei et al. (1994), par bombardement de particules selon le protocole de Fauquet et al. (1996). Les vecteurs pBIOS
369 et pBIOS
371 décrits dans l'exemple 3, sont utilisés pour la transformation du riz via Agr~obacte~ium tumefaciens.
3o EXEMPLE 6 : Production de blë transformé.
La transformation du blé (Triticum aestivurn) peut se faire selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 B 1.

6.1- Préparation des tissus à transformer Les tissus utilisés pour Ie transfert de génes ont été préparés selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 Bl. Ce sont des cals de type M qui sont utilisés pour le bombardement. Ils peuvent être obtenus à partir d'embryons immatures prélevés des grains 5 immatures de blé et placés sur un milieu MS décrit par Murashige et Skoog (1962) contenant du maltose.
6.2 - Préparation des vecteurs à transférer Les vecteurs utilisés pour la transformation du blé sont purifiés sur gradient de 1o Césium puis concentré à 1-mg/ml dans le tampon TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 rnM ;
EDTA
1 mM) (Sarnbrook et al., 1989).
6.3 - Préparation des particules d'or Des particules d'or de 1 ~m sont enrobées d'ADN à transférer selon le procédé
de 15 Daines (1990). Les particules sont reprises dans de l'éthanol absolu, 60 mg de particules par ml d'éthanol. Un volume de 35 ~,l de cette suspension est transféré dans un tube de micro centrifugation de 1,5 ml, les particules sont récupérées par centrifugation à
14 000 g pendant 3 minutes. Élles sont lavées avec 1,5 ml d'eau distïllée stérile et récupérées par centrifugation à 14 000 g pendant 3 minutes. Les particules sont reprises dans 25 ~l de tampon TE contenant 20 25 ~,g du vecteur portant le gène d'intérêt et 25 ~,g du vecteur portant le gène de sélection, le géne dhfr codant pour l'enzyme dihydrofolate réductase. On ajoute à cette préparation, dans l'ordre : 220 ~l d'eau distillée stérile, 250 ~,1 de CaCl2 2,5 M et 50 ~.l de spermidine 0,1 M. Le mélange est homogénéisé par agitation à 4°C pendant 15 minutes. Le mélange est centrifugé
pendant 5 minutes à 14 000 g, le surnageant est éliminé et les particules lavées avec 200 ~,l ' 25 d'éthanol absolu. Les particules d'or chargées d'ADN sont reprises dans 36 ~.1 d'éthanol absolu.
6.4 - Etape de transformation Le déroulement du bombardement dès cellules s'est effectué telle que la demande 3o de brevet EP 0 674 715 le décrit. Dans la chambre du canon, la boîte de Pétri contenant les expiants à bombarder est placée sur la plate-forme au centre de l'ouverture d'où sont projetées les particules d'or enrobées d'ADN ou microprojectiles. Les microprojectiles sont placés sur un support au dessus des expiants. La chambre est fermée et scellée, le vide de la chambre est réalisé et le réservoir d'hélium rempli avec une quantité appropriée de gaz.
Le bombardement :est~déclenché permettant la projection des microprojectiles sur les expiants.
Les expiants sont bombardés deux fois avec les microprojectiles. Après bombardement,1es cals sont maintenus à l'obscurité pendant 15 heures puis placés sur le milieu MS pendant 1 S
jours.
6.5 - Sélection des cals et régénération des plantes transgéniques.
La sélection des cals transformés se fait Ie milieu MS contenant l'agent sélectif, le méthotrexate pendant 4 mois.
Pour régénérer des plantes, les cals sont transférées sur un milieu MS
contenant du 2,4-D à l'obscurité. Quand des structures embryogènes apparaissent, les cals sont l0 transférés sur un milieu MS contenant des hormones (auxines et gibbérellines) à la lumière pendant 15 jours, cette étape permet l'induction de tiges. Les expiants sont ensuite transférés sur un milieu MS sans hormone afin de permettre l'induction des racines.
Les plantules sont acclimatées en phytotron avant d' être cultivées en serre.

REFERENCES
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<120> Acide nucléique codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, et applications <130> BET 01/0621 <140>
<141>
<160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210>

<211>

<212>
ADN

<213>
Zea mays <220>

<221>
CDS

<222> (1575) (1)..

<400>

atgggc atggctgct ccgcgc gcgccgctg cctctcccc caactgctg 48 MetGly MetAlaAla ProArg AlaProLeu ProLeuPro GlnLeuLeu ctcctc ctcgttgcc gcgctc ctcgccgcc gctcgcctc cctagggcg 96 LeuLeu LeuValAla AlaLeu LeuAlaAla AlaArgLeu ProArgAla gccagg gcggacgag ttcgat gtccgccgc cacctctcc accgtcacc 144 AlaArg AlaAspGlu PheAsp ValArgArg HisLeuSer ThrValThr aggtat gatgtggcc agggag tccagtagt gtcatctcc atgccgtca 192 ArgTyr AspValAla ArgGlu SerSerSer ValIleSer MetProSer atccca gacgggtgc cgtgtc attcacctc aatttagtg gcaagacat 240 IlePro AspGlyCys ArgVal IleHisLeu AsnLeuVal AlaArgHis gggact cgcgctcct accaag aagcgcatc aaggagctg gatagattg.288 GlyThr ArgAlaPro ThrLys LysArgIle LysGluLeu AspArgLeu gcagtt cgactggaa gccctt ctgaaagag gcgaatcag gtccttgat 336 AlaVal ArgLeuGlu AlaLeu LeuLysGlu AlaAsnGln ValLeuAsp agtgat tctctgaag aaaatt ccatcctgg attaaaggc tgggaatca 384 SerAsp SerLeuLys LysIle ProSerTrp IleLysGly TrpGluSer cgctgg aagggtagg actaaa ggtggtgag ctgattagt gaaggggaa 432 ArgTrp LysGlyArg ThrLys GlyGlyGlu LeuIleSer GluGlyGlu gaggag ctttacaat ttagct accagaatgagg gagaggttt caagat 480 GluGlu LeuTyrAsn LeuAla ThrArgMetArg GluArgPhe GlnAsp ctattt gatgacgaa tatcac cctgatgtatat tcaataaga gcaacc 528 LeuPhe AspAspGlu TyrHis ProAspValTyr SerIleArg AlaThr caggtt cctcgagca tcagct agtgcagtggca tttgggttg ggacta 576 GlnVal ProArgAla SerAla SerAlaValAla PheGlyLeu GlyLeu ctttct gggaaagga aagctt ggacaagggaag aaccgagcc ttttct 624 LeuSer GlyLysGly LysLeu GlyGlnGlyLys AsnArgAla PheSer gttctg agtgagagt cgtgca agtgatatttgt ctgagattc tttgac 672 ValLeu SerGluSer ArgAla SerAspIleCys LeuArgPhe PheAsp agctgt gagacatac aaggca tacaggaaaagg aaggagcct gatgta 720 SerCys GluThrTyr LysAla TyrArgLysArg LysGluPro AspVal gag aag caa aag gaa cca att cta gag cat gtc aca gct gca ctt gtc 768 Glu Lys Gln Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Val Thr Ala Ala Leu Val aat cgt tat cac cta aaa ttt aca act cgc gat gtt tct tcc ctc tgg 816 Asn Arg Tyr His Leu Lys Phe Thr Thr Arg Asp Val Ser Ser Leu Trp ttt ctt tgt aag cag gaa aca tct ttg ttg aat aca aca aat caa gct 864 Phe Leu Cys Lys Gln Glu Thr Ser Leu Leu Asn Thr Thr Asn Gln Ala tgt ggg ctt ttt aat gaa gct gag gtt cgt ttt ctg gag tgg aca gat 912 Cys Gly Leu Phe Asn Glu Ala Glu Val Arg Phe Leu Glu Trp Thr Asp gat ttg gag ggt ttt gtt cta aaa ggc tat ggt gag tca att aac tac 960 Asp Leu Glu Gly Phe Val Leu Lys Gly Tyr Gly Glu Ser Ile Asn Tyr agg atg gga ctg cca ttg ctc aag gat gtt gtc cag tca atg gaa gaa 1008 Arg Met Gly Leu Pro Leu Leu Lys Asp Val Val Gln Ser Met Glu Glu gca atc ata gct aga gaa gaa aac cgt gct gat ggt acg ttt gaa aag 1056 Ala Ile Ile Ala Arg Glu Glu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Phe Glu Lys gca agg ctc cga ttt gca cat gca gaa act gtt gtt cct ttt agc tgc 1104 Ala Arg Leu Arg Phe Ala His Ala Glu Thr Val Val Pro Phe Ser Cys ctt ctt ggt ctt ttt ctt gaa ggt cca gaa att gag aag ata cag aga 1152 Leu Leu Gly Leu Phe Leu Glu Gly Pro Glu Ile Glu Lys Ile Gln Arg gaggaagca ttggac cta,ccccct ttgecgccacag ggaaga aactgg ..1200 GluGluAla LeuAsp LeuProPro LeuProProGln GlyArg AsnTrp aagggcagt gttgtt gcgcctttc gctggtaacaat atgctg gtttta 1248 LysGlySer ValVal AlaProPhe AlaGlyAsnAsn MetLeu ValLeu tatcaatgt ccaagc aaaatttcg gatggcagcaca atctct ggaggc 1296 TyrGlnCys ProSer LysIleSer AspGlySerThr IleSer GlyGly cgaaacaac tcttac ttagttcaa gttctacacaac gaagtc ccagtt 1344 ArgAsnAsn SerTyr LeuValGln ValLeuHisAsn GluVal ProVal tcaatgcct gggtgc ggcaacaaa gatttctgtccg ttcgag gagttc 1392 SerMetPro GlyCys GlyAsnLys AspPheCysPro PheGlu GluPhe aaggagaaa attgtg aaaccgcac ctgaagcacgac tacaac atgata 1440 LysGluLys IleVal LysProHis LeuLysHisAsp TyrAsn MetIle tgcaaggtc aaatcc ccagcggca agcgaggagcct gcctcg ttcgcc 1488 CysLysVal LysSer ProAlaAla SerGluGluPro AlaSer PheAla tccagggtg tccagt ttcttccta ggactcctctcg cagaaa gggtac 1536 SerArgVal SerSer PhePheLeu GlyLeuLeuSer GlnLys GlyTyr cgcggtgtg ggcgcc gagggcgtc aagacegagctg tag 1575 ArgGlyVal GlyAla GluGlyVal LysThrGluLeu <210> 2 <211> 524 <212> PR.T
<213> Zea mays <400> 2 Met Gly Met Ala Ala Pro Arg Ala Pro Leu Pro Leu Pro Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Arg Leu Pro Arg Ala Ala Arg Ala Asp Glu Phe Asp Val Arg Arg His Leu Ser Thr Val Thr Arg Tyr Asp Val Ala Arg Glu Ser Ser Ser Val Ile Ser Met Pro Ser Ile Pro Asp Gly Cys Arg Val Ile His Leu Asn Leu Val Ala Arg His Gly Thr Arg Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Lys Glu Leu Asp Arg Leu Ala Val Arg Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Asn Gln Val Leu Asp Ser Asp Ser Leu Lys Lys Ile Pro Ser Trp Ile Lys Gly Trp Glu Ser Arg Trp Lys Gly Arg Thr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Glu Gly Glu Glu Glu Leu Tyr Asn Leu Ala Thr Arg Met Arg Glu Arg Phe Gln Asp Leu Phe Asp Asp Glu Tyr His Pro Asp Val Tyr Ser Ile Arg Ala Thr Gln Val Pro Arg Ala Ser Ala Ser Ala Val Ala Phe Gly Leu Gly Leu Leu Ser Gly Lys Gly Lys Leu Gly Gln Gly Lys Asn Arg Ala Phe Ser Val Leu Ser Glu Ser Arg Ala Ser Asp Ile Cys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Cys Glu Thr Tyr Lys Ala Tyr Arg Lys Arg Lys Glu Pro Asp Val Glu Lys Gln Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Val Thr Ala Ala Leu Val Asn Arg Tyr His Leu Lys Phe Thr Thr Arg Asp Val Ser Ser Leu Trp 260 ' 265 270 Phe Leu Cys Lys Gln Glu Thr Ser Leu Leu Asn Thr Thr Asn Gln Ala Cys Gly Leu Phe Asn Glu Ala Glu Val Arg Phe Leu Glu Trp Thr Asp Asp Leu Glu Gly Phe Val Leu Lys Gly Tyr Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Arg Met Gly Leu Pro Leu Leu Lys Asp Val Val Gln Ser Met Glu Glu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Glu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Phe Glu Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala His Ala Glu Thr Val Val Pro Phe Ser Cys 355 360 . 365 Leu Leu Gly Leu Phe Leu Glu Gly Pro Glu Ile Glu Lys Ile Gln Arg Glu Glu Ala Leu Asp Leu Pro Pro Leu Pro Pro Gln Gly Arg Asn Trp Lys GIy Ser Val Val Ala Pro Phe Ala Gly Asn Asn Met Leu VaI Leu Tyr Gln Cys Pro Ser Lys Ile Ser Asp Gly Ser Thr Ile Ser Gly Gly 420 . 425 430 Arg Asn Asn Ser Tyr Leu Val Gln Val Leu His Asn Glu Val Pro Val Ser Met Pro Gly Cys Gly Asn Lys Asp Phe Cys Pro Phe Glu Glu Phe Lys Glu Lys Ile Val Lys Pro His Leu Lys His Asp Tyr Asn Met Ile Cys Lys Val Lys Ser Pro Ala Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ser Phe Ala Ser Arg Val Ser Ser Phe Phe Leu Gly Leu Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Arg Gly Val Gly Ala Glu Gly Val Lys Thr Glu Leu <210> 3 <211> 1509 <212> ADN
<213> riz <220>
<221> CDS
<222> (1)..(I509) <400> 3 atg gct gCt CCC CgC aCg CCt CtC CCC CtC gtC CtC Ct C CtC gtC tCC 48 Met Ala Ala Pro Arg Thr Pro Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu Val Ser gec gcg ttc gac gtc cgc cgc cac etc tcc acc gtc ace agg tac gat 96 Ala Ala Phe Asp Val Arg Arg His Leu Ser Thr Val Thr Arg Tyr Asp gtg gcg agg gga tcc aat agt gtg tcc tcc gcg ccg tct atg tcg gat 144 Val Ala Arg Gly Ser Asn Ser Val Ser Ser Ala Pro Ser Met Ser Asp gag tgc cgc gtg atc cac ctc aat ctc gtg gca aga cat ggg act cgc 192 Glu Cys Arg Val Ile His Leu Asn Leu Val Ala Arg His Gly Thr Arg gca cct ace aaa aag aga atc aaa gag ctg gat aga otg gcg gtt cgg 240 Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Lys Glu Leu Asp Arg Leu Ala Val Arg ttg aag gct ett atc gat gaa gca aaa caa ggg cct gaa agt gac tcc 288 Leu Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ala Lys Gln Gly Pro Glu Ser Asp Ser ctg aaa aaa att cct tca tgg atg aaa ggg tgg gag tca ccc tgg aaa 336 Leu Lys Lys Ile Pro Ser Trp Met Lys Gly Trp Glu Ser Pro Trp Lys ggt agg gtg aaa ggt ggt gag ctg gtc agt gaa ggg gag gaa gag cta 384 GlyArg ValLysGly GlyGluLeu ValSerGlu GlyGluGlu GluLeu tacaac cttgctatc agagtcaag gagaggttt caaggccta tttgat 432 TyrAsn LeuAlaIle ArgValLys GluArgPhe GlnGlyLeu PheAsp gaggaa tatcaccct gatgtgtat tcaataaga gcaactcag gttcct 480 GluGlu TyrHisPro AspValTyr SerIleArg AlaThrGln ValPro cgggca tcagctagt gcagtagca tttggtttg ggtctactt tctggg 528 ArgAla SerAlaSer AlaValAla PheGlyLeu GlyLeuLeu SerGly aaaggg aagcttgga cctgtgaaa aaccgtgcc ttttctgtt ctgagt 576 LysGly LysLeuGly ProValLys AsnArgAla PheSerVal LeuSer gagagt cgtgcaagt gatatttgt ctgcgattc tttgatagc tgtgaa 624 GluSer ArgAlaSer AspIleCys LeuArgPhe PheAspSer CysGlu acatac aaggactac aggaaaaga aaggagcct gatgttgaa aagcaa 672 ThrTyr LysAspTyr ArgLysArg LysGluPro AspValGlu LysGln aaggaa ccaatttta gaacacgtc acatcggca ttagttaac cgttat 720 LysGlu ProIleLeu GluHisVal ThrSerAla LeuValAsn ArgTyr catctc aattttaca ccaaaagat gtttcttcc ctctggttc ctttgc 768 HisLeu AsnPheThr ProLysAsp ValSerSer LeuTrpPhe LeuCys aagcag gaagcatct ttaatgaat ataaccaat caagcttgt caactt 816 LysGln GluAlaSer LeuMetAsn IleThrAsn GlnAlaCys GlnLeu tttaat gaagctgag gtttatttt ctagagtgg acagatgat ctggag 864 PheAsn GluAlaGlu ValTyrPhe LeuGluTrp ThrAspAsp LeuGlu ggcttt gtgctaaaa ggttatggt gagtcaata aactatcgg atggga 912 GlyPhe ValLeuLys GlyTyrGly GluSerIle AsnTyrArg MetGly ctgcca ttgctcaag gacgttgtc cagtcaatg gaagaagca atogtt 960 LeuPro LeuLeuLys AspValVal GlnSerMet GluGluAla IleVal gctaaa gaagaaaac caccctgat ggtacatat gagaaggca aggctc 1008 AlaLys GluGluAsn HisProAsp GlyThrTyr GluLysAla ArgLeu cgattt gcacatgct gaaactgtt gtccctttc tcatgtctt cttggt 1056 ArgPhe AlaHisAla GluThrVal ValProPhe SerCysLeu LeuGly cttttt cttgaagga tcagatttt gcgaagata caacgggag gaatca 1104 LeuPhe LeuGluG1~ SerAspPhe AlaLysIle GlnArgGlu GluSer ttg gae ata cct cct gtg cca cca cag gga aga aat tgg aag ggc agt 1152 Leu Asp Ile Pro Pro Val Pro Pro Gln Gly Arg Asn Trp Lys Gly Ser gtt gtt gca cct ttt gct ggt aac aat atg ttg gct ttg tac cag tgc 1200 Val Val Ala Pro Phe Ala Gly Asn Asn Met Leu Ala Leu Tyr Gln Cys cca gga aaa act gat ggt ggt aag att tct cgg gat cag aag agc tca 1248 Pro Gly Lys Thr Asp Gly Gly Lys Ile Ser Arg Asp Gln Lys Ser Ser tac ttc gtg cag gtt ata cac aat gaa gct cca gtt tca atg ccg gga 1296 Tyr Phe Val Gln Val Ile His Asn Glu Ala Pro Val Ser Met Pro Gly tgc ggg aac aaa gat ttc tgc cca ttt gaa gag ttc aag gag aag ata 1344 Cys Gly Asn Lys Asp Phe Cys Pro Phe Glu Glu Phe Lys Glu Lys Ile gtt gaa ccc cac ctg aag cat gac tac gac gcc cta tgc aag ata agg 1392 Val Glu Pro His Leu Lys His Asp Tyr Asp Ala Leu Cys Lys Ile Arg ccg gtg gca aga gag gag cct tcc tcc ttc agt tcc agg atg tcc aat 1440 Pro Val Ala Arg Glu Glu Pro Ser Ser Phe Ser Ser Arg Met Ser Asn ttc ttc cta ggt ttg ttc tcg cag aaa gga tac cgt gtt agt gct cag 1488 Phe Phe Leu Gly Leu Phe Ser Gln Lys Gly Tyr Arg Val Ser Ala Gln gat gtg aag tcg gag ctg tag 1509 Asp Val Lys Ser Glu Leu <210> 4 <211> 502 <212> PRT
<213> riz <400> 4 Met Ala Ala Pro Arg Thr Pro Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu Val Ser Ala Ala Phe Asp Val Arg Arg His Leu Ser Thr Val Thr Arg Tyr Asp Val Ala Arg Gly Ser Asn Ser Val Ser Ser Ala Pro Ser Met Ser Asp Glu Cys Arg Val Ile His Leu Asn Leu Val Ala Arg His Gly Thr Arg Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Lys Glu Leu Asp Arg Leu Ala Val Arg Leu Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ala Lys Gln Gly Pro Glu Ser Asp Ser Leu Lys Lys Ile Pro Ser Trp Met Lys Gly Trp Glu Ser Pro Trp Lys Gly Arg Val Lys Gly Gly Glu Leu Val Ser Glu Gly Glu Glu Glu Leu Tyr Asn Leu Ala Ile Arg Val Lys Glu Arg Phe Gln Gly Leu Phe Asp Glu Glu Tyr His Pro Asp Val Tyr Ser Ile Arg A1a Thr Gln Val Pro Arg Ala Ser Ala Ser Ala Val Ala Phe Gly Leu Gly Leu Leu Ser Gly Lys Gly Lys Leu Gly Pro Val Lys Asn Arg Ala Phe Ser Val Leu Ser Glu Ser Arg Ala Ser Asp Ile Cys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Cys Glu Thr Tyr Lys Asp Tyr Arg Lys Arg Lys Glu Pro Asp Val Glu Lys Gln Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Val Thr Ser Ala Leu Val Asn Arg Tyr His Leu Asn Phe Thr Pro Lys Asp Val Ser Ser Leu Trp Phe Leu Cys Lys Gln Glu Ala Ser Leu Met Asn Ile Thr Asn Gln Ala Cys Gln Leu Phe Asn Glu Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu Trp Thr Asp Asp Leu Glu Gly Phe Val Leu Lys Gly Tyr Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Arg Met Gly Leu Pro Leu Leu Lys Asp Val Val Gln Ser Met Glu Glu Ala Ile Val Ala Lys Glu Glu Asn His Pro Asp Gly Thr Tyr Glu Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala His Ala Glu Thr Val Val Pro Phe Ser Cys Leu Leu Gly Leu Phe Leu Glu Gly Ser Asp Phe Ala Lys Ile Gln Arg Glu Glu Ser Leu Asp Ile Pro Pro Val Pro Pro Gln Gly Arg Asn Trp Lys Gly Ser Val Val Ala Pro Phe Ala Gly Asn Asn Met Leu Ala Leu Tyr Gln Cys Pro Gly Lys Thr Asp Gly Gly Lys Ile Ser Arg Asp Gln Lys Ser Ser Tyr Phe Val Gln Val Ile His Asn Glu Ala Pro Val Ser Met Pro Gly Cys Gly Asn Lys Asp Phe Cys Pro Phe Glu Glu Phe Lys Glu Lys Ile Val Glu Pro His Leu Lys His Asp Tyr Asp Ala Leu Cys Lys Ile Arg Pro Val Ala Arg Glu Glu Pro Ser Ser Phe Ser Ser Arg Met Ser Asn Phe Phe Leu Gly Leu Phe Ser Gln Lys Gly Tyr Arg Val Ser Ala Gln Asp Val Lys Ser Glu Leu <210> 5 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 5 catatgggca tggctgctcc gc 22 <210> 6 <211> 26 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artïficielle:
oligonuclêotide <400> 6 ggatcctagg tcttgacgcc tacagc 26 <210> 7 <211> 19 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 7 caagacatgg gactcgcgc 19 <210> 8 <211> 19 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 8 cgcgagtccc atgtcttgc 1g <210> 9 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 9 caaatcgatt cgccatggct gc 22 <210> 10 <211> 27 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 10 ggatcctaca gctccgactt cacatcc 27 <210> 11 <211> 21 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 11 catatggctg ctccccgcac g 21 <210> 12 <211> 29 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 12

11 ggatcctaca gctccgtctt aacatcttg 29 <210> 13 <211> 25 <212> ADN
<213> Sêquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide <400> 13 gtctatcgtt tctattaagc cagac 25 <210> 14 <211> 478 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Description de la sêquence artificielle : EST
<400> 14 ggcacgagcc gggggtggca gcagaggagg agccatcctc tttcagctcc aagctcaact 60 tcttccttga tctgctctcg cggaaaggtt accgttttaa ggggcaagat gttaagacgg 120 agctgtagag tacaggcgcc ttgtgccgcg acgaccttgg a.ttaggactg acatgtggac 180 actaaccttg gtgtttttgt acctaggttt ggtgacttgt'gagcgagttc agcgcgtatc 240 aggctctgat ggcttgcagg tgccgccgtg tgcgagtctg gcttaataga aacgatagac 300 tactcatatt aataaggaat tcttttttcg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctcgagagta 360 cttntagagc ggccgcgggc ccatcgattt tncacccggg tggggtacca ggtaagtgta 420 cccaattcgc cctatagtga gtcgnattac aattcactgg cccgcgnttt acaacgtn 478 <210> 15 <211> 25 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide signal <400> 15 Met Gly Met Ala Ala Pro Arg Ala Pro Leu Pro Leu Pro Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Leu Leu Ala' <210> 16 <211> 18 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>

12 <223> Description de la séquence artificielle: peptide signal <400> 16 Met Ala Ala Pro Arg Thr Pro Leu Pro Leu Val Leu Leu Leu Val Ser Ala Ala <210> 17 <211> 1575 <212> ADN
<213> Zea mays <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1575) <400> 17 atg ggc atg act gcg ccg cgc gcg ccg ctg cct ctc ccc~caa ctg ctg 48 Met Gly Met Thr Ala Pro Arg Ala Pro Leu Pro Leu Pro Gln Leu Leu CtC CtC CtC gtt gcc gcg ctc ctc gcc gcc gct ccc ctc cct agg gcg 96 Leu Leu Leu Val Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Pro Leu Pro Arg Ala gcc agg gcg gac gag ttc gac gtc cgc cgc cac ctc tcc acc gtc acc 144 Ala Arg Ala Asp Glu Phe Asp Val Arg Arg His Leu Ser Thr Val Thr agg tat gat gtg gcc agg gag tcc agt agt gtc atc tcc atg ccg tca 192 Arg Tyr Asp Val Ala Arg Glu Ser Ser Ser Val Tle Ser Met Pro Ser atc cca gac ggg tgc cgt gtc att cac ctc aat tta gtg gca aga cat 240 Ile Pro Asp Gly Cys Arg Val Ile His Leu Asn Leu Val Ala Arg His ggg act cgc gct cct acc aag aag cgc atc aag gag ctg gat aga ttg 288 Gly Thr Arg Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Lys Glu Leu Asp Arg Leu gca gtt cga ctg gaa gcc ctt ctg aaa gag gca aat cag gtc ctt gat 336 Ala Val Arg Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Asn Gln Val Leu Asp agt gat tct ctg aag aaa att cca tcc tgg att aaa ggc tgg gaa tca 384 Ser Asp Ser Leu Lys Lys Ile Pro Ser Trp Ile Lys Gly Trp Glu Ser cgc tgg aag ggt agg act aaa ggt ggt gag ctg att agt gaa ggg gaa 432 Arg Trp Lys Gly Arg Thr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Glu Gly Glu gag gag ctt tac aat tta gct acc aga atg agg gag agg ttt caa gat 480 Glu Glu Leu Tyr Asn Leu Ala fihr Arg Met Arg Glu Arg Phe Gln Asp

13 cta ttt gat gac gaa tat cac cct gat gta tat tca ata aga gca acc 528 Leu Phe Asp Asp Glu Tyr His Pro Asp Val Tyr Ser Ile Arg Ala Thr cag gttcctcga gcatcagct agtgcagtg gcatttggg ttggga cta 576 Gln ValProArg AlaSerAla SerAlaVal AlaPheGly LeuGly Leu ctt tctgggaaa ggaaagctt ggacaaggg aagaaccga gccttt tct 624 Leu SerGlyLys GlyLysLeu GlyGlnGly LysAsnArg AlaPhe Ser gtt ctgagtgag agtcgtgca agtgatatt tgtctgaga ttcttt gac 672 Val LeuSerGlu SerArgAla SerAspIle CysLeuArg PhePhe Asp 210 21.5 220 agc tgtgagaca tacaaggca tacaggaga aggaaggag cctgat gta 720 Ser CysGluThr TyrLysAla TyrArgArg ArgLysGlu ProAsp Val gag aagcaaaag gaaccaatt ctagagcat gtcacagct gcactt gtc 768 Glu LysGlnLys GluProIle LeuGluHis ValThrAla AlaLeu Val aat cgttatcac ctaaaattt acaactcgc gatgtttct tccctc tgg 816 Asn ArgTyrHis LeuLysPhe ThrThrArg AspValSer SerLeu Trp ttt ctttgtaag caggaagca tctttgttg aatacaaca aatcaa gct 864 Phe LeuCysLys GlnGluAla SerLeuLeu AsnThrThr AsnGln Ala tgt gggcttttt aatgaagct gaggttcgt tttctggag tggaca gat 912 Cys GlyLeuPhe AsnGluAla GluValArg PheLeuGlu TrpThr Asp gat ttggagggt tttgttcta aaaggctat ggtgagtca attaac tac 960 Asp LeuGluGly PheValLeu LysGlyTyr GlyGluSer IleAsn Tyr agg atgggactg ccattgctc aaggatgtt gtccagtca atggaa gaa 1008 Arg MetGlyLeu ProLeuLeu LysAspVal ValGlnSer MetGlu Glu gca atcatagct agagaagaa aaccgtgct gatggtacg tttgaa aag 1056 Ala IleIleAla ArgGluGlu AsnArgAla AspGlyThr PheGlu Lys 340 ~ 345 350 gca aggctccga tttgcactt geagaaact gttgttcct tttagc tgc 1104 Ala ArgLeuArg PheAlaLeu AlaGluThr ValValPro PheSer Cys ctt cttggtctt tttcttgaa ggtccagaa attgagagg atacag aga 1152 Leu LeuGlyLeu PheLeuGlu GlyProGlu IleGluArg IleGln Arg gag gaagcattg gacctaccc cctttgccg ccacaggga agaaac tgg 1200 Glu GluAlaLeu AspLeuPro ProLeuPro ProGlnGly ArgAsn Trp

14 aagggcagt gttgttgcg cctttt gctggtaacaat atgctg gtttta 1248 LysGlySer ValValAla ProPhe AlaGlyAsnAsn MetLeu ValLeu tatcaatgt ccaagcaaa atttcg gatggcagcaca atctct ggaggc 1296 TyrGlnCys ProSerLys IleSer AspGlySerThr IleSer GlyGly cgaaacaac tcttactta gttcaa gttctacacaac gaagtc ccagtt 1344 ArgAsnAsn SerTyrLeu ValGln ValLeuHisAsn GluVal ProVal tcaatgcct gggtgcggc aacaaa gatttctgtccg ttcgag gagttc 1392 SerMetPro GlyCysGly AsnLys AspPheCysPro PheGlu GluPhe aaggagaaa attgtgaaa ccgcac ctgaagcacgac tacaac atgata 1440 LysGluLys IleValLys ProHis LeuLysHisAsp TyrAsn MetIle tgcaaggtc aaatcccca gcggca agcgaggagCCt gCCtcg ttcgcc 1488 CysLysVal LysSerPro AlaAla SerGluGluPro AlaSer PheAla tccagggtg tccagtttc ttccta ggactcctctcg cagaaa gggtac 1536 SerArgVal SerSerPhe PheLeu GlyLeuLeuSer GlnLys GlyTyr cgcggtgtg ggcgccgag ggcgtc aagaccgagctg tag 1575 ArgGlyVal GlyAlaGlu GlyVal Lys-ThrGluLeu 515 - 520 ~ ~ 525 ' <210> 18 <211> 524 <212> PRT
<213> Zea mays <400> 18 Met Gly Met Thr Ala Pro Arg Ala Pro Leu Pro Leu Pro Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Pro Leu Pro Arg Ala Ala Arg Ala Asp Glu Phe Asp Val Arg Arg His Leu Ser Thr Val Thr Arg Tyr Asp Val Ala Arg Glu Ser Ser Ser Val Ile Ser Met Pro Ser 50 ' 55 60 Ile Pro Asp Gly Cys Arg Val Ile His Leu Asn Leu Val Ala Arg His Gly Thr Arg Ala Pro Thr Lys Lys Arg Ile Lys Glu Leu Asp Arg Leu Ala Val Arg Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu Ala Asn Gln Val Leu Asp Ser Asp Ser Leu Lys Lys Ile Pro Ser Trp Ile Lys Gly Trp Glu Ser Arg Trp Lys Gly Arg Thr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Glu Gly Glu Glu Glu Leu Tyr Asn Leu Ala Thr Arg Met Arg Glu Arg Phe Gln Asp Leu Phe Asp Asp Glu Tyr His Pro Asp Va1 Tyr Ser Ile Arg Ala Thr 165 170 x.75 Gln Val Pro Arg Ala Ser Ala Ser Ala Val Ala Phe Gly Leu Gly Leu Leu Ser Gly Lys Gly Lys Leu Gly Gln Gly Lys Asn Arg Ala Phe Ser Val Leu Ser Glu Ser Arg Ala Ser Asp Ile Cys Leu Arg Phe Phe Asp Ser Cys Glu Thr Tyr Lys Ala Tyr Arg Arg Arg Lys Glu Pro Asp Val Glu Lys Gln Lys Glu Pro Ile Leu Glu His Val Thr Ala Ala Leu Val Asn Arg Tyr His Leu Lys Phe Thr Thr Arg Asp Val Ser Ser Leu Trp Phe Leu Cys Lys Gln Glu Ala Ser Leu Leu Asn Thr Thr Asn Gln Ala 275 280 285 ' ' Cys Gly Leu Phe Asn Glu Ala Glu Val Arg Phe Leu Glu Trp Thr Asp Asp Leu Glu Gly Phe Val Leu Lys Gly Tyr Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Arg Met Gly Leu Pro Leu Leu Lys Asp Val Val Gln Ser Met Glu Glu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Glu Asn Arg Ala Asp Gly Thr Phe Glu Lys Ala Arg Leu Arg Phe Ala Leu Ala Glu Thr Val Val Pro Phe Ser Cys Leu Leu Gly Leu Phe Leu Glu Gly Pro Glu Ile Glu Arg Ile G1n Arg Glu Glu Ala Leu Asp Leu Pro Pro Leu Pro Pro Gln Gly Arg Asn Trp Lys Gly Ser Val Val Ala Pro Phe Ala Gly Asn Asn Met Leu Val Leu 405 ' 410 415 Tyr Gln Cys Pro Ser Lys Ile Ser Asp Gly Ser Thr Ile Ser Gly Gly Arg Asn Asn Ser Tyr Leu Val Gln Val Leu His Asn Glu Val Pro Val Ser Met Pro Gly Cys Gly Asn Lys Asp Phe Cys Pro Phe Glu Glu Phe Lys Glu Lys Ile Val Lys Pro His Leu Lys His Asp Tyr Asn Met Ile Cys Lys Val Lys Ser Pro Ala Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ser Phe Ala Ser Arg Val Ser Ser Phe Phe Leu Gly Leu Leu Ser Gln Lys Gly Tyr 500 505 . 510 Arg Gly Val Gly Ala Glu Gly Val Lys Thr Glu Leu

Claims (26)

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique isolé codant pour une MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase) végétale à activité phytasique.

2. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n°1, n° 3, n° 17 ou une séquence homologue d'une de ces séquences.

3. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence homologue de la séquence SEQ ID n°1, n°3 ou n°17, ladite séquence homologue étant définie comme i) une séquence similaire à au moins 70% de la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n°17;
ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n°17 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) une séquence codant pour une enzyme MIPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n°2, n°4 ou n°18.

4. Acide nucléique isolé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n° 17 ou une séquence homologue à la séquence SEQ ID
n° 17.

5. Enzyme isolée MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase) végétale à
activité
phytasique.

6. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 4, comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID N°2, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°18.

7. Enzyme isolée selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n°18.

8. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 5, comprenant une séquence d'acides aminés similaire à au moins 70% de la séquence SEQ ID N°2, SEQ ID
N°4 ou SEQ ID N°
18.

9. Cassette d'expression contenant au moins une des séquences selon les revendications 1 à
4 placée sous le contrôle d'au moins une séquence régulatrice capable de commander l'expression de la protéine MIPP végétale.

10. Cassette d'expression selon la revendication 9, caractérisée en ce que la séquence régulatrice est un promoteur.

11. Cassette d'expression selon la revendication 10, caractérisée en ce que le promoteur est spécifique d'un organe ou d'un tissu de la plante.

12. Cassette d'expression selon la revendication 11, caractérisée en ce que le promoteur spécifique est choisi parmi les promoteurs de gènes codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée HMWG de blé ou d'orge, la napine, la phaséoline, l'hélianthinine, l'albumine, l'oléosine, GEA1 et GEA6 d'Arabidopsis thaliana, la .gamma.-zéine de maïs, le promoteur pHyPRP du gène codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs, le promoteur Vp1 du gène Viviparous1 combiné au premier intron Sh du gène Shrunken.

13. Cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'une séquence régulatrice comprend un signal d'adressage.

14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que le signal d'adressage est une séquence codant pour un peptide signal N-terminal.

15. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que le signal d'adressage comporte un signal de rétention endoplasmique à l'extrémité C-terminale.

16. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que le signal d'adressage ne comporte pas de signal de rétention endoplasmique à l'extrémité
C-terminale.

17. Vecteur nucléotidique dans lequel est insérée une cassette d'expression telle que définie dans l'une des revendications 9 à 16.

18. Hôte cellulaire contenant un vecteur nucléotidique selon la revendication 17.

19. Procédé de production de plantes transgéniques comprenant les étapes de:
- transformation de cellules de plante avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 ou un vecteur selon la revendication 17, - sélection des cellules transformées, - génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant une MIPP
végétale à activité phytasique codée par ladite séquence d'acide nucléique.

20. Plante transformée susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 17.

21. Partie d'une plante, notamment semence, caractérisée en ce qu'elle provient d'une plante transformée selon la revendication 20.

22. Produit, notamment farine, susceptible d'être obtenu à partir d'une plante transformée selon la revendication 20 ou d'une partie d'une plante transformée selon la revendication 21.

23. Méthode de production de protéine MIPP végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de:
a) transformation d'une cellule, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme, avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à 16, b) éventuellement culture de ladite cellule hôte ou, dans le cas où cette cellule hôte est une cellule végétale, croissance de la plante transformée, c) extraction de la protéine MIPP de la culture cellulaire ou de la plante transformée.

24. Utilisation d'une plante ou partie d'une plante selon les revendications 20 ou 21, ou encore d'un produit selon la revendication 22, dans toute situation dans laquelle l'activité
phytasique est nécessaire ou désirée.

25. Utilisation selon la revendication 24, pour libérer le phosphate inorganique et/ou améliorer la disponibilité des cations chélatés par la phytine tels que le fer, le calcium, le magnésium ou le zinc.

26. Utilisation d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à
16 pour l'obtention de plante transgénique productrice de graines contenant une MIPP.