FR2787466A1 - Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues - Google Patents
Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues Download PDFInfo
- Publication number
- FR2787466A1 FR2787466A1 FR9816163A FR9816163A FR2787466A1 FR 2787466 A1 FR2787466 A1 FR 2787466A1 FR 9816163 A FR9816163 A FR 9816163A FR 9816163 A FR9816163 A FR 9816163A FR 2787466 A1 FR2787466 A1 FR 2787466A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- plant
- sat
- transit peptide
- plants
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
- C12N15/8253—Methionine or cysteine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
- C12N15/8254—Tryptophan or lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
Abstract
La présente invention concerne un procédé pour augmenter la production de cystéine par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les chloroplastes des cellules végétales, et des plantes contenant les dites cellules végétales.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
Procédé pour augmenter la teneur en cystéine, méthionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues
La méthionine est le premier acide aminé essentiel limitant chez les plantes, en particulier les légumineuses qui sont une des bases de l'alimentation animale. La cystéine, autre acide aminé soufré n'est pas un acide aminé essentiel, mais peut être considérée comme un élément limitant pour la nutrition animale puisque la cystéine dérive, chez les animaux, de la méthionine. Dans le maïs, les acides aminés soufrés sont aussi des acides aminés limitant après la lysine et le tryptophane. En effet les protéines de réserves majoritaires des graines de ces plantes, sont pauvres en ces acides aminés.
La méthionine est le premier acide aminé essentiel limitant chez les plantes, en particulier les légumineuses qui sont une des bases de l'alimentation animale. La cystéine, autre acide aminé soufré n'est pas un acide aminé essentiel, mais peut être considérée comme un élément limitant pour la nutrition animale puisque la cystéine dérive, chez les animaux, de la méthionine. Dans le maïs, les acides aminés soufrés sont aussi des acides aminés limitant après la lysine et le tryptophane. En effet les protéines de réserves majoritaires des graines de ces plantes, sont pauvres en ces acides aminés.
La surproduction de méthionine et de cystéine dans les graines des légumineuses (soja, luzerne, pois,...) et du maïs aura donc un impact considérable sur la qualité nutritionnelle de ces graines.
Jusqu'à présent, l'augmentation de la qualité nutritionnelle des aliments dérivés des graines de légumineuses a été obtenue par complémentation avec de la méthionine libre synthétisée chimiquement. Par exemple, les contenus moyens en méthionine + cystéine du soja et du pois sont de l'ordre de 20 mg par g de protéines. Ce contenu doit être augmenté à une valeur de l'ordre de 25 mg cystéine + méthionine/g de protéines pour couvrir les besoins alimentaires de l'homme adulte, et à une valeur de l'ordre de 48 mg de cystéine + méthionine/g de protéines pour couvrir ceux des porcs (De Lumen, B.O., Food Technology (1997) 51,67-70).
Les techniques de caracterisation des protéines enrichies en acides aminés soufrés et la préparation de plantes transgéniques permettant l'expression de telles protéines, de manière à augmenter la teneur en acides aminés soufrés de ces plantes, et donc leur valeur nutritive pour l'alimentation animale, donc à diminuer l'apport en méthionine de synthèse, sont maintenant bien connus et décrites dans la littérature((1] Korit, A. A. & al., Eur. J. Biochem. (1991) 195, 329-334; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822).
L'enrichissement en protéines à fortes teneurs en acides aminés soufrés par une telle approche reste toutefois limité à la capacité des cellules végétales et des plantes à produire lesdits acides aminés soufrés. Or, on a constaté que le paramètre limitant d'une telle approche est bien lié à cette capacité à produire de la méthionine. Il est donc important de pouvoir modifier dans les plantes cette capacité à produire de la méthionine en quantités suffisantes pour permettre la production de protéines hétérologues à haute teneur en acides aminés soufrés, c'est à dire de mettre en #uvre une stratégie moléculaire visant à augmenter les taux de cystéine et de méthionine chez les plantes, et plus particulièrement les plantes de cultures d'intérêt agronomique.
<Desc/Clms Page number 2>
Chez les plantes, on connaît que la biosynthèse de méthionine est effectuée à partir de la cystéine, cette même cystéine étant impliquée dans la synthèse du glutathion.
Le glutathion est une forme de stockage du soufre réduit et représente 60 à 70% du soufre organique dans la cellule. Le glutathion joue un rôle important pour les plantes dans la resistance contre le stress oxydatif et l'élimination des composés toxiques. Il participe ainsi à l'élimination des composés xénobiotiques : métaux lourds (par exemple) via la formation des phytochélatines ; herbicides, via l'activité glutathion S-transférase ; sont toxiques pour la plante, et dans des mécanismes de défenses de la plante contre les micro-organismes. En augmentant la teneur en cystéine d'une plante, et par conséquence sa teneur en glutathion, il est alors possible de moduler la réponse de la plante aux différents stress cités ci-dessus.
Il existe donc à partir de la cystéine, deux voies métaboliques distinctes, l'une pour la préparation de la méthionine, l'autre pour la préparation du glutathion, dont les différentes enzymes impliquées sont rappelées ci-après.
Chez les plantes les étapes finales de synthèse de la cystéine impliquent les deux enzymes suivantes :
El) Sérine acétyltransférase (EC 2. 3.1.30) (SAT):
E2) O-acétylsérine (thiol) lyase (EC 4. 2.99.8) (OASTL):
El) Sérine acétyltransférase (EC 2. 3.1.30) (SAT):
E2) O-acétylsérine (thiol) lyase (EC 4. 2.99.8) (OASTL):
La synthèse de la méthionine à partir de la cystéine implique une succession des trois enzymes suivantes :
E3) cystathionine synthase (EC 4.2.99.9) (CGS) :
Pi signifie phosphate inorganique.
E3) cystathionine synthase (EC 4.2.99.9) (CGS) :
Pi signifie phosphate inorganique.
E4) cystathionine ss-lyase (EC 4. 4.1.8) (CBL) :
E5) méthionine synthase (EC 2. 1.1.14) (MS) :
E5) méthionine synthase (EC 2. 1.1.14) (MS) :
La synthèse du glutathion à partir de la cystéine implique pour sa part une succession des deux enzymes suivantes :
E6) y-glutamylcystéine synthéthase (EC 6.3.2.2)
E7) glutathion synthéthase (EC 6. 3.2.3)
E6) y-glutamylcystéine synthéthase (EC 6.3.2.2)
E7) glutathion synthéthase (EC 6. 3.2.3)
<Desc/Clms Page number 3>
Toutes ces enzymes ont été caractérisées et clonées chez les plantes ([2] Lunn, J.E. & al., Plant Physiol. (1990) 94, 1345-1352 ; [3] Rolland, N & al., Plant Physiol.
(1992) 98, 927-935 ; [4] Droux, M. & al, Arch. Biochem. Biophys. (1992) 295, 379- 390 ; [5] Rolland, N. & al., Arch. Biochem (1993) 300, 213-222 ; [6] Ruffet, M. L. & al., Plant Physiol. (1994) 104,597 - 604 ; [7] Ravanel, S. & al., Arch. Biochem.
Biophys. (1995) 316,572 - 5584 ; [8] Droux, M.& al, Arch. Biochem. Biophys. (1995) 31, 585 - 595 ; [9] Ruffet, M. L. & al., Eur. J. Biochem. (1995) 227, 500 - 509 ; [10] Ravanel, S. & al., Biochem. J. (1996) 320,383 - 392 ; [11] Ravanel, S. & al., Plant Mol. Biol. (1996) 29,875 - 882 ; [12] Rolland, N. & al., Eur. J. Biochem. (1996) 236, 272 - 282 ; [13] Ravanel, S. & al., Biochem. J. (1998) 331, 639-648 ; [14] Droux, M & al., Eur. J. Biochem. (1998) 255,235-245 ; [15] May, M. J., Leaver, C.J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1994) 91, 10059-10063 ; [16] Ullmann, P. & al., Eur. J. Biochem.
(1996) 236, 662-669 ; [17] Eichel, J. & al., Eur. J. Biochem. (1995) 230, 1053-1058).
On sait que pour la synthèse de cystéine, les enzymes Elet E2 sont présentes dans les trois compartiments de la cellule végétale, c'est-à-dire, les plastes, le cytosol et les mitochondries (2-3,6, 9). Ces trois enzymes El sont dénomées SAT1 pour l'enzyme chloroplastique, SAT2 pour l'enzyme mitochondriale et SAT3 pour l'enzyme cytoplasmique.
Pour les enzymes de la synthèse de la méthionine, la situation est différente puisque les enzymes E3 et E4 sont exclusivement localisées dans les plastes (7-8, 10-11, 13), alors que l'enzyme terminale E5 est dans le cytosol (17).
Les enzymes associées à la voie de biosynthèse du glutathion sont pour leur part localisées à la fois dans le chloroplaste et le cytosol ([18] Hell, R. and Bergmann, L., Planta (1990) 180, 603-612).
L'enzyme- E3, de la voie de synthèse de la méthionine, présente un Km (concentration en substrat donnant la moitié de la vitesse maximum) de l'ordre de 200 M à 500 M pour la cystéine (7,13, [19] Kreft, B-D. & al., Plant Physiol. (1994) 104, 1215-1220).
L'enzyme E6, de la voie de synthèse du glutathion, présente aussi un Km élevé pour la cystéine, de l'ordre de 200 M [18].
On a maintenant constaté que les enzymes SATI chloroplastiques (figure 1) était inhibée par la cystéine, contrairement à l'enzyme SAT3 cytoplasmique (figure 1), cette inhibition constituant le facteur limitant essentiel de la synthèse de cystéine dans les cellules végétales, et en aval de la méthionine et du glutathion.
La présente invention consiste donc à augmenter le taux de cystéine synthétisée dans le compartiment chloroplastique de manière à augmenter le taux de cystéine produite par les cellules végétales et les plantes. L'augmentation du taux de ce précurseur soufré (la cystéine) permet avantageusement d'augmenter le taux de
<Desc/Clms Page number 4>
méthionine et/ou de glutathion dans les cellules végétales et les plantes, et subséquemment à améliorer la production de protéines, naturelles ou hétérologues, enrichies en acides aminés soufrés dans les cellules végétales et les plantes.
Cette augmentation selon l'invention est obtenue en surexprimant une Sérine acétyltransférase (SAT) dans les chloroplastes.
La présente invention concerne donc un procédé pour augmenter la production de cystéine par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les chloroplastes des cellules végétales, et des plantes contenant les dites cellules végétales.
La SAT surexprimée dans les chloroplastes peut être constituée par toute SAT, qu'elle soit d'origine végétale, notamment SAT1, SAT2 ou SAT3, ou de toute autre origine, notamment bactérienne, sous une forme native ou mutée.
Elle peut notamment être une SAT sensible à la cystéine, comme par exemple une SAT chloroplastique de plante (SAT1), ou une SAT native d'origine bactérienne (Nakamori et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64, 1607-1611.).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention elle peut être une SAT insensible à la cystéine, comme par exemple une SAT cytoplasmique de plante (SAT3), ou une SAT d'origine bactérienne mutée, rendue insensible à la cystéine par mutagénèse (Nakamori et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64,1607-1611 dont le contenu est incorporé ici par référence), ou toutes SAT de plantes mutée et fonctionnelle dans la synthèse de l'O-acétylsérine (le précurseur carbonné pour la synthèse de la cystéine)
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT est une SAT d'Arabidopsis thaliana (9).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT est une SAT d'Arabidopsis thaliana (9).
De manière avantageuse, la protéine SAT est choisie parmi les protéines SAT3 (L34076), SAT3' (U30298) et SAT1 (L78443 ou U22964) représentées avec leur séquence codante par les identificateurs de séquence 1, 2, et 3 et 4 respectivement (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4 en annexe).
La SAT sera exprimée dans les chloroplastes par tout moyen approprié, en particulier par tout moyen connu de l'homme du métier et largement décrit dans l'état de la technique.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans les chloroplastes par intégration dans l'ADN chloroplastique d'un gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite SAT, sous le contrôle d'éléments de régulations en 5' et 3' fonctionnels dans les chloroplastes. Les techniques d'insertion de gènes dans les chloroplastes, comme les éléments de régulations appropriés à l'expression desdits gènes dans les chloroplastes sont bien connus de l'homme du métier, et notamment décrits dans les brevets et demandes de brevet suivants : US 5,693,507, US 5,451,513 et WO 97/32977.
<Desc/Clms Page number 5>
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, la SAT est surexprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/SAT, le peptide de transit ayant pour fonction d'adresser la SAT à laquelle il est fusionné vers les chloroplastes, la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l'intérieur des chloroplastes après clivage au niveau de la membrane chloroplastique.
Les peptides de transit, leurs structures, leurs modes de fonctionnement et leur utilisation dans la construction de gènes chimères pour l'adressage d'une protéine hétérologue dans les chloroplastes, ainsi que des peptides de transit chimères comprenant plusieurs peptides de transit sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera notamment les demandes de brevet suivants : EP 189 707, EP 218 571 et EP 508 909, et les références citées dans ces demandes de brevet, dont le contenu est incorporé ici par référence.
La présente invention concerne donc une protéine de fusion peptide de transit/SAT, dans laquelle la SAT est définie plus haut, et dans laquelle le peptide de transit est constitué par au moins un peptide de transit d'une protéine végétale naturelle à localisation plastidiale. On entend par protéine à localisation plastidiale une protéine exprimée dans le cytoplasme des cellules végétales sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/protéine, la protéine mature étant localisée dans le chloroplaste après clivage du peptide de transit.
Dans la protéine de fusion selon l'invention, la SAT peut être homologue ou hétérologue du peptide de transit. Dans le premier cas, la protéine de fusion est la protéine SAT1 exprimée naturellement dans les cellules végétales. Dans le second cas, le peptide de transit peut être un peptide de transit d'une SAT1 d'une autre espèce végétale, ou un peptide de transit d'une autre protéine à localisation plastidiale.
Il est entendu que dans le cas de la protéine de fusion hétérologue, la SAT peut être constituée par toute SAT, qu'elle soit d'origine végétale SAT1, SAT2 ou SAT3, ou de toute autre origine, notamment bactérienne, en particulier les SAT définies précédemment.
Un peptide de transit d'EPSPS de plante est notamment décrit dans la demande de brevet EP 218 571, alors qu'un peptide de transit de ssu RuBisCO de plante est décrit dans la demande de brevet EP 189 707.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de transit comprend également, entre la partie C-terminale du peptide de transit et la partie N-terminale de la SAT une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, cette partie de séquence comprenant généralement moins de 40 acides aminés de la partie N-terminale de la protéine mature, de préférence moins de 30 acides aminés, plus préférentiellement entre 15 et 25 acides aminés. Un tel peptide de transit comprenant un peptide de transit fusionné à une partie de la partie N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale est notamment décrit dans la demande de brevet EP
<Desc/Clms Page number 6>
189 707, plus particulièrement pour le peptide de transit et la partie N-terminale de ssu RuBisCO de plante.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide de transit comprend également entre la partie C-terminale de la partie N-terminale de la protéine mature et la partie N-terminale de la SAT un deuxième peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale. Préférentiellement, ce peptide de transit chimère comprenant l'association de plusieurs peptide de transit est un peptide de transit optimisé (OTP) constitué par la fusion d'un premier peptide de transit, avec une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, laquelle est fusionnée avec un deuxième peptide de transit. Un tel peptide de transit optimisé est décrit dans la demande de brevet EP 508 909, plus particulierèrement le peptide de transit optimisé comprenant le peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol, fusioné à un peptide constitué par les 22 acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs mature, fusioné au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs.
La présente invention concerne également une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/SAT décrite ci-dessus. Selon la présente invention, on entend par séquence d'acide nucléique une séquence nucléotidique pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin, qu'elle soit d'origine naturelle ou synthétique, notamment une séquence d'ADN pour laquelle les codons codant pour la protéine de fusion selon l'invention auront été optimisés en fonction de l'organisme hôte dans lequel elle sera exprimée, ces méthodes d'optimisations étant bien connues de l'homme du métier.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention dans un procédé pour la transformation des plantes, comme séquence codante permettant de modifier le contenu en cystéine, méthionine et glutathion des plantes transformées. Cette séquence peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre (s) marqueur (s) séquence (s) pour une ou plusieurs autres propriétés agronomiques.
La présente invention concerne également un gène chimère (ou cassette d'expression) comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, en particulier les cellules végétales ou les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion telle que définie précédemment.
Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production de protéine de fusion peptide de transit/SAT. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus,
<Desc/Clms Page number 7>
ou de préférence des cellules végétales et des plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier en fonction de l'organisme hôte. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne plus particulièrement la transformation des plantes.
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur s'exprimant notamment dans les feuilles des plantes, comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale ou encore des promoteurs dits lumière dépendants comme celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose- biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) de plante ou tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera les promoteurs d'histone tels que décrits dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'actine de riz (US 5,641,876). Parmi les promoteurs d'un gène de virus de plante, on citera celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou le promoteur du circovirus (AU 689 311).
On peut encore utiliser une séquence de régulation promotrice spécifique de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines ([22] Datla, R.& al., Biotechnology Ann. Rev. (1997) 3,269- 296), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de la zéine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATSI ou de l'ATS3 (PCT/US98/06978, déposée le 20 octobre 1998, incorporée ici par référence).
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du
<Desc/Clms Page number 8>
tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression.
De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.
Pour la transformation des organismes hôtes, le gène chimère selon l'invention peut être employé en association avec un gène marqueur de sélection, soit dans un même vecteur, les deux gènes étant associés de manière convergente, divergente ou colinéaire, ou encore dans deux vecteurs employés simultanément pour la transformation de l'organisme hôte. De tels gènes marqueurs et leur utilisation pour la transformation d'organismes hôtes sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.
<Desc/Clms Page number 9>
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention a encore pour objet les organismes hôtes, en particulier cellules végétales ou plantes, transformés et contenant un gène chimère défini ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références ci-dessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : US4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91102071 et WO 95/06128.
La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou dicotyledones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.
Les plantes transformées selon l'invention peuvent contenir d'autres gènes d'intérêt, conférant aux plantes de nouvelles propriétés agronomiques. Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une tolérance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies . De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128. On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés ([1]; WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ;
<Desc/Clms Page number 10>
WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant.
On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibacterienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998), la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998), la thanatine (PCTIFR98/02375, déposée le 6 novembre 1998) ou l'héliomicine (FR 98 04933, déposée le 15 avril 1998).
Ces autres gènes d'intérêt peuvent être combinés au gène chimère selon l'invention soit par croisement conventionnel de deux plantes contenant chacune l'un des gènes (la première le gène chimère selon l'invention et la seconde le gène codant pour la protéine d'intérêt) soit en effectuant la transformation de cellules végétales d'une plante contenant le gène codant pour la protéine d'intérêt avec le gène chimère selon l'invention.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T. Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,1982.
Exemple 1. Mise en évidence de l'inhibition de la serine acetyltransferase chloroplastique de feuilles de pois (Pisum sativum) par la cysteine
On prépare à partir de feuilles de pois les trois compartiments subcellulaires correspondant au cytosol (préparation à partir d'un fractionnement subcellulaire de protoplastes de pois, [9] ), aux mitochondries et aux chloroplastes [9]. On en extrait les protéines solubles et on mesure l'activité sérine acétyltransférase au moyen d'une technique décrite [9,14].
On prépare à partir de feuilles de pois les trois compartiments subcellulaires correspondant au cytosol (préparation à partir d'un fractionnement subcellulaire de protoplastes de pois, [9] ), aux mitochondries et aux chloroplastes [9]. On en extrait les protéines solubles et on mesure l'activité sérine acétyltransférase au moyen d'une technique décrite [9,14].
Description de la méthode de dosage:
<Desc/Clms Page number 11>
L'activité de la serine acetyltransférase est mesurée par chromatographie liquide haute performance (HPLC), en dosant l'O-acétylserine formée au cours de la réaction (réaction 1), après dérivatisation avec de l'orthophtalaldéhyde (OPA). Une quantité définie de l'extrait protéique, correspondant au cytosol, et aux différentes fractions solubles des chloroplastes (stroma) et mitochondries (matrice), sont dessalées sur une colonne PD 10 (Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon 50 mM Hepes-HCI, pH 7,5 et 1 mM EDTA. La réaction enzymatique est effectuée en présence de 50 mM Hepes-HCI, pH 7.5, ImM dithiotreitol, 10 mM L-serine, 2. 5 mM acétyl-CoA, dans un volume réactionnel de 100 (il, à 25 C. Après 10 à 15 min d'incubation, la réaction est arrêtée par l'addition de 50 l d'acide trichloroacétique 20% (P/V). Les protéines précipitées sont ensuite éliminées par une centrifugation de 2 min à 15,000g. Le surnageant, contenant le produit de la réaction, est mélangé avec 500 l d'une solution de dérivatization (54 mg d'OPA dissous dans 1 ml d'éthanol absolu, 9 ml d'une solution de borate-NaOH 400 mM, pH 9,5 et 0,2 ml de B-mercaptoethanol 14 M) et incubée pendant 2 min. Une fraction de ce mélange (20 l) est injectée sur une colonne de phase inverse (colonne AccQ Tag C18, 3,9 X 150 mm, Waters) connectée à un système HPLC. Les tampons utilisées pour l'élution des composés dérivés par l'OPA sont:Tampon A, 85 mM acétate de sodium, pH 4. 5, et acétonitile 6% (V/V), pH 4,5; Tampon B, acétonitrile, 60 % (V/V) dans de l'eau. L'O-acétylsérine, dérivée par l'OPA, est éluée par un gradient linéaire continu du tampon B dans le tampon A de 25 à 70 % (V/V), et détectée par fluorescence à 455 nm (excitation à 340 nm). Le temps de rétention de l'O-acétylserine est de l'ordre de 6. 2 min, et la quantité de produit formée dans les essais enzymatiques est quantifiée à partir d'une courbe étalon réalisée avec de l'O-acétylserine. Les essais enzymatiques ont été optimisés afin de respecter le pH optimal de la réaction, la linérarité en fonction du temps, et afin d'opérer dans des concentrations saturantes en substrats.
Effet de la cystéine sur l'activité serine acétvltransférase de feuilles de pois
L'incubation (2 min) est réalisée en présence de l'extrait protéique (cytosol, matrice et stroma), et des concentrations croissantes de L-cystéine (de 0 à 1 mM), avant l'ajout de concentrations saturantes des substrats de la sérine acétyltransférase, la Lserine (10 mM) et l'acétyl-CoA (2,5 mM). La réaction enzymatique et le dosage de l'Oacétylserine résiduelle dans le surnageant sont effectués comme décrit précédemment.
L'incubation (2 min) est réalisée en présence de l'extrait protéique (cytosol, matrice et stroma), et des concentrations croissantes de L-cystéine (de 0 à 1 mM), avant l'ajout de concentrations saturantes des substrats de la sérine acétyltransférase, la Lserine (10 mM) et l'acétyl-CoA (2,5 mM). La réaction enzymatique et le dosage de l'Oacétylserine résiduelle dans le surnageant sont effectués comme décrit précédemment.
Le résultat de ces expériences est représenté sur le graphe de la figure 1 en annexe.
L'activité sérine acétyltransférase résiduelle associée à chacun des compartiments cellulaires (le chloroplaste, la mitochondrie et le cytosol) est mesurée après une incubation de l'extrait en présence de concentrations croissantes de L-cystéine.
Si on ajoute de la cystéine libre (de 0 à 1 mM, figure 1) aux différents essais, on constate une très forte inhibition de l'activité sérine acétyltransférase chloroplastique.
L'activité sérine acétyltransférase mitochondriale est inhibée mais pour des
<Desc/Clms Page number 12>
concentrations supérieures de cystéine (constante d'inhibition de l'ordre de 300 M). En revanche, l'activité sérine acétyltransférase cytosolique est insensible à l'inhibition par la cystéine jusqu'à des concentrations de l'ordre de 1 mM (figure 1). Ce résultat prouve donc que seul l'activité sérine acétyltransférase chloroplastique, donc l'enzyme associée à la voie de l'assimilation du sulfate, est inhibiée par le produit finale, la L-cystéine.
Tableau I: Détermination des activité spécifiques et des valeurs de CI50 pour la cystéine pour chacune des isoformes de la serine acétyltransférase.
<tb>
<tb>
<tb>
Serine <SEP> acétyltransférase <SEP> (Pisum <SEP> sativum)
<tb> Activité <SEP> spécifique <SEP> C150 <SEP> L-cysteine
<tb> nmoles <SEP> OAS <SEP> #min-1 <SEP> #mg-1 <SEP> M
<tb> Stroma <SEP> 0,93 <SEP> 0,2 <SEP> 33,4 <SEP> ~ <SEP> 8
<tb> Matrice <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 283 <SEP> ~ <SEP> 50
<tb> Cytosol <SEP> 0,83 <SEP> 0,3 <SEP> pas <SEP> d'inhibition
<tb>
<tb> Activité <SEP> spécifique <SEP> C150 <SEP> L-cysteine
<tb> nmoles <SEP> OAS <SEP> #min-1 <SEP> #mg-1 <SEP> M
<tb> Stroma <SEP> 0,93 <SEP> 0,2 <SEP> 33,4 <SEP> ~ <SEP> 8
<tb> Matrice <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 283 <SEP> ~ <SEP> 50
<tb> Cytosol <SEP> 0,83 <SEP> 0,3 <SEP> pas <SEP> d'inhibition
<tb>
La concentration en L-cystéine permettant l'obtention de 50% d'inhibition (CI50) dans les conditions standards de la réaction calculée pour différentes préparations enzymatiques est représenté dans le tableau I. Les déterminations de l'activité enzymatique de la serine acétyltransférase et de la CI50 ont été effectuées lors de 9 expériences différentes (stroma), et 3 pour les extraits cytosolique et issus de la mitochondrie.
Etude du mode d'inhibition de l'activité serine acetyltransferase par la cystéine
La vitesse de la réaction enzymatique a été déterminée pour des concentrations fixes de cystéine (0 M; 10 M; 20 M; 40 M; 60 M; et 100 M; en faisant varier soit la concentration en L-serine ou en acétyl-CoA, pour des concentrations saturantes du second co-substrat. Pour chacunes des cinétiques obtenues, l'affinité de l'enzyme pour ces substrats ne semblent pas être affectée, mais par contre la vitesse maximale de la réaction est modifiée. Plus la concentration en L-cystéine augmente, plus la vitesse de synthèse de l'O-acétylserine est diminuée. Pour chacune des conditions analysées, la constante d'inhibition Ki a été estimée de l'ordre de 30 ( 2,2) M; (substrat variable : serine), et de 22 ( 2 M; (substats variable: l'acétyl-CoA). Nous avons pu montré que la cystéine est un inhibiteur de type non-compétitif pour l'activité serine acétyltransférase et de plus de type allostérique (constante de Hill de l'ordre de 1,6 0,3 M; en utilisant les équations cinétiques classiques ([20] Segel, I.H. (1995), John Wiley and Sons, New-York). Ces résultats indiquent que l'inhibition de l'enzyme chloroplastique prend place en un site différent du site actif, et de plus qui n'existe pas sur l'isoforme serine acétyltransférase, présent dans le cystosol.
La vitesse de la réaction enzymatique a été déterminée pour des concentrations fixes de cystéine (0 M; 10 M; 20 M; 40 M; 60 M; et 100 M; en faisant varier soit la concentration en L-serine ou en acétyl-CoA, pour des concentrations saturantes du second co-substrat. Pour chacunes des cinétiques obtenues, l'affinité de l'enzyme pour ces substrats ne semblent pas être affectée, mais par contre la vitesse maximale de la réaction est modifiée. Plus la concentration en L-cystéine augmente, plus la vitesse de synthèse de l'O-acétylserine est diminuée. Pour chacune des conditions analysées, la constante d'inhibition Ki a été estimée de l'ordre de 30 ( 2,2) M; (substrat variable : serine), et de 22 ( 2 M; (substats variable: l'acétyl-CoA). Nous avons pu montré que la cystéine est un inhibiteur de type non-compétitif pour l'activité serine acétyltransférase et de plus de type allostérique (constante de Hill de l'ordre de 1,6 0,3 M; en utilisant les équations cinétiques classiques ([20] Segel, I.H. (1995), John Wiley and Sons, New-York). Ces résultats indiquent que l'inhibition de l'enzyme chloroplastique prend place en un site différent du site actif, et de plus qui n'existe pas sur l'isoforme serine acétyltransférase, présent dans le cystosol.
<Desc/Clms Page number 13>
Ces valeurs de constantes d'inhibition sont consistantes avec la concentration en cystéine déterminée dans les chloroplastes de pois de 40 10 M (2 nmoles / mg chlorophylle), valeur qui est calculée pour un volume du compartiment stromatique de l'ordre de 35 à 65 l par mg de chlorophylle.
Exemple 2. Isolement et caractérisation d'un gène codant pour une isoforme serine acétyltransférase putative cytoplasmique (SAT3) [9]
On reprend dans cet exemple le mode opératoire décrit en page 502 de Ruffet & al [9], en particulier les chapitres décrits sous les titres Bacterial strain and growth conditions et Isolation of A. thaliana serine acetyltransferase cDNA clones by complémentation in E. coli .
On reprend dans cet exemple le mode opératoire décrit en page 502 de Ruffet & al [9], en particulier les chapitres décrits sous les titres Bacterial strain and growth conditions et Isolation of A. thaliana serine acetyltransferase cDNA clones by complémentation in E. coli .
Un gène codant pour une serine acétyltransférase putative cytosolique (Z34888 ou L34076) représentée sur la figure 4 (SEQ ID NO 1), a été isolé par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichia coli déficiente pour l'activité serine acétyltransférase. L'analyse de la séquence primaire a montré la présence d'une forte similitude avec la séquence de l'enzyme bactérienne (40% d'identité).
Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac (en caractères gras sur la figure 2) sont les suivantes : Oligo 1 : 5 ' GAGAGAGGAT CCTCTTTCCA ATCATAAACC ATGGCAACAT
GCATAGACAC ATGC 3' Oligo 2 : 5 ' GGCTCACCAG ACTAATACAC TAAATTGTGT TTACCTCGAG
AGAGAG 3'
Ces amorces permettent l'instroduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en3' (GAGCTC).
GCATAGACAC ATGC 3' Oligo 2 : 5 ' GGCTCACCAG ACTAATACAC TAAATTGTGT TTACCTCGAG
AGAGAG 3'
Ces amorces permettent l'instroduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en3' (GAGCTC).
L'extrémité N-terminale de la séquence en acide aminé de l'isoforme SAT3 ne présente pas les caractéristiques des peptides d'adressage dans un organite (mitochondrie ou chloroplaste). Cette analyse conduit à supposer une localisation cytosolique pour cette isoforme [9].
Exemple 3. Sur-expression et purification de la SAT3 chez Escherichia coli
Le protocole défini pour la sur-expression de l'enzyme chez E. coli permet la purification de l'enzyme sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acetylserine (thiol) lyase de plante, le complexe cystéine synthase [14]. Avec les protéines purifiées, l'effet de la cystéine sur l'activité de la serine acétyltransférase a été analysée par un dosage spectrophotométrique basé sur la consommation de l'acétyl-CoA au cours de la réaction 1, en fonction du temps d'incubation. Cette analyse s'effectue dans un milieu (1 ml) contenant 50 mM Hepes-HCI, pH 7. 5, 2 mM L-serine et 0. 2 mM Acetyl-CoA. La
Le protocole défini pour la sur-expression de l'enzyme chez E. coli permet la purification de l'enzyme sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acetylserine (thiol) lyase de plante, le complexe cystéine synthase [14]. Avec les protéines purifiées, l'effet de la cystéine sur l'activité de la serine acétyltransférase a été analysée par un dosage spectrophotométrique basé sur la consommation de l'acétyl-CoA au cours de la réaction 1, en fonction du temps d'incubation. Cette analyse s'effectue dans un milieu (1 ml) contenant 50 mM Hepes-HCI, pH 7. 5, 2 mM L-serine et 0. 2 mM Acetyl-CoA. La
<Desc/Clms Page number 14>
réaction est suivie en mesurant la diminution de l'absorbance à 232 nm (coefficient d'extinction moléculaire de 4200 M-1cm-1)([21] Kredich, N. M. & al., J. Biol. Chem.
(1969) 244, 2428-2439). Nous avons pu montrer que cette isoforme (SAT3) sous sa forme libre ou en complexe avec l'O-acétylserine (thiol) lyase est insensible à la cystéine. Ce résultat nous permet d'infirmer que cet ADNc (L34076, Figure 2) code pour une serine acétyltransférase cytosolique, car la composition en acides aminés de l'extrémité N-terminale ne présente pas les caractérisitiques de peptides de transit, et de plus cette sérine acétyltransférase est insensible à la cystéine. Ce dernier résultat parallèle les observations obtenues pour l'activité serine acétyltransférase cytosolique de feuilles de pois (Figure 1 et Tableau I).
Exemple 4. Isolement et caractérisation d'un gène codant pour une isoforme serine acétyltransférase cytoplasmique (SAT3' )
On reprend le mode opératoire de l'exemple 3 avec les oligonucléotides 3 et 4 suivants : Oligo 3 : 5 ' GAGAGAGGAT CCTCTTATCG CCGCGTTAAT ATGCCACCGG
CCGGAGAACTC C 3' Oligo 4 : 5'GAGCCTTACC AGTCTAATGT AGTATATTTC AACCTCGAGA
GAGAG 3'
On isole un gène codant pour une acétyltransférase (U 30298) représentée sur la figure 5 (SEQ ID NO 2).
On reprend le mode opératoire de l'exemple 3 avec les oligonucléotides 3 et 4 suivants : Oligo 3 : 5 ' GAGAGAGGAT CCTCTTATCG CCGCGTTAAT ATGCCACCGG
CCGGAGAACTC C 3' Oligo 4 : 5'GAGCCTTACC AGTCTAATGT AGTATATTTC AACCTCGAGA
GAGAG 3'
On isole un gène codant pour une acétyltransférase (U 30298) représentée sur la figure 5 (SEQ ID NO 2).
Exemple 5. Isolement et caractérisation de gènes codant pour une isoforme serine acétyltransférase putative chloroplastique (SAT1)
Le mode opératoire décrit pour l'exemple 3 est repris pour le présent exemple.
Le mode opératoire décrit pour l'exemple 3 est repris pour le présent exemple.
Un gène codant pour une serine acétyltransférase putative chloroplastique (L78443) représenté sur la figure 6 (SEQ ID NO 3) a été isolée par complémentation fonctionnelle d'une souche d'Escherichia coli déficiente pour l'activité serine acétyltransférase. [9] L'analyse de la séquence primaire a montré la présence de fortes similitudes avec la séquence de l'enzyme bactérienne (40% d'identité).
Les amorces qui ont été utilisées pour l'amplification de la séquence nucléotidique et son clonage dans le vecteur utilisé pour la transformation de plants de tabac (en caractères gras sur la figure 3) sont les suivantes : Oligo 5 : 5 ' GAGAGAGGAT CCCCTCCTCC TCCTCCTCCT ATGGCTGCGT
GCATCGACAC CTG 3' Oligo6: 5'GCTCACCAGC CTAATACATT AAACTTTTTC AGCTCGAGAG
AGAG 3'
Ces amorces permettent l'instroduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en 3' (GAGCTC).
GCATCGACAC CTG 3' Oligo6: 5'GCTCACCAGC CTAATACATT AAACTTTTTC AGCTCGAGAG
AGAG 3'
Ces amorces permettent l'instroduction des sites de restriction BamHl en 5' (GGATCC) et Sacl en 3' (GAGCTC).
<Desc/Clms Page number 15>
On obtient un deuxième gène codant pour une serine acétyltransférase putative chloroplastique (U22964) représenté sur la figure 7 (SEQ ID NO 4) en reprenant le même mode opératoire avec l'oligo 7 en remplacement de l'oligo 5 comme amorce en 5'.
Oligo 7 : 5' GAGAGAGGAT CCGGCCGAGA AAAAAAAAAA ATGTTGCCGG
TCACAAGTCG CCG 3' Exemple 6. Constructions utilisées pour la transformation des plants de tabac variété petit Havanna
Expression du transgène dans les feuilles
Les transformations des plants de tabac est réalisé par l'intermédiaire d'Agrobactérium tuméfaciens EHA105, contenant le vecteur pBI121 (Clonetch) (Figures 4 et 5).
TCACAAGTCG CCG 3' Exemple 6. Constructions utilisées pour la transformation des plants de tabac variété petit Havanna
Expression du transgène dans les feuilles
Les transformations des plants de tabac est réalisé par l'intermédiaire d'Agrobactérium tuméfaciens EHA105, contenant le vecteur pBI121 (Clonetch) (Figures 4 et 5).
SAT3
Afin d'obtenir une expression de la SAT3 (SEQ ID NO 1) de l'exemple 2 dans le chloroplaste (figure 2), on introduira en position 5' de L'ADNc une extension qui permettra l'adressage dans ce compartiment. Pour cela, le peptide de transit optimisé décrit auparavant sera utilisé.
Afin d'obtenir une expression de la SAT3 (SEQ ID NO 1) de l'exemple 2 dans le chloroplaste (figure 2), on introduira en position 5' de L'ADNc une extension qui permettra l'adressage dans ce compartiment. Pour cela, le peptide de transit optimisé décrit auparavant sera utilisé.
Entre les bordures gauche (BG) et droite (BD) du T-DNA sont clonés un gène de résistance à la kanamycine (NPTII) codant pour la néomycine phosphotransférase utilisés comme marqueur de sélection pour la transformation du tabac. L'expression du gene NPTII est sous la dépendance du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase de A. tumefaciens. En aval, le gène de la glucuronidase cloné entre les sites uniques BamHl et Sacl, est sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et le signal de polyadénylation du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti. L'insertion du produit de la OTP-SAT3 s'effectue entre les sites BamHl et Sacl du vecteur délété du gène de la B-glucuronidase.
SAT3'
On reprend le même mode opératoire que précédemment en remplaçant l'enzyme SAT3 (SEQ ID NO 1) de l'exemple 2 par l'enzyme SAT3' (SEQ ID NO 2) de l'exemple 4.
On reprend le même mode opératoire que précédemment en remplaçant l'enzyme SAT3 (SEQ ID NO 1) de l'exemple 2 par l'enzyme SAT3' (SEQ ID NO 2) de l'exemple 4.
SAT1
Entre les bordures gauche (BG) et droite (BD) du T-DNA sont clonés un gène de résistance à la kanamycine (NPTII) codant pour la néomycine phosphotransférase utilisés comme marqueur de sélection pour la transformation du tabac. L'expression du gene NPTII est sous la dépendance du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase de A. tumefaciens. En aval, le gene de la glucuronidase cloné entre les sites uniques BamHl et Sacl, est sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque
Entre les bordures gauche (BG) et droite (BD) du T-DNA sont clonés un gène de résistance à la kanamycine (NPTII) codant pour la néomycine phosphotransférase utilisés comme marqueur de sélection pour la transformation du tabac. L'expression du gene NPTII est sous la dépendance du promoteur et du terminateur de la nopaline synthase de A. tumefaciens. En aval, le gene de la glucuronidase cloné entre les sites uniques BamHl et Sacl, est sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque
<Desc/Clms Page number 16>
du chou-fleur (CaMV) et le signal de polyadénylation du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti. L'insertion du gène codant pour une SAT1 (SEQ ID NO 3 ou 4) s'effectue entre les sites BamHl et Sacl du vecteur délété du gène de la B-glucuronidase.
<Desc/Clms Page number 17>
Expression des transgènes dans les graines
Une construction similaire à celle présenté dans la figure 3 est réalisé dans le but d'obtenir une expression spécifique du transgène dans les graines. Cette stratégie pourrait être importante puisque les graines composent l'apport principale pour l'alimentation animale. Pour cela le promoteur constitutif de la mosaïque du tabac sera remplacé par un promoteur qui permet une expression spécifique du transgène pendant la mise en place des réserves de la graines.
Une construction similaire à celle présenté dans la figure 3 est réalisé dans le but d'obtenir une expression spécifique du transgène dans les graines. Cette stratégie pourrait être importante puisque les graines composent l'apport principale pour l'alimentation animale. Pour cela le promoteur constitutif de la mosaïque du tabac sera remplacé par un promoteur qui permet une expression spécifique du transgène pendant la mise en place des réserves de la graines.
Exemple 6. Transformation du tabac
De jeunes feuilles de plants de tabac (âgés de 3 à 4 semaines) dont la surface est stérilisée avec une solution de javel 10% (V/V) pendant 10 min puis rincée à l'eau stérile, sont découpées à l'emporte-pièce (30 disques par construction). 20 ml d'une culture de 48 heures d'Agrobacterium tumefaciens EHA105 (contenant le vecteur pBI121 modifié selon l'invention) sont centrifugés puis resuspendus dans 4 ml d'une solution de MgS04 10mM. Les disques foliaires sont incubés pendant quelques minutes avec la solution d'agrobactéries puis transférés sur milieu MS (Sigma M-5519) supplémenté avec 0,05 mg/1 d'acide a-naphtalène acétique (NAA, Sigma), 2 mg/l de 6benzylaminopurine (BAP) et 7 mg/1 de phytoagar, pendant 2 à 3 jours. Les disques foliaires sont ensuite transférés sur un milieu identique auquel sont ajoutés 350 mg/1 de cefotaxine (bacteriostatique) et 75 mg/1 de kanamycine (agent de sélection). Au bout de 2 semaines, les disques sur lesquels se sont développés des cals ainsi que de jeunes pousses sont repiqués sur un milieu identique afin d'accélérer la croissance des pousses.
De jeunes feuilles de plants de tabac (âgés de 3 à 4 semaines) dont la surface est stérilisée avec une solution de javel 10% (V/V) pendant 10 min puis rincée à l'eau stérile, sont découpées à l'emporte-pièce (30 disques par construction). 20 ml d'une culture de 48 heures d'Agrobacterium tumefaciens EHA105 (contenant le vecteur pBI121 modifié selon l'invention) sont centrifugés puis resuspendus dans 4 ml d'une solution de MgS04 10mM. Les disques foliaires sont incubés pendant quelques minutes avec la solution d'agrobactéries puis transférés sur milieu MS (Sigma M-5519) supplémenté avec 0,05 mg/1 d'acide a-naphtalène acétique (NAA, Sigma), 2 mg/l de 6benzylaminopurine (BAP) et 7 mg/1 de phytoagar, pendant 2 à 3 jours. Les disques foliaires sont ensuite transférés sur un milieu identique auquel sont ajoutés 350 mg/1 de cefotaxine (bacteriostatique) et 75 mg/1 de kanamycine (agent de sélection). Au bout de 2 semaines, les disques sur lesquels se sont développés des cals ainsi que de jeunes pousses sont repiqués sur un milieu identique afin d'accélérer la croissance des pousses.
Une semaine plus tard, les pousses vertes sont excisées et transférées sur le même milieu sans hormones, afin de permettre le développement des racines, ceci pendant 2 semaines environ, au bout desquelles les jeunes plantes sont transférées en terre et cultivées en serre.
Exemple 7. Analyse des résultats pour les plantes transgéniques et témoins.
L'impact de l'expression de SAT3, SAT et SATI dans les plants de tabac est analysé au niveau du contenu en composés soufrés, la cystéine et la méthionine et le glutathion. La cystéine et le glutathion sont mis en évidence par la Méthode de Fahey ([23] Fahey, R. C. and Newton, G. L., Methods Enzymol. (1987) 143, 85-96), après dérivatisation des composés par le thiolyte (Calbiochem) et séparation par chromatographie liquide haute performance (CLHP) [23]. Le dosage de la méthionine libre est effectué par les méthodes de dosage des acides aminé libres après extraction et dérivation par l'orthophtaldéhyde et séparation par CLHP ([24] Brunet, P. & al., J.
Chrom. (1988) 455,173-182). L'activité de la serine acetyltransferase s'effectue comme décrit dans la méthodologie de dosage de l'O-acetylserine formée, par la technique
<Desc/Clms Page number 18>
HPLC, ou par la méthode de couplage en présence d'un excès d'O-acétylserine (thiol) lyase [9], [14].
L'expression du gène de la serine acétyltransférase d'Arabidopsis thaliana dans le tabac conduit à une augmentation du taux en cystéine, du taux en glutathion et du taux en méthionine dans les tissus des plantes transformées par rapport aux plantes contrôles. Cette augmentation en composés soufrés s'accompagne d'une augmentation du contenu en d'autres acides aminés essentiels comme la threonine, isoleucine, leucine valine, tyrosine et phenylalanine. Toutes les augmentations en acides aminés sont corrélées avec une augmentation en l'activité serine acétyltransférase (SAT3, SAT3' ou SATI) liée à l'expression du transgène dans le chloroplaste. De plus, l'augmentation en ces composés soufrés conduit à améliorer le rapport nutritionnelle N/S de la plante et se traduit par un enrichissement des protéines de réserves de la graines en polypeptides riches en acides aminé soufrés au détriment des polypeptides pauvres en ces composés.
Claims (40)
1. Procédé pour augmenter la production de cystéine par les cellules végétales et les plantes, ledit procédé consistant à surexprimer une SAT dans les chloroplastes des cellules végétales, et des plantes contenant les dites cellules végétales.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SAT surexprimée dans les chloroplastes est une SAT sensible à la cystéine, comme par exemple une SAT chloroplastique de plante (SAT1) ou une SAT native d'origine bactérienne.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la SAT surexprimée dans les chloroplastes est une SAT insensible à la cystéine, comme par exemple une SAT cytoplasmique de plante (SAT3) ou une SAT d'origine bactérienne ou de plante mutée, rendue insensible à la cystéine par mutagénèse.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la SAT est une SAT d'Arabidopsis thaliana.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine SAT est choisie parmi les protéines SAT3, SAT3' et SAT1 représentées avec leur séquence codante par les identificateurs de séquence 1 , 2, et 3 et 4 respectivement (SEQ ID NO 1 à 4).
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans les chloroplastes par intégration dans l'ADN chloroplastique des cellules végétales d'un gène chimère comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite SAT, sous le contrôle d'éléments de régulations en 5' et 3' fonctionnels dans les chloroplastes.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la SAT est surexprimée dans le cytoplasme sous la forme d'une protéine de fusion peptide de transit/SAT, la SAT mature fonctionnelle étant libérée à l'intérieur des chloroplastes.
8. Protéine de fusion peptide de transit/SAT, dans laquelle la SAT est définie dans l'une des revendications 2 à 5, et dans laquelle le peptide de transit est constitué par au moins un peptide de transit d'une protéine végétale naturelle à localisation plastidiale.
9. Protéine de fusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que la SAT est homologue du peptide de transit.
10. Protéine de fusion selon la revendication 8, caractérisée en ce que la SAT est hétérologue du peptide de transit.
11. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisée en ce que le peptide de transit est un peptide de transit d'une autre protéine à localisation plastidiale.
<Desc/Clms Page number 20>
12. Protéine de fusion selon la revendication 11, caractérisé en ce que le peptide de transit est constitué par le peptide de transit d'une EPSPS de plante ou le peptide de transit d'une ssu RuBisCO de plante .
13. Protéine de fusion selon la revendication 10, caractérisé en ce que le peptide de transit comprend un peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale et une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale entre la partie C-terminale du peptide de transit et la partie Nterminale de la SAT.
14. Protéine de fusion selon la revendication 13, caractérisée en ce que la partie de séquence comprend généralement moins de 40 acides aminés de la partie Nterminale de la protéine mature, de préférence moins de 30 acides aminés, plus préférentiellement entre 15et 25 acides aminés.
15. Protéine de fusion selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que le peptide de transit comprend entre la partie C-terminale de la partie Nterminale de la protéine mature et la partie N-terminale de la SAT un deuxième peptide de transit d'une protéine végétale à localisation plastidiale.
16. Protéine de fusion selon la revendication 15, caractérisée en ce que le peptide de transit est un peptide de transit optimisé (OTP) constitué par la fusion d'un premier peptide de transit, avec une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'une protéine à localisation plastidiale, laquelle est fusionnée avec un deuxième peptide de transit.
17. Séquence d'acide nucléique codant pour une protéine de fusion peptide de transit/SAT selon l'une des revendications 8 à 16.
18. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans un organisme hôte, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17.
19. Gène chimère selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, les baculovirus, ou les cellules végétales et les plantes.
20. Gène chimère selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante la contenant.
21. Gène chimère selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'élément de régulation en 5' comprend les séquences de régulation promotrice dans cellules végétales et les plantes, choisi parmi les promoteur s'exprimant dans les feuilles des plantes, les promoteurs constitutifs, ou les promoteurs lumière dépendants d'origine bactérienne, virale ou végétale
<Desc/Clms Page number 21>
22. Gène chimère selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'élément de régulation en 5' comprend les séquences de régulation promotrice dans les cellules végétales et les plantes, choisi parmi les promoteurs spécifiques des graines.
23. Gène chimère selon la revendication 22, caractérisé en ce que le promoteur est choisi parmi les promoteurs de la napine, de la phaseoline, de la glutenine, de la zéine, de l'héliantinine, de l'albumine ou de l'oléosine.
24. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère tel que défini selon l'une des revendications 18 à 23.
25. Procédé de transformation des organismes hôtes caractérisé en ce que l'on intègre dans le génome dudit organisme hôte au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17 ou un gène chimère selon l'une des revendications 18 à 23.
26. Procédé selon la revendication 25, au moyen du vecteur selon la revendication 24.
27. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que l'organisme hôte est choisi parmi les bactéries, par exemple E. coli, les levures, en particulier des genres Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, les champignons, en particulier Aspergillus, les baculovirus, ou les cellules végétales et les plantes.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante la contenant.
29. Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir d'une cellule végétale transformée.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une plante monocotylédone, en particulier choisie parmi les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs, ou une plante dicotyledone, en particulier choisie parmi le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave et le trèfle.
31. Organisme hôte transformé, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17 ou un gène chimère selon l'une des revendications 18 à 23.
32. Organisme hôte selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 25 à 29.
32. Cellule végétale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 17 ou un gène chimère selon l'une des revendications 18 à 23.
33. Plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une cellule végétale selon la revendication 32.
34. Plante selon la revendication 33, caractérisé en ce que la plante est régénérée à partir d'une cellule végétale selon la revendication 32.
<Desc/Clms Page number 22>
35. Plante génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées selon la revendication 34.
36. Plante génétiquement modifiée selon l'une des revendications 33 à 35, caractérisé en ce qu'elle est une plante monocotylédone, en particulier choisie parmi les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs, ou une plante dicotyledone, en particulier choisie parmi le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave et le trèfle.
37. Plante génétiquement modifiée selon, l'une des revendications 33 à 36, caractérisée en ce qu'elle comprend d'autres gènes d'intérêt.
38. Plante selon la revendication 37, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un autre gène modifiant la teneur et la qualité des protéines de ladite plante, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines.
39. Plante selon la revendication 38, caractérisé en ce que le gène code pour une protéine enrichie en acides aminés soufrés.
40. Graines des plantes génétiquement modifiées selon l'une des revendications 33 à 39.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9816163A FR2787466B1 (fr) | 1998-12-17 | 1998-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
| ARP990106473A AR028807A1 (es) | 1998-12-17 | 1999-12-16 | Procedimiento para aumentar la produccion de cisteina, metionina y celulas vegetales y glutation en plantas, sobreexpresando las enzimas sat de cloroplastos, proteinas de fusion de peptidos de transito que incluyen dichas enzimas sat, secuencias de acidos nucleicos que codifican proteinas de fusion, |
| PCT/FR1999/003179 WO2000036127A1 (fr) | 1998-12-17 | 1999-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en composes soufres et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
| AU17830/00A AU773031B2 (en) | 1998-12-17 | 1999-12-17 | Method for increasing the content in sulphur compounds and particularly in cysteine, methionine and glutathione in plants and plants obtained |
| EP99961099A EP1141349A1 (fr) | 1998-12-17 | 1999-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en composes soufres et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
| BR9916968-1A BR9916968A (pt) | 1998-12-17 | 1999-12-17 | Método de aumento da produção de cisteìna, glutationa, metionina e seus derivados de enxofre, vetor, gene quimérico, sequência de ácido nucleico, organismo hospedeiro transformado, célula vegetal, planta geneticamente modificada e suas sementes |
| CA002355255A CA2355255A1 (fr) | 1998-12-17 | 1999-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en composes soufres et notamment en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9816163A FR2787466B1 (fr) | 1998-12-17 | 1998-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2787466A1 true FR2787466A1 (fr) | 2000-06-23 |
| FR2787466B1 FR2787466B1 (fr) | 2001-02-16 |
Family
ID=9534264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9816163A Expired - Fee Related FR2787466B1 (fr) | 1998-12-17 | 1998-12-17 | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1141349A1 (fr) |
| AR (1) | AR028807A1 (fr) |
| AU (1) | AU773031B2 (fr) |
| BR (1) | BR9916968A (fr) |
| CA (1) | CA2355255A1 (fr) |
| FR (1) | FR2787466B1 (fr) |
| WO (1) | WO2000036127A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002060939A2 (fr) * | 2001-02-02 | 2002-08-08 | Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Procede pour augmenter la concentration de composes sulfures dans des plantes |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE319847T1 (de) | 1998-07-07 | 2006-03-15 | Verfahren zur erhöhung des gehaltes an schwefelverbindungen in pflanzen | |
| US6576819B1 (en) | 1999-02-18 | 2003-06-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for modulating the levels of organic sulfur compounds in plants by transforming with (P)APS reductase DNA |
| US7038109B1 (en) | 2001-03-29 | 2006-05-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enzymatic methods for modulating the levels of organic sulfur compounds in plants |
| US6831206B2 (en) | 2001-05-21 | 2004-12-14 | Stephen M. Allen | Serine O-acetytransferase |
| FR2844142B1 (fr) | 2002-09-11 | 2007-08-17 | Bayer Cropscience Sa | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
| DE10260871A1 (de) * | 2002-12-23 | 2004-07-08 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Veränderung des Serin-Acetyltransferase-Gehalts |
| AR074941A1 (es) | 2009-01-07 | 2011-02-23 | Bayer Cropscience Sa | Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion |
| PL389131A1 (pl) * | 2009-09-25 | 2011-03-28 | Instytut Biochemii I Biofizyki, Polska Akademia Nauk | Rekombinowana molekuła DNA, wektor, komórka oraz materiał roślinny dostarczający duże ilości enzymatycznie aktywnej syntazy cysteinowej, oraz ich zastosowanie |
| CN102741415A (zh) | 2010-02-02 | 2012-10-17 | 拜尔农科股份公司 | 使用hppd抑制剂作为选择剂的大豆转化 |
| WO2012029727A1 (fr) | 2010-08-31 | 2012-03-08 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Algue dans laquelle la production de produits photosynthétiques est améliorée, et utilisation pour ladite algue |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997015673A1 (fr) * | 1995-10-26 | 1997-05-01 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Procedes de preparation de o-acetylserine, l-cysteine et produits apparentes a la l-cysteine |
| WO1998055601A2 (fr) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymes de biosynthese d'acides amines d'origine vegetale |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6338966B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-01-15 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Genes encoding sulfate assimilation proteins |
-
1998
- 1998-12-17 FR FR9816163A patent/FR2787466B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-12-16 AR ARP990106473A patent/AR028807A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-12-17 EP EP99961099A patent/EP1141349A1/fr not_active Withdrawn
- 1999-12-17 AU AU17830/00A patent/AU773031B2/en not_active Ceased
- 1999-12-17 CA CA002355255A patent/CA2355255A1/fr not_active Abandoned
- 1999-12-17 BR BR9916968-1A patent/BR9916968A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-12-17 WO PCT/FR1999/003179 patent/WO2000036127A1/fr not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997015673A1 (fr) * | 1995-10-26 | 1997-05-01 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Procedes de preparation de o-acetylserine, l-cysteine et produits apparentes a la l-cysteine |
| WO1998055601A2 (fr) * | 1997-06-06 | 1998-12-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymes de biosynthese d'acides amines d'origine vegetale |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002060939A2 (fr) * | 2001-02-02 | 2002-08-08 | Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung | Procede pour augmenter la concentration de composes sulfures dans des plantes |
| WO2002060939A3 (fr) * | 2001-02-02 | 2003-01-03 | Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik | Procede pour augmenter la concentration de composes sulfures dans des plantes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR028807A1 (es) | 2003-05-28 |
| FR2787466B1 (fr) | 2001-02-16 |
| WO2000036127A1 (fr) | 2000-06-22 |
| AU1783000A (en) | 2000-07-03 |
| EP1141349A1 (fr) | 2001-10-10 |
| AU773031B2 (en) | 2004-05-13 |
| CA2355255A1 (fr) | 2000-06-22 |
| BR9916968A (pt) | 2002-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1537216B1 (fr) | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree | |
| EP1186666B1 (fr) | Utilisation d'inhibiteurs d' hydroxylphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) comme agents de sélection dans la transformation de plantes | |
| EP0507698B1 (fr) | Promoteurs d'histone | |
| CA2242903C (fr) | Proteines de reserve de plantes enrichies en acides amines, notamment .gamma.-zeine de mais enrichie en lysine, plantes exprimant ces proteines | |
| CA2832834C (fr) | Molecules d'adn synthetique servant a l'expression d'une proteine d'interet | |
| WO2005071091A1 (fr) | Methode pour modifier l'expression genique d'un champignon phytopathogene | |
| FR2787466A1 (fr) | Procede pour augmenter la teneur en cysteine, methionine et glutathion chez les plantes et plantes obtenues | |
| WO1999025842A1 (fr) | Gene chimere ayant un promoteur lumiere dependant conferant la tolerance aux inhibiteurs de l'hppd | |
| FR2913694A1 (fr) | Elements regulateurs d'expression | |
| EP1539969B1 (fr) | Peptide d adressage plastidial | |
| EP1153135B1 (fr) | Procedes permettant de moduler les taux de composes organiques contenant du soufre dans des plantes | |
| FR2848570A1 (fr) | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant | |
| EP1244792B1 (fr) | Procede d'obtention de plantes a teneur enrichie en cysteine et glutathion | |
| WO2002000890A1 (fr) | Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications | |
| EP1315801A1 (fr) | Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptidesignal, sequence d 'adn et obtention de plantes contenant un tel gene,tolerantes aux herbicides | |
| FR2796954A1 (fr) | Hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase fusionnee a un peptide signal, sequence d'adn et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides | |
| FR2815971A1 (fr) | Promoteur de plante dirigeant fortement l'expression des genes dans les fruits |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20060831 |