WO2002000890A1 - Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications - Google Patents

Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications Download PDF

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WO2002000890A1
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plant
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seq
mipp
gene
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PCT/FR2001/002116
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Pascual Perez
Tania Di Gioia
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Biogemma
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • Nucleic acids coding for a plant phosphatase of the MIPP type with phytase activity and applications are provided.
  • the present invention relates to nucleic acid sequences coding for a plant phosphatase of the MIPP type with phytase activity, the isolated proteins coded by these sequences, as well as their applications.
  • This invention relates more specifically to nucleic acid sequences of corn, rice and wheat encoding an MIPP.
  • Phosphorus is essential for the growth of the animal; 80% of the phosphorus is located in the skeleton. The rest of the phosphorus is contained in the soft tissues where it is involved in many biochemical reactions such as the synthesis of nucleic acids, phospholipids and certain B vitamins. Phosphorus is supplied to animals by food, mainly by plants . Most of the phosphate present in plants, in particular. in seeds is found in the form of phytin, complex salt of myo-inositol-hexakisphosphoric acid or phytic acid.
  • Phytin therefore constitutes a reserve of phosphorus, of sugars, but also of various cations (Ca 2+ , Zn 2+ , Mg 2+ , Fe 3+ ).
  • Phytin, salt of phytic acid complexed with various cations therefore represents the major form of storage of phosphate in seeds but it is also present in pollen, storage organs such as tubers or in the roots. Its distribution in seeds varies from one species to another:
  • dicots in dicots (soybeans, castor), it is mainly present in the cotyledons and the endosperm;
  • phytin and phytic acid from dry seed meal are not digested by monogastric animals (such as pork and chicken) in the absence of exogenous phosphatase, and are therefore excreted as such. They thus contribute to the pollution of soil and water, by phosphate, in areas of intensive farming.
  • phytic acid is considered to be an anti-nutritional factor because it chelates the mineral elements and causes protein aggregation. Consequently, these minerals and proteins will not be correctly assimilated during intestinal transit by monogastric animals (Graf, 1986).
  • the authors of the present invention are interested in another family of enzymes, which do not exhibit significant homology with Phyt I or Phyt II: MLPP - Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatases, related to the histidine phosphatases listed only in the animal kingdom. They play an important role in the processes of ossification, in particular in the development and differentiation of chondrocytes (Romano et al, 1998). These phosphatases are also known to be the only animal enzymes which hydrolyze the molecules of inositol-tetra, -penta- and - hexa ⁇ hos ⁇ hate (Chi and ⁇ /., 1999).
  • the present invention therefore relates to an acid. isolated nucleic acid coding for a plant MIPP enzyme with phytase activity. Cereal MIPP enzymes are particularly targeted, in particular those of corn, rice and wheat.
  • the invention relates more particularly to an isolated nucleic acid comprising a sequence chosen from SEQ ID No. 1 (corn cDNA), SEQ ID No. 3 (rice cDNA) or SEQ ID No. 17 (corn cDNA).
  • the subject of the invention is an isolated nucleic acid comprising the sequence SEQ ID No. 17 or a sequence homologous to the sequence SEQ ID No. 17.
  • sequences complementary to these nucleic acid sequences also form part of the present invention.
  • a subject of the invention is also fragments of the above sequences coding for peptides retaining the activity mentioned, or the complementary sequences of these fragments.
  • the invention also relates to the homologous sequences of the sequences mentioned above.
  • homologous refers to any nucleic acid having one or more sequence modification (s) from all or part of a given sequence.
  • homologous sequences are, preferably, defined as: i) sequences similar to at least 70% of the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17, preferably at least 80%, more preferably at least minus 90%; or ii) sequences hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17, or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions, or iii) sequences coding for a plant MIPP enzyme comprising the sequence amino acid SEQ ID No. 2, No. 4 or No. 18, or a homologous amino acid sequence.
  • a homologous nucleotide sequence specifically hybridizes to the sequences complementary to the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17 under stringent conditions.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) + 16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases) (Sambrook et al, 1989).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature can preferably be 5 to 10 ° C below Tm, and the hybridization buffers used are preferably force solutions high ionic content such as 6xSSC solution for example.
  • similar sequences used above refers to the perfect resemblance or identity between the nucleotides compared but also to the non-perfect resemblance which is called similarity. This search for similarities in the nucleic sequences distinguishes, for example, purines and pyrimidines.
  • a nucleotide sequence homologous to the ORF represented in SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17 therefore includes any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17 by mutation, insertion, deletion or substitution of one or more bases, or by degeneration of the genetic code, provided that it codes for a polypeptide exhibiting the phytase activity of plant MTPP.
  • homologous sequences are included the sequences of cereal genes other than corn or rice, as well as allelic variants.
  • the present invention also relates to an isolated polypeptide, called
  • Plant MIPP preferably comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 2, No. 4 or No. 18. More particularly, the polypeptide comprises the amino acid sequence SEQ ID No. 18. It is understood that are also understood the homologous sequences, advantageously defined as i) sequences similar to at least 70% of the sequence SEQ ID No. 2, No. 4 or No. 18, preferably at least 80%, more preferably at least 90 %; or ii) the sequences encoded by a homologous nucleic acid sequence as defined above, that is to say a nucleic acid sequence hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17 or its complementary sequence, under stringent hybridization conditions.
  • similar refers to the perfect resemblance or identity between the amino acids compared but also to the non-perfect resemblance which is termed similarity.
  • This search for similarities in a polypeptide sequence takes into account conservative substitutions which are amino acid substitutions of the same class, such as amino acid substitutions for the uncharged side chains (such as asparagine, glutamine, serine, threo ine, and tyrosine), amino acids with basic side chains (such as lysine, arginine, and histidine), amino acids with acid side chains (such as aspartic acid and glutamic acid); amino acids with apolar side chains (such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan, and cysteine).
  • amino acid substitutions for the uncharged side chains such as asparagine, glutamine, serine, threo ine, and tyrosine
  • homologous amino acid sequence any amino acid sequence which differs from the sequence SEQ ID No. 2, No. 4 or No. 18 by substitution, deletion and / or insertion of an amino acid or a reduced number of amino acids, in particular by substitution of natural amino acids with non-natural amino acids or pseudo-amino acids at positions such that these modifications do not significantly affect the biological activity of the Vegetable MIPP.
  • Homology is usually determined using sequence analysis software (for example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Similar amino acid sequences are aligned to obtain the maximum degree of homology (i.e. identity or similarity, as defined above).
  • the degree of homology is established by recording all the positions for which the amino acids of the two sequences compared are identical, relative to the total number of positions.
  • the biological activity of plant MIPP refers in particular to its phytase activity, which can be determined by the determination of the phosphate released by the enzyme from sodium phytate.
  • polypeptide of the present invention can be synthesized by any method well known to those skilled in the art.
  • the polypeptide of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as the Merrifield type synthesis which is advantageous for reasons of purity, absence of unwanted side products and for its ease of production. .
  • a recombinant protein can also be produced by a method, in which a vector containing a nucleic acid according to the invention, such as a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID No. 1, No. 3 or No. 17 or a homologous sequence is transferred to a prokaryotic or eukaryotic host cell which is cultured under conditions allowing expression of the corresponding polypeptide.
  • the protein produced can then be recovered and purified.
  • the purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide obtained can be purified from cell lysates and extracts, supernatant of the culture medium, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, etc.
  • the present invention therefore also relates to a method for producing vegetable MIPP protein, characterized in that it comprises the steps of: a) transformation of a cell, in particular of a plant or of a microorganism, with a expression cassette comprising regulatory sequences capable of controlling the expression of an increased amount of MIPP in said host cell; b) optionally culturing said host cell or, in the case where this host cell is a plant cell, growing the transformed plant; c) extraction of the MIPP protein from the cell culture or from the transformed plant.
  • the present invention therefore also relates to an expression cassette, characterized in that it comprises at least one of the nucleic acid sequences or fragments as defined above, placed under the control of at least one regulatory sequence capable of controlling expression of the vegetable MTPP protein.
  • promoters include promoters, activators and introns and transcription terminators.
  • a large number of promoters can be used for the transformation of plants according to the present invention.
  • the specific promoters of an organ or a tissue of the plant and more particularly the specific grain promoters (Datla et al, 1997), such as the promoters of genes coding for reserve proteins such as: a glutenin of high molecular weight HMWG (High Molecular Weight Glutenin) of wheat or barley specific for albumen (Roberts et al, 1989; Anderson OD et al, 1989), napine, phaseoline, helianthinine, albumin, oleosin, GEAI and GEA6 from Arabidopsis thaliana (Gaubier et al, 1993), corn ⁇ -zein, the promoter of the pHyPRP gene coding for a hybrid protein rich in corn proline (HyPRP: Hybrid Proline Rich Protein) which is specific for the embryo and more particularly for scutellum (Josè-Estanyol et al, 1992), the Npl promoter of the gene Niviparousl (transcription activator -
  • promoter of the gene coding for the small subunit of RUBISCO Ribulose 1.5 BISphosphate Carboxylase Oxygenase, promoter of the gene coding for chlorophyll a / b,
  • genes coding for enzymes preferably chosen from these: corn alcohol dehydrogenase 1 (Adhl), phenylalanine ammonia lyase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), chitinase, glucanase , protease inhibitors, genes of the PR1 family, the vspB gene (US 5,670,349), HMG2 (US 5,670,349), apple beta-galactosidase (Abgl), or amino-cyciopropane carboxylate synthase (WO 98/45445 ).
  • tissue-specific or organ-specific ectopic expression allows the production of seeds rich in inorganic phosphate or enriched in MTPP protein capable of degrading phytin while limiting any physiological damage due to a variation in the phytin content.
  • a constitutive promoter will preferably be used such as the pAct 1 promoter of the rice Act 1 gene contained in the plasmid pActl-F4 (Me Elroy et al, 1991) or the p35S promoter (Kay et al, 1987), or a tissue specific promoter such as the HMWG wheat or barley promoter, or the pCRU promoter of the radish cruciferin gene, which all allow expression of the protein of interest in the seeds (Roberts et al, 1989; Anderson OD et al, 1989; Depigny-This et al, 1992).
  • elements such as activators and introns can also be inserted into the expression cassette in order to amplify the expression of the gene of interest.
  • an activator is the TEN (Tobbaco Etch Nirus) translation activator described by Carrington and Freed (1990).
  • the first intron of the Adhl S gene from corn which can be placed between the promoter and the coding sequence. This intron, when included in a genetic construction, increases the expression of the desired protein in corn cells (Callis et al, 1987).
  • the expression cassette can also contain 5 'untranslated sequences called' leaders'. Such sequences can increase translation. Among those known to those skilled in the art, there may be mentioned:
  • the transcription terminator is the nos terminator of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al, 1992) or the polyA 35S sequence of the cauliflower mosaic virus (CaMN) , described in the article by Franck et al. (1980).
  • said regulatory sequences also include addressing signals capable of directing the expression specifically in a particular type of cell compartment, for example the extracellular space or the apoplasm.
  • chloroplast addressing signals mention may be made of the sequence coding for the transit peptide of the precursor of the small subunit of ribulose 1,5-bis-phosphate carboxylase oxygenase from Pisum sativum.
  • mitochondrial addressing signals mention may be made of the sequence coding for the transit peptide of the precursor of the ⁇ subunit of the mitochondrial ATP-ase FI of Nicotiana plumbaginifolia.
  • the addressing sequences can be sequences coding for an N-terminal signal peptide ("prepeptide"), possibly in association with a signal responsible for the retention of the protein in the endoplasmic reticulum (signal of the KDEL type or KTEL), or a vacuolar or "propeptide” addressing signal.
  • the presence of the N-terminal signal peptide or prepeptide allows the introduction of the neopolypeptide into the endoplasmic reticulum where a number of post-translational modifications take place, in particular the cleavage of the signal peptide, the N-glycosylations, if the protein in question presents N-glycosylation sites, and the formation of disulfide bridges.
  • the prepeptide responsible for addressing the protein in the endoplasmic reticulum, is very useful. It is normally a hydrophobic N-terminal signal peptide having between 10 and 40 amino acids and being of animal or vegetable origin. Preferably, it is a prepeptide of plant origin, for example that of sporamine, barley lectin, plant extensin, protein PR1 or PR2.
  • the signal peptide is cleaved by a signal-peptidase upon the co-translational introduction of the neopolypeptide into the lumen of the RER (Rough Endoplasmic Reticulum).
  • the mature protein no longer has this N-terminal extension.
  • the addressing sequences can, in addition to the prepeptide, also include an endoplasmic retention signal, consisting of the peptides KDEL, KTEL, SEKDEL or HEKDEL. These signals are normally found at the C-terminus of the protein and can remain on the mature protein. The presence of this signal tends to increase the yields of recombinant proteins.
  • KDEL or KTEL type sequences at the C-terminal end of proteins leads to their retention in the endosplasmic reticulum and therefore to a cellular compartmentalization of these proteins.
  • This compartmentalization can in certain cases block the accessibility of the enzyme to its substrate present in a different cellular compartment, leading to inactivity of the protein.
  • the elimination of these sequences can lead to an apoplastic expression of the protein which can allow better accessibility of the protein to its substrate.
  • Elimination can also lead to expression of the protein in a compartment other than that in which its substrate is expressed, thus avoiding rapid degradation of phytic acid capable of altering the development of the seed.
  • the activity of the enzyme vis-à-vis its substrate can therefore be controlled in space and time.
  • a subsequent step of grinding the seed can be carried out to allow the enzyme to access its substrate.
  • the elimination of the KTEL or KDEL sequence can be carried out in particular by the PCR amplification technique using primers specific for the C-terminal part of the protein just upstream of the KTEL or KDEL sequence and by adding on the initiates a stop codon.
  • the addressing signals may, in addition to the prepeptide, also include a vacuolar or "propeptide" addressing signal.
  • a vacuolar or "propeptide” addressing signal In the presence of such a signal, after passing through the RER, the protein is addressed to the vacuoles of the aqueous tissues, for example the leaves, as well as to the protein bodies of the reserve tissues, for example the seeds, tubers and roots.
  • the addressing of the protein towards the protein bodies of the seed is particularly interesting because of the capacity of the seed to accumulate proteins, up to 40% of the proteins relative to the dry matter, in cellular organelles derived from vacuoles. , called protein bodies and because of the possibility of storing for several years the seeds containing the recombinant proteins in the dehydrated state.
  • propeptide a signal of animal or plant origin can be used, plant signals being particularly preferred, for example pro-sporamine.
  • the propeptide can be N-terminal ("N-terminal targeting peptide" or NTTP), or C-terminal (CTTP). Since propeptides are normally cleaved upon entry of the protein into the vacuole, they are not present in the mature protein.
  • signal peptide or prepeptide can lead to the glycosylation of the protein.
  • the invention also relates to a vector into which is inserted the expression cassette as defined above.
  • This vector can be a plasmid which may further comprise a marker gene for distinguishing a transformed plant from a plant which does not contain the transferred foreign DNA.
  • the vector can include, as a marker gene, both selection genes which confer resistance to an antibiotic or a herbicide, as well as reporter genes. the selection genes which can be used, there may be mentioned:
  • the chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene which detoxifies chloramphenicol.
  • the following reporter genes can be mentioned: the gene coding for the ⁇ -glucuronidase (GUS) enzyme,
  • vectors comprising a DNA sequence containing at least one origin of replication such as plasmids, cosmids, bacteriophages, viruses, etc. .. Plasmids are nevertheless preferred.
  • the invention also relates to cellular hosts, in particular bacterial hosts, containing the above-mentioned vectors.
  • the invention also provides a method for producing transgenic plants comprising, inter alia, the steps of: transformation of plant cells with an expression vector containing a nucleic acid fragment of the present invention, selection of the transformed cells, generation plants transformed from these cells, expressing the inserted nucleic acid fragment.
  • the transformation of the plants according to the invention can be carried out by different methods, known to the skilled person. We can cite, first of all, direct gene transfer methods such as micro-injection into plant embryo cells (Neuhaus et al., 1987) or electroporation (Chupeau et al., 1989 ), direct precipitation with polyethylene glycol (Schocher et al., 1986) or bombardment with a particle gun (Me Cabe et al., 1988).
  • the bacterial strain may contain the gene coding for the plant MLPP enzyme, under the control of elements ensuring the expression of said gene.
  • the bacterial strain can be transformed by a vector into which is inserted a sequence encoding said enzyme under the control of elements ensuring its expression.
  • This sequence is inserted, for example, into a binary vector such as pBLN19 (Bevan, 1984) or pMON 505 (Horsch and Klee, 1986) or any other binary vector derived from the plasmids pTi and pRi. It can also be usefully introduced by homologous recombination into a disarmed pTi or pRi plasmid, such as pGN 3850 (Zambryski et Coll., 1983) before the transformation of the plant.
  • the nucleic acid fragments are introduced into the cells by bombardment of particles covered by said fragments.
  • Particle bombardment offers the advantage of rapid transformation. Generally immature embryos undergo only one bombardment. However, repeated bombardment can increase the frequency of transformation (WO 98/49316).
  • the transformed cells are selected according to the phenotypic markers used in the vector. This selection is carried out on a medium containing an appropriate selective agent. The transformed cells thus selected are then cultivated and the plants are regenerated. DNA extraction and a Southern blot with probes specific for the gene of interest confirm the transformation.
  • the methods making it possible to isolate DNA from biological materials in culture and to verify the presence of the insert are well known to those skilled in the art, they are, among others, described by Southern et a, 1975 and Mullis et a, 1987.
  • a more particular subject of the present invention is a method for increasing the phytase activity of a plant, characterized in that an overexpression of a MIPP, more particularly of corn, rice or wheat, is induced in said plant. using an expression cassette as described above and according to the preceding method.
  • overexpression is meant here both an increase in the level of MIPP compared to the level expressed in a normal plant, and an ectopic expression of this enzyme, in a tissue or a compartment and / or at a stage of development where that -this is not normally expressed.
  • the foreign sequence can be heterologous, that is to say that it comes from a plant different from the host cell. It can also be a sequence of MIPP naturally produced by the plant.
  • the present invention also relates to plant hosts, consisting of plants or plant organs, transformed with one or more nucleic acids of the invention and according to the method defined above. If the transformation involves several genes of interest, then these can be inserted into the same expression cassette or else into different expression cassettes.
  • plant hosts includes plants as well as plant cells or different parts of the plant, such as seed, fruit or leaf.
  • transgenic plants in particular corn, wheat, barley, sorghum, rye, rice, preferentially corn, as well as peas, soybeans and potato.
  • transgenic plants of the invention include both first generation plants and their descendants (lines or hybrids, in particular).
  • the present invention more particularly relates to transgenic plant hosts in which a plant MIPP, more particularly of corn, wheat or rice, can be expressed in a part of the plant or a cellular compartment where this enzyme is not produced naturally or only in small quantities.
  • These plant hosts are characterized by a genome into which an expression cassette according to the invention has been introduced comprising regulatory sequences which induce specific expression in said part of the plant or said cell compartment.
  • the plant host in question is advantageously a cereal and more advantageously still corn, wheat and rice, or their organs.
  • the present invention relates more precisely to a transgenic plant, according to the invention, characterized in that it produces transgenic seeds expressing an increased quantity of enzymes with phytase activity.
  • the present invention also comprises the seeds of this transgenic plant and in particular the seeds comprising an increased vegetable MIPP content, obtained by specific expression of one of the nucleic acid sequences according to the present invention, in the seed.
  • the subject of the present invention is a composition for human or animal consumption comprising seeds, a seed meal or a vegetable MIPP, produced according to the present invention.
  • the nucleic acids defined by the invention can be used as a marker for the phenotype linked to the expression of MIPP proteins.
  • the invention allows the use of the nucleotide fragments as molecular markers in culture programs, in particular in the selection of varieties expressing a MIPP protein or a plant transformed with a sequence coding for this MIPP.
  • these sequences make it possible to obtain genomic DNAs by methods known to those skilled in the art, for example by screening genomic libraries according to the indications of Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • degenerate probes they allow the identification of genes coding for proteins homologous to plant MIPPs.
  • the transgenic plants expressing the plant MIPP according to the invention or the enzyme itself can be used for various purposes, in any situation where the phytase activity of this enzyme is necessary or desired.
  • Plant MIPP is thus useful in food preparation processes or in starch extraction processes (soaking process).
  • this enzyme it is possible to increase the extractability of the starches of the grains where it is expressed.
  • Phytate precipitates proteins with starch so that if you reduce the phytate level, the extraction of starch is easier.
  • Addition of an active enzyme phytase to the grains of plants from which it is desired to extract the starch makes it possible to compensate for the precipitation of proteins by phytates.
  • a plant transformed with a sequence coding for a plant MIPP according to the process defined by the invention, or a part thereof, can be used to improve the digestibility of phytate, in the food ration of monogastric animals, and therefore , reduce the level of phytate in manure or slurry.
  • the phytase activity of the vegetable MIPP can also be used to make the most of recovered soaking water or brewing water, during food preparations.
  • the increased availability of phosphorus makes these waters very useful as additives for culture media or fermentation supports.
  • the phytase activity generated allows better recovery of inositol and its derivatives from soaking or brewing water.
  • the invention also relates to the use of a plant MIPP according to the invention or the use of all or part of plants containing an MLPP according to the invention, for therapeutic or dietetic purposes, in particular for the production of myo-inositol and / or for the reduction of phytic acid.
  • Phytic acid has been held responsible for certain impacts on human health such as bone malformation, osteosporosis and anemia caused by iron deficiency, or interference with the assimilation of calcium, magnesium and zinc (Berlyne et al., 1973; Shan et al., 1979).
  • Myo-inositol the active nutritional form of inositol, is a constituent of the phospholipid phosphatidylinositol. He is known for his virtues in the health field. It has often been attributed to effects on the decrease in the concentration of triglycerides and cholesterol in the blood, and more generally for protection against cardiovascular diseases. In addition, it is recognized that compounds derived from a phospholipid such as myo-inositol have beneficial effects on insomnia and anxiety. In addition, the peripheral neuropathy of the diabetic is one of the most paralyzing complications of diabetes.
  • the invention relates to the use of the vegetable MIPP, according to the invention, for releasing inorganic phosphate directly assimilable by monogastrics (Pointillard, 1994) and / or improving the availability of cations chelated by phytin such as iron, calcium, magnesium or zinc. This avoids the addition of supplements in animal rations and increases the nutritional value of the seed.
  • Figure 1 represents an alignment of the nucleic sequences coding for the MLPP of corn and rice.
  • Figure 2 shows an alignment of the protein sequences of MIPP in rice and maize.
  • Figure 3 shows a comparison of the amino acid sequences of MIPP in rice and corn with animal MIPP, acid phophatases and fungal phytases.
  • Figure 4 is a restriction map of plasmid pRD-257.
  • Figure 5 is a restriction map of plasmid p3214.
  • Figure 6 is a restriction map of plasmid pBIOS 421.
  • Figure 7 is a restriction map of plasmid pBIOS 422.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic sequence of cDNA isolated from maize
  • SEQ ID N ° 2 Amino acid sequence of a corn MLPP protein (ZmMIPP)
  • SEQ ID N ° 3 Nucleic sequence of cDNA isolated from rice
  • SEQ ID N ° 4 Amino acid sequence of a rice MIPP protein (OsMIPP)
  • SEQ ID N ° 5 Oligonucleotide 5'olZMP1 used as primer 5 'for obtaining the ZmMIPP cDNA.
  • SEQ ID N ° 7 Internal oligonucleotide olMIPPl.
  • SEQ TD No. 8 Internal oligonucleotide olMIPP2.
  • SEQ ID No. 10 Oligonucleotide 3'olOSP used as primer 3 'for obtaining the OsMIPP cDNA.
  • SEQ ID NO: 1 Oligonucleotide 5'olOSP1 used as primer 5 'for obtaining the OsMIPP cDNA.
  • SEQ TD N ° 12 oligonucleotide olMIPP9 used as a 3 'primer for obtaining the cDNA coding for a wheat MIPP.
  • SEQ ID N ° 13 oligonucleotide olMIPPlO used as a 3 'primer for obtaining cDNA encoding a wheat MIPP.
  • SEQ TD N ° 14 Nucleic sequence of EST 3'TaMIPP.
  • SEQ ID N ° 17 Nucleic sequence of cDNA isolated from corn
  • SEQ ID N ° 18 Amino acid sequence of a corn MTPP protein (ZmMIPP)
  • EXAMPLE 1 Isolation of the cDNA clones coding for a plant MIPP protein.
  • the plant MLPP sequences can be obtained by carrying out a bioanalysis study from sequences coding for animal MTPPs, presented by Caffrey et al. (1999). These sequences thus make it possible to define ho ologies with cDNA sequences referenced, for example, in databases specific to corn, wheat and rice. By identifying ESTs specific to the homologous sequences of said animal sequences, oligonucleotides can then be defined and used as primers to isolate by PCR these cDNAs of interest from cDNA or cDNA libraries.
  • Immature leaves 40 seeds B73 are put in potting soil and placed in a greenhouse. For the harvest of immature leaves, we await the stage where 7-8 leaves are visible, that is to say approximately 3-4 weeks in the greenhouse. The immature leaves are still in the cornet. A sample at 3 weeks and 4 weeks was taken. Immature leaves were also collected at 2 weeks after germination. Obtaining type II calluses
  • the ear samples are taken when the immature embryos have reached a size of 1.5 mm to 2 mm, that is to say 10 days after fertilization.
  • the harvested ears are stripped of their husks and their bristles then are disinfected with Domestos® 20% (v / v) for 15 minutes with stirring.
  • the ears are rinsed three times with sterile water.
  • the upper part of the grain is cut to reveal the albumen, then a light pressure on the grain allows to release the albumen.
  • the immature embryo which is still in the grain is extracted and then deposited on the callogenesis medium N6P6 (Salts N6 3.98% (w / v) (Sigma C1416); vitamins N6 5ml / L; L-proline 0.7 % (w / v); casein hydrolyzate 0.1% (w / v); sucrose 20% (w / v); 2,4-D 0.001% (w / v); phytagel 2.5% (w / v), pH 5.8) by orienting it flat side on the agar.
  • the embryos are cultured for 15 days in a culture chamber at
  • the embryos are separated from their radicle and then subcultured on a new N6P6 medium.
  • the proliferating callus is subcultured every 2 to 3 weeks on N6P6 medium (box of 16 calluses).
  • the calluses are multiplied in a culture chamber at 26 ° C and in the dark.
  • oligonucleotides used as PCR primers for the screening of cDNAs are presented in the appendix.
  • the oligonucleotides were determined from the nucleic acid sequences of the ESTs identified in bioanalysis as being highly homologous to the sequences coding for animal MIPPs.
  • the oligonucleotides which surround the coding sequence of the ZmMIPP gene have restriction sites in 5 ′: Ncol or NJel and in 3 ′: Bam ⁇ l, this to allow cloning oriented in the bacterial expression vector pET-14b ( ⁇ ovagen).
  • the internal oligonucleotides olMTPP1 and olMIPP2 SEQ LD ⁇ ° 7 and 8), which are used to verify the identity of the sequences, do not have any.
  • PCR amplification The manipulation was repeated on two different pools of total RNA for the same species and the same tissue.
  • the amplification reaction was carried out directly on the first strand of cDNA synthesized from the total RNAs.
  • CDNA from immature leaves and calluses allowed amplification of a 1.6 kb fragment.
  • a PCR was carried out with the pairs of oligonucleotides 5'olZMP1-olMIPP2 (SEQ LD N ° 5 and 8), and olMIPPl-3'olZMP (SEQ ID N ° 7 and 6), olMTPPl and olMIPP2 being internal oligonucleotides specific for the RHGXRXP consensus sequence, generating respectively an amplification at 0.2 kb and 1.4 kb.
  • This result shows the presence of the RHGXRXP site in the 1.6 kb fragment. Therefore, it was cloned into pGEM-T (Promega) and sequenced.
  • MGMAAPRAPLPLPQLLLLLNAALLA (SEQ . LD ⁇ ° 15) - a putative retention signal in the endoplasmic reticulum at the C-terminal end of the protein: KTEL
  • RNA extraction is carried out using rice calluses.
  • Cultivation conditions Induction of rice calluses. Ripe rice grains are stripped of their outer husks, disinfected 1 min in 70% ethanol (v / v) and 30 min in 50% domestos (v / v). The grains are rinsed in sterile distilled water and deposited on the N6P6 medium contained in petri dishes. The boxes are sealed and placed for 21 days in the oven at 28 ° C in the dark. From the scutellum of the embryo, a primary callus develops. Around the primary callus, small embryogenic units are individualized, they are transferred to petri dishes containing the N6P6 medium and incubated for 14 days at 28 ° C and in the dark. During this period, their size will increase. The calluses are then removed for the extraction of RNA.
  • the oligonucleotides used were determined from the ESTs identified in bioanalysis as being highly homologous to the sequences coding for animal MTPP.
  • the oligonucleotides which should frame the coding sequence of the MIPP gene have restriction sites in 5 ′: Nc ⁇ l or Ndel and in 3 ′: BamHl, this to allow cloning oriented in the bacterial expression vector pET-14b.
  • the internal oligonucleotides which are used to verify the identity of the sequences do not have any.
  • PCR amplification The manipulation was repeated on two different pools of total RNA for the same species and the same tissue.
  • the amplification reaction was carried out directly on the first strand of cDNA synthesized from the total RNAs.
  • the amplification reaction with the pairs of oligonucleotides 5O1OSP-3O1OSP (SEQ ID N ° 9 and 10) or 5O1OSP1-3O1OSP (SEQ ID N ° 11 and 10) on the callus cDNAs generates a 1.6 kb fragment.
  • MAAPRTPLPLVLLLVSAA SEQ LD n ° 16
  • the authors of the invention carried out kinetics of the phytase activity of a fraction of the grain enriched in bran during development at 10, 20, 30 and 40 JAA. This phytase activity increases during grain development. This increase can be explained by an activation of enzymes and / or by an accumulation of enzymes in the bran during grain development.
  • RNA extracted from grain bran taken at 10, 20, 30, 40 JAA.
  • expression kinetics i.e. Northern blots, with the OsMP probe (nucleotide 105 to nucleotide 1506 - sequence corresponding to 467 amino acids of the C-terminal part of the protein) or the ZmMP probe nucleotide 1 to nucleotide 1572 - (sequence corresponding to 524 amino acids of the protein), were carried out on Total RNA extracted from grain bran taken at 10, 20, 30 and 40 JAA. Furthermore, the cDNAs corresponding to the total RNAs extracted from its sample taken from
  • the wheat MIPP cDNA is isolated by RT-PCR or by RACE-PCR.
  • the oligonucleotides used for the amplification reactions are determined from the nucleic sequences of the rice and maize MIPP cDNA clones in the areas where the sequence homologies are strongest. It is also possible to use degenerate oligonucleotides, determined from the nucleic acid sequences, in particular that of rice and corn, corresponding to the N and C-terminal regions of plant MIPPs.
  • the nucleic sequence of the OsMIPP cDNA was used to search for homologous sequences in EST bases of wheat Triticum aestivum.
  • a TSE from wheat cDNA has been retained, it is named 3'TaMIPP (SEQ TD N ° 14).
  • the protein sequence deduced from the EST has a strong homology with the 58 amino acids of the C-terminal part of the protein OsMIPP. This EST was used to define two primers olMIPP9 and olMIPPlO (SEQ ID No. 12, SEQ LD No. 13).
  • the Ndel restriction site brought by the oligonucleotides 5'olZMPl and 5'olOSPl and the BamHI restriction site, brought by the oligonucleotides 3'olZMPl and 3'olOSPl, frame the CDNA ZmMIPP and OsMIPP. They allow the oriented and phase cloning of cDNAs at the NdeI and BamHI restriction sites of the bacterial expression vector pET-14b (Novagen).
  • the vectors obtained pET-OsMTPP and pET-ZrnMTPP were verified by sequencing.
  • Protein production is done according to the recommendations of the supplier Novagen. E. coli strain BL21 (D ⁇ 3) pLysS bacteria were used.
  • the vector pLysS makes it possible to avoid the expression of the recombinant protein when the production has not been induced and facilitates the lysis of the cells because it carries the gene coding for the lysozyme of phage T7.
  • E. coli strain BL21 (D ⁇ 3) pLysS bacteria are transformed with the vectors p ⁇ T-OsMTPP and p ⁇ T-ZmMIPP; these bacterial transformants are used respectively for the production of the proteins OsMIPP and ZmMIPP.
  • E. coli strain BL21 (D ⁇ 3) pLysS bacteria are transformed with p ⁇ T-14b; these bacterial transformants serve as a negative production control.
  • E. coli strain BL21 (D ⁇ 3) pLysS bacteria are also used as a negative production control.
  • Each bacterial transformant is cultured in 5 ml of LB medium (Luria-Bertani medium) in the presence of suitable antibiotics at 37 ° C. with stirring (175 rpm) for 15 hours.
  • suitable antibiotics Two antibiotics are used: carbenicillin and chloramphenicol. Resistance to chloramphenicol is provided by the vector pLysS (concentration used: 30 ⁇ g / ml). Resistance to carbenicillin is provided by the vector p ⁇ T-14b (concentration used: 50 ⁇ g / ml).
  • the appropriate use of one or both antibiotics makes it possible to select the bacterial transformants which contain the vectors pLysS and / or p ⁇ T-14b.
  • a volume of 1 ml of each preculture is used to inoculate a volume of 100 ml of LB medium with the appropriate antibiotics contained in a 500 ml Erlenmeyer flask.
  • DOeoonm 0.6
  • the 100 ml of LB medium are distributed equitably in two 250 ml Erlenmeyer flasks.
  • the first is used for protein production.
  • the production is induction by adding 500 ⁇ l of 100 mM IPTG, ie a final concentration of 1 mM.
  • the production is carried out for 6 h at 30 ° C. with stirring (175 rpm).
  • the second Erlenmeyer flask serves as an uninduced witness. It is incubated for 6 h at 30 ° C. with shaking (175 rpm).
  • the bacterial culture is centrifuged at 3000 rpm for 5 min at 4 ° C.
  • the bacterial pellet is taken up in a volume of T ⁇ buffer pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, ⁇ DTA 1 mM) such that the T volume volume / culture volume ratio is 1/20.
  • the bacteria are stored at -80 ° C.
  • Bacteria are lysed in two stages: a freezing stage - defrosting (two freezing cycles at -80 ° C / defrosting at 37 ° C), an ultrasound step: 3 times 15 s, 30%, 4 draws / s. Between each cycle, the sample is placed in ice.
  • a cocktail of protease inhibitors is added to the bacterial lysate, which contains bacterial proteins and heterologous proteins, in order to preserve them.
  • the concentration of total proteins in the extracts is evaluated according to the method of Bradford (1976).
  • 2 ⁇ l of bacterial lysate are added to 200 ⁇ l of Coomassie reagent (Bio-Rad protein assay).
  • the protein extract is replaced by 2 ⁇ l of TE buffer pH 8.0.
  • the absorbances are read at 595 nm with a fluorimeter (Labsystems Genesis N2.00) assisted by the software (Labsystems).
  • the amount of protein is determined according to a standard curve made with bovine serum albumin (1 mg / ml).
  • the separation gel is 10% polyacrylamide (acrylamide / bisacrylamide,
  • the concentration gel is 4% polyacrylamide containing 0.12 M Tris-HCl pH 6.8 and 0.1% SDS (w / v).
  • the polymerization of the gel is carried out in the presence of ammonium persulfate 0.05% (w / v) and Temed 0.078% (v / v).
  • 40 ⁇ g of protein is used for the SDS-PAGE analysis.
  • the proteins are taken up in the deposition buffer composed of 30 mM Tris-HCl, pH 6.8, 12.5% glycerol (v / v), 1% SDS (w / v), 0.005% bromophenol blue.
  • the migration buffer is composed of 25 mM Tris-base, 0.2 M glycine and 0.1% SDS (w / v).
  • the electrophoresis is carried out at constant voltage 150 volts for 1 hour at room temperature. After migration, the gel is rinsed three times 10 minutes in water, the proteins are stained with a solution of Coomassie blue G250 (Bio-Safe Coomassie, Bio-Rad) for 1 hour, the gel is then rinsed in water, at room temperature.
  • heterologous protein SDS-PAGE analysis was performed on crude bacterial extracts.
  • the presence of the heterologous protein in the bacterial culture after induction of production is difficult to determine.
  • Western blot analysis with an appropriate antibody confirms the presence of the heterologous protein.
  • the heterologous protein has the advantage of being synthesized with a peptide at its N-terminal end.
  • Antibodies specific for this peptide are commercially available and can be used to demonstrate the heterologous protein. This is in line with the work of Craxton et al. (1997): during production trials in E. coli of an animal MIPP, the protein could only be detected by immunodetection.
  • the phytase activity is determined by the dosage of phosphate released by the enzyme from sodium phytate. The measurement of phytase activity is carried out directly on the bacterial lysates. .
  • the determination of free phosphate is carried out on the supernatant.
  • 750 ⁇ l of supernatant 750 ⁇ l of the following reagent is added: FeSO 0.38 M, H SO 0.16 N / ammonium molybdate 12 mM, H 2 SO 1 N, 1/4, v / v.
  • the absorbance is measured at 690 nm.
  • the amount of phosphate is determined from a standard curve.
  • the phytase activity is expressed in rrmoles of phosphate released per hour, per mg of total protein at 55 ° C.
  • the phytase activity was carried out on bacterial extracts.
  • a step of purification of the heterologous protein from the crude bacterial extracts is nevertheless preferable to improve the interpretation of the results. This is easily possible due to the presence of the peptide at the N-terminal end of the heterologous protein which makes it possible to purify it by affinity chromatography.
  • the pCsNMV promoter (Nerdaguer et al, 1996, 1998) of the cassava rib mosaic virus is used.
  • the construct is carried out as follows:
  • the 556 bp ClaI-Sacll fragment of the vector pRD 257 contains the promoter pCsVMV. This fragment is cloned into the vector p3214 (FIG. 5) digested with ClaI and EcoRI.
  • the vector obtained is named vector pBIOS 366. It contains the promoter pCsVMN and the terminator ter nos.
  • the OsMIPP cDNA was cloned into the vector pG ⁇ M-T (Promega) giving the vector pBIOS 367.
  • the vector pBIOS 367 is digested with NotI generating a fragment of 1563 bp containing the complete OsMIPP cDNA.
  • This fragment is cloned into the vector pBIOS 366 digested with Pstl.
  • the vector pBIOS 368 which contains the cassette: pCsVMV promoter, OsMIPP cDNA, ter nos terminator.
  • the vector pBIOS 368 is digested with Xho, which allows the cassette to be released: pCsVMV promoter, OsMIPP cDNA, ter nos terminator. It is cloned at the Xhol site of the binary vector pBIOS 273.
  • the vector pBIOS 273 contains the T-DNA of Arabidopsis thaliana in which are found the promoter pActl and the first intron of the rice Actl gene, the coding sequence of the bar gene and the terminator nos.
  • the vector obtained is the vector pBIOS 369.
  • the vector pBIOS 369 comprises firstly the T-DNA in which the cassette for expression of the OsMIPP gene is found, inserted between the promoter pCsVMV and the terminator Nos, the cassette for expression of the selection gene, the Bar gene inserted between the pActl promoter and the first intron of the rice Actl gene and the nos terminator.
  • pBIOS 369 also contains the gene for resistance to spectinomycin and an origin of functional replication in E. coli
  • the construct allowing the expression of OsMIPP in the cytoplasm of the albumen cells is carried out as follows:
  • vector pBIOS 370 10 - Digestion of the vector pBIOS 370 with the enzyme Xhol generates a fragment of 2287 bp which is cloned at the Xhol site of the binary vector pBIOS 273.
  • the vector obtained is named pBIOS 271.
  • the vector pBIOS 371 comprises on the one hand the T-DNA in which the expression cassette for the OsMLPP gene is located, inserted between the promoter pHMWG and the terminator Nos, the expression cassette for the selection gene, the Bar gene inserted between the pActl promoter and the first intron of the rice Actl gene and the nos terminator. On the other hand, pBIOS 371 also contains the gene for resistance to spectinomycin and an origin of replication in E. coli.
  • the promoter pHMWG of the gene coding for a high molecular weight wheat glutenin (HMWG: High Molecular Weight Glutenin) is used.
  • ZmMIPP in the vector pG ⁇ M-T easy generates a 1600 bp fragment containing the complete ZmMIPP cDNA. This fragment is cloned at the EcoRI and BamHI sites of the vector P3214 (FIG. 5) between the promoter pHMWG and the terminator ter NOS. The vector obtained is called vector pBIOS 421 and described in FIG. 6.
  • the pHMWG-ZmMTPP-JT vector comprises, on the one hand, the T-DNA in which the expression cassette for the ZmMIPP gene is found, inserted between the promoter pHMWG and the ter NOS terminator, the expression cassette for the selection gene , the Bar gene (White et al, 1990) inserted between the pActlet promoter the first Actl rice intron and the ter NOS terminator.
  • the selection gene expression cassette is also inserted between the transposable elements Ac / Ds (Lechelt et al, 1989) which allow excision of the selection cassette after the action of a transposase.
  • the vector pHMWG-ZmMIPP-JT also contains the gene for resistance to spectinomycin and an origin of replication in E. coli.
  • the pHyPRP promoter of the gene coding for a hybrid protein rich in corn proline (HyPRP: Hybrid Proline Rich Protein) is used.
  • the construct allowing the expression of ZmMIPP in the cells of the embryo is carried out as follows:
  • vector pBIOS 413 Digestion by the enzymes Apal and NdeI of the vector pBIOS 413 (fragment pHyPRP in vector pBluescript) generates a fragment of 2162 bp containing the promoter of the pHyPRP gene described by Josè- ⁇ stanyol et al (1992). This fragment is cloned at the Apal and NJel sites of the vector pBIOS 421 in front of the complete ZmMIPP cDNA and the ter NOS terminator. The vector obtained is called vector pBIOS 422 described in FIG. 7.
  • the pHyPRP-ZmMLPP-JT vector comprises, on the one hand, the T-DNA in which the expression cassette for the ZmMIPP gene is found, inserted between the promoter pHyPRP and the ter NOS terminator, the expression cassette for the selection gene , the Bar gene inserted between the pActlet promoter the first Actl rice intron and the ter NOS terminator.
  • the expression cassette the selection gene is also inserted between the transposable elements Ac / Ds which allow excision of the selection cassette after the action of a transposase.
  • the vector pHyPRP-ZmMIPP-JT also contains the gene for resistance to spectinomycin and an origin of replication in E. coli.
  • embryogenic callus cells or type II calluses The genetic transformation of corn by bombardment of particles takes place on embryogenic callus cells or type II calluses. These calluses are obtained from immature embryos of genotype HiU or A188 x B73 according to the method described by Armstrong (1994). The calluses thus obtained can be multiplied and maintained by successive subcultures every 15 days on the initiation medium. Seedlings are regenerated from these calluses by modification of the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by Vain et al. (1989).
  • the transfer of the genes of interest and selection by bombardment of particles in type II calluses is done according to the following protocol. Four hours before the bombardment, fragments of type II calluses with an area of 10 to 20 mm 2 are placed in the center of a petri dish containing the initiation medium supplemented with 0.2 M mannitol and sorbitol 0 , 2 M, 16 fragments per box.
  • the vectors carrying the genes of interest and selection are prepared using the CONCERT system according to the supplier's instructions (GIBCO BRL). They are then precipitated on tungsten particles (M10) following the protocol described by Klein (1987). The particles thus coated are projected towards the target cells using a particle gun. Optimization of the bombardment conditions may depend on the type of aircraft used and is one of the techniques normally mastered by those skilled in the art.
  • the boxes are sealed using fresh Scello® and placed in the dark at 27 ° C.
  • the calluses are transferred to an initiation medium supplemented with a selective agent 24 h after the bombardment.
  • the calluses are maintained on this medium for 3 months, the medium is changed every
  • Calluses whose growth is not inhibited by the selective agent are usually and predominantly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated in its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
  • the frequency of obtaining such calluses is approximately 0.8 calluses per bombarded box.
  • calluses are identified, individualized, multiplied and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid any interference with untransformed cells, all of these operations are carried out on culture media containing the selective agent.
  • the plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the superbinary vector used for the transformation of corn comes from the homologous recombination between two vectors: the vector pBIOS 371 and the vector pSB1.
  • the vector pBIOS 371 constructed as above (example 3.2), comprises on the one hand the T-DNA in which the cassette for expression of the OsMIPP gene is found, inserted between the promoter pHMWG and the terminator Nos, the cassette of expression of the selection gene, the Bar gene.
  • pBIOS 371 also contains the gene for resistance to spectinomycin and an origin of replication in E. coli.
  • the vector pSB1 contains the virB, virC and virG genes of the plasmid pTiBo542 present in Agrobacterium strain A281 (ATCC 37349), the gene for resistance to tetracycline, an origin of functional replication in E. coli and Agrobacterium.
  • the vectors pSB1 and pBIOS 371 have a homologous region which allows them to recombine and generate the superbinary vector pRec 371. The homologous recombination between the two vectors takes place in Agrobacterium.
  • the vector pBIOS 371 is introduced into Agrobacterium strain LBA4404 containing the vector pSBl by electroporation using the device C ⁇ LL PORATOR Voltage Booster (GIBCO BRL) according to the method described by Mattanovitch et al. (1989) and the protocol given by the supplier (Life Technologies, USA).
  • the agrobacteria containing the superbinary vector pRec 371 are selected on YT medium in the presence of CaC 2, rifampicin and spectinomycin.
  • the rifampicin resistance gene is carried by the bacterial chromosome. Resistance to spectinomycin, carried by the vector pBIOS 371 (origin of functional replication in E. coli), can only be expressed after homologous recombination with the vector pSB1 (origin of functional replication in Agrobacterium and E. coli).
  • the superbinary vector pRec 371 has the T-DNA in which the expression cassettes for the Bar gene and for the sequence OsMIPPs are found (under the control of the pHMWG promoter for specific tissue expression), origins of both functional replication in E. coli and Agrobacterium, the tetracycline and spectinomycin resistance genes, and the virulence genes virB, virC and virG of the plasmid pTiBo542.
  • the transformed calluses are selected on a culture medium containing the selective agent and the bacteriostatic agent, cefotaxime. Calluses of type I are obtained, from these, seedlings will be regenerated on a culture medium containing the selective agent and the bacteriostatic agent, cefotaxime. The regenerated seedlings are then transferred to a development medium containing the selective agent.
  • the plants obtained are acclimatized to the phytotron, then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the nature and concentration of the selective agent may vary depending on the gene used.
  • the selective agents which can be used are generally active compounds of certain herbicides (Basta®, Round up®) or certain antibiotics (Hygromycin, Kanamycin,).
  • the Bar gene from Streptomyces hygroscopicus codes for a phosphinothricin acetyl transferase (PAT) which inactivates phosphinotricin - the active molecule of the herbicide Basta® - by acetylation.
  • PAT phosphinothricin acetyl transferase
  • the coding sequence of the Bar gene is under the control of a regulatory region allowing a strong and constitutive expression in plant cells.
  • a regulatory region can advantageously consist of the promoter and the first intron of the rice Actin 1 gene (Me ⁇ lroy et al, 1991).
  • the chimeric gene composed of the promoter and the first intron of the rice Actin 1 gene and of the Bar gene, is cloned in the plasmid pDM 302 allowing its multiplication in E. coli (Cao et a, 1992). Culture media intended for the selection of transformed cells are supplemented with phosphinothricin 2 mg / 1.
  • cotransformation For the introduction of the OsMIPP constructs which should lead to an ectopic expression of the proteins derived from the OsMIPP genes, a technique called cotransformation can advantageously be used.
  • the two plasmids (the Bar gene plasmid and the OsMIPP gene plasmid) are coprecipitated on the tungsten particles, the total amount of DNA precipitated on the particles remaining identical to that in the protocol. standard (5 ⁇ g of DNA for 2.5 mg of particles), each plasmid will represent approximately half of the total DNA used.
  • the OsMIPP gene can thus advantageously be followed in the progenies thanks to the resistance to the herbicide which is closely associated with it.
  • the superbinary vector pRec 371 has the T-DNA in which the expression cassettes of the Bar and OsMIPP genes are found, origins of functional replication both in E. coli and Agrobacterium, the tetracycline and spectinomycin resistance genes, and the virulence genes virB, virC and virG of the plasmid pTiBo542.
  • Immature embryos are co-cultivated with A. tumefaciens strain LBA 4404, containing the superbinary vector pRec 371 for 5 minutes, then placed on an initiation medium for callogenesis for 5 days in the dark and at 25 ° C.
  • the selection of transformed type I calluses and the regeneration of seedlings is carried out on a medium containing phosphinotricin 5 to 10 mg / 1 and a bacteriostatic agent, cefotaxime. Seedling development takes place on a medium containing only phosphinotricin. Calluses and plants which have integrated into their genome, the T-DNA which contains the OsMIPP gene and the Bar gene, can be followed in the progenies thanks to the resistance to the herbicide.
  • the final objective of the production of corn transformed with the OsMIPP gene being the obtaining of an increased phytase activity measurements of enzymatic activity are planned.
  • the dosage of phytase activity is carried out according to the method described above in Example 2, paragraph 2.5.
  • the phytase activity is measured on the protein extracts of different organs of transgenic corn and non-transgenic corn: leaves, seeds, young seedlings in the process of germination (5 or 6 days of germination).
  • the extraction of total proteins from these tissues is carried out according to the method described below.
  • the tissues, taken and frozen at -80 ° C, are ground in the form of powder in liquid nitrogen.
  • 100 mg of ground vegetable powder is transferred to 1 ml of extraction buffer (100 mM sodium acetate, pH 4.8, 2 mM CaCl 2 , 1 mM DTT, cocktail of protease inhibitors 0.5 to 1 mM (Roche)).
  • the samples are homogenized for 1 hour at 4 ° C and the extracts are centrifuged at 8000 rpm for 20 min at 4 ° C. The supernatant containing the total proteins is used for the measurement of phytase activity.
  • the production of processed rice can be envisaged according to two methods: via
  • Example 371 described in Example 3, are used for the transformation of rice via Agrobacterium tumefaciens.
  • the tissues used for gene transfer were prepared according to the method described in patent EP 0674 715 B1. These are type M calluses which are used for bombardment. They can be obtained from immature embryos taken from immature wheat grains and placed on an MS medium described by Murashige and Skoog (1962) containing maltose.
  • the vectors used for the transformation of wheat are purified on a Cesium gradient and then concentrated to 1 mg / ml in TE buffer pH 8.0 (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA) (Sambrook et al, 1989).
  • Gold particles of 1 ⁇ are coated with DNA to be transferred according to the method of Daines (1990).
  • the particles are taken up in absolute ethanol, 60 mg of particles per ml of ethanol.
  • a volume of 35 ⁇ l of this suspension is transferred to a 1.5 ml micro-centrifuge tube, the particles are recovered by centrifugation at 14,000 g for
  • the bombardment of the cells was carried out as described in patent application EP 0 674 715.
  • the Petri dish containing the explants to be bombarded is placed on the platform in the center of the opening from which the gold particles coated with DNA or microprojectiles are projected.
  • the microprojectiles are placed on a support above the explants.
  • the chamber is closed and sealed, the chamber is vacuumed and the helium tank filled with an appropriate amount of gas.
  • the bombardment is triggered allowing the projection of microprojectiles onto the explants.
  • the explants are bombarded twice with microprojectiles. After bombardment, the calluses are kept in the dark for 15 hours and then placed on the MS medium for 15 days.
  • the selection of transformed calluses is carried out in the MS medium containing the selective agent, methotrexate for 4 months.
  • calluses are transferred to MS medium containing 2,4-D in the dark.
  • the calluses are transferred to an MS medium containing hormones (auxins and gibberellins) in the light for 15 days, this step allows the induction of stems.
  • the explants are then transferred to a hormone-free MS medium in order to allow induction of the roots.
  • the seedlings are acclimatized in phytotron before being grown in the greenhouse.

Abstract

La présente invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications, notamment pour l'amélioration de la digestibilité des aliments pour animaux.

Description

Acides nucléiques codant pour uns phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique et applications.
La présente 'invention concerne des séquences d'acides nucléiques codant pour une phosphatase végétale de type MIPP à activité phytasique, les protéines isolées codées par ces séquences, ainsi que leurs applications.
Cette invention concerne plus précisément des séquences d'acides nucléiques de maïs, de riz et de blé codant pour une MIPP.
L'importance du rôle du phosphore dans la nutrition animale a été, depuis longtemps, reconnue. Le phosphore est essentiel à la croissance de l'animal ; 80% du phosphore est localisé dans le squelette. Le reste du phosphore est contenu dans les tissus mous où il intervient dans de nombreuses réactions biochimiques comme la synthèse des acides nucléiques, des phospholipides et de certaines vitamines B. Le phosphore est fourni à l'animal par l'alimentation, principalement par les plantes. La plus grande partie du phosphate présent dans les plantes, notamment. dans les semences, se trouve sous la forme de phytine, sel complexe de myo-inositol-acide hexakisphosphorique ou acide phytique. La phytine constitue donc une réserve de phosphore, de sucres, mais aussi de divers cations (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe3+). La phytine, sel d'acide phytique complexé à divers cations, représente donc la forme majeure de stockage du phosphate dans les graines mais elle est également présente dans le pollen, les organes de stockage tels que les tubercules ou dans les racines. Sa distribution dans les graines varie d'une espèce à l'autre :
- chez les dicotylédones (soja, ricin), elle est présente majoritairement dans les cotylédons et l'albumen ;
- chez les céréales (blé, riz), elle est présente surtout dans l'aleurone alors qu'elle est absente dans l'albumen ;
- chez le maïs, la majorité de la phytine présente dans le grain est stockée dans l'embryon (O'Dell et al., 1972; Barba et al, 1997). Dans les grains de maïs, le phosphore du phytate représente jusqu'à 88 % du phosphore total (O'Dell et al, 1972). La dégradation de la phytine est assurée par des phosphatases spécifiques, dont les phytases, enzymes capables d'hydrolyser le phosphate à partir de l'acide phytique (Gibson et Ullah, 1990) en libérant du myo-inositol et du phosphate inorganique. Toutefois les phosphatases de type phytase végétale sont produites en quantités insuffisantes dans les parties des plantes utilisées pour l'alimentation de certains animaux.
En particulier, la phytine et l'acide phytique provenant de farines de semences sèches, ne sont pas digérés par les animaux monogastriques (comme le porc et le poulet) en l'absence de phosphatase exogène, et sont donc excrétés tels quels. Ils contribuent ainsi à la pollution des sols et des eaux, par le phosphate, dans les zones d'élevages intensifs. De plus, l'acide phytique est considéré comme un facteur anti-nutritionnel car il chélate les éléments minéraux et provoque l'agrégation des protéines. Par conséquent, ces minéraux et protéines ne seront pas correctement assimilés lors du transit intestinal, par les animaux monogastriques (Graf, 1986).
Des recherches ont été entreprises afin de permettre une meilleure digestibilité de la phytine et de l'acide phytique chez les animaux monogastriques. De nombreux travaux se sont portés principalement sur les phosphatases ou d'autres types d'enzymes intervenant dans la mobilisation de la phytine. Par exemple, des gènes codant pour des phytases de céréales ont été isolés. L'identification des gènes Phyt I et Phyt II, provenant du maïs a ainsi permis d'obtenir des plantes de maïs présentant une teneur accrue en phytase (WO 98/05785).
Les auteurs de la présente invention, quant à eux, se sont intéressés à une autre famille d'enzymes, qui ne présentent pas d'homologie significative avec Phyt I ou Phyt II : les MLPP - Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatases, apparentées aux histidine phosphatases répertoriées uniquement dans le règne animal. Elles jouent un rôle important dans les processus d'ossification, notamment dans le développement et la différenciation des chondrocytes (Romano et al, 1998). Ces phosphatases sont également connues comme étant les seules enzymes animales qui hydrolysent les molécules d'inositol-tétra, -penta- et - hexaρhosρhate (Chi et α/., 1999).
Alors que ces enzymes étaient jusqu'alors reconnues comme spécifiques de l'espèce animale, les auteurs de la présente invention sont parvenus à caractériser des séquences d'acides nucléiques de plantes présentant une homologie significative avec les gènes codant pour les MIPP animales. Aussi les enzymes codés par ces acides nucléiques de plantes seront par la suite appelées MIPP végétales.
La phytine, un substrat privilégié pour les MIPP, libère ainsi du phosphate inorganique ainsi que les cations chelatés. Le phosphate inorganique et les différents cations libérés sont alors disponibles pour les voies métaboliques qui les requièrent. La présente invention a donc pour objet un acide. nucléique isolé codant pour une enzyme MIPP végétale à activité phytasique. Les enzymes MIPP des céréales sont particulièrement visées, en particulier celles du maïs, du riz et du blé. L'invention a plus particulièrement pour objet un acide nucléique isolé comprenant une séquence choisie parmi SEQ ID n° 1 (ADNc de maïs), SEQ ID n°3 (ADNc de riz) ou SEQ ID n° 17 (ADNc de maïs).
De manière préférentielle, l'invention a pour objet un acide nucléique isolé comprenant la séquence SEQ ID n° 17 ou une séquence homologue à la séquence SEQ ID n° 17.
Les séquences complémentaires de ces séquences d'acides nucléiques font également partie de la présente invention.
L'invention a également pour objet, des fragments des séquences ci-dessus codant pour des peptides conservant l'activité mentionnée, ou les séquences complémentaires de ces fragments.
L'invention concerne aussi les séquences homologues des séquences mentionnées plus haut.
Le terme "homologue" fait référence à tout acide nucléique présentant une ou plusieurs modification(s) de séquence par rapport à tout ou partie d'une séquence donnée.
Ces séquences homologues sont, de manière préférentielle, définies comme: i) des séquences similaires à au moins 70 % de la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90%; ou ii) des séquences hybridant avec la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n°17, ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii)des séquences codant pour une enzyme MIPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n°2, n°4 ou n° 18, ou une séquence d'acides aminés homologue. De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) - 0,63(%formamide) - (600/nombre de bases) (Sambrook et al, 1989).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T). Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation peut être de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple. Le terme "séquences similaires" employé plus haut se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les nucléotides comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans les séquences nucléiques distingue par exemple les purines et les pyrimidines.
Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 inclut donc toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant qu'elle code pour un polypeptide présentant l'activité phytasique de la MTPP végétale.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les séquences des gènes de céréales autres que le maïs ou le riz, ainsi que les variants alléliques.
La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé, dénommé
MIPP végétale, comprenant de préférence la séquence d'acides aminés SEQ ID n° 2, n° 4 ou n° 18. Plus particulièrement, le polypeptide comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID n° 18. Il est entendu que sont également comprises les séquences homologues, définies de manière avantageuse comme i) les séquences similaires à au moins 70% de la séquence SEQ ID n° 2, n° 4 ou n° 18, de préférence au moins 80%, de préférence encore au moins 90%; ou ii) les séquences codées par une séquence d'acide nucléique homologue telle que définie précédemment c'est-à-dire une séquence d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
Là encore, le terme "similaires" se réfère à la ressemblance parfaite ou identité entre les acides aminés comparés mais aussi à la ressemblance non parfaite que l'on qualifie de similitude. Cette recherche de similitudes dans une séquence polypeptidique prend en compte les substitutions conservatives qui sont des substitutions d'acides aminés de même classe, telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréo ine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
Plus généralement, par « séquence d'acides aminés homologue », on entend donc toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID n° 2, n° 4 ou n° 18 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la MIPP végétale. L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité ou similitude, comme défini plus haut). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces (« gaps ») dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
"L'activité biologique de la MIPP végétale" se réfère notamment à son activité phytasique, qui peut être déterminée par le dosage du phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium.
Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
Une protéine recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique selon l'invention, tel qu'un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 ou une séquence homologue est transféré dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant. La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, etc.
La présente invention a donc également pour objet une méthode de production de protéine MIPP végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : a) transformation d'une cellule, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme, avec une cassette d'expression comportant des séquences régulatrices capables de commander l'expression d'une quantité accrue de MIPP dans ladite cellule hôte ; b) éventuellement culture de ladite cellule hôte ou, dans le cas où cette cellule hôte est une cellule végétale, croissance de la plante transformée ; c) extraction de la protéine MIPP de la culture cellulaire ou de la plante transformée.
La présente invention a donc aussi pour objet une cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comporte au moins une des séquences ou fragments d'acide nucléique tels que définis précédemment, placé sous le contrôle d'au moins une séquence régulatrice capable de commander l'expression de la protéine MTPP végétale.
Parmi ces séquences régulatrices, on peut citer les promoteurs, les activateurs et les introns et les terminateurs de transcription.
Un grand nombre de promoteurs sont utilisables pour la transformation des plantes selon la présente invention. A titre d'exemple on peut citer :
- des promoteurs permettant une expression constitutive :
- promoteur p35S (Kay et al., 1987)
- promoteur pUbil du gène codant pour l'ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al. , 1992) - promoteur pActl du gène codant l'actine 1 de riz (Me Elroy et a , 1991)
- promoteurs des histones (EP 0 507 698)
- promoteur CsNMN du virus de la mosaïque de la nervure du manioc (Verdaguer et al, 1996, 1998)
- les promoteurs spécifiques d'un organe ou d'un tissu de la plante, et plus particulièrement les promoteurs spécifiques des grains (Datla et al, 1997), comme les promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserve telles que : une gluténine de masse moléculaire élevée HMWG (High Molecular Weight Glutenin) de blé ou d'orge spécifique de l'albumen (Roberts et al, 1989 ; Anderson O.D. et al, 1989), la napine, la phaséoline, l'hélianthinine, l'albumine, l'oléosine, GEAI et GEA6 d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al, 1993), la γ-zéine de maïs, le promoteur du gène pHyPRP codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs (HyPRP : Hybrid Proline Rich Protein) qui est spécifique de l'embryon et plus particulièrement du scutellum (Josè-Estanyol et al, 1992), le promoteur Npl du gène Niviparousl (activateur de transcription - Me Carty D.R et al (1989)) combiné au premier intron Sh du gène Shrunken (Maas et al (1991)), qui est spécifique de l'aleurone.
- des promoteurs inductibles :
- lors d'un stress hydrique (Kasuga et al, 1999)
- par la lumière : promoteur du gène codant pour la petite sous unité de la RUBISCO, Ribulose 1,5 BISphosphate Carboxylase Oxygénase, promoteur du gène codant pour la chlorophylle a/b,
- des promoteurs des gènes codant la mannopine synthase, la nopaline synthase, l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens,
- des promoteurs de gènes codant pour des enzymes choisis de préférence parmi ceux-ci : l'alcool déhydrogénase 1 (Adhl) de maïs, la phénylalanine ammonia lyase (PAL), la HMG-CoA reductase (HMG), la chitinase, la glucanase, les inhibiteurs de protéases, les gènes de la famille PR1, le gène vspB (US 5,670,349), HMG2 (US 5,670,349), la béta- galactosidase (Abgl) de pomme, ou l'amino-cyciopropane carboxylate synthase (WO 98/45445).
Ainsi, l'expression ectopique tissu-spécifique ou organe-spécifique permet la production de graines riches en phosphate inorganique ou enrichies en protéine MTPP capables de dégrader la phytine tout en limitant les dommages physiologiques éventuels dus à une variation de la teneur en phytine.
De manière générale, on utilisera préférentiellement un promoteur constitutif tel que le promoteur pAct 1 du gène Act 1 de riz contenu dans le plasmide pActl-F4 (Me Elroy et al, 1991) ou le promoteur p35S (Kay et al, 1987), ou un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (Roberts et al, 1989 ; Anderson O.D. et al, 1989 ; Depigny-This et al, 1992).
Conformément à l'invention, des éléments comme les activateurs et les introns peuvent également être insérés dans la cassette d'expression dans le but d'amplifier l'expression du gène d'intérêt.
Un exemple d' activateur est l' activateur de la traduction du virus TEN (Tobbaco Etch Nirus) décrit par Carrington et Freed (1990). Parmi les introns utilisables, le premier intron du gène Adhl S de maïs, qui peut être placé entre le promoteur et la séquence codante. Cet intron lorsqu'il est inclu dans une construction génétique, augmente l'expression de la protéine désirée dans les cellules de maïs (Callis et al, 1987). On peut aussi utiliser le premier intron du gène shrunken 1 de maïs (Maas et al, 1991), le premier intron du gène de la catalase du pois, CAT-1 (Ohta et α/.,1990), le second intron du gène ST-LS1 de pomme de terre (Nancanneyt et al, 1990), l'intron du gène TobYDN du virus 'yellow dwarf (Morris et al, 1992), l'intron du gène Act 1 codant l'actine 1 du riz (Me Elroy et al, 1990) ou encore l'intron 1 du gène codant pour la triosephosphate isomérase (Snowdon et al., 1996).
De manière avantageuse, la cassette d'expression peut aussi contenir des séquences 5' non traduites dites 'leaders'. De telles séquences peuvent augmenter la traduction. Parmi celles connues de l'homme du métier, on peut citer :
- le leader EMCN (EncephaloMyoCarditis Virus 5' noncoding région) (Elroy-Stein et al, 1989),
- le leader TEN (Tobacco Etch Virus) (Carrington and Freed, 1990),
- le leader du gène BiP codant pour la protéine de liaison à la chaîne lourde de l 'immunoglobuline humaine (Macejack ét al, 1991),
- le leader AMN RΝA 4 provenant de l' ARΝ de la protéine du virus de la mosaïque de la luzerne (Jobling et al 1987),
- le leader du virus de la mosaïque du tabac (Gallie et al, 1989),
Parmi les terminateurs utilisables dans les constructions de l'invention, on peut citer notamment :
- le polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMN), décrit dans l'article de Franck et al. (1980),
- le terminateur nos correspondant à la région 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al, 1992), - le terminateur du gène histone (EP 0 633 317),
Selon un mode de réalisation préférée, le terminateur de transcription est le terminateur nos du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al, 1992) ou alors la séquence polyA 35S du virus de la mosaïque de chou-fleur (CaMN), décrit dans l'article de Franck et al. (1980). Dans une variante de réalisation de l'invention, lesdites séquences régulatrices comprennent également des signaux d'adressage capables de diriger l'expression spécifiquement dans un type particulier de compartiment cellulaire, par exemple l'espace extracellulaire ou l'apoplasme. Comme exemple de signaux d'adressage chloroplastiques, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la petite sous-unité de la ribulose 1,5- bis-phosphate carboxylase oxygénase de Pisum sativum. Comme signaux d'adressage mitochondrial, on peut citer la séquence codant pour le peptide transit du précurseur de la sous-unité β de l'ATP-ase FI mitochondriale de Nicotiana plumbaginifolia.
Ces peptides transits, comprenant la méthionine N-terminale, sont normalement clivés dans les chloroplastes ou les mitochondries. L'expression des protéines dans ces organites a donc également la caractéristique de produire une molécule dépourvue de la méthionine N-terminale comme la molécule naturelle. Selon une autre variante, les séquences d'adressage peuvent être des séquences codant pour un peptide signal N-terminal ("prépeptide"), éventuellement en association à un signal responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique (signal du type KDEL ou KTEL), ou un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". La présence du peptide signal N-terminal ou prépeptide permet l'introduction du néopolypeptide dans le reticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de modifications post- traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les N-glycosylations, si la protéine en question présente des sites de N-glycosylation, et la formation des ponts disulfures. Parmi ces différents signaux, le prépeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le reticulum endoplasmique, est très utile. Il s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés et étant d'origine animale ou végétale. De préférence, il s'agit d'un prépeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de la protéine PR1 ouPR2.
Normalement, le peptide signal est clivé par une signal-peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du néopolypeptide dans la lumière du RER (Reticulum Endoplasmique Rugueux). La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale. Pour obtenir la sécrétion, selon un mode de réalisation de l'invention, on peut par exemple utiliser le peptide signal de la sporamine A des racines tubérisées de la patate douce.
Les séquences d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, KTEL, SEKDEL ou HEKDEL. Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et peuvent subsister sur la protéine mature. La présence de ce signal a tendance à augmenter les rendements en protéines recombinantes.
La présence de séquences de type KDEL ou KTEL à l'extrémité C-terminale des protéines conduit à la rétention de celles-ci dans le reticulum endosplasmique et donc à une compartimentalisation cellulaire de ces protéines. Cette compartimentalisation peut dans certains cas bloquer l'accessibilité de l'enzyme à son substrat présent dans un compartiment cellulaire différent, conduisant à une inactivité de la protéine. Ainsi, selon une variante, il est possible d'envisager l'élimination de ce type de séquences d'adressage sans perdre l'activité enzymatique de la protéine. L'élimination de ces séquences peut conduire à une expression apoplastique de la protéine pouvant permettre une meilleure accessibilité de la protéine à son substrat. L'élimination peut conduire aussi à une expression de la protéine dans un autre compartiment que celui où s'exprime son substrat, évitant ainsi une dégradation rapide de l'acide phytique susceptible d'altérer le développement de la graine. L'activité de l'enzyme vis-à-vis de son substrat peut donc être contrôlée dans l'espace et dans le temps. Eventuellement, une étape ultérieure de broyage de la graine peut être mise en oeuvre pour permettre à l'enzyme d'accéder à son substrat.
L'élimination de la séquence KTEL ou KDEL peut être réalisée notamment par la technique d'amplification par PCR en utilisant des amorces spécifiques de la partie C- terminale de la protéine juste en amont de la séquence KTEL ou KDEL et en ajoutant sur l'amorce un codon stop.
Les signaux d'adressage peuvent, outre le prépeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, après passage dans le RER, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps proteiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines. L'adressage de la protéine vers les corps proteiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40 % des protéines par rapport à la matière sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps proteiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté.
Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant particulièrement préférés, par exemple la pro-sporamine. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTTP), ou C-terminal (CTTP). Dans la mesure où les propeptides sont normalement clivés dès l'entrée de la protéine dans la vacuole, ils ne sont pas présents dans la protéine mature.
L'utilisation du peptide signal ou prépeptide peut conduire à la glycosylation de la protéine.
En l'absence de tout signal d'adressage, la protéine est exprimée dans le cytoplasme. L'invention se "rapporte aussi à un vecteur dans lequel est insérée la cassette d'expression telle que définie ci-dessus. Ce vecteur peut être un plasmide qui peut en outre comprendre un gène marqueur permettant de distinguer une plante transformée d'une plante qui ne contient pas l'ADN étranger transféré. Ainsi, conformément à l'invention, le vecteur peut inclure comme gène marqueur, aussi bien des gènes de sélection qui confèrent une résistance à un antibiotique ou à un herbicide, que des gènes rapporteurs. Parmi les gènes de sélection utilisables, on peut citer :
- le gène sul conférant la résistance à l'herbicide sulfonamide Asulam (WO 98/49316), le gène nptll conférant la résistance à la kanamycine (Bevan et al, 1983), - le gène hph conférant la résistance à l'hygromycine (Herrera-Estrella et al, 1983),
- le gène bar conférant la tolérance au bialaphos (White et al, 1990),
- le gène EPSPS conférant la tolérance au glyphosate (US 5, 188,642),
- le gène HPPD conférant la tolérance aux isoxazoles (WO 96/38567),
- le gène de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) qui détoxifie le chloramphénicol. De même, on peut citer comme gènes rapporteurs : le gène codant pour l'enzyme β-glucuronidase (GUS),
- le gène de la protéine de fluorescence verte GFP qui permet de visualiser, sous UN, les cellules transformées,
Conformément à l'invention, comme vecteur de clonage ou d'expression comprenant le fragment, on peut citer les vecteurs comprenant une séquence d'ADN contenant au moins une origine de réplication telle que des plasmides, des cosmides, des bactériophages, des virus etc.. Les plasmides sont néanmoins préférés.
L'invention concerne aussi les hôtes cellulaires, notamment bactériens, contenant les vecteurs ci-dessus mentionnés.
L'invention propose également un procédé de production de plantes transgéniques comprenant, entre autres, les étapes de : transformation de cellules de plante avec un vecteur d'expression contenant un fragment d'acide nucléique de la présente invention, sélection des cellules transformées, génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant le fragment d'acide nucléique inséré. La transformation des plantes selon l'invention peut être réalisée par différentes méthodes, connues de l'homme du métier. On peut citer, tout d'abord, les méthodes de transfert direct de gènes telles que la micro-injection dans des cellules d'embryon de la plante (Neuhaus et Coll., 1987) ou l'électroporation (Chupeau et Coll., 1989), la précipitation directe avec le polyéthylèneglycol (Schocher et Coll., 1986) ou le bombardement par canon à particules (Me Cabe et Coll., 1988).
On peut aussi infecter la plante par une souche bactérienne notamment d'Agrobacterium tumefaciens selon une méthode éprouvée (Schell et Van Montagu, 1983) ou d'Agrobacterium rhizogenes notamment pour les espèces récalcitrantes à la transformation (Chilton et Coll., 1982). La souche bactérienne peut comporter le gène codant pour l'enzyme MLPP végétale, sous le contrôle d'éléments assurant l'expression dudit gène. La souche bactérienne pourra être transformée par un vecteur dans lequel est insérée une séquence codant ladite enzyme sous le contrôle d'éléments assurant son expression. Cette séquence est insérée par exemple dans un vecteur binaire tel que pBLN19 (Bevan, 1984) ou pMON 505 (Horsch et Klee, 1986) ou tout autre vecteur binaire dérivé des plasmides pTi et pRi. Elle peut aussi être utilement introduite par recombinaison homologue dans un plasmide pTi ou pRi désarmé, tel que pGN 3850 (Zambryski et Coll., 1983) avant la transformation de la plante.
Il a été montré récemment que des plantes monocotylédones telles que le riz et le maïs pouvaient être avantageusement transformées par Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al. 1994, Ishida et al, 1996).
Selon une méthode préférée de l'invention, les fragments d'acides nucléiques sont introduits dans les cellules par bombardement de particules recouvertes par lesdits fragments. Le bombardement de particules offre l'avantage d'une transformation rapide. Généralement les embryons immatures ne subissent qu'un unique bombardement. Toutefois un bombardement répété peut augmenter la fréquence de transformation (WO 98/49316).
Après l'étape de transformation, les cellules transformées sont sélectionnées selon les marqueurs phénotypiques utilisés dans le vecteur. Cette sélection s'effectue sur un milieu contenant un agent sélectif approprié. Les cellules transformées ainsi sélectionnées sont alors cultivées et les plantes sont régénérées. Une extraction d'ADN et un Southern blot avec des sondes spécifiques du gène d'intérêt permettent de confirmer la transformation. Les méthodes permettant d'isoler l'ADN à partir de matériels biologiques en culture et de vérifier la présence de l'insert sont bien connues de l'homme du métier, elles sont, entre autres, décrites par Southern et a , 1975 et Mullis et a , 1987. La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé pour accroître l'activité phytasique d'une plante, caractérisé en ce qu'on induit une surexpression d'une MIPP, plus particulièrement de maïs, de riz ou de blé, dans ladite plante à l'aide d'une cassette d'expression telle que décrite auparavant et selon le procédé précédent. On entend ici par "surexpression" aussi bien une augmentation du taux de MIPP par rapport au taux exprimé dans une plante normale, qu'une expression ectopique de cette enzyme, dans un tissu ou un compartiment et/ou à un stade de développement où celle-ci n'est normalement pas exprimée.
Conformément à la présente invention, la séquence étrangère peut être hétérologue, c'est-à-dire qu'elle provient d'une plante différente de la cellule hôte. Il peut aussi s'agir d'une séquence de la MIPP naturellement produite par la plante.
La présente invention a également pour objet des hôtes végétaux, consistant en des plantes ou organes végétaux, transformés avec un ou plusieurs acides nucléiques de l'invention et selon le procédé défini ci-dessus. Si la transformation implique plusieurs gènes d'intérêt, alors ceux-ci peuvent être insérés dans une même cassette d'expression ou alors dans des cassettes d'expression différentes.
Le terme de 'hôtes végétaux' englobe aussi bien les plantes que les cellules de plantes ou les différentes parties de la plante, telles que semence, fruit ou feuille.
On peut citer, comme exemples de plantes transgéniques selon l'invention, les céréales, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le seigle, le riz, préférentiellement le maïs, ainsi que le pois, le soja et la pomme de terre.
Ces plantes transgéniques de l'invention englobent aussi bien les plantes de première génération, que leurs descendants (lignées ou hybrides, notamment).
La présente invention a plus particulièrement pour objet des hôtes végétaux transgéniques dans lesquels une MIPP végétale, plus particulièrement de maïs, de blé ou de riz, peut être exprimée dans une partie de la plante ou un compartiment cellulaire où cette enzyme n'est pas produite naturellement ou seulement en faibles quantités. Ces hôtes végétaux sont caractérisés par un génome dans lequel on a introduit une cassette d'expression selon l'invention comportant des séquences régulatrices qui induisent une expression spécifique dans ladite partie de la plante ou ledit compartiment cellulaire. L'hôte végétal en question est avantageusement une céréale et plus avantageusement encore le maïs, le blé et le riz, ou leurs organes. La présente invention concerne plus précisément une plante transgénique, selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle produit des semences transgéniques exprimant une quantité accrue d'enzymes à activité phytasique.
La présente invention comprend également les semences de cette plante transgénique et notamment les semences comportant une teneur en MIPP végétale accrue, obtenue par expression spécifique d'une des séquences d'acide nucléique selon la présente invention, dans la semence.
Par ailleurs, la farine et tout produit susceptible d'être obtenu à partir de cette semence font aussi partie de l'invention. Enfin, la présente invention a pour objet une composition pour l'alimentation humaine ou animale comprenant des semences, une farine de semences ou une MIPP végétale, produites selon la présente invention.
Selon un mode de réalisation, les acides nucléiques définis par l'invention peuvent être utilisés comme marqueur du phénotype lié à l'expression de protéines MIPP.
L'invention permet l'utilisation des fragments nucléotidiques comme marqueurs moléculaires dans des programmes de culture, notamment dans la sélection de variétés exprimant une protéine MIPP ou une plante transformée avec une séquence codant pour cette MIPP. Selon la présente invention, ces séquences permettent l'obtention des ADN génomiques par des méthodes connues de l'homme du métier, par exemple par le criblage de banques génomiques suivant les indications de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). De même au moyen de sondes dégénérées elles permettent l'identification de gènes codant pour des protéines homologues aux MIPP végétales.
Les plantes transgéniques exprimant la MIPP végétale selon l'invention ou l'enzyme elle-même peuvent être utilisées à des fins variées, dans toute situation où l'activité phytasique de cette enzyme est nécessaire ou désirée. La MIPP végétale est ainsi utile dans les procédés de préparation alimentaire ou dans les procédés d'extraction de l'amidon (procédé de trempage). Par exemple, avec cette enzyme, il est possible d'augmenter l'extractibilité des amidons des grains où elle s'exprime. Le phytate fait précipiter les protéines avec l'amidon de sorte que si l'on réduit le taux de phytate, l'extraction de l'amidon s'en trouve facilitée. L'ajout d'une enzyme à activité phytasique aux grains de plantes à partir desquels on souhaite extraire l'amidon permet de pallier la précipitation des protéines par les phytates.
Une plante transformée avec une séquence codant pour une MIPP végétale selon le procédé défini par l'invention, ou une partie de celle-ci, peut être utilisée pour améliorer la digestibilité du phytate, dans la ration alimentaire d'animaux monogastriques, et par conséquent, réduire le taux de phytate dans le fumier ou lisier.
L'activité phytasique de la MIPP végétale peut être également mise à profit pour valoriser les eaux de trempage récupérées ou les eaux de brassage, lors de préparations alimentaires. En particulier, la disponibilité accrue du phosphore rend ces eaux très utiles comme additifs pour milieux de culture ou supports de fermentation.
En outre, l'activité phytasique générée permet une meilleure récupération de l'inositol et de ses dérivés à partir des eaux de trempage ou de brassage.
L'invention concerne également l'utilisation d'une MIPP végétale selon l'invention ou l'utilisation de tout ou partie de plantes contenant une MLPP selon l'invention, à des fins thérapeutiques ou diététiques, notamment pour la production de myo-inositol et/ou pour la diminution de l'acide phytique.
L'acide phytique a été tenu pour responsable de certains impacts sur la santé humaine tels que la malformation des os, l'ostéosporose et les anémies causées par des carences en fer, ou des interférences avec l'assimilation du calcium, du magnésium et du zinc (Berlyne et al., 1973; Shan et al., 1979).
Le myo-inositol, forme nutritionnelle active de l'inositol, est un constituant du phospholipide phosphatidylinositol. Il est connu pour ses vertus dans le domaine de la santé. On lui a souvent attribué des effets sur la diminution de la concentration des triglycérides et du cholestérol dans le sang, et plus généralement pour la protection contre les maladies cardiovasculaires. De plus, il est reconnu que les composés issus d'un phospholipide tel que le myo-inositol ont des effets bénéfiques sur l'insomnie et l'anxiété. Par ailleurs, la névropathie périphérique du diabétique est une des complications les plus paralysantes du diabète. Or, on suppose depuis déjà plusieurs armées qu'une diminution du taux de myo-inositol est associée aux dégâts des fibres nerveuses des diabétiques souffrant d'une telle complication. L'invention concerne enfin l'utilisation de la MIPP végétale, selon l'invention, pour libérer le phosphate inorganique directement assimilable par les monogastriques (Pointillard, 1994) et/ou améliorer la disponibilité des cations chélatés par la phytine tels que le fer, le calcium, le magnésium ou le zinc. Ceci évite des ajouts de compléments dans les rations animales et permet d'augmenter la valeur nutritive de la graine. LEGENDES DES FIGURES
La Figure 1 représente un alignement des séquences nucléiques codant pour les MLPP de maïs et de riz.
La Figure 2 représente un alignement des séquences proteiques de MIPP de riz et de maïs.
La Figure 3 représente une comparaison des séquences d'acides aminés des MIPP de riz et de maïs avec des MIPP animales, des phophatases acides et des phytases fongiques La Figure 4 est une carte de restriction du plasmide pRD-257.
La Figure 5 est une carte de restriction du plasmide p3214.
La Figure 6 est une carte de restriction du plasmide pBIOS 421.
La Figure 7 est une carte de restriction du plasmide pBIOS 422.
LISTE DES SEQUENCES
SEQ ID N°l : Séquence nucléique d'ADNc isolé de maïs
SEQ ID N°2 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MLPP de maïs (ZmMIPP)
SEQ ID N°3 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de riz
SEQ ID N°4 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MIPP de riz (OsMIPP) SEQ ID N°5 : Oligonucléotide 5'olZMPl utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc ZmMIPP.
SEQ ID N°6 : Oligonucléotide 3'olZMP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc
ZmMIPP.
SEQ ID N°7 : Oligonucléotide interne olMIPPl. SEQ TD N°8 : Oligonucléotide interne olMIPP2.
SEQ ID N°9 : Oligonucléotide 5'olOSP utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc
OsMIPP.
SEQ ID N°10 : Oligonucléotide 3'olOSP utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP. SEQ ID N°l l: Oligonucléotide 5'olOSPl utilisé comme amorce 5' pour l'obtention de l'ADNc OsMIPP.
SEQ TD N°12 : Oligonucléotide olMIPP9 utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.
SEQ ID N°13 : Oligonucléotide olMIPPlO utilisé comme amorce 3' pour l'obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé.
SEQ TD N°14 : Séquence nucléique de l'EST 3'TaMIPP.
SEQ TD N°15 : Peptide signal putatif
SEQ ID N°16 : Peptide signal putatif
SEQ ID N° 17 : Séquence nucléique d'ADNc isolé de maïs
SEQ ID N° 18 : Séquence d'acides aminés d'une protéine MTPP de maïs (ZmMIPP)
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Isolement des clones d'ADNc codant pour une protéine MIPP végétale.
Les séquences de MLPP végétales peuvent être obtenues en réalisant une étude de bioanalyse à partir de séquences codant pour des MTPP animales, présentées par Caffrey et al. (1999). Ces séquences permettent ainsi de définir des ho ologies avec des séquences ADNc référencées, par exemple, dans des bases de données spécifiques au maïs, au blé et au riz. En identifiant les EST spécifiques aux séquences homologues desdites séquences animales, des oligonucléotides peuvent alors être définis et utilisés comme amorces pour isoler par PCR ces ADNc d'intérêt à partir de banques d'ADNc ou d'ADNc.
1.1 - MIPP de maïs (ZmMIPP)
1.1.1 - Choix de la variété
Deux lignées de Zea Mays ont été utilisées : la lignée B73 et l'hybride Hill (un de ses parents étant la lignée B73). L'extraction d'ARN totaux a été réalisée sur des feuilles immatures pour la lignée B73 et sur des cals pour l'hybride Hill (Armstrong et al., 1991)
Conditions de culture
Feuilles immatures 40 graines B73 sont mises dans du terreau et placées en serre. Pour la récolte des feuilles immatures, on attend le stade où 7-8 feuilles sont visibles soit environ 3-4 semaines en serre. Les feuilles immatures sont encore dans le cornet. Un prélèvement à 3 semaines et à 4 semaines a été effectué. Des feuilles immatures ont été également prélevées à 2 semaines après germination. Obtention de cals de type II
Le prélèvement des épis est réalisé lorsque les embryons immatures ont atteint une taille de 1,5 mm à 2 mm c'est à dire 10 jours après la fécondation. Les épis récoltés sont débarrassés de leurs spathes et de leurs soies puis sont désinfectés au Domestos® 20% (v/v) pendant 15 minutes sous agitation. Les épis sont rincés trois fois à l'eau stérile. La partie supérieure du grain est coupée de façon à découvrir l'albumen, puis une légère pression sur le grain permet de dégager l'albumen. L'embryon immature qui se trouve encore dans le grain est extrait puis déposé sur le milieu de callogénèse N6P6 (Sels N6 3,98 % (p/v) (Sigma C1416) ; vitamines N6 5ml/L ; L-proline 0,7 % (p/v) ; hydrolysat de caséine 0,1 % (p/v) ; saccharose 20 % (p/v) ; 2,4-D 0,001 % (p/v) ; phytagel 2,5 % (p/v), pH 5,8) en l'orientant côté plat sur la gélose. Les embryons sont mis en culture pendant 15 jours en chambre de culture à
26°C et à l'obscurité. Les embryons sont séparés de leur radicule puis repiqués sur un nouveau milieu N6P6. Le cal qui prolifère est repiqué toutes les 2 à 3 semaines sur milieu N6P6 (boîte de 16 cals). Les cals sont multipliés en chambre de culture à 26 °C et à l'obscurité.
1.1.2. - Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc
L'extraction des ARN totaux a été réalisée selon la méthode décrite par Nerwoerd et al. (1989).
Pour chaque tissu deux extractions d'ARΝ totaux ont été faites. Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit
SMART PCR cDNA synthesis Kit, commercialisé par Clontech, ont été suivies.
1.1.3 - Isolement d'un clone d'ADNc ZmMIPP de maïs
Les oligonucléotides, utilisés comme amorces PCR pour le criblage des ADNc sont présentés en annexe.
Les oligonucléotides ont été déterminés à partir des séquences nucléiques des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MIPP animales. Les oligonucléotides qui encadrent la séquence codante du gène ZmMIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : Ncol ou NJel et en 3' : BamΗl, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b (Νovagen). Les oligonucléotides internes olMTPPl et olMIPP2 (SEQ LD Ν° 7 et 8), qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.
Amplification PCR La manipulation a été répétée sur deux pools différents'd'ARN totaux pour une même espèce et un même tissu.
La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux. Le couple d'oligonucléotides 5O1ZMP1-3O1ZMP (SEQ LD N° 5 et 6) sur les
ADNc de feuilles immatures et de cals a permis l'amplification d'un fragment de 1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides 5'olZMPl-olMIPP2 (SEQ LD N° 5 et 8), et olMIPPl-3'olZMP (SEQ ID N°7 et 6), olMTPPl et olMIPP2 étant des oligonucléotides internes spécifiques de la séquence consensus RHGXRXP, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans le fragment de 1,6 kb. Par conséquent, il a été clone dans pGEM-T (Promega) et séquence.
1.1.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse La séquence d'acide nucléique et la séquence d'acides aminés sont présentées en annexe, respectivement par SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2. Elles sont valables pour le clone d'ADNc de feuilles immatures et le clone d'ADNc de cals de maïs. En effet le séquençage â montré qu'elles sont identiques. L'analyse des séquences nucléotidiques a été réalisée avec le logiciel MAC VECTOR™ 6.5.3 - Oxford Molecular.
Caractéristiques biochimiques de ZmMIPP (par le logiciel MAC VECTOR™ 6.5.3 - Oxford Molecular)
Masse moléculaire calculée 58,6 kDa pi 8,95
Avec les logiciels de détection de motifs proteiques (SEQ WEB version 1.1 - Wisconsin Package Genetic Computer Group), identification de :
- un peptide signal putatif de 25 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine :
MGMAAPRAPLPLPQLLLLLNAALLA (SEQ .LD Ν°15) - un signal de rétention putatif dans le reticulum endoplasmique à l'extrémité C-terminale de la protéine : KTEL
1.2 - MIPP de Riz (OsMIPP)
1.2.1 - Choix de la variété Le matériel végétal est Oryza sativa japonica, variété Nipponbare. L'extraction d'ARN est réalisée à partir de cals de riz.
Conditions de culture : Induction des cals de riz. Les grains de riz à maturité sont débarrassés de leurs enveloppes externes, désinfectés 1 min dans l'éthanol 70% (v/v) et 30 min dans le domestos 50% (v/v). Les grains sont rincés dans de l'eau distillée stérile et déposés sur le milieu N6P6 contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont scellées et placées 21 jours dans l'étuve à 28°C à l'obscurité. A partir du scutellum de l'embryon, un cal primaire se développe. Autour du cal primaire, des petites unités embryogènes s'individualisent, elles sont transférées dans des boîtes de Pétri contenant le milieu N6P6 et incubées pendant 14 jours à 28°C et à l'obscurité. Pendant cette période, leur taille va augmenter. Les cals sont ensuite prélevés pour l'extraction d'ARN.
1.2.2 - Extraction des ARN totaux et synthèse des ADNc L'extraction d'ARN totaux a été réalisée selon la méthode décrite par Verwoerd et al. (1989).
A partir des cals, deux extractions d'ARN totaux ont été réalisées. Pour la synthèse du premier brin d'ADNc, les consignes données dans le kit SMART PCR cDNA synthesis Kit, commercialisé par Clontech, ont été suivies.
1.2.3 - Isolement d'un clone d'ADNc OsMIPP de riz
Les oligonucléotides utilisés ont été déterminés à partir des ESTs identifiés en bioanalyse comme étant fortement homologues aux séquences codant pour des MTPP animales. Les oligonucléotides qui devraient encadrer la séquence codante du gène MIPP, possèdent des sites de restriction en 5' : Ncόl ou Ndel et en 3' : BamHl, ceci pour permettre le clonage orienté dans le vecteur d'expression bactérien pET-14b. Les oligonucléotides internes qui servent à vérifier l'identité des séquences, n'en ont pas.
Amplification PCR : La manipulation a été répétée sur deux pools différents d'ARN totaux pour une même espèce et un même tissu.
La réaction d'amplification a été réalisée directement sur le premier brin d'ADNc synthétisé à partir des ARN totaux. La réaction d'amplification avec les couples d'oligonucléotides 5O1OSP-3O1OSP (SEQ ID N° 9 et 10) ou 5O1OSP1-3O1OSP (SEQ ID N° 11 et 10) sur les ADNc de cals génère un fragment de 1,6 kb. Sur ce fragment, une PCR a été réalisée avec les couples d'oligonucléotides 5'olOSPl-olMIPP2 et olMTPPl-3'olOSP, olMIPPl et olMIPP2 étant des oligonucléotides internes, générant respectivement une amplification à 0,2 kb et 1,4 kb. Ce résultat montre la présence du site RHGXRXP dans le fragment de 1,6 kb. Par conséquent, il a été clone dans pGEM-T (Promega) et séquence.
1.2.4 - Déduction de la séquence d'acides aminés et analyse La séquence d'acide nucléique et la séquence d'acides aminés sont en annexe, respectivement par SEQ ID N° 3 et 4.
Caractéristiques biochimiques de OsMIPP : Masse moléculaire calculée 56,5 kDa pi 8,3
Avec les logiciels de détection de motifs proteiques, identification de :
- un peptide signal putatif de 18 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine : MAAPRTPLPLVLLLVSAA (SEQ LD n°16)
- un signal de rétention dans le reticulum endoplasmique à l'extrémité C-terminale de la protéine : KSEL
1.3 - Analyse des séquences proteiques déduites des clones d'ADNc OsMIPP et ZmMIPP
1.3.1 - Comparaison OsMIPP et ZmMIPP Les séquences proteiques des protéines MIPP de riz et de maïs sont fortement homologues entre elles. Les résultats de cet alignement, obtenu au moyen du logiciel MAC VECTOR™ 6.5.3 - Oxford Molecular, sont présentés en annexe, figure 1.
1.3.2 - Comparaison entre OsMLPP/ZmMIPP et phosphatases acides Une bioanalyse avec les séquences proteiques clonées par les ADNc, comme précédemment, met en évidence des homologies avec deux familles de phosphatases acides : les MTPP animales et les phytases fongiques. Les résultats de cette étude sont présentés en annexe, figure 3. Les MIPP sont des protéines décrites uniquement dans le domaine animal. Ces protéines hydrolysent les composés inositol polyphosphate, particulièrement les tétra-, penta-, et hexa-inositol phosphate, par conséquent l'acide phytique (Craxton et al, 1997). Ceci suggère que les ADNc de maïs et de riz ainsi clones codent pour des enzymes homologues des MIPP animales, avec notamment une activité phytasique.
1.4 - Obtention de l'ADNc codant pour une MIPP de blé
La comparaison des caractéristiques biochimiques des MTPP de riz et de maïs avec la phytase de blé met en évidence des similarités :
Riz* Maïs* Blé0 (Johansen et al, 1997)
Masse moléculaire kDa 56.5 ± 2.5 58.6 ± 3.5 47 pi 8.3 8.95 7.4-8.2
* valeurs calculées.
0 valeurs apparentes.
De plus, il a été constaté que les MTPP des plantes sont homologues aux MLPP animales et aux phytases fongiques, protéines pour lesquelles une activité phytasique est décrite. Ces deux constatations montrent fortement que la phytase de son du grain de blé est une MIPP.
Les grains de blé Triticum aestivum à différents stades de développement : 10, 20, 30 et 40 jours après anthèse (JAA) ont été utilisés comme matériel végétal.
Chez le blé, la fécondation a lieu dans la fleur encore fermée, par conséquent elle n'est pas visible. Lorsqu'elle a eu lieu, les anthères apparaissent, c'est la floraison. Cette étape correspond également à la fin de l'anthèse ou développement des anthères. C'est à partir de ce moment que sont comptés les jours correspondant à la période de développement du grain.
Les auteurs de l'invention réalisé une cinétique de l'activité phytasique d'une fraction du grain enrichie en son au cours du développement à 10, 20, 30 et 40 JAA. Cette activité phytasique augmente au cours du développement du grain. Cette augmentation peut s'expliquer par une activation des enzymes et/ou par une accumulation des enzymes dans le son au cours du développement du grain.
L'extraction des ARN totaux a ensuite été effectuée pour les 4 stades : 10, 20, 30, 40 JAA. Des cinétiques d'expression, c'est à dire des Northern blots, avec la sonde OsMP (nucléotide 105 au nucléotide 1506 - séquence correspondant aux 467 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine) ou la sonde ZmMP nucléotide 1 au nucléotide 1572 - (séquence correspondant aux 524 acides aminés de la protéine), ont été réalisées sur les ARN totaux extraits à partir de son de grain prélevé à 10, 20, 30 et 40 JAA. Par ailleurs, les ADNc correspondant aux ARN totaux extraits de son prélevé aux
4 stades de développement du grain, ont été synthétisés.
L'isolement de l'ADNc MIPP de blé est effectué par RT-PCR ou par RACE-PCR. Les oligonucléotides utilisés pour les réactions d'amplification, sont déterminés à partir des séquences nucléiques des clones d'ADNc MIPP de riz et de maïs dans les zones où les homologies de séquences sont les plus fortes. On peut également utiliser des oligonucléotides dégénérés, déterminés à partir des séquences d'acides nucléiques, notamment celle de riz et de maïs, correspondant aux régions N et C-terminales des MIPP végétales.
Par ailleurs, la séquence nucléique de l'ADNc OsMIPP a été utilisée pour rechercher des séquences homologues dans des bases d'EST de blé Triticum aestivum. Un EST issu d'ADNc de blé a été retenue, elle est nommée 3'TaMIPP (SEQ TD N°14). La séquence protéique déduite de l'EST présente une forte homologie avec les 58 acides aminés de la partie C-terminale de la protéine OsMIPP. Cette EST a été utilisée pour définir deux amorces olMIPP9 et olMIPPlO (SEQ ID N°12 , SEQ LD N°13). Ces amorces combinées avec l'amorce Smart II oligonucléotide™ du kit SMART PCR cDNA synthesis Kit (Clontech), permettent d'isoler par PCR un ADNc codant pour une MLPP de blé. La PCR génère divers fragments qui sont séparés en gel d'agarose, transférés sur une membrane nylon et hybrides avec la sonde ZmMP. Les fragments reconnus par la sonde ZmMP sont homologues à ZmMIPP.
EXEMPLE 2 : Production des protéines ZmMIPP et OsMIPP chez E.coli et évaluation de l'activité phytasique des protéines recombinantes
2.1 - Clonage dans le vecteur d'expression pET-14b Le site de restriction Ndel, amené par les oligonucléotides 5'olZMPl et 5'olOSPl et le site de restriction BamHl, amené par les oligonucléotides 3'olZMPl et 3'olOSPl, encadrent les ADNc ZmMIPP et OsMIPP. Ils permettent le clonage orienté et en phase des ADNc aux sites de restriction Ndel et BamHl du vecteur d'expression bactérien pET-14b (Novagen). Les vecteurs obtenus pET-OsMTPP et pET-ZrnMTPP ont été vérifiés par séquençage.
2.2 - Production des MIPP chezE. coli
La production des protéines se fait selon les recommandations du fournisseur Novagen. Des bactéries E. coli souche BL21(DΕ3)pLysS ont été utilisées. Le vecteur pLysS permet d'éviter l'expression de la protéine recombinante alors que la production n'a pas été induite et facilite la lyse des cellules car il porte le gène codant pour le lysozyme du phage T7.
Des bactéries E. coli souche BL21(DΕ3)pLysS sont transformées avec les vecteurs pΕT-OsMTPP et pΕT-ZmMIPP ; ces transformants bactériens servent respectivement pour la production des protéines OsMIPP et ZmMIPP. Des bactéries E. coli souche BL21(DΕ3)pLysS sont transformées avec pΕT-14b ; ces transformants bactériens servent de contrôle négatif de production. Des bactéries E. coli souche BL21(DΕ3)pLysS sont utilisées également comme contrôle négatif de production.
Chaque transformant bactérien est mis en culture dans 5 ml de milieu LB (milieu de Luria-Bertani) en présence des antibiotiques adéquats à 37°C sous agitation (175 rpm) pendant 15 heures. Deux antibiotiques sont utilisés : la carbénicilline et le chloramphénicol. La résistance au chloramphénicol est apportée par le vecteur pLysS (concentration utilisée : 30 μg/ml). La résistance à la carbénicilline est apportée par le vecteur pΕT- 14b (concentration utilisée : 50 μg/ml). L'utilisation appropriée d'un ou des deux antibiotiques permet de sélectionner les transformants bactériens qui contiennent les vecteurs pLysS et/ou pΕT-14b. Un volume de 1 ml de chaque préculture est utilisée pour ensemencer un volume de 100 ml de milieu LB avec les antibiotiques adéquats contenu dans un erlenmeyer de 500 ml. Les cultures sont incubées à 37°C, sous agitation (175 rpm), jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm soit de DOeoonm = 0,6. Lorsque la DO6oonm = 0,6 : les 100 ml de milieu LB sont répartis équitablement dans deux erlenmeyer de 250 ml. Le premier sert à la production de protéines. L'induction de la production se fait par ajout de 500 μl d'IPTG 100 mM soit une concentration finale de 1 mM. La production se fait pendant 6 h à 30°C sous agitation (175 rpm). Le second erlenmeyer sert de témoin non induit. Il est incubé 6 h à 30°C sous agitation (175 rpm).
Après production, la culture bactérienne est centrifugée à 3000 rpm pendant 5 min à 4°C. Le culot bactérien est repris dans un volume de tampon TΕ pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM, ΕDTA 1 mM) tel que le rapport volume TΕ / volume culture soit de 1/20. Les bactéries sont stockées à -80°C. Les bactéries sont lysées en deux étapes : une étape de congélation- décongélation (deux cycles congélation à -80°C / décongélation à 37°C), une étape d'ultrasons : 3 fois 15 s, 30 %, 4 puises / s. Entre chaque cycle, l'échantillon est placé dans la glace. Un cocktail d'inhibiteurs de protéases est ajouté au lysat bactérien, qui contient les protéines bactériennes et les protéines hétérologues, afin de les préserver.
2.3 - Dosage protéique
La concentration en protéines totales des extraits est évaluée selon la méthode de Bradford (1976). Dans une plaque de microtitration, 2 μl de lysat bactérien sont ajoutés à 200 μl de réactif de Coomassie (Bio-Rad protein assay). Pour le témoin négatif, l'extrait protéique est remplacé par 2 μl de tampon TE pH 8,0. Après homogénéisation, les absorbances sont lues à 595 nm avec un fluorimètre (Labsystems Genesis N2.00) assisté du logiciel (Labsystems). La quantité de protéines est déterminée d'après une courbe étalon réalisée avec de l'albumine de sérum bovin (1 mg/ml).
2.4 - Analyse des extraits proteiques par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)
Elle a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970) en suivant les instructions de Bio-Rad. Le gel de séparation est à 10 % de polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide,
29/1, p/v) contenant du Tris-HCl 0,38 M pH 8,8 et du SDS 0,1 (p/v). Le gel de concentration est à 4 % de polyacrylamide contenant du Tris-HCl 0,12 M pH 6,8 et du SDS 0,1 % (p/v). La polymérisation du gel s'effectue en présence de persulfate d'ammonium 0,05 % (p/v) et de Temed 0,078 % (v/v). Une quantité de 40 μg de protéines est utilisée pour l'analyse SDS- PAGE. Les protéines sont reprises dans le tampon de dépôt composé de Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, de glycérol 12,5 % (v/v), de SDS 1 % (p/v), de bleu de bromophénol 0,005 % (p/v), . en présence de dithiothréitol 100 mM et/ou de 2-mercaptoéthanol 360 . Les échantillons sont incubés à 100°C pendant 5 minutes avant dépôt en gel. Des protéines précolorées BEΝCHMARK prestained protein ladder (Gibco BRL) sont utilisées comme marqueurs de masses moléculaires. Le tampon de migration est composé de Tris-base 25 mM, de glycine 0,2 M et de SDS 0,1 % (p/v). L' électrophorèse est réalisée à voltage constant 150 volts pendant 1 heure à température ambiante. Après migration, le gel est rincé trois fois 10 minutes dans de l'eau, les protéines sont colorées par une solution de bleu de Coomassie G250 (Bio-Safe Coomassie, Bio-Rad) pendant 1 heure, le gel est ensuite rincé dans l'eau, à température ambiante.
L'analyse SDS-PAGE a été réalisée sur des extraits bactériens bruts. La présence de la protéine hétérologue dans la culture bactérienne après induction de la production est difficile à déterminer. Une analyse par Western blot avec un anticorps approprié permet de confirmer la présence de la protéine hétérologue. En effet, dans ce cas, la protéine hétérologue a l'avantage d'être synthétisée avec un peptide à son extrémité N-terminale. Des anticorps spécifiques de ce peptide sont commercialisés et peuvent être utilisés pour mettre en évidence la protéine hétérologue. Ceci va dans le sens des travaux de Craxton et al. (1997) : lors des essais de production chez E. coli d'une MIPP animale, la protéine n'a pu être détectée que par immunodétection.
2.5 - Evaluation de l'activité phytasique L'activité phytasique est déterminée par le dosage de phosphate libéré par l'enzyme à partir de phytate de sodium. La mesure de l'activité phytase est réalisée directement sur les lysats bactériens. .
Dans un tube Ependorf de 1,5 ml, on mélange 75 μl de lysat bactérien avec 300 μl d'une solution contenant du phytate de sodium 5 mM, de l'acétate de sodium 0,25 M pH 4,8, du CaCl 1 mM. La réaction enzymatique se fait pendant 1 heure à 55°C. Pour chaque essai, un témoin identique est gardé à 0°C pendant l'incubation. Ce témoin utilisé comme zéro, permet d'éliminer les absorbances possibles dues aux extraits proteiques eux-mêmes. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 375 μl d'acide trichloroacétique 20 % (p/v), suivie d'une centrinigation à 8000 rpm pendant 15 minutes et à 4°C qui permet de précipiter les protéines. Le dosage du phosphate libre se fait sur le surnageant. A 750 μl de surnageant, on ajoute 750 μl du réactif suivant : FeSO 0,38 M, H SO 0,16 N / molybdate d'ammonium 12 mM, H2SO 1 N, 1 / 4, v/v. L'absorbance est mesurée à 690 nm. La quantité de phosphate est déterminée à partir d'une courbe standard. L'activité phytasique est exprimée en rrmoles de phosphate libéré par heure, par mg de protéines totales à 55°C.
L'activité phytasique a été réalisée sur des extraits bactériensUne étape de purification de la protéine hétérologue à partir des extraits bactériens bruts est néanmoins préférable pour améliorer l'interprétation des résultats. Ceci est aisément envisageable de part la présence du peptide à l'extrémité N-terminale de la protéine hétérologue' qui permet de la purifier par chromatographie d'affinité.
EXEMPLE 3 : Construction de gènes chimériques.
3.1 - Pour une expression ectopique constitutive de OsMIPP
Pour obtenir une expression constitutive, le promoteur pCsNMV (Nerdaguer et al, 1996, 1998) du virus de la mosaïque de la nervure du manioc est utilisé. Le construit est réalisé de la façon suivante :
- Le fragment Clal-Sacll de 556 pb du vecteur pRD 257 (figure 4) contient le promoteur pCsVMV. Ce fragment est clone dans le vecteur p3214 (figure 5) digéré par Clal et EcoRI. Le vecteur obtenu est nommé vecteur pBIOS 366. Il contient le promoteur pCsVMN et le terminateur ter nos. - L'ADNc OsMIPP a été clone dans le vecteur pGΕM-T (Promega) donnant le vecteur pBIOS 367. Le vecteur pBIOS 367 est digéré par Notl générant un fragment de 1563 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est clone dans le vecteur pBIOS 366 digéré par Pstl. On obtient le vecteur pBIOS 368 qui contient la cassette : promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos. - Le vecteur pBIOS 368 est digéré par Xho , ce qui permet de sortir la cassette : promoteur pCsVMV, ADNc OsMIPP, terminateur ter nos. Elle est clonée au site Xhol du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur pBIOS 273 contient l'ADN-T d'Arabidopsis thaliana dans lequel se trouvent le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz, la séquence codante du gène bar et le terminateur nos. Le vecteur obtenu est le vecteur pBIOS 369. Le vecteur pBIOS 369 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entre le promoteur pCsVMV et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 369 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli
3.2 - Pour une expression ectopique tissu-spécifique de OsMTPP a Pour obtenir une expression albumen-spécifique, le promoteur pHMWG du gène codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée de blé (HMWG : High Molecular Weight Glutenin) est utilisé.
Le construit permettant l'expression de OsMIPP dans le cytoplasme des cellules 5 de l'albumen est réalisé de la façon suivante :
- La digestion par l'enzyme EcoRI du vecteur pBIOS 367 génère un fragment de 1547 pb contenant l'ADNc OsMIPP complet. Ce fragment est clone au site EcoRI du vecteur p3214 entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter nos. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 370. 10 - La digestion du vecteur pBIOS 370 par l'enzyme Xhol génère un fragment de 2287 pb qui est clone au site Xhol du vecteur binaire pBIOS 273. Le vecteur obtenu est nommé pBIOS 271. Le vecteur pBIOS 371 comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMLPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le 15 promoteur pActl et le premier intron du gène Actl de riz et le terminateur nos. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.
3.3 - Pour une expression ectopique albumen-spécifique de ZmMIPP
20 Pour obtenir une expression albumen-spécifique, le promoteur pHMWG du gène codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée de blé (HMWG : High Molecular Weight Glutenin) est utilisé.
Le construit permettant l'expression de ZmMIPP dans les cellules de l'albumen est réalisé de la façon suivante :
25 - La digestion par les enzymes EcoRI et BamHl du vecteur ZM4 (fragment
ZmMIPP dans le vecteur pGΕM-T easy) génère un fragment de 1600 pb contenant l'ADNc ZmMIPP complet. Ce fragment est clone aux sites EcoRI et BamHl du vecteur P3214 (figure 5) entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter NOS. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 421 et décrit figure 6.
30 - La digestion du vecteur pBIOS 421 par les enzymes Sαcl et Sali génère un fragment de 2335 pb. L'extrémité du fragment de 2335.pb digéré par l'enzyme Sαcl est rendue franche par un traitement à l'exonucléase 3'-5' portée par l'enzyme T4 DNA polymérase de New Εngland Biolabs. Ce fragment est ensuite clone aux sites Pmel et Xhol d'un vecteur binaire dérivé de pSB12 (Japan Tobacco, ΕP 672 752) dans lequel a été insérée une cassette d'expression du gène de sélection décrite ci-dessus. Le veoteur obtenu est nommé pHMWG- ZmMIPP-JT. Le vecteur pHMWG-ZmMTPP-JT comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène ZmMIPP, inséré entre le promoteur pHMWG et le terminateur ter NOS, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar (White et al, 1990) inséré entre le promoteur pActlet le premier intron Actl de riz et le terminateur ter NOS. La cassette d'expression du gène de sélection est également insérée entre les éléments transposables Ac/Ds (Lechelt et al, 1989) qui permettent une excision de la cassette de sélection après action d'une transposase. D'autre part le vecteur pHMWG-ZmMIPP-JT contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.
3.4 - Pour une expression ectopique embryon-spécifique de ZmMIPP
Pour obtenir une expression embryon-spécifique, et plus particulièrement scutellum-spécifique, le promoteur pHyPRP du gène codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs (HyPRP : Hybrid Proline Rich Protein) est utilisé.
Le construit permettant l'expression de ZmMIPP dans les cellules de l'embryon est réalisé de la façon suivante :
- La digestion par les enzymes Apal et Ndel du vecteur pBIOS 413 (fragment pHyPRP dans vecteur pBluescript) génère un fragment de 2162 pb contenant le promoteur du gène pHyPRP décrit par Josè-Εstanyol et al (1992). Ce fragment est clone aux sites Apal et NJel du vecteur pBIOS 421 devant l'ADNc ZmMIPP complet et le terminateur ter NOS. Le vecteur obtenu est appelé vecteur pBIOS 422 décrit figure 7.
- La digestion du vecteur pBIOS 422 par les enzymes Sαcl et Apal génère un fragment de 4050 pb. Les extrémités du fragment de 4050 pb sont rendues franches par un traitement à l'exonucléase 3'-5' portée par l'enzyme T4 DNA polymérase de New Εngland
Biolabs. Ce fragment est ensuite clone aux sites Pmel et Xhol du vecteur binaire pBIOS 342, les extrémités du vecteur étant rendues franches par un traitement avec l'enzyme T4 DNA polymérase de New Εngland Biolabs. Ce fragment est ensuite clone aux sites Pmel et Xhol d'un vecteur dérivé depSB112 (Japan Tobacco ΕP 672 752) comme décrit dans l'exemple précédent. Le vecteur obtenu est nommé pHyPRP-ZmMIPP-JT. Le vecteur pHyPRP-ZmMLPP-JT comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène ZmMIPP, inséré entre le promoteur pHyPRP et le terminateur ter NOS, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar inséré entre le promoteur pActlet le premier intron Actl de riz et le terminateur ter NOS. La cassette d'expression du gène de sélection est également insérée entre les éléments transposables Ac/Ds qui permettent une excision de la cassette de sélection après action d'une transposase. D'autre part le vecteur pHyPRP-ZmMIPP-JT contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli.
EXEMPLE 4 : Production de maïs transformé
4.1 - Transformation du maïs par bombardement de particules
La transformation génétique du maïs par bombardement de particules se fait sur des cellules de cals friables embryogènes ou cals de type II. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype HiU ou A188 x B73 selon la méthode décrite par Armstrong (1994). Les cals ainsi obtenus peuvent être multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation. Des plantules sont régénérées à partir de ces cals par modification de l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989).
Le transfert des gènes d'intérêt et de sélection par bombardement de particules dans les cals de type II se fait selon le protocole suivant. Quatre heures avant le bombardement, des fragments de cals de type II d'une surface de 10 à 20 mm2 sont disposés au centre d'une boîte de Pétri contenant le milieu d'initiation additionné de mannitol 0,2 M et de sorbitol 0,2 M, 16 fragments par boîte.
Les vecteurs porteurs des gènes d'intérêt et de sélection sont préparés à l'aide du système CONCERT selon les instructions du fournisseur (GIBCO BRL). Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide d'un canon à particules. L'optimisation des conditions de bombardement peut dépendre du type d'appareil utilisé et fait partie des techniques normalement maîtrisées par l'homme de l'art.
Après bombardement, les boîtes sont scellées à l'aide de Scello frais® et placées à l'obscurité à 27°C. Les cals sont transférés sur un milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif 24 h après le bombardement. Les cals sont maintenus sur ce milieu pendant 3 mois, le milieu est changé tous les
15 jours. Les cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif sont habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cals par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, multipliés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.
4.2- Transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens La transformation du maïs par Agrobacterium se fait selon la méthode de Ishida et al. (1996).
4.2.1- Obtention du vecteur superbinaire
Le vecteur superbinaire utilisé pour la transformation du maïs est issu de la recombinaison homologue entre deux vecteurs : le vecteur pBIOS 371 et le vecteur pSBl. Le vecteur pBIOS 371, construit comme précédemment (exemple 3.2), comporte d'une part l'ADN-T dans lequel se trouvent la cassette d'expression du gène OsMIPP, inséré entré le promoteur pHMWG et le terminateur Nos, la cassette d'expression du gène de sélection, le gène Bar. D'autre part, pBIOS 371 contient également le gène de la résistance à la spectinomycine et une origine de réplication chez E. coli. Le vecteur pSBl contient les gènes virB, virC et virG du plasmide pTiBo542 présent dans Agrobacterium souche A281 (ATCC 37349), le gène de la résistance à la tétracycline, une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli et Agrobacterium. Les vecteurs pSBl et pBIOS 371 possèdent une région homologue qui leur permet de se recombiner et de générer le vecteur superbinaire pRec 371. La recombinaison homologue entre les deux vecteurs se fait dans Agrobacterium.
Le vecteur pBIOS 371 est introduit dans Agrobacterium souche LBA4404 contenant le vecteur pSBl par électroporation en utilisant l'appareil CΕLL PORATOR Voltage Booster (GIBCO BRL) selon la méthode décrite par Mattanovitch et al. (1989) et le protocole donné par le fournisseur (Life Technologies, USA). Les agrobactéries contenant le vecteur superbinaire pRec 371 sont sélectionnées sur milieu YT en présence de CaC ,, de rifampicine et de spectinomycine. Le gène de résistance à la rifampicine est porté par le chromosome bactérien. La résistance à la spectinomycine, portée par le vecteur pBIOS 371 (origine de réplication fonctionnelle chez E. coli), ne pourra s'exprimer qu'après recombinaison homologue avec le vecteur pSBl (origine de réplication fonctionnelle chez Agrobacterium et E. coli).
Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression du gène Bar et de la séquence OsMIPPs (sous le contrôle du promoteur pHMWG pour une expression tissu spécifique), des origines de réplication fonctionnelles à la fois dans E. coli et Agrobacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la spectinomycine, et les gènes de virulence virB, virC et virG du plasmide pTiBo542.
4.2.2 - Méthode de transformation du maïs et régénération des plantes transformées Des embryons immatures sont co-cultivés avec .! tumefaciens souche LBA 4404, contenant le vecteur superbinaire pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25°C.
Les cals transformés sont sélectionnés sur un milieu de culture contenant l'agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Des cals de type I sont obtenus, à partir de ceux-ci, des plantules vont être régénérées sur un milieu culture contenant l'agent sélectif et l'agent bactériostatique, la céfotaxime. Les plantules ayant régénéré sont ensuite transférées sur un milieu de développement contenant l'agent sélectif.
Les plantes obtenues sont acclimatées au phytotron, puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou auto-fécondées.
4.3 - Le gène Bar
La nature et la concentration de l'agent sélectif peuvent varier selon le gène utilisé. Les agents sélectifs utilisables sont généralement des composés actifs de certains herbicides (Basta®, Round up®) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine,). Le gène Bar de Streptomyces hygroscopicus code pour une phosphinothricine acétyl transférase (PAT) qui inactive par acétylation la phosphinotricine - molécule active de l'herbicide Basta® . Les cellules portant ce gène sont donc rendues résistantes à cet herbicide et peuvent être sélectionnées par son intermédiaire.
Pour la transformation des céréales, la séquence codante du gène Bar est sous le contrôle d'une région régulatrice permettant une expression forte et constitutive dans les cellules végétales. Une telle région peut avantageusement être constituée par le promoteur et le premier intron du gène Actine 1 de riz (Me Εlroy et al, 1991). 4.3.1 - Utilisation du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules
Le gène chimérique, composé du promoteur et du premier intron du gène Actine 1 de riz et du gène Bar, est clone dans le plasmide pDM 302 permettant sa multiplication chez E. coli (Cao et a , 1992). Les milieux de cultures destinés à la sélection des cellules transformées sont additionnés de phosphinothricine 2 mg/1.
Pour l'introduction des construits OsMIPP devant conduire à une expression ectopique des protéines issues des gènes OsMIPP, une technique dite de cotransformation peut avantageusement être utilisée. On procède à une coprécipitation des deux plasmides (le plasmide porteur du gène Bar et le plasmide porteur du gène OsMIPP) sur les particules de tungstène, la quantité totale d'ADN précipité sur les particules restant identique à ce qu'elle est dans le protocole standard (5 μg d'ADN pour 2,5 mg de particules), chaque plasmide représentera environ la moitié du total d'ADN utilisé.
L'expérience montre qu'avec cette méthode, la cointégration des plasmides dans les cellules végétales est l'événement le plus fréquent (de l'ordre de 90 %) c'est-à-dire que pratiquement chaque plante ayant intégré le gène Bar et ayant été sélectionnée par son intermédiaire portera aussi le gène MIPP. Ainsi, le pourcentage de plantes sélectionnées exprimant le gène OsMIPP est d'environ 70 %.
Les gènes ainsi introduits sont généralement liés au sens génétique, le gène OsMIPP peut ainsi avantageusement être suivi dans les descendances grâce à la résistance à l'herbicide qui lui est étroitement associée.
4.3.2 - Utilisation du gène Bar dans la transformation par bombardement de particules Le vecteur superbinaire pRec 371 possède l'ADN-T dans lequel se trouvent les cassettes d'expression des gènes Bar et OsMIPP, des origines de réplication fonctionnelles à la fois dans E. coli et Agrobacterium, les gènes de résistance à la tétracycline et à la spectinomycine, et les gènes de virulence virB, virC et virG du plasmide pTiBo542.
Des embryons immatures sont co-cultivés avec A. tumefaciens souche LBA 4404, contenant le vecteur superbinaire pRec 371 pendant 5 minutes, puis placés sur un milieu d'initiation de la callogenèse pendant 5 jours à l'obscurité et à 25°C. La sélection des cals de type I transformés et la régénération des plantules se fait sur un milieu contenant de la phosphinotricine 5 à 10 mg/1 et un agent bactériostatique, la céfotaxime. Le développement des plantules se fait sur un milieu contenant uniquement la phosphinotricine. Les cals et les plantes qui ont intégré dans leur génome, l'ADN-T qui contient le gène OsMIPP et le gène Bar, peuvent être suivis dans les descendances grâce à la résistance à l'herbicide.
4.4 - Mesure de l'activité phytasique du maïs transformé
L'objectif final de la production de maïs transformé avec le gène OsMIPP étant l'obtention d'une activité phytasique accrue, des mesures d'activité enzymatique sont prévus. Le dosage de l'activité phytasique se fait selon la méthode décrite précédemment dans l'exemple 2 paragraphe 2.5. L'activité phytasique est mesurée sur les extraits proteiques de différents organes de maïs transgénique et de maïs non transgénique : feuilles, graines, jeunes plantules en cours de germination (5 ou 6 jours de germination). L'extraction des protéines totales à partir de ces tissus se fait selon la méthode décrite ci-après. Les tissus, prélevés et congelés à -80°C, sont broyés à l'état de poudre dans l'azote liquide. Une quantité de 100 mg de poudre végétale broyée est transférée dans 1 ml de tampon d'extraction (acétate de sodium 100 mM, pH 4,8, CaCl2 2 mM, DTT 1 mM, cocktail d'inhibiteurs de protéases 0,5 à 1 mM (Roche)). Les échantillons sont homogénéisés pendant 1 heure à 4°C et les extraits sont centrifαgés à 8000 rpm pendant 20 min à 4°C. Le surnageant contenant les protéines totales, sert à la mesure de l'activité phytasique.
EXEMPLE 5 : Production de riz transformé
La production de riz transformé peut être envisagée selon deux méthodes : via
Agrobacterium tumefaciens selon le protocole décrit par Hiei et al. (1994), par bombardement de particules selon le protocole de Fauquet et al. (1996). Les vecteurs pBIOS 369 et pBIOS
371 décrits dans l'exemple 3, sont utilisés pour la transformation du riz via Agrobacterium tumefaciens.
EXEMPLE 6 : Production de blé transformé.
La transformation du blé (Triticum aestivum) peut se faire selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 Bl. 6.1 - Préparation des tissus à transformer
Les tissus utilisés pour le transfert de gènes ont été préparés selon la méthode décrite dans le brevet EP 0674 715 Bl. Ce sont des cals de type M qui sont utilisés pour le bombardement. Ils peuvent être obtenus à partir d'embryons immatures prélevés des grains immatures de blé et placés sur un milieu MS décrit par Murashige et Skoog (1962) contenant du maltose.
6.2 - Préparation des vecteurs à transférer
Les vecteurs utilisés pour la transformation du blé sont purifiés sur gradient de Césium puis concentré à 1 mg/ml dans le tampon TE pH 8,0 (Tris-HCl 10 mM ; EDTA 1 mM) (Sambrook et al, 1989).
6.3 - Préparation des particules d'or
Des particules d'or de 1 μ sont enrobées d'ADN à transférer selon le procédé de Daines (1990). Les particules sont reprises dans de l'éthanol absolu, 60 mg de particules par ml d'éthanol. Un volume de 35 μl de cette suspension est transféré dans un tube de micro- centrifugation de 1,5 ml, les particules sont récupérées par centrifugation à 14 000 g pendant
3 minutes. Elles sont lavées avec 1,5 ml d'eau distillée stérile et récupérées par centrifugation à 14 000 g pendant 3 minutes. Les particules sont reprises dans 25 μl de tampon TE contenant 25 μg du vecteur portant le gène d'intérêt et 25 μg du vecteur portant le gène de sélection, le gène dhfr codant pour l'enzyme dihydrofolate réductase. On ajoute à cette préparation, dans l'ordre : 220 μl d'eau distillée stérile, 250 μl de CaCl2 2,5 M et 50 μl de spermidine 0,1 M. Le mélange est homogénéisé par agitation à 4°C pendant 15 minutes. Le mélange est centrifugé pendant 5 minutes à 14 000 g, le surnageant est éliminé et les particules lavées avec 200 μl d'éthanol absolu. Les particules d'or chargées d'ADN sont reprises dans 36 μl d'éthanol absolu.
6.4 - Etape de transformation
Le déroulement du bombardement des cellules s'est effectué telle que la demande de brevet EP 0 674 715 le décrit. Dans la chambre du canon, la boîte de Pétri contenant les explants à bombarder est placée sur la plate-forme au centre de l'ouverture d'où sont projetées les particules d'or enrobées d'ADN ou microprojectiles. Les microprojectiles sont placés sur un support au dessus des explants. La chambre est fermée et scellée, le vide de la chambre est réalisé et le réservoir d'hélium rempli avec une quantité appropriée de gaz. Le bombardement ;est déclenché permettant la projection des microprojectiles sur les explants. Les explants sont bombardés deux fois avec les microprojectiles. Après bombardement, les cals sont maintenus à l'obscurité pendant 15 heures puis placés sur le milieu MS pendant 15 jours.
6.5 - Sélection des cals et régénération des plantes transgéniques.
La sélection des cals transformés se fait le milieu MS contenant l'agent sélectif, le méthotrexate pendant 4 mois.
Pour régénérer des plantes, les cals sont transférées sur un milieu MS contenant du 2,4-D à l'obscurité. Quand des structures embryogènes apparaissent, les cals sont transférés sur un milieu MS contenant des hormones (auxines et gibbérellines) à la lumière pendant 15 jours, cette étape permet l'induction de tiges. Les explants sont ensuite transférés sur un milieu MS sans hormone afin de permettre l'induction des racines.
Les plantules sont acclimatées en phytotron avant d'être cultivées en serre.
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Claims

REVENDICATIONS r
I. Acide nucléique isolé codant pour une MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase) végétale à activité phytasique. 2. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ JD n°l, n° 3, n° 17 ou une séquence homologue d'une de ces séquences.
3. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence homologue de la séquence SEQ JD n°l, n°3 ou n° 17, ladite séquence homologue étant définie comme i) une séquence similaire à au moins 70 % de la séquence SEQ LD n° 1, n° 3 ou n° 17 ; ou ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n° 1, n° 3 ou n° 17 ou sa séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou iii) une séquence codant pour une enzyme MLPP végétale comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n°2, n°4 ou n° 18.
4. Acide nucléique isolé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n° 17 ou une séquence homologue à la séquence SEQ ID n° 17.
5. Enzyme isolée MIPP (Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase) végétale à activité phytasique. 6. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 4, comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID N°2, SEQ ID N°4 ou SEQ ID N° 18.
7. Enzyme isolée selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID n° 18.
8. Enzyme isolée MIPP végétale selon la revendication 5, comprenant une séquence d'acides aminés similaire à au moins 70% de la séquence SEQ ID N°2, SEQ ID N°4 ou SEQ LD N°
18.
9. Cassette d'expression contenant au moins une des séquences selon les revendications 1 à 4 placée sous le contrôle d'au moins une séquence régulatrice capable de commander l'expression de la protéine MTPP végétale. 10. Cassette d'expression selon la revendication 9, caractérisée en ce . que la séquence régulatrice est un promoteur.
II. Cassette d'expression selon la revendication 10, caractérisée en ce que le promoteur est spécifique d'un organe ou d'un tissu de la plante.
12. Cassette d'expression selon la revendication 11, " caractérisée en ce que le promoteur spécifique est choisi parmi les promoteurs de gènes codant pour une gluténine de masse moléculaire élevée HMWG de blé ou d'orge, la napine, la phaséoline, l'hélianthinine, l'albumine, l'oléosine, GEAI et GEA6 d'Arabidopsis thaliana, la γ-zéine de maïs, le promoteur pHyPRP du gène codant pour une protéine hybride riche en proline de maïs, le promoteur Vpl du gène Viviparousl combiné au premier intron Sh du gène Shrunken. 13. Cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'une séquence régulatrice comprend un signal d'adressage.
14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que le signal d'adressage est une séquence codant pour un peptide signal N-terminal.
15. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que le signal d'adressage comporte un signal de rétention endoplasmique à l'extrémité C-terminale.
16. Cassette d'expression selon la revendication 14, caractérisée en ce que le signal d'adressage ne comporte pas de signal de rétention endoplasmique à l'extrémité C- terminale.
17. Vecteur nucléotidique dans lequel est insérée une cassette d'expression telle que définie dans l'une des revendications 9 à 16.
18. Hôte cellulaire contenant un vecteur nucléotidique selon la revendication 17.
19. Procédé de production de plantes transgéniques comprenant les étapes de : - transformation de cellules de plante avec une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 ou un vecteur selon la revendication 17,
- sélection des cellules transformées,
- génération des plantes transformées à partir de ces cellules, exprimant une MLPP végétale à activité phytasique codée par ladite séquence d'acide nucléique. 20. Plante transformée susceptible d'être obtenue par le procédé de la revendication 17.
21. Partie d'une plante, notamment semence, caractérisée en ce qu'elle provient d'une plante transformée selon la revendication 20.
22. Produit, notamment farine, susceptible d'être obtenu à partir d'une plante transformée selon la revendication 20 ou d'une partie d'une plante transformée selon la revendication 21.
23. Méthode de production de protéine MIPP végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : a) transformation d'une cellule, en particulier d'un végétal ou d'un microorganisme, avec une cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à 16, b) éventuellement culture de ladite cellule hôte ou, dans le cas où cette cellule hôte est une cellule végétale, croissance de la plante transformée, c) extraction de la protéine MLPP de la culture cellulaire ou de la plante transformée.
24. Utilisation d'une plante ou partie d'une plante selon les revendications 20 ou 21, ou encore d'un produit selon la revendication 22, dans toute situation dans laquelle l'activité phytasique est nécessaire ou désirée.
25. Utilisation selon la revendication 24, pour libérer le phosphate inorganique et/ou améliorer la disponibilité des cations chélatés par la phytine tels que le fer, le calcium, le magnésium ou le zinc. 26. Utilisation d'une cassette d'expression selon l'une des revendications 9 à 16 pour l'obtention de plante transgénique productrice de graines contenant une MIPP.
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