DE69935225T2

DE69935225T2 - Expression von herbizidtoleranzgenen in pflanzenplastiden

Info

Publication number: DE69935225T2
Application number: DE69935225T
Authority: DE
Inventors: Peter Chesterfield HAJDUKIEWICZ; Kevin E. Davis McBRIDE; Narender Chesterfield NEHRA; David J. Davis SCHAAF; David M. Woodland STALKER; Jeffrey M. Wildwood STAUB; Guangning Ellisville YE
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1998-07-10
Filing date: 1999-07-10
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-07-11
Also published as: AR020110A1; DE69935225D1; WO2000003022A9; JP2002520024A; ATE354660T1; BR9912498A; MXPA01000372A; EP1097223A2; CA2332700A1; EP1097223B1; WO2000003022A3; ES2281183T3; WO2000003022A2

Description

Fachgebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von gentechnischen Methoden auf Pflanzen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Verstärkung der Expression von Proteinen in Pflanzenplastiden.
Hintergrund
Die Plastiden höherer Pflanzen sind ein attraktiver Angriffspunkt für die Gentechnik. Pflanzenplastiden (Chloroplasten, Amyloplasten, Elaioplasten, Etioplasten, Chromoplasten usw.) sind die hauptsächlichen Biosynthesezentren, die neben der Photosynthese auch für die Produktion von industriell wichtigen Verbindungen, wie Aminosäuren, komplexen Kohlenhydraten, Fettsäuren und Pigmenten, verantwortlich sind. Plastiden stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab, der als Proplastid bekannt ist, und daher haben die in einer gegebenen Pflanzenspezies vorhandenen Plastiden alle denselben genetischen Gehalt. Pflanzenzellen enthalten 500 bis 10 000 Kopien eines kleinen, 120-160 Kilobasen großen zirkulären Genoms, von denen jedes Molekül eine große (ungefähr 25 kb) invertierte Sequenzwiederholung aufweist. Somit ist es möglich, Pflanzenzellen so zu gestalten, dass sie bis zu 20 000 Kopien eines bestimmten interessierenden Gens enthalten, das potentiell zu sehr hohen Niveaus der Fremdgen-Expression führen kann. Außerdem werden die Plastiden der meisten Pflanzen maternal vererbt. Folglich werden in Plastiden exprimierte heterologe Gene im Unterschied zu heterologen Genen, die im Zellkern expri miert werden, nicht über Pollen verbreitet, und daher wird eine in ein Pflanzenplastid eingeführte Eigenschaft nicht auf Wildtypverwandte übertragen.
Es besteht immer noch ein Bedürfnis nach verbesserten regulatorischen Elementen für die Expression von Genen in einem Pflanzenplastid. Bisher stammen die Expressionssignale, die routinemäßig für die Expression von Transgenen in einem Plastid verwendet werden, aus endogenen Plastidgenen. Die Plastid-Expressionssignale stammen typischerweise von Promotorbereichen von hochgradig exprimierten Plastidgenen, wie den Promotorbereichen aus dem 16S-ribosomalen RNA-Operon (Prrn), dem psbA-Gen (PpsbA) oder dem rbcL-Gen (PrbcL). Das psbA- und das rbcL-Gen werden hochgradig transcribiert, aber ihre Translation wird von gewebespezifischen und lichtregulierten Faktoren gesteuert, die ihren Nutzen einschränken. Im Falle von Prrn wird typischerweise eine nach dem Plastid-rbcL-Genleader platzierte synthetische Ribosomenbindungsstelle (RBS) verwendet, um die Translation zu steuern. Dieses Prrn/RBS wird aufgrund von schlechter Ribosomenbindung jedoch ineffizient translatiert.
Ein völlig heterologes Expressionssystem wird verwendet, um Plastidgene zu exprimieren (USPN 5,576,198). Dieses System ist ein zweikomponentiges System. Die erste Komponente ist ein Plastid-Transgen, das von einer T7-Bakteriophagen-Gen-10-Promotor/Leader-Sequenz gesteuert wird. Die zweite Komponente ist ein Zellkerngen, das die T7-Polymerase codiert, die zum Plastidkompartiment gesteuert wird. Die Beschränkung dieses Systems besteht in der Notwendigkeit, zellkerntransformierte Linien zu schaffen, die die T7-Polymerase bevorzugt exprimieren.
Plastiden von höheren Pflanzen stellen einen attraktiven Angriffspunkt für die Gentechnik dar. Wie oben erwähnt, werden Plastiden höherer Pflanzen maternal vererbt. Dies bietet einen Vorteil für die gentechnische Veränderung von Pflanzen in Bezug auf Toleranz oder Resistenz gegen natürliche oder chemische Bedingungen, wie Herbizidtoleranz, da diese Eigenschaften nicht auf Wildtypverwandte übertragen werden. Außerdem ist das hohe Niveau der Fremdgen- Expression attraktiv für gentechnisch eingeführte Eigenschaften, wie die Produktion von pharmazeutisch wichtigen Proteinen.
Die Expression von Nucleinsäuresequenzen, die für Enzyme, welche für eine Herbizidtoleranz sorgen, sowie für pharmazeutische Proteine codieren, aus dem Pflanzenplastidgenom bietet eine attraktive Alternative zur Expression aus dem Pflanzenzellkerngenom.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuresequenzen bereit, die geeignet sind, um die Expression eines bestimmten EPSPS-Gens in Pflanzenplastiden zu verstärken. Weiterhin werden Plastidexpressionskonstrukte bereitgestellt, die für die gentechnische Veränderung von Pflanzenzellen geeignet sind und die für eine verstärkte Expression des EPSP-Synthase-Proteins in Pflanzenzellenplastiden sorgen. Die transformierten Plastiden sollten metabolisch aktive Plastiden sein und werden vorzugsweise in einer hohen Kopienzahl in dem interessierenden Pflanzengewebe gehalten, am meisten bevorzugt sind es die Chloroplasten, die man in grünen Pflanzengeweben, wie Blättern oder Keimblättern, findet.
Die Plastidexpressionskonstrukte zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen eine Plastid-Promotorsequenz des 16S-ribosomalen RNA-Operon (Prrn), das für eine verstärkte Expression der DNA-Sequenz, die das EPSPS-Protein codiert, sorgen kann, und einen Transcriptionsterminationsbereich, der die Transcription in einem Pflanzenplastid beenden kann.
Der Plastid-Promotorbereich der vorliegenden Erfindung ist mit der Ribosomenbindungsstelle des T7-Bakteriophagen-Polymerase-Gen-10-Leaders verknüpft, die für eine verstärkte Translation von mRNA-Transcripten in einem Pflanzenplastid sorgt.
Das Plastidexpressionskonstrukt dieser Erfindung ist vorzugsweise mit einem Konstrukt verknüpft, das eine DNA-Sequenz aufweist, die einen Selektionsmar ker codiert, der in einem Pflanzenplastid exprimiert werden kann. Die Expression des Selektionsmarkers ermöglicht die Identifizierung von Pflanzenzellen, die ein Plastid umfassen, das den Marker exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhalten Vektoren für die Übertragung des Konstrukts in eine Pflanzenzelle ein Mittel zum Einsetzen der Expressions- und Selektionskonstrukte in das Plastidgenom. Dieses umfasst vorzugsweise Bereiche der Homologie mit dem Zielplastidgenom, die die Konstrukte flankieren.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen eine Promotorsequenz, wie sie oben definiert ist, welche verknüpft ist mit einer Ribosomenbindungsstelle, wie sie oben definiert ist, welche die Translation von mRNA-Transcripten im Pflanzenplastid verstärken kann.
Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist das hohe Expressionsniveau von bestimmten EPSPS-Nucleinsäuresequenzen in Pflanzenplastiden.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die für eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase codiert (USPN 5,633,435).
Pflanzenzellplastiden, die die Konstrukte enthalten, werden in der Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen, ebenso wie Pflanzen, Pflanzensamen, Pflanzenzellen oder deren Nachkommen, die Plastide enthalten, welche das Konstrukt umfassen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren für die verstärkte Expression von DNA-Sequenzen in Pflanzenplastiden.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren für die verstärkte Expression eines Enzyms, das einer Pflanzenzelle Herbizidtoleranz verleiht, durch Exprimieren von Agrobacterium-tumefaciens-sp-Stamm-CP4-EPSPS in Plastiden der Pflanzenzelle.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein chimärisches Gen, das eine bestimmte Herbizidtoleranz-codierende Sequenz enthält, auf einen Pflanzenplastid-Expressionsvektor, der einen prrn-Promotor enthält, der funktionell mit einer T7-Bakteriophagen-Polymerase-Gen-10-Ribosomenbindungsstelle verknüpft ist, die zu einer verstärkten Expression in einem Pflanzenplastid befähigt ist und funktionell mit einem Herbizidtoleranz- oder Pharmazeutikumcodierenden Gen verknüpft ist, auf einen Pflanzentransformationsvektor, in den ein bestimmtes Herbizidtoleranz-Gen eingesetzt ist, das ausgehend von einem Plastidpromotor exprimiert wird, der mit einer T7-Bakteriophagen-Polymerase-Gen-10-Ribosomenbindungsstelle verknüpft ist, auf Pflanzenzellen, die unter Verwendung solcher Vektoren transformiert sind, und auf daraus regenerierte Pflanzen, die einen wesentlichen Grad der Expression von Nucleinsäuresequenzen und Proteinen aufweisen, und auf Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen und auf solche Pflanzen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nucleotidsequenz der G10L-Ribosomenbindungsstelle.
2 gibt eine Aminosäuresequenz an, die für Aprotinin codiert.
3 gibt die Ergebnisse einer RP-HPLC-Analyse zur Charakterisierung von in dem Plastid exprimiertem hGH-Protein an. Peak I (höchster Peak) zeigt die erwartete Retentionszeit für richtig gefaltetes natives 22-kDa-GP2000 an.
4 gibt eine Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie(MS)-Analyse unter Verwendung eines Micromass-Q-Tof-Elektrospray-Time-of-Flight-Massenspektrometers an. Insbesondere wird eine Reihe von Ionen angegeben, die der in der Probe vorhandenen Spezies mit unterschiedlichen Zahlen daran gebundener Protonen entspricht. Die Achsen des Spektrums geben die Intensität bzw. das Masse-Ladungs-Verhältnis der vorhandenen Spezies an.
5 gibt eine graphische Darstellung der Bioaktivität von ausgehend von einem Pflanzenplastid exprimiertem hGH an. Die auf der Graphik dargestellten Proben sind bovines Prolactin (bPL), aus E. coli exprimiertes hGH (Ala-hGH) und ein Nulltransgen, das mit bovinem Prolactin gespiket ist (SPFF Null Spike), als positive Kontrollen, ein Nulltransgen (SPFF Null) als negative Kontrolle sowie transgene Proben aus einer Sepharosesäule (SPFF Sample, SPFF Sample) und eine transgene Probe, die bei pH 3,5 aus der Sepharosesäule eluiert wurde (SPFF pH 3,5 Eln).
6 gibt die Nucleinsäuresequenz für den prrn/G10L-Promotor/RBS-Hybriden an. Der Prrn-Promotor enthält die Consensus-Plastid-(-35)- und -(-10)-Promotorelemente (unterstrichen) und die Transcriptionsstartstellen (halbfett gedruckte GC) für die plastidcodierte RNA-Polymerase (PEP). Der Gen-10-Leader (G10L) enthält eine perfekte Plastidribosomenbindungsstelle (RBS, halbfett gedruckte Nucleotide).
7 gibt die Nucleinsäuresequenz für die Prrn/NEP/G10L::14aaGFP-Fusion an. Der NEP-Promotorbereich ist unterstrichen (halbfett gedruckte A in Transcriptionsstartstelle). Der verwendete NEP-Promotorbereich erstreckt sich sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des Promotors über die Consensussequenz hinaus. Das Startcodon ATG, das einleitende Methionin, ist in den 14 Aminosäuren von GFP nicht mitgezählt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Plastidexpressionskonstrukte bereitgestellt, die im Allgemeinen einen in einem Pflanzenplastid funktionierenden Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, die vom T7-Bakteriophagen-Polymerase-Gen-10-Leader abgeleitet ist, eine DNA-Sequenz, die eine bestimmte EPSPS codiert, und einen Transcriptionsterminationsbereich, der die Transcription in einem Pflanzenplastid beenden kann, umfassen. Diese Elemente werden als funktionell miteinander verknüpfte Komponenten in der 5'→3'-Transcriptionsrichtung bereitgestellt.
Weiterhin können die Konstrukte der vorliegenden Erfindung auch eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ein Peptid codiert, das die DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, in das Thylakoidlumen innerhalb des Chloroplasten steuern kann.
Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Plastidexpressionskonstrukte zur Steuerung der auf hohem Niveau erfolgenden Transcription und Translation (Expression) von Nucleinsäuresequenzen. Solche Plastidexpressionskonstrukte finden Verwendung bei der Steuerung der auf hohem Niveau erfolgenden Expression von DNA-Sequenzen, die für bestimmte EPSPS-Enzyme codieren, die an der Herbizidtoleranz beteiligt sind.
Von ganz besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Plastidexpressionskonstrukte zur Steuerung der auf hohem Niveau erfolgenden Translation von transcribierter mRNA.
DNA-Sequenz und biochemische Daten zeigen eine Ähnlichkeit der Transcriptions- und Translationsmaschinerien und Initiationssignale des Plastidorganells mit denjenigen, die man in prokaryontischen Systemen findet. Tatsächlich wurde berichtet, dass aus Plastiden stammende Promotorsequenzen die Expression von Reportergenen in prokaryontischen Zellen steuern. Außerdem sind Plastidgene häufig zu polycistronischen Operons organisiert, wie bei Prokaryonten.
Trotz der offensichtlichen Ähnlichkeiten zwischen Plastiden und Prokaryonten gibt es auch fundamentale Unterschiede in den Verfahren, die zur Steuerung der Genexpression in Plastiden und Prokaryonten verwendet werden. Im Gegensatz zu den Transcriptionssteuerungsmechanismen, die typischerweise in Prokaryonten beobachtet werden, wird die Expression von Plastidgenen vorwiegend auf dem Niveau der Translation und der mRNA-Stabilität durch trans-agierende zellkerncodierte Proteine gesteuert.
Die Translation ist ein mehrstufiger Vorgang, der zuerst die Bindung von Messenger-RNA (mRNA) an Ribosomen beinhaltet. Beginnend am Translationsstartcodon werden die mRNA-Codons nacheinander abgelesen, während sich die Ribosomen an dem mRNA-Molekül entlang bewegen. Dann werden die spezifizierten Aminosäuren nacheinander an die wachsende Polypeptidkette addiert, was das in der mRNA codierte Protein oder Polypeptid ergibt.
Wie erwähnt, ist der erste Schritt im Translationsvorgang die Bindung des mRNA-Moleküls an das Ribosom. Die Natur dieser Wechselwirkung (d.h. Bindung) wurde erst teilweise aufgeklärt. Analysen von RNase-resistenten Oligonucleotiden, die aus bakteriellen Translationsstartkomplexen isoliert wurden, deuten darauf hin, dass ein RNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 30 bis 40 Nucleotiden die Startribosomenbindungsstelle (RBS) umfasst. Eine RBS wird also im Folgenden so verstanden, dass sie eine mRNA-Sequenz umfasst, die das Translationsstartcodon umgibt, das für die Bindung des Ribosoms und für den Start der Translation verantwortlich ist.
Vor kurzem wurden Ribosomenbindungsstellen identifiziert, die die Translation in Prokaryonten steuern können. Zum Beispiel wurde eine Ribosomenbindungsstelle identifiziert, die vom T7-Bakteriophagen-Gen-10-Leader G10L abgeleitet ist (USPN 5,232,840) und die Expression von Nucleinsäuresequenzen in Prokaryonten verstärkt.
Herbizide, wie N-Phosphonomethylglycin, halogenierte Hydroxybenzonitrile und Norflurazon, sind Gegenstand einer großen Menge von Forschungen.
N-Phosphonomethylglycin, das üblicherweise als Glyphosat bezeichnet wird, hemmt den Shikimisäure-Weg, der zur Biosynthese von aromatischen Verbindungen einschließlich Aminosäuren, Pflanzenhormonen und Vitaminen führt. Insbesondere kurbelt Glyphosat die Umwandlung von Phosphoenolpyruvinsäure (PEP) und 3-Phosphoshikimisäure zu 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäure an, indem es das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (im Folgenden als EPSP-Synthase oder EPSPS bezeichnet) hemmt.
Glyphosattolerante Pflanzen werden durch Einführung von verschiedenen EPSP-Synthase-Genen durch Transformation in das Zellkerngenom einer Pflanze hergestellt. Ein Gen für EPSP-Synthase wurde aus dem Agrobacterium-tumefaciens-sp-Stamm CP4 (USPN 5,633,435) kloniert und verleiht Pflanzen ein hohes Niveau an Glyphosattoleranz. Weiterhin wurden in mehreren Kulturpflanzen hohe Niveaus der Glyphosattoleranz erreicht, indem man EPSPS für die gelenkte Expression in Plastiden mit einem Chloroplastentransitpeptid (CTP) fusionierte. Außerdem wurden Varianten des Wildtyp-EPSPS-Enzyms isoliert, die infolge von Veränderungen in der EPSPS-aminosäurecodierenden Sequenz glyphosattolerant sind (Kishore und Shah, Ann. Rev. Biochem. (1988) 57: 627-663; Shulze et al., Arch. Microbiol. (1984) 137: 121-123; Kishore et al., Fed. Proc. (1986) 45: 1506). Diese Varianten haben typischerweise ein höheres K_i für Glyphosat als das Wildtyp-EPSPS-Enzym, das für den glyphosattoleranten Phänotyp sorgt, aber diese Varianten sind auch durch ein hohes Km für PEP charakterisiert, so dass das Enzym kinetisch weniger effizient ist (Kishore und Shah, Ann. Rev. Biochem. (1988) 57: 627-663; Sost et al., FEBS Lett. (1984) 173: 238-241; Shulze et al., Arch. Microbiol. (1984) 137: 121-123; Kishore et al., Fed. Proc. (1986) 45: 1506; Sost und Amrhein, Arch. Biochem. Biophys. (1990) 282: 433-436).
Während Pflanzen, die so transformiert wurden, dass sie für solche Enzyme codierende Nucleinsäuresequenzen ausgehend vom Zellkerngenom exprimieren, Anwendung bei der gentechnischen Produktion von herbizidtoleranten Pflanzen fanden, wäre es zunehmend günstig, herbizidtolerante Pflanzen über Plastidexpression zu erhalten.
In den hier angegebenen Beispielen werden DNA-Sequenzen, die für an Herbizidtoleranz beteiligte Enzyme codieren, in Konstrukten verwendet, um die vom Pflanzenplastid ausgehende Expression der Sequenzen zu steuern. DNA-Sequenzen, die für 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) codieren, werden in den Expressionskonstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet, um die vom Pflanzenplastid ausgehende Expression der Herbizidtoleranz-Nucleotidsequenzen zu steuern.
Transplastomische Tabakpflanzen werden identifiziert, die homoplasmisch für die interessierenden DNA-Sequenzen sind, welche die Herbizidtoleranz-Gene codieren. Homoplasmische Pflanzen zeigen ein hohes Niveau der vom Pflanzenplastid ausgehenden Proteinexpression. Weiterhin zeigen homoplasmische Pflanzen ein hohes Niveau der Toleranz gegenüber dem jeweiligen Herbizid. Wie es in dem folgenden Beispiel ausführlicher beschrieben ist, zeigen Pflanzen, die so transformiert sind, dass sie EPSPS ausgehend von einem Plastid exprimieren, zum Beispiel ein hohes Niveau der Toleranz gegenüber dem Herbizid Glyphosat.
Bei der Entwicklung der Konstrukte können die verschiedenen Fragmente, die die regulatorischen Bereiche und das offene Leseraster umfassen, verschiedenen Verarbeitungsbedingungen, wie Ligierung, Abbau mit Restriktionsenzymen, PCR, in-vitro-Mutagenese oder Zugabe von Linkern und Adaptoren, unterworfen werden. Mit der DNA, die in den regulatorischen Bereichen eingesetzt wird, oder den interessierenden DNA-Sequenzen zur Expression in den Plastiden können also Nucleotidtransitionen, -transversionen, -insertionen oder -deletionen durchgeführt werden. Verfahren zum Abbau mit Restriktionsenzymen, Klenow-Behandlungen für glatte Enden, Ligierungen und dergleichen sind dem Fachmann wohlbekannt und wurden zum Beispiel von Maniatis et al. beschrieben (in Molecular Cloning: A Laborstory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Während der Herstellung der Konstrukte werden die verschiedenen DNA-Fragmente häufig in einem geeigneten Klonierungsvektor kloniert, der die Amplifikation der DNA, Modifikation der DNA oder Manipulation der DNA durch Hinzufügen oder Entfernen von Sequenzen, Linkern oder dergleichen ermöglicht. Vorzugsweise sind die Vektoren zur Replikation bis zu wenigstens einer relativ hohen Kopienzahl in E. coli befähigt. Zum Klonieren sind mehrere Vektoren leicht erhältlich, einschließlich Vektoren wie pBR322, Vektoren der pUC-Reihe, die Vektoren der M13-Reihe und pBluescript-Vektoren (Stratagene; La Jolla, CA).
Um ein Mittel zum Selektieren der gewünschten Pflanzenzellen bereitzustellen, enthalten Vektoren für die Plastidentransformation typischerweise ein Konstrukt, das für die Expression eines Selektionsmarker-Gens sorgt. Marker-Gene sind pflanzenexprimierbare DNA-Sequenzen, die ein Polypeptid exprimieren, das einer natürlichen Hemmung durch Inhibitoren widersteht oder eine selektive Substanz, d.h. ein Antibiotikum oder Herbizid, dämpft oder inaktiviert.
Alternativ dazu kann ein Marker-Gen auch für irgendeine andere sichtbare Reaktion sorgen, d.h. ein erkennbares Erscheinungsbild oder Wachstumsmuster, im Vergleich zu Pflanzen oder Pflanzenzellen, die das Selektionsmarker-Gen nicht exprimieren, in Gegenwart einer bestimmten Substanz verursachen, die entweder direkt auf die Pflanze oder die Pflanzenzellen aufgebracht wird oder im Wachstumsmedium der Pflanze oder Pflanzenzelle vorliegt.
In beiden Fällen haben die Pflanzen oder Pflanzenzellen, die solche Selektionsmarker-Gene enthalten, einen für Identifikationszwecke erkennbaren Phänotyp, d.h. sie sind von nichttransformierten Zellen unterscheidbar. Der charakteristische Phänotyp ermöglicht die Identifizierung von Zellen, Zellgruppen, Geweben, Organen, Pflanzenteilen oder ganzen Pflanzen, die das Konstrukt enthalten.
Der Nachweis des Markerphänotyps ermöglicht die Auswahl von Zellen, die ein zweites Gen aufweisen, mit dem das Marker-Gen verknüpft wurde. Dieses zweite Gen umfasst typischerweise einen wünschenswerten Phänotyp, der sich in transformierten Zellen nicht leicht identifizieren lässt, der aber vorhanden ist, wenn die Pflanzenzellen oder ihr Abkömmling bis zur Reife wachsen gelassen wird, selbst unter Bedingungen, bei denen der Phänotyp des Selektionsmarkers selbst nicht erkennbar ist.
Die Verwendung eines solchen Markers zur Identifizierung von Pflanzenzellen, die ein Plastidenkonstrukt enthalten, ist beschrieben worden, Svab et al. (1993, a.a.O.). In den im Folgenden angegebenen Beispielen wird ein bakterielles aadA-Gen als Marker unter der regulatorischen Kontrolle des Chloroplasten-5'-Promotors und von 3'-Transcriptionsterminationsbereichen, insbesondere der regulatorischen Bereiche des psbA-Gens (beschrieben in Staub et al., EMBO J. (1993) 12(2): 601-606), exprimiert. Zahlreiche weiteren Promotorbereiche können ebenfalls verwendet werden, um die Expression des Selektionsmarker-Gens anzutreiben, einschließlich verschiedener Plastidenpromotoren und bakterieller Promotoren, von denen gezeigt wurde, dass sie in Pflanzenplastiden funktionieren.
Die Expression des aadA-Gens verleiht Resistenz gegen Spectinomycin und Streptomycin und ermöglicht somit die Identifizierung von Pflanzenzellen, die diesen Marker exprimieren. Das aadA-Genprodukt ermöglicht ein fortgesetztes Wachsen und Grünen von Zellen, deren Chloroplasten das Produkt des Selektionsmarker-Gens umfassen. Zellen, die das Produkt des Selektionsmarker-Gens nicht enthalten, werden gebleicht. Die Selektion anhand des aadA-Genmarkers beruht also auf der Identifizierung von Pflanzenzellen, die durch die Anwesenheit von Streptomycin oder besonders bevorzugt Spectinomycin im Pflanzenwachstumsmedium nicht gebleicht werden.
Mehrere Marker wurden zur Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt, wie Resistenz gegen Chloramphenicol, das Aminoglycosid G418 oder Hygromycin. Andere Gene, die ein am Chloroplastenstoffwechsel beteiligtes Produkt codieren, können ebenfalls als Selektionsmarker-verwendet werden. Zum Beispiel können Gene, die Resistenz gegen Pflanzenherbizide, wie Glyphosat, Bromoxynil oder Imidazolinon, verleihen, besondere Verwendung finden. Solche Gene wurden beschrieben (Stalker et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 4724-4728 (glyphosatresistentes EPSP); Stalker et al., J. Biol. Chem. (1985) 263: 6310-6314 (bromoxynilresistentes Nitrilase-Gen); und Sathasivan et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 2188 (AHAS-Imidazolinon-Resistenz-Gen)).
Die stabile Transformation von Tabakplastidengenomen durch Teilchenbeschuss wurde beschrieben (Svab et al. (1990, a.a.O.) und Svab et al. (1993, a.a.O.)). Die dort beschriebenen Verfahren können eingesetzt werden, um Pflanzen zu erhalten, die homoplasmisch für Plastidenexpressionskonstrukte sind.
Im Allgemeinen wird das beschossene Gewebe ungefähr 2 Tage lang auf einem die Zellteilung fördernden Medium kultiviert, und danach wird das Pflanzenge webe in ein Selektionsmedium übergeführt, das eine inhibitorische Menge des besonderen Selektionsmittels sowie die besonderen Hormone und anderen Substanzen enthält, die notwendig sind, um eine Regeneration dieser besonderen Pflanzenspezies zu erhalten. Dann werden Schösslinge auf demselben Selektionsmedium subkultiviert, um eine Produktion und Selektion von homoplasmischen Schösslingen zu gewährleisten.
Transplastomische Tabakpflanzen werden in Bezug auf eine reine Population von transformierten Plastidgenomen (homoplasmische Linien) analysiert. Die Homoplasmie wird durch Southern-Analyse bestätigt, wobei man Nucleinsäuresonden einsetzt, die einen Bereich des Transgens und das Chloroplastengenom (d.h. den Einfügungsbereich) überspannen. Transplastomische Pflanzen, die heteroplasmisch sind (d.h. ein Gemisch von Plastidgenomen enthalten, die das Transgen enthalten bzw. nicht enthalten), sind durch ein Hybridisierungsmuster von Wildtyp- und transgenen Banden charakterisiert. Homoplasmische Pflanzen zeigen ein Hybridisierungsmuster, dem die Wildtypbande fehlt.
Alternativ dazu kann Homoplasmie auch mit Hilfe von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestätigt werden. Es werden PCR-Primer verwendet, die so zielgesteuert werden, dass sie ausgehend von Sequenzen aus dem Einfügungsbereich amplifizieren. Zum Beispiel kann in einer PCR-Reaktion ein Paar von Primern verwendet werden. Ein Primer amplifiziert ausgehend von einem Bereich im Transgen, während der zweite Primer ausgehend von einem zum Einfügungsbereich proximalen Bereich hin zum Einfügungsbereich amplifiziert. Eine zweite PCR-Reaktion wird mit Hilfe von Primern durchgeführt, die so gestaltet sind, dass sie den Einfügungsbereich amplifizieren. Transplastomische Linien, die als homoplasmisch identifiziert wurden, produzieren in der ersten Reaktion das Fragment mit der erwarteten Größe, während sie in der zweiten Reaktion nicht das Fragment mit der erwarteten Größe produzieren.
Wenn Transformations- und Regenerationsverfahren für eine gegebene Pflanzenspezies angepasst wurden, entweder durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, Beschuss oder ein anderes Verfahren, können die etablierten Techniken zur Verwendung in Selektions- und Regenerationsverfahren zur Bildung von plastidtransformierten Pflanzen modifiziert werden. Zum Beispiel lassen sich die hier für Tabak beschriebenen Verfahren leicht an andere Nachtschattengewächse, wie Tomate, Petunie und Kartoffel, anpassen.
Zur Transformation von Soja wurden Teilchenbeschuss- sowie Agrobacteriumvermittelte Zellkerntransformations- und -regenerationsvorschriften beschrieben (Hinchee et al., USPN 5,416,011, und Christou et al., USPN 5,015,580). Der Fachmann wird anerkennen, dass für die Sojatransformation beschriebene Vorschriften verwendet werden können.
Bei Brassica beinhalten die Anweisungen für die Agrobacterium-vermittelte Transformation und Regeneration im Allgemeinen die Verwendung von Hypokotylgewebe, eines nichtgrünen Gewebes, das einen geringen Plastidengehalt aufweisen könnte. Bevorzugte Zielgewebe für Brassica wären also von Mikrosporen abgeleitete Hypokotyl- oder Kotyledonargewebe (die grün sind und daher zahlreiche Plastiden enthalten) oder Blattgewebeexplantate. Während die Regenerationsgeschwindigkeiten von solchen Geweben gering sein können, sind keine positionalen Effekte, wie man sie bei der Agrobacterium-vermittelten Transformation beobachtet, zu erwarten, und daher wäre es nicht notwendig, zahlreiche erfolgreich transformierte Pflanzen zu durchmustern, um einen gewünschten Phänotyp zu erhalten.
Für Baumwolle wurde die Transformation von Keimblättern von Gossypium hirsutum L. durch Cokultivierung mit Agrobacterium tumefaciens von Firoozabady et al., Plant Mol. Bio. (1987) 10: 105-116, und Umbeck et al., Bio/Technology (1987) 5: 263-266, beschrieben. Wiederum kann dieses Gewebe wie bei Brassica einen für die Chloroplastentransformation unzureichenden Plastidengehalt haben. Wie bei Brassica kann also ein alternatives Verfahren für die Transformation und Regeneration von alternativem Zielgewebe, das Chloroplasten enthält, wünschenswert sein, zum Beispiel das Ansteuern von grünem embryogenem Gewebe.
Weitere Pflanzenspezies können unter Verwendung verwandter Techniken in ähnlicher Weise transformiert werden. Alternativ dazu können auch Mikroprojektil-Beschussverfahren, wie sie von Klein et al. (Bio/Technology 10: 286-291) beschrieben werden, verwendet werden, um zellkerntransformierte Pflanzen zu erhalten, die die hier beschriebenen viralen Einzel-Untereinheit-RNA-Polymerase-Expressionskonstrukte umfassen. Die Transformation von Baumwolle durch Teilchenbeschuss ist in WO 92/15675 beschrieben, das am 17. September 1992 veröffentlicht wurde. Zu den geeigneten Pflanzen für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung gehören unter anderem Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Raps, Flachs, Tomate, Zuckerrübe, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Mais, Weizen, Reis und Kopfsalat.
Die Vektoren zur Verwendung in der Plastidentransformation enthalten vorzugsweise Mittel zur Gewährleistung einer stabilen Übertragung des Plastidenexpressionskonstrukts und Selektionsmarker-Konstrukts in das Plastidengenom. Dies wird am zweckmäßigsten durch Bereiche der Homologie mit dem Zielplastidengenom erreicht. Die Homologiebereiche flankieren das zu übertragende Konstrukt und sorgen für eine Übertragung auf das Plastidengenom durch homologe Rekombination über einen doppelten Crossover in das Genom. Die vollständige DNA-Sequenz des Plastidengenoms von Tabak ist beschrieben worden (Shinozaki et al. (1986) EMBO J. 5: 2043-2049). Vollständige DNA-Sequenzen der Plastidengenome von Lebermoos (Ohyama et al. (1986) Nature 322: 572-574) und Reis (Hiratsuka et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217: 185-194) wurden ebenfalls beschrieben.
Wenn sich die Homologiebereiche in den Bereichen der invertierten Sequenzwiederholungen des Plastidengenoms (als IRA und IRB bekannt) befinden, werden zwei Kopien des Transgens pro transformiertem Plastid erwartet. Wenn sich die Homologiebereiche außerhalb der Inverted-Repeat-Bereiche des Plastidgenoms befinden, wird eine Kopie des Transgens pro transformiertem Plastid erwartet. Die Homologiebereiche innerhalb des Plastidengenoms haben eine Größe von ungefähr 1 kb. Kleinere Homologiebereiche können ebenfalls verwendet werden, und bereits 100 bp können für eine homologe Rekombination in das Plastidenge nom sorgen. Die Häufigkeit der Rekombination und somit die Häufigkeit der Gewinnung von Pflanzen mit transformierten Plastiden nimmt jedoch mit sinkender Größe der Homologiebereiche ab.
Beispiele für Konstrukte mit Homologiebereichen im Plastidengenom werden bei Svab et al. (1990, a.a.O.), Svab et al. (1993, a.a.O.) und Zoubenko et al. (Nuc Acid Res (1994) 22(19): 3819-3824) beschrieben.
Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist, werden Konstrukte beschrieben, die für eine verstärkte Expression von DNA-Sequenzen in Pflanzenplastiden sorgen. Promotor/Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen, die eingesetzt werden, um die Expression in Pflanzenplastiden zu steuern, sind Promotorsequenzen des 16S-ribosomalen RNA-Operons (Prrn), die mit einer Ribosomenbindungsstelle (RBS) verknüpft sind, welche von der T7-Bakteriophagen-Gen-10-Leadersequenz (G10L) abgeleitet ist. DNA-Sequenzen, die unter der regulatorischen Kontrolle der Prrn/G10L-Sequenz exprimiert werden, zeigen ein signifikant höheres Niveau der Proteinexpression als solche Niveaus, die unter der Kontrolle anderer Promotor/RBS-Kombinationen erhalten wurden, während die Expression von mRNA in diesen Pflanzen höher sein kann oder auch nicht.
In den folgenden Beispielen werden Nucleinsäuresequenzen, die CP4-EPSP-Synthase codieren (USPN 5,633,435), in Expressionskonstrukte für die Expression von EPSP-Synthase-Enzym ausgehend von dem Pflanzenplastid platziert. Die hergestellten Konstrukte verwenden eine Ribosomenbindungsstelle, die nach dem T7-Bakteriophagen-Gen-10-Leader (G10L) entworfen ist, um die Expression von Nucleinsäuresequenzen in dem Pflanzenplastid zu erhöhen.
Plastidexpressionskonstrukte, die für die Expression von EPSPS codieren, werden über einen Chloroplastentransformationsvektor eingeführt.
Tabaklinien, die die native codierende Sequenz zu dem EPSPS-Enzym enthalten, das in Plastiden unter der Kontrolle der Prrn/G10L-Promotor/Ribosomenbin dungsstellen-Sequenz exprimiert wird, zeigen ein signifikant höheres Niveau der Proteinexpression als die Niveaus, die von EPSPS erhalten werden, das unter der Kontrolle der Prrn/rbcL-RBS-Sequenz exprimiert wird. EPSPS-mRNA wird jedoch in Pflanzen, die CP4-EPSPS ausgehend vom Plastid unter der Kontrolle des Prrn/rbcL(RBS) exprimieren, auf einem höheren Niveau exprimiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Translation ausgehend von Transcripten, die die T7-Bakteriophagen-Gen-10-Ribosomenbindungsstelle enthalten, effizienter ist. Außerdem sorgen Proteinexpressionsniveaus von EPSPS, das von transplastomischen Tabaklinien erhalten wurde, die EPSPS unter der Kontrolle des Prrn/G10L-RBS exprimieren, für ein höheres Niveau der Glyphosattoleranz.
Weiterhin zeigen transplastomische Tabaklinien, die so transformiert sind, dass sie hGH unter der Kontrolle der Prrn/G10L-Promotor/Ribosomenbindungsstellen-Sequenz exprimieren, ein signifikant höheres Niveau der Proteinexpression als die Niveaus, die von hGH erhalten werden, das unter der Kontrolle der PpsbA-Promotor/RBS-Sequenz exprimiert wird.
Bei Konstrukten, die die Prrn/G10L-Ribosomenbindungsstelle für die Expression von EPSPS verwenden, können Erhöhungen der Proteinexpressionsniveaus auf wenigstens ungefähr das 200-fache gegenüber den Expressionsniveaus, die man bei anderen Promotor/RBS-Kombinationen für die Plastidexpression erhält, erhalten werden. Außerdem können Proteinniveaus, die bei Plastidexpressionskonstrukten erhalten werden, die die Prrn/G10L-Promotor/RBS-Sequenz verwenden, 50- bis 3500-fach höhere Niveaus akkumulieren als bei Zellkernexpressionskonstrukten. Der Einschluss der G10L-Ribosomenbindungsstelle in Plastidexpressionskonstrukten kann also Verwendung finden, um die Niveaus der von Pflanzenplastiden ausgehenden Proteinexpression zu erhöhen.
Weiterhin können die Konstrukte der vorliegenden Erfindung auch Sequenzen beinhalten, um das exprimierte Protein in einen bestimmten suborganellären Bereich zu lenken, zum Beispiel das Thylakoidlumen des Chloroplasten. Wie in den folgenden Beispielen beschrieben ist, lenkt eine Nucleotidsequenz, die ein Peptid von dem Plastidgenom-Cytochrom f codiert, das exprimierte Aprotinin- Protein zum Beispiel zur Thylakoidmembran. Eine solche Zielsteuerung von exprimierten Proteinen kann für eine Kompartimentierung des Proteins sorgen, was eine erhöhte oxidative Stabilität und richtige Proteinfaltung ermöglicht.
Die Konstrukte und Verfahren der vorliegenden Erfindung sorgen also für ein Mittel zur Gewinnung von transplastomischen Pflanzen mit einem hohen Niveau der Herbizidtoleranz. Zu den hohen Niveaus der Toleranz gehört die Toleranz von vegetativem Gewebe, wenn Mengen von mehr als etwa 454 g (etwa 16 oz)/acre Glyphosat aufgebracht werden, vorzugsweise mehr als etwa 907 g (etwa 32 oz)/acre, besonders bevorzugt mehr als etwa 1,81 kg (etwa 64 oz)/acre, am meisten bevorzugt mehr als etwa 3,63 kg (etwa 128 oz)/acre. Weiterhin kann zu den hohen Niveaus der Toleranz auch eine Toleranz von reproduktiven Geweben gehören, wenn Mengen von mehr als etwa 454 g (etwa 16 oz)/acre Glyphosat aufgebracht werden, vorzugsweise mehr als etwa 907 g (etwa 32 oz)/acre, am meisten bevorzugt mehr als etwa 1,81 kg (etwa 64 oz)/acre.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verständlich.
Beispiele
Beispiel 1. Expressionskonstrukte
Konstrukte und Verfahren zur Verwendung beim Transformieren der Plastiden von höheren Pflanzen sind beschrieben bei Zoubenko et al. (Nuc Acid Res (1994) 22(19): 3819-3824), Svab et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87: 8526-8530 und Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 913-917) sowie Staub et al. (EMBO J. (1993) 12: 601-606). Konstrukte und Verfahren zur Verwendung beim Transformieren von Plastiden höherer Pflanzen, so dass sie DNA-Sequenzen unter der Kontrolle einer zellkerncodierten, zum Plastid gelenkten T7-Polymerase exprimieren, sind im US-Patent Nr. 5,576,198 beschrieben. Die vollständigen DNA-Sequenzen des Plastidgenoms von Tabak sind bei Shinozaki et al. (EMBO J. (1986) 5: 2043-2049) angegeben. Alle Bezugnahmen auf Plastid-DNA in der folgenden Beschreibung beziehen sich auf die Nucleotidnummer aus Tabak.
Die vollständige Nucleotidsequenz, die das Tabak-Cytochrom f codiert (petA), ist beschrieben bei Bassham et al. (1991) J Biol Chem 266: 23606-23610 und Konishi et al. (1993) Plant Cell Physiol 34: 1081-1087.
1A. Promotor/Ribosomenbindungsstelle-Sequenzen Der Promotorbereich des Plastid-16S-ribosomalen RNA-Operons (Prrn) ist so mit einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle (RBS), die auf dem Plastid-rbcL-Genleader angeordnet ist, verknüpft, dass das Prrn/rbcLRBS-Fragment entsteht. Die Prrn/rbcLRBS-Sequenz entspricht der Beschreibung bei Svab et al. (1993, a.a.O.) für das Prrn/rbcL(S)-Fragment.
Der Promotorbereich der Plastid-psbA-Promotor- (PpsbA) und Terminatorsequenzen (TpsbA) sind bei Staub et al. (1993, EMBO J., 12, 601-606) beschrieben.
Die Prrn/G10L-Sequenz wurde aufgebaut, indem man zwei Oligonucleotidsequenzen, T7lead1 und T7lead2 (Tabelle 1) miteinander assoziierte, so dass die G10L-Plastid-Ribosomenbindungsstelle entstand (1). Die G10L-Sequenz wurde als EcoRI/NcoI-Fragment mit dem 3'-Terminus der Prrn-Promotorsequenz ligiert, wobei die Prrn/G10L-Sequenz entstand. Tabelle 1
Chimärische Gene werden vorzugsweise in den Expressionsvektor eingesetzt, um ihre vom Prrn-Promotor ausgehende Transcription zu steuern. Im Plastidgenom werden also chimärische Gene ausgehend vom Prrn/RBS-Promotor oder dem Prrn/G10L-Promotor im Pflanzenplastid transcribiert. Die Nucleinsäuresequenz der Prrn/G10L-Fusion ist in 6 angegeben.
1B. CP4-EPSPS-Plastidexpressionskonstrukte
Ein Plastidexpressionsvektor pMON30117 wird aus einem Vorläufervektor pPRV111B (Zoubenko et al. 1994, a.a.O., GenBank-Zugriffs-Nr. U12813) aufgebaut. Der Vektor pMON30117 trägt eine mehrfache Klonierungsstelle für die Einfügung eines Passenger-Gens in eine Prrn/rbcLRBS/Trps16-Expressionscassette. Die Prrn/rbcLRBS-Sequenz wird als EcoRI/NcoI-Fragment in einen pPRV111B-Vektor kloniert, und der Terminatorbereich aus dem Plastid-rps16-Gen (Trps16) wird als HindIII/NcoI-Fragment 3' des Prrn-Promotors kloniert. Das Trps16-Fragment umfasst den rps16-Gen-3'-regulatorischen Bereich aus den Nucleotiden 5087 bis 4939 in der Tabak-Plasmid-DNA.
Das pPRV111B-Gerüst des Vektors pMON30117 enthält ein Marker-Gen, aadA, für die Selektion auf Spectinomycin und Streptomycin und rps 7/12 für die Integration der Passenger-DNA durch homologe Rekombination in den trnV-rps7/12-Intergenbereich.
Ein Zellkern-Expressionskonstrukt, pMON10154, wurde als Kontrolle für die Integration in Pflanzen durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. In diesem Konstrukt wird das CP4-native Gen ausgehend vom konstitutiven Figwort-Mosaic-Virus-Promotor und dem Petunia-HSP70-Leader exprimiert und weist den E9-Terminator auf. Die Zielsteuerung zu Plastiden erfolgt durch das Chloroplasten-Transitpeptid des Petunia-EPSPS, das translational mit dem N-Terminus des CP4-Gens fusioniert ist.
Das Plastid-Expressionskonstrukt pMON30118 wurde hergestellt, indem man das nativ CP4-EPSPS-Gen, das als NcoI/SmaI-Fragment mit den fünf (5) N-termina len Aminosäuren des Plastid-rbcL-Gens (beschrieben in Svab et al., 1993, a.a.O.) fusioniert wurde, in die mehrfache Klonierungsstelle des Vektors pMON30117 klonierte.
Das Plastid-Expressionskonstrukt pMON30123 ist im Wesentlichen dasselbe wie pMON30118 mit Ausnahme der Deletion der fünf (5) N-terminalen Aminosäuren aus dem Plastid-rbcL.
Das Plastid-Expressionskonstrukt pMON30130 wurde hergestellt, indem man das native CP4-EPSPS von pMON30123 durch ein synthetisches CP4-Gen ersetzte. Diesem Konstrukt fehlt auch die Fusion der 5 N-terminalen Aminosäuren aus dem Plastid-rbcL-Gen.
Das Plastid-Expressionskonstrukt pMON38773 wurde aufgebaut, indem man die Prrn/RBS-Sequenz von pMON30123 durch die oben beschriebene Prrn/G10L-Promotorsequenz ersetzte. Der EPSPS-DNA-Sequenz von pMON38773 fehlt auch die Fusion der 5 N-terminalen Aminosäuren aus dem Plastid-rbcL-Gen.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON38766, wurde unter Verwendung des Promotors aus dem T7-Phagen-Gen 10 (P-T7) einschließlich G10L, des (nativen) CP4-G-Gen-codierenden Bereichs und der Terminatorsequenz aus dem Plastid-rps-16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON38797, wurde unter Verwendung des Promotors aus dem T7-Phagen-Gen 10 (P-T7) einschließlich G10L, des (synthetischen) CP4-G-Gen-codierenden Bereichs und des Terminators aus dem Plastid-rps-16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON38798, wurde unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn), G10L, des (synthetischen) CP4-G-Gen-codierenden Bereichs und des Terminators aus dem Plastid-rps-16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON38793, wurde unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn), einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle (RBS), die aus dem Plastid-rbcL-Gen angeordnet war, des Glyphosattoleranz-Petunia-EPSP-Synthase-Gens (P-EPSPS, Padgette et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 258: 564-573), das die Mutation Glycin zu Alanin auf der Aminosäureposition 101 trägt, und des Terminators aus dem Plastid-rps16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON38796, wurde unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn), einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle (RBS), die aus dem Plastid-rbcL-Gen angeordnet war, des Glyphosattoleranz-Achromobacter(Stamm LBAA)-EPSP-Synthase-Gens (US-Patent Nr. 5,627,061, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird), das die Mutation Glycin zu Alanin auf der Aminosäureposition 100 trägt (G100A), und des Terminators aus dem Plastid-rps16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON45204, wurde unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn) mit dem G10L, des Glyphosattoleranz-Pseudomonas(Stamm LBAA)-EPSP-Synthase-Gens, das die Mutation Glycin zu Alanin auf der Aminosäureposition 100 trägt (G100A), und des Terminators aus dem Plastid-rps16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON45201, wurde unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn), der synthetischen Ribosomenbindungsstelle (RBS), die aus dem Plastid-rbcL-Gen angeordnet war, des Wildtyp-Glyphosattoleranz-Bacillus-subtilis-aroE(EPSPS)(US-Patent Nr. 5,627,061)-Gens und des Terminators aus dem Plastid-rps16-Gen (Trps16) aufgebaut.
Ein Plastid-Expressionskonstrukt, pMON45259, wurde aufgebaut unter Verwendung des Promotors des 16SrDNA-Operons (Prrn) mit der G10L-Sequenz, die funktionell mit der Nucleinsäuresequenz assoziiert ist, die das synthetische CP4-Protein codiert, das am N-Terminus eine zusätzliche Sequenz aufweist, die die ersten 14 Aminosäuren des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) codiert (GKGEELFTGVVPSM). Die Sequenz, die die 14-Aminosäure-GFP-Fusion codiert, beginnt am Glycin in der zweiten Position des Proteins. Das Konstrukt enthält auch den rps16-Terminator.
Ein weiteres Plastid-Expressionskonstrukt, pMON49218, wurde so aufgebaut, dass es die synthetische CP4-Sequenz mit der 14-Aminosäure-GFP-Fusion aus dem Promotorbereich des 16SrDNA-Operons exprimiert, die den zellkerncodierten RNA-Polymerase-Bereich (PrrnPEP+NEP) und den Terminatorbereich aus dem Plastid-rps16-Gen aufweist. Die DNA-Sequenz aus der Prrn/NEP/G10L:: 14aaGFP-Fusion ist in 7 angegeben.
Beispiel 2. Pflanzentransformation
2A. Zellkerntransformation
Tabakpflanzen, die so transformiert wurden, dass sie die Konstrukte pWRG4744 und pWRG4747 im Zellkern einer Pflanzenzelle exprimieren, können so erhalten werden, wie es von Horsch et al. (Science(1985) 227: 1229-1232) beschrieben wurde.
2B. Plastidtransformation
Tabakplastiden werden durch Teilchenkanone-Abgabe von Mikroprojektilen transformiert, wie es von Svab und Maliga (Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 913-917) sowie hier beschrieben ist.
Dunkelgrüne, runde Blätter werden vorzugsweise aus der Mitte der Schösslinge von 3-6 Wochen alten Nicotiana tabacum cv. Havana abgeschnitten, die in vitro auf hormonfreiem MS-Medium (Murashige und Skoog, (1962) Physiol Plant. 15, 473-497), das mit B5-Vitaminen ergänzt war, in Phytatrays oder Sundae-Schalen mit einer 16-stündigen Photoperiode bei 24 °C gehalten worden waren. Jedes abgeschnittene Blatt wird dann mit der adaxialen Seite nach oben auf steriles Filterpapier über Tabakschössling-Regenerationsmedium (TSO-Medium: MS-Salze, 1 mg/l N⁶-Benzyladenin, 0,1 mg/l 1-Naphthalinessigsäure, 1 mg/l Thiamin, 100 mg/l Inosit, 7 g/l Agar, pH 5,8, und 30 g/l Saccharose) gelegt. Die Blätter werden vorzugsweise in die Mitte der Platte mit möglichst viel Kontakt mit dem Medium gelegt. Die Platten werden vorzugsweise unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet, aber sie können auch bis zu einen Tag vor der Transformation durch Teilchenbeschuss vorbereitet werden, indem man sie in Kunststoffbeutel einwickelt und über Nacht bei 24 °C aufbewahrt.
Wolfram- oder Goldteilchen werden zur Verwendung als Mikroträger in Beschussexperimenten sterilisiert. Teilchen (50 mg) werden mit 1 ml 100%igem Ethanol sterilisiert und bei –20 °C oder –80 °C aufbewahrt. Unmittelbar vor der Verwendung werden die Teilchen durch Zentrifugation sedimentiert, zwei- bis dreimal mit 1 ml sterilem entionisierten destillierten Wasser gewaschen, mit dem Wirbelmischer gemischt und zwischen den Waschvorgängen jeweils zentrifugiert. Die gewaschenen Teilchen werden in 500 μl 50%igem Glycerin resuspendiert.
Die sterilisierten Teilchen werden für die Transformation mit DNA beschichtet. 25-μl-Aliquote von sterilisierten Teilchen werden in ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen gegeben, und 5 μg interessierende DNA werden hinzugefügt und durch Klopfen gemischt. 35 μl einer frisch hergestellten Lösung von 1,8 M CaCl₂ und 30 mM Spermidin werden zu dem Teilchen/DNA-Gemisch gegeben, sachte gemischt und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die beschichteten Teilchen werden kurz durch Zentrifugieren sedimentiert. Die Teilchen werden zweimal durch Hinzufügen von 200 μl 70%igem Ethanol gewaschen, sachte gemischt und kurz zentrifugiert. Die beschichteten Teilchen werden in 50 μl 100%igem Ethanol resuspendiert und sachte gemischt. Für jeden Beschuss werden 5 bis 10 μl beschichtete Teilchen verwendet.
Die Transformation durch Teilchenbeschuss wird mit Hilfe der PDS-1000-Heliumkanone (Bio Rad, Richmond, CA) unter Verwendung einer modifizierten, vom Hersteller beschriebenen Vorschrift durchgeführt.
Platten, die die Blattproben enthalten, werden auf das zweitunterste Fach der Vakuumkammer gelegt und unter Verwendung der 1100-psi-Berstscheibe beschossen. Nach dem Beschuss werden Petri-Schalen, die die Blattproben enthalten, in Kunststoffbeutel eingewickelt und 48 Stunden lang bei 24 °C inkubiert.
Nach der Inkubation werden die beschossenen Blätter in Stücke von ungefähr 0,5 cm² geschnitten und mit der abaxialen Seite nach oben auf ISO-Medium gelegt, das mit 500 μg/ml Spectinomycin ergänzt ist. Nach 3 bis 4 Wochen auf dem Selektionsmedium erscheinen kleine grüne Spectinomycin-resistente Schösslinge auf dem Blattgewebe. Diese Schösslinge wachsen auf Spectinomycin-haltigem Medium weiter und werden als primäre mutmaßliche Transformanten bezeichnet.
Wenn die primären mutmaßlichen Transformanten 2 bis 3 Blätter entwickelt haben, werden zwei kleine Stücke (ungefähr 0,5 cm²) aus jedem Blatt geschnitten und entweder für die Selektion oder für eine zweite Runde Schösslingsregeneration verwendet. Das eine Stück wird mit der abaxialen Seite nach oben auf Platten gelegt, die ISO-Medium enthalten, das mit 500 μg/ml Spectinomycin ergänzt ist, und das andere Stück wird mit der abaxialen Seite nach oben auf ISO-Medium gelegt, das mit jeweils 500 μg/ml Spectinomycin und Streptomycin ergänzt ist. Positive Transformanten werden identifiziert als die Schösslinge, die auf dem ISO-Medium, das Spectinomycin und Streptomycin enthält, einen grünen Kallus bilden.
Nach 3 bis 4 Wochen entwickelt das Gewebe, das auf ISO-Medium, welches nur Spectinomycin enthielt, gelegt wurde und das auf dem ISO-Medium mit Spectinomycin und Streptomycin als positiv identifiziert wurde, grüne Schösslinge. Zwei bis vier Schösslinge von jeder positiven Transformanten werden ausgewählt und zur Bildung von Wurzeln auf ISO-Medium übergeführt, das mit 500 μg/ml Spectinomycin ergänzt ist. Bei 2 Schösslingen wird eine Southern-Analyse durchgeführt, um Homoplasmie zu bestätigen, wie unten beschrieben ist. Schösslinge aus homoplasmischen Ereignissen werden zur Samenproduktion in das Treibhaus übergeführt, während Transformanten, die nicht homoplas misch sind, einer zweiten Runde der Regeneration auf ISO-Medium mit 500 μg/ml Spectinomycin unterzogen werden, um Homoplasmie zu erreichen.
Beispiel 3. Analyse von transplastomischen Tabakpflanzen, die mit herbizidtoleranten Konstrukten transformiert sind
3A. Southern-Analyse
Transformierte Pflanzen, die in Bezug auf aadA-Marker-Gen-Expression selektiert wurden, werden analysiert, um zu bestimmen, ob der gesamte Plastidgehalt der Pflanze transformiert wurde (homoplastische Transformanten). Typischerweise sind nach zwei Runden der Schösslingsbildung und Spectinomycin-Selektion ungefähr 50% der transgenen Pflänzchen, die analysiert werden, homoplasmisch gemäß einer Bestimmung der Plastid-DNA durch Southern-Blot-Analyse. Homoplasmische Pflänzchen werden für die weitere Kultivierung ausgewählt.
Genomische DNA wird aus transformierten Tabakpflanzen isoliert, einer Elektrophorese unterzogen und auf Filter übertragen, wie es in Svab et al. ((1993), Proc Natl Acad Sci, 90: 913-917) beschrieben ist.
Homoplasmische Tabakpflanzen, die so transformiert wurden, dass sie CP4-EPSPS in Plastiden exprimieren, wurden identifiziert, wobei man eine Sonde verwendete, die aus einem 2,4-kb-EcoRI/EcoRV-Fragment aus dem Vektor pOVZ2 (ähnlich dem bei Zoubenko et al., 1994, a.a.O., beschriebenen pOVZ15) hergestellt wurde. Das 2,4-kb-Sondenfragment umfasst einen Teil der Zielsteuerungssequenz.
Ergebnisse der Southern-Hybridisierungen identifizierten 3 homoplasmische Linien aus Tabak, der mit den Konstrukten pMON30123 und pMON30130 transformiert wurde, und 1 Linie aus Tabak, der mit pMON38773 transformiert wurde, für die weitere Analyse.
Durch das vollständige Verschwinden des 3,27 kb großen nativen Tabak-BamHI-Fragments in den Linien 30123-19-1A, 30123-23-2A, 30123-18-1B, 30130-51- 2A, 30130-51-2P, 30130-57-1P und 38773-6 mit einer Sonde, die den Integrationsbereich abdeckt, und das Auftreten von Banden der erwarteten Größe für die insertierten DNA-Fragmente in diesen Transformanten, 5,14 kb und 0,9 kb, wird festgestellt, dass die transformierten Pflanzen homoplasmisch für die beabsichtigten Konstrukte sind.
Ergebnisse der Southern-Hybridisierungen identifizierten 3 homoplasmische Linien aus Tabak, der mit pCGN5177 transformiert wurde, die Linien 74-1B-P, 74-2 und 74-7.
5175 und 6114 transplastomische Tabaklinien wurden durch Southern-Hybridisierung in Bezug auf Homoplasmie analysiert, wie es oben beschrieben ist. Ergebnisse der Southern-Hybridisierungen identifizierten 4 homoplasmische Linien aus Tabak, der mit pCGN6114 transformiert war.
Ergebnisse von Hybridisierungen von 5175 transplastomischen Tabaklinien identifizierten eine Linie, 76-4A-F, als homoplasmisch und eine zweite Linie als 95% homoplasmisch.
3B. Northern-Analyse
Um das Transcriptionsniveau der in den transplastomischen Tabakpflanzen exprimierten EPSPS-mRNA zu bestimmen, wurden Northern-Blot-Hybridisierungen mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus jeder der identifizierten Linien isoliert wurde. Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß der Vorschrift des Herstellers isoliert. Gesamt-RNA, 2 μg, wurde auf einem denaturierenden Agarose-Gel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übergeführt (Maniatis et al., 1989, a.a.O.). Radioaktive Sonden für Hybridisierungen wurden unter Verwendung von statistisch primermarkierten (mit Hilfe des Random Primer Labeling Kits von Boehringer Mannheim) CP4-EPSPS-Fragmenten hergestellt, und Hybridisierungen wurden in 2x SSPE (Maniatis et al., 1989, a.a.O.) bei 60 °C durchgeführt. Filter wurden abgezogen und mit einer Plastid-16S-ribosomalen RNA-Gen-Sonde (von pPRV112A, Zoubenko, et al., 1994, a.a.O.) neu sondiert, um die homogene Beladung mit RNA auf dem Filter zu bestätigen.
Ergebnisse der Northern-Hybridisierungen, die mit EPSPS-Sonden durchgeführt wurden, beweisen, dass alle sieben (7) untersuchten Linien CP4-EPSPS-mRNA exprimieren. Hybridisierungen, die mit der 16S-Ribosomensonde durchgeführt wurden, bestätigen, dass denaturierende Gele bei jeder Probe mit den gleichen Mengen an Gesamt-RNA beladen wurden. Weiterhin exprimieren transplastomische Tabaklinien, die EPSPS ausgehend von den regulatorischen Elementen Prrn/rbcL(RBS) (pMON30123) exprimieren, die EPSPS-mRNA auf höherem Niveau als Tabakpflanzen, die homoplasmisch in Bezug auf EPSPS sind, das durch die Prrn/G10L(pMON38773)-Promotor/RBS-Sequenzen gesteuert wird.
3C. Western-Blot-Analyse von Tabak-CP4-EPSPS Um die Expression des EPSPS zu bestimmen, wurde eine Western-Blot-Analyse an einer einzigen Linie von jedem Konstrukt, pMON30123, pMON30130 und pMON38773, durchgeführt.
Das gesamte lösliche Protein wurde aus gefrorenem Blattgewebe extrahiert, indem man 250 mg Gewebe in 250 μl PBS-Puffer (1 mM KH₂PO₄, Na₂HPO₄, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,0), der Protease-Inhibitoren enthielt, vermahlte. Das Homogenisat wird 5 Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wird in ein frisches Röhrchen übergeführt. Die Konzentration des Proteins im Überstand wird mit Hilfe eines Proteinkonzentrationsassays (BioRad, Richmond, CA) bestimmt.
Extrahiertes Gesamt-Protein wird einer Elektrophorese auf einem 4-20%igen SDS-PAGE-Gel (Sigma, St. Louis, MO) unterzogen und auf PVDF-Membran in 1x SDS-PAGE-Puffer übergeführt (Maniatis et al. 1989, Cold Spring Harbor Press). Standards von quantifiziertem gereinigtem CP4-EPSPS-Protein wurden verwendet, um die Expression des CP4-EPSPS, wie es im Pflanzenplastid exprimiert wird, zu quantifizieren.
Western-Hybridisierungen werden so durchgeführt, wie es bei Staub und Maliga (1993) EMBO Journal, 12(2) 601-606, beschrieben ist, außer dass gegen EPSPS erzeugte Antikörper verwendet wurden. PVDF-Membranen, die das übertragene elektrophoresierte Protein enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C in einer Blockierungslösung von PBS-Puffer, der 0,05% Tween-20 (PBS-T) und 5% Milch enthielt, inkubiert. Dann werden die Membranen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Lösung von PBS-T inkubiert, die 1% Milch und einen in Ziegen gegen das CP4-EPSPS erzeugten primären Antikörper enthielt. Die Membranen werden dreimal in einer Lösung von PBS-T gewaschen, die 0,1% Milch enthielt, wobei jeder Waschvorgang bei Raumtemperatur 5 Minuten lang dauerte. Dann werden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Lösung von PBS-T, die 1% Milch und Schaf-Anti-Ziegen-Antikörper enthielt, inkubiert und wiederum dreimal 10 Minuten bei Raumtemperatur in PBS-T gewaschen, das 0,1% Milch enthielt. Ein letzter Waschvorgang, bei dem nur PBS-T verwendet wurde, wird durchgeführt, bevor man die Membranen mit Hilfe eines nichtradioaktiven Nachweiskits (ECL, Amersham) entwickelt. Tabelle 2
Die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse beweisen, dass erhebliche Erhöhungen des Niveaus von EPSPS-Protein von Pflanzen erhalten werden können, die so transformiert sind, dass sie EPSPS ausgehend vom Prrn/G10L-Promotor exprimieren. Diese Ergebnisse beweisen, dass die von den regulatorischen Prrn/rbcLRBS-Sequenzen gesteuerte EPSPS-Expression ungefähr 0,001% des gesamten löslichen Proteins als EPSPS produzieren kann, während bei Pflanzen, die EPSPS ausgehend von den regulatorischen Prrn/G10L-Sequenzen exprimieren, 0,2% des gesamten löslichen Proteins als EPSPS exprimieren. Anschließende Linien haben etwa 1% EPSPS im gesamten löslichen Protein gezeigt, wenn es ausgehend von den regulatorischen Prrn/G10L-Sequenzen exprimiert wurde. Diese Ergebnisse zusammen mit den obigen Ergebnissen der Northern-Hybridisierungen deuten darauf hin, dass ausgehend von der G10L-Ribosomenbindungsstelle eine effizientere Translation erhalten werden kann.
Weiterhin zeigten Plastid-Expressionskonstrukte, die die 14 N-terminalen Aminosäuren aus GFP enthielten, hohe Niveaus der Proteinexpression. Transplastomische Linien, die entweder pMON45259 oder pMON49218 enthielten, zeigten mehr als 12% CP4-EPSPS im gesamten löslichen Protein.
3D. Analyse der EPSPS-Enzymaktivität
Die EPSPS-Enzymaktivität in transplastomischen Tabakpflanzen, die den Plastidexpressionsvektor pMON38773 enthalten, wurde mit Hilfe eines HPLC-Assays (HPLC: high pressure liquid chromatography) bestimmt.
Verfahren zur Analyse der EPSPS-Enzymaktivität sind bei Padgette et al. (J. Biol. Chem. (1988) 263: 1798-1802 und Arch. Biochem. Biophys. (1987) 258: 564-573) und Wibbenmeyer et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1988) 153: 760-766) beschrieben.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3
Diese Ergebnisse beweisen, dass die EPSPS-Expression in Plastiden aktives EPSPS-Enzym erzeugt.
3E. Analyse in Bezug auf Glyphosattoleranz
Eine transplastomische Tabaklinie, die homoplasmisch in Bezug auf das Konstrukt pMON38773 war, wurde in vitro getestet, um das höchste Niveau der Glyphosattoleranz zu bestimmen. Explantatgewebe wurde aus Blattstücken von nichttransgenen Wildtyp-Tabak-Kontroll-Havanna-Pflanzen und der homoplasmischen Tabaklinie 38773-6 hergestellt und zur Regeneration von Schösslingen auf TSO-Medium (oben beschrieben) kultiviert, das mit Glyphosatkonzentrationen von 50 μM, 75 μM, 100 μM, 150 μM und 200 μM ergänzt war. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefasst. Die Zahl der Explantate, die Schösslinge produzierten, wurde 3 Wochen bzw. 6 Wochen nach der Explantatsherstellung und Kultivieren auf glyphosathaltigem Medium bestimmt. Tabelle 4
Die obigen Ergebnisse beweisen, dass bei allen untersuchten Glyphosatkonzentrationen Schösslinge sich aus Explantaten regenerierten, die aus einer in Bezug auf pMON38773 homoplasmischen Tabaklinie hergestellt wurden, während sich keine Schösslinge aus Explantaten regenerierten, die aus nichttransformierten Kontrollpflanzen hergestellt wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Tabakpflanzen, die EPSPS in Plastiden exprimieren, Toleranz gegenüber Glyphosatkonzentrationen von wenigstens 200 μM zeigen.
Zusätzliche transplastomische Linien wurden in vitro in Bezug auf Glyphosattoleranz getestet, wie es oben beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Zusammenfassung von Tabakplastid-Transformationsexperimenten mit verschiedenen Konstrukten, die EPSPS-Gene enthalten
Diese Ergebnisse zeigen, dass diese transplastomischen Linien Toleranz gegenüber Glyphosat zeigen. Die Zahlen in Klammern bedeuten die Zahl der Schösslinge, die resistent gegenüber einer Selektion bei 1 mM Glyphosat waren. Wie man in Tabelle 5 erkennt, werden also Tabaklinien erzeugt, die tolerant gegenüber einer Selektion mit 1 mM Glyphosat sind.
Homoplasmische Tabakpflanzen der Linie 38773-6 werden unter Verwendung eines Track-Sprühgeräts mit Glyphosat mit Konzentrationen besprüht, die 0 oz/acre, 454 g (16 oz)/acre, 907 g (32 oz)/acre und 1,81 kg(64 oz)/acre entsprechen, um auf Toleranz der ganzen Pflanze zu testen. Die Pflanzenhöhe wurde vor und nach dem Sprühen mit Glyphosat gemessen. Die Daten zu Verletzungen des vegetativen Gewebes wurden zwei Wochen nach dem Sprühen gesammelt, während die Daten zu Verletzungen des reproduktiven Gewebes bei Reife der Pflanze gesammelt wurden.
Die Anfangsergebnisse weisen darauf hin, dass besprühte homoplasmische Tabaklinien tolerant gegen Glyphosat bei der Konzentration von 454 g (16 oz)/acre sind, was bei der Verletzung des vegetativen Gewebes nachgewiesen wurde (Tabelle 6). Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, wurden transplastomische Linien erzeugt, die bei 907 g (32 oz)/acre ein gutes Maß an Glyphosattoleranz zeigten. In anschließenden Experimenten mit zusätzlichen transformierten Linien zeigten transplastomische Linien bei einer Konzentration von 1,81 kg (64 oz)/acre Toleranz gegenüber Glyphosat.
Toleranz ist gekennzeichnet durch das fortgesetzte Wachstum und Austreiben von Geweben, die mit Glyphosat besprüht wurden. Wenn die Konzentration des aufgetragenen Glyphosats erhöht wurde, gab es jedoch eine entsprechende Erhöhung des Niveaus der Verletzung von vegetativem Gewebe. Dagegen waren nichttransformierte Kontrollpflanzen in hohem Maße anfällig für Glyphosatkonzentrationen von nur 454 g (16 oz)/acre. Tabelle 6
Verletzungen des vegetativen Gewebes:

0 = normale Pflanze
1 = leichte Chlorose neuer Blätter und Verkümmerung
2 = schwere Chlorose neuer Blätter, Fehlbildung neuer Blätter und schwere Verkümmerung
3 = sterbende Pflanze
4 = tote Pflanze

Fruchtbarkeitseinstufungen:

0 = fruchtbar, keine Verzögerung der Reifung, viele Samen
1 = einige Aborte, geringfügige Verzögerung im Samenansatz, Samen
2 = erhebliche Aborte, erhebliche Verzögerung im Samenansatz, einige Samen
3 = sehr schwere Aborte, unreife Samenkapseln, wenige Samen
4 = fehlgebildete Blüten; wenn die Pflanze blüht, extreme Verzögerung des Blühens und keine Samen
5 = tote Pflanze

16 oz/A ≙ 454 g/acre; 32 oz/A ≙ 907 g/acre; 64 oz/A ≙ 1,81 kg/acre.

Außerdem wurden andere transplastomische Linien in Bezug auf Toleranz gegenüber Sprühen mit verschiedenen Glyphosatkonzentrationen analysiert, wie es oben beschrieben ist. Die spezifische Aktivität wird als Menge des exogen hinzugefügten Phosphoenolpyruvats (PEP), das in Shikimat-3-phosphat (S3P) umgewandelt wird, pro Proteineinheit im Pflanzenextrakt gemessen. Durch die Zugabe von Glyphosat wird die Empfindlichkeit des EPSPS-Enzyms gegenüber Glyphosat getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Tabelle 7

32 oz/acre ≙ 907 g/acre; 128 oz/acre ≙ 3,63 kg/acre; 64 oz/acre ≙ 1,81 kg/acre; 16 oz/acre ≙ 454 g/acre.

Diese Daten beweisen, dass bei transplastomischen Pflanzen, die verschiedene EPSPS-Sequenzen exprimieren, hohe Niveaus der Glyphosattoleranz erhalten werden können. Insbesondere liefern die Linien pMON45204, pMON45259 und pMON49218 eine Toleranz gegen Glyphosat, das in Konzentrationen von wenigstens 3,63 kg (128 oz)/acre auf vegetative Gewebe und wenigstens 1,81 kg (64 oz)/acre auf reproduktive Gewebe aufgetragen wird.
Weiterhin sorgen die Konstrukte pMON42259 und pMON49218 für eine Expression von CP4-EPSPS auf hohem Niveau ausgehend von Pflanzenplastiden, die mit diesen Konstrukten transformiert sind. Insbesondere werden in Konstrukten, die Sequenzen verwenden, die die ersten 14 Aminosäuren von GFP fusioniert an den N-Terminus von CP4 codieren, Expressionsniveaus von mehr als etwa 12% des gesamten löslichen Proteins erhalten. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Konstrukt, das die folgenden Komponenten in 5'→3'-Transcriptionsrichtung umfasst: (a) Promotorsequenz des 16S-ribosomalen RNA-Operon (Prrn), das zur Funktion in einem Pflanzenplastid geeignet ist; (b) Ribosomenbindungsstelle des T7-Bakteriophagen-Polymerase-Gen-10-Leaders, der mit der Promotorkomponente (a) verknüpft ist; (c) eine DNA-Sequenz, die die Agrobacterium-CP4-5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) codiert, welche einer Pflanzenzelle Toleranz gegenüber wenigstens der Herbizidverbindung Glyphosat verleihen kann, wenn die DNA-Sequenz in Plastiden der Pflanzenzelle transcribiert wird; und (d) einen Transcriptionsterminationsbereich.
Konstrukt gemäß Anspruch 1, wobei das Konstrukt weiterhin Folgendes umfasst: (e) ein Gen, das einen Selektionsmarker für die Selektion von Pflanzenzellen umfasst, die ein diesen Marker exprimierendes Plastid umfassen, und (f) DNA-Bereiche, die dem Genom dieses Plastids homolog sind, wobei die homologen Bereiche in (f) die Komponenten (a), (b), (c), (d) und (e) flankieren.
Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiterhin eine Sequenz enthält, die die 14 N-terminalen Aminosäuren des GFP am N-Terminus des durch (c) codierten Proteins codiert.
Pflanzenzellenplastid, das das Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Pflanze, Pflanzensamen, Pflanzenzelle oder Nachkommen davon, die ein Pflanzenplastid gemäß Anspruch 4 enthalten.
Verfahren zur Erzeugung von Toleranz gegenüber einem Herbizid in einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Transformieren von Plastiden der Pflanzenzelle mit einem Konstrukt, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, und Wachsenlassen von Pflanzenzellen, die die transformierten Plastide umfassen, unter Bedingungen, bei denen die DNA-Sequenz transcribiert wird, wodurch Pflanzenzellen, die die Pflanzenplastiden enthalten, tolerant gegenüber Anwendungen von Glyphosat werden.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Konstrukt weiterhin eine zweite interessierende DNA-Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweite DNA-Sequenz ein Gen umfasst, das ausgehend von einem Promotor exprimiert wird, der von dem Promotor (a) unabhängig ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweite DNA-Sequenz ein Gen umfasst, das ausgehend von dem Promotor (a) als polycistronische mRNA zusammen mit der DNA-Sequenz in (c) exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweite DNA-Sequenz ein Gen umfasst, das kein Gen ist, welches einer Pflanzenzelle Toleranz gegenüber der Herbizidverbindung verleihen kann.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweite DNA-Sequenz ein Gen umfasst, das einer Pflanzenzelle Toleranz gegenüber einer zweiten Herbizidverbindung verleihen kann.
Herbizidtolerante Pflanzenzelle, die nach dem Verfahren von Anspruch 6 erhältlich ist.
Pflanze, Pflanzensamen oder Pflanzenteil, die bzw. der eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 12 umfasst.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 12, die insgesamt mehr als etwa 0,01% lösliche Proteine als Protein, das ausgehend von dem Herbizidtoleranz-Gen exprimiert wird, umfasst.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 12, die insgesamt mehr als etwa 0,1%, vorzugsweise mehr als etwa 0,2%, lösliche Proteine als Protein, das ausgehend von dem Herbizidtoleranz-Gen exprimiert wird, umfasst.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 12, die ein Konstrukt gemäß Anspruch 3 aufweist und insgesamt 1% oder mehr, vorzugsweise 12% oder mehr, lösliche Proteine als Protein, das ausgehend von dem Herbizidtoleranz-Gen exprimiert wird, umfasst.
Pflanze, Pflanzensamen oder Pflanzenteil, die bzw. der eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 16 umfasst.
Verfahren, bei dem die durch das Verfahren von Anspruch 6 erhältliche Herbizidtoleranz verwendet wird, um Zellen zu selektieren, die aus untransformierten Zellen durch das Konstrukt transformiert wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Selektion anhand der Herbizidtoleranz auf einem Medium erfolgt, das Glyphosat in einer Konzentration von wenigstens etwa 50 μM bis etwa 200 μM enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Selektion anhand der Herbizidtoleranz auf einem Medium erfolgt, das Glyphosat in einer Konzentration ab etwa 1 mM enthält.
Pflanzenzelle, die nach dem Verfahren von Anspruch 18 erhältlich ist.