WO2011076370A1 - Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität - Google Patents

Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität Download PDF

Info

Publication number
WO2011076370A1
WO2011076370A1 PCT/EP2010/007767 EP2010007767W WO2011076370A1 WO 2011076370 A1 WO2011076370 A1 WO 2011076370A1 EP 2010007767 W EP2010007767 W EP 2010007767W WO 2011076370 A1 WO2011076370 A1 WO 2011076370A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
combination
amino acid
preferred
another preferred
mentioned above
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/007767
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Aehle
Juergen Eck
Karsten Harms
Michael Klingeberg
Stefan Pelzer
Wolfgang Wach
Original Assignee
Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt filed Critical Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt
Priority to JP2012545146A priority Critical patent/JP2013515462A/ja
Priority to EP10794900A priority patent/EP2516642A1/de
Priority to US13/518,849 priority patent/US8691535B2/en
Priority to CN2010800585706A priority patent/CN102695793A/zh
Publication of WO2011076370A1 publication Critical patent/WO2011076370A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99011—Isomaltulose synthase (5.4.99.11)

Definitions

  • the invention relates to the biotechnological production of isomaltulose and isomaltulose-containing compositions from sucrose and provides improved agents, in particular a sucrose mutase with improved product specificity and microbial cells containing the improved sucrose mutase.
  • isomaltulose palatinose
  • sucrose cane sugar, beet sugar
  • Isomaltulose is a physiologically valuable sugar that is becoming increasingly important as a sucrose substitute in foods and related products. Isomaltulose is non-cariogenic and has a low glycemic index with essentially the same energy content as sucrose. Isomaltulose has been approved for use in food since 2005.
  • Isomaltulose is also the starting material for the preparation of the sugar alcohol isomalt, a racemic mixture of 1,6-GPS (6-OaD-glucopyranosyl-D-sorbitol) and 1, 1-GPM (1-OaD-glucopyranosyl-D-mannitol). and modifications thereof, in particular GPS or GPM-enriched mixtures.
  • the biotechnological production of isomaltulose from sucrose is carried out, as is known, using preferably immobilized bacterial cells or fragments thereof which have the activity of the bacterial enzyme sucrose mutase, EC 5.4.99.11 (synonym: sucrose mutase, sucrose isomerase, sucrose isomerase, isomaltulose synthase).
  • Microorganisms which are known to have sucrosase activity and can be used in biotechnological processes are in particular Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Pseudomonas mesoacidophila, Pantoea dispersa and Serratia plymuthica.
  • sucrosemutase Their endogenous Sucrosemutase (s) are known under the short names SmuA, Pal I, SmtA, MutB, SIM and others.
  • the sucrosemutases are encoded by a chromosomal gene.
  • sucrose is not fully isomerized enzymatically to isomaltulose. Rather, further isomerization products and by-products are formed.
  • An essential further isomerization product is trehalulose.
  • Protaminobacter rubrum there is a sucrose mutase SmuA whose product specificity is such that sucrose is also under optimized cultivation conditions only about 85% isomerized to isomaltulose.
  • the product specificity of the sucrose mutant SmuA is in need of improvement.
  • technical isomaltulose production with biotechnological agents is based on the sucrose mutant SmuA of P. rubrum.
  • the object of the present invention is therefore to provide an improved SmuA-based sucrose mutase as well as a microorganism containing this improved sucrose mutase, which has improved product specificity and selectivity for isomaltulose, thereby increasing the proportion of isomaltulose in the isomerization product, thus reducing the conversion from sucrose to isomaltulose can also be carried out more efficiently in otherwise known biotechnological processes.
  • the invention has a particular object to provide an improved Sucrosemutase based on SmuA, which can be used in substantially unchanged, already established industrial biotechnological processes, without the reaction conditions and procedures in the established processes would have to be adapted consuming.
  • the use of sucrose mutases from other organisms and the conversion to new biotechnological processes should be avoided.
  • the technical problem underlying the invention is completely solved by the provision of a novel polyamino acid molecule which has an improved sucrose mutase activity with respect to the conversion of sucrose into isomaltulose, that is to say a higher product specificity for isomaltulose.
  • the improved sucrose mutase has an amino acid sequence which is preferably directly derived from the wild-type sequence of the Sucrosemutase SmuA from Protaminobacter rubrum, wherein in at least one of the following amino acid positions, in each case based on the position number of a wild-type sequence shown in SEQ ID No.
  • 1 is one or more of the amino acid substitutions listed below: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q and combinations of two, three, four, five, six, seven eight, nine or all ten , In this case, the position is determined according to the position of the active center according to the invention.
  • an improved novel sucrosemutase enzyme which is characterized in that it has, exclusively contains or contains a modified amino acid sequence which is selected from the group of amino acid sequences which are opposite to those shown in SEQ ID NO: 1 sequence one or more of the following Have amino acid substitutions: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • the invention also relates to a functional modification thereof, that is to say a polyamino acid molecule which exhibits or exclusively contains sections of this amino acid sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, provided that this polyamino acid molecule has the inventive function of the improved novel sucrosemutase enzyme.
  • a functional modification thereof that is to say a polyamino acid molecule which exhibits or exclusively contains sections of this amino acid sequence of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, provided that this polyamino acid molecule has the inventive function of the improved novel sucrosemutase enzyme.
  • the amino acid substitution is at position S303; preferably, it is exchanged for amino acid P.
  • the amino acid substitution at position D302 is exchanged for amino acid Y.
  • Particularly preferred is a combination of the exchanges S303P with D302Y.
  • the amino acid substitution is at position K180; is preferably exchanged for amino acid P.
  • the amino acid substitution is at position Q276; Preferably, it is exchanged for amino acid A.
  • amino acid exchange at position Y219 preference is exchanged for amino acid F.
  • amino acid substitution at position V324 preference is exchanged for amino acid T.
  • amino acid exchange at position T369 preference is exchanged for amino acid L.
  • the amino acid substitution is at position A346; Preferably, it is exchanged for amino acid Q.
  • the following additional amino acids are possible individually or in combination: M199I in combination with V114I, Q122R, Q276A, N423E, L426I, L426F.
  • a preferred combination is S303P + D302Y.
  • Another preferred combination is S303P + M99I.
  • Another preferred combination is S303P + Q276A.
  • Another preferred combination is S303P + A198D.
  • Another preferred combination is S303P + Y219F.
  • Another preferred combination is S303P + V324T.
  • Another preferred combination is S303P + T369L.
  • Another preferred combination is S303P + A346Q.
  • S303P with D302Y with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • combination of S303P with K180P having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P with M199I having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P with Q276A with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • combination of S303P with A198D having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P with Y219F having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of S303P with V324T with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • S303P with T369L with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • S303P with A346Q with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L.
  • a preferred combination thereof is S303P + D302Y + K180P.
  • this combination is additionally combined with one or more of: M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + D302Y + M199I.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P + D302Y + M199I + S303P + D302Y + M199I + Q276A S303P + D302Y + M199I + A198D
  • S303P + D302Y + M199I + Y219F S303P + D302Y + M199I + V324T
  • S303P + D302Y + M199I + T369L S303P + D302Y + M199I + T369L
  • S303P + D302Y + M199I + A346Q Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + D302Y + Q276A.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + D302Y + Q276A + A198D, S303P + D302Y + Q276A + Y219F, S303P + D302Y + Q276A + V324T, S303P + D302Y + Q276A + T369L, S303P + D302Y + Q276A + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + D302Y + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + D302Y + A198D + Y219F, S303P + D302Y + A198D + V324T, S303P + D302Y + A198D + T369L and / or S303P + D302Y + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + D302Y + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + D302Y + Y219F + V324T, S303P + D302Y + Y219F + T369L and / or S303P + D302Y + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + D302Y + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + D302Y + V324T + T369L and / or S303P + D302Y + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + D302Y + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is S303P + D302Y + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + D302Y + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + K180P + M199I is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more from: D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + K180P + M199I + S303P + K180P + M199I + Q276A, S303P + K180P + M199I + A198D, S303P + K180P + M199I + Y219F, S303P + K180P + M199I + V324T, S303P + K180P + M199I + T369L and / or S303P + K180P + M199I + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + K180P + Q276A is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + K180P + Q276A + A198D, S303P + K180P + Q276A + Y219F, S303P + K180P + Q276A + V324T, S303P + K180P + Q276A + T369L and / or S303P + K180P + Q276A + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + K180P + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + K180P + A198D + Y219F, S303P + K180P + A198D + V324T, S303P + K180P + A198D + T369L and / or S303P + K180P + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + K180P + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + K180P + Y219F + V324T, S303P + K180P + Y219F + T369L and / or S303P + K180P + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + K180P + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + K180P + V324T + T369L and / or S303P + K180P + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + K180P + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, 199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is S303P + K180P + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + K180P + A346Q. In further variants this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + M199I + Q276A. In further variants, this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P + M199I + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + M199I + A198D + Y219F, S303P + M199I + A198D + V324T, S303P + M199I + A198D + T369L and / or S303P + M199I + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + M199I + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + M199I + Y219F + V324T and / or S303P + M199I + Y219F + T369L, S303P + M199I + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + M199I + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + M199I + V324T + T369L and / or S303P + M199I + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + M199I + T369L Another preferred combination is S303P + M199I + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is S303P + M199I + T369L + A346Q Other preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + M199I + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more from: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + Q276A + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + Q276A + A198D + Y219F, S303P + Q276A + A198D + V324T, S303P + Q276A + A198D + T369L and / or S303P + Q276A + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + Q276A + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L and, A346Q.
  • Preferred is S303P + Q276A + Y219F + V324T, S303P + Q276A + Y219F + T369L and / or S303P + Q276A + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + Q276A + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + Q276A + V324T + T369L, and / or S303P + Q276A + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + Q276A + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is S303P + Q276A + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + Q276A + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + A198D + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + A198D + Y219F + V324T, S303P + A198D + Y219F + T369L and / or S303P + A198D + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + A198D + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + A198D + V324T + T369L, S303P + A198D + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • S303P + A198D + T369L Another preferred combination is S303P + A198D + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is S303P + A198D + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + A198D + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + Y219F + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L and A346Q.
  • Preferred is S303P + Y219F + V324T + T369L and / or S303P + Y219F + V324T + A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + Y219F + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and A346Q.
  • Preferred is S303P + Y219F + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is S303P + Y219F + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + V324T + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and A346Q.
  • Preferred is S303P + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is S303P + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • a preferred combination is D302Y + K180P.
  • Another preferred combination is D302Y + M199I.
  • Another preferred combination is D302Y + Q276A.
  • Another preferred combination is D302Y + A198D.
  • Another preferred combination is D302Y + Y219F.
  • Another preferred combination is D302Y + V324T.
  • Another preferred combination is D302Y + T369L.
  • Another preferred combination is D302Y + A346Q.
  • D302Y with K180P with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y with M199I having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y with Q276A with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y with A198D with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of D302Y with Y219F with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y with V324T with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • D302Y with T369L with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • D302Y with A346Q with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Also preferred is a combination of D302Y with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Another preferred combination is D302Y + K180P + M199I.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + K180P + M199I + D302Y + K180P + M199I + Q276A D302Y + K180P + M199I + A198D, D302Y + K180P + M199I + Y219F, D302Y + K180P + M199I + V324T, D302Y + K180P + M199I + T369L and / or D302Y + K180P + M199I + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above. Another preferred combination is D302Y + K180P + Q276A.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + K180P + Q276A + A198D D302Y + K180P + Q276A + Y219F, D302Y + K180P + Q276A + V324T, D302Y + K180P + Q276A + T369L and / or D302Y + K180P + Q276A + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + K180P + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preference is given to D302Y + K180P + A198D + Y219F, D302Y + K180P + A198D + V324T, D302Y + K180P + A198D + T369L and / or D302Y + K180P + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + K180P + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, 199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • S303P 199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + K180P + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is D302Y + K180P + V324T + T369L and / or D302Y + K180P + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + K180P + T369L Another preferred combination is D302Y + K180P + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is D302Y + K180P + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + K180P + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + M199I + Q276A is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + M199I + Q276A + A198D is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + M199I + Q276A + A198D is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + M199I + Q276A + A198D is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + M199I + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preference is given to D302Y + M199I + A198D + Y219F, D302Y + M199I + A198D + V324T, D302Y + M199I + A198D + T369L and / or D302Y + M199I + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + M199I + Y219F.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is D302Y + 199I + Y219F + V324T, D302Y + M199I + Y219F + T369L and / or D302Y + 199I + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + M199I + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is D302Y + M199I + V324T + T369L, D302Y + 199I + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + M199I + T369L Another preferred combination is D302Y + M199I + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is D302Y + M199I + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + M199I + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + Q276A + A198D.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + Q276A + A198D + Y219F D302Y + Q276A + A198D + V324T, D302Y + Q276A + A198D + T369L, and / or D302Y + Q276A + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + Q276A + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • D302Y + Q276A + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • S303P K180P
  • M199I M199I
  • A198D Y219F
  • T369L T369L
  • A346Q Preferred is D302Y + Q276A + V324T + T369L, D302Y + Q276A + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + Q276A + T369L Another preferred combination is D302Y + Q276A + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T and A346Q. Is preferred D302Y + Q276A + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + Q276A + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + A198D + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is D302Y + A198D + V324T + T369L, and / or D302Y + A198D + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + A198D + T369L Another preferred combination is D302Y + A198D + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is D302Y + A198D + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + A198D + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and T369L.
  • S303P K180P
  • M199I M199I
  • Q276A Y219F
  • V324T V324T
  • T369L T369L
  • D302Y + Y219F + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L and A346Q.
  • Preferred is D302Y + Y219F + V324T + T369L, D302Y + Y219F + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • D302Y + Y219F + T369L Another preferred combination is D302Y + Y219F + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and A346Q.
  • Preferred is D302Y + Y219F + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + Y219F + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + V324T + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and A346Q.
  • Preferred is D302Y + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is D302Y + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Another preferred combination is K180P + Q276A.
  • Another preferred combination is K180P + A198D.
  • Another preferred combination is K180P + Y219F.
  • Another preferred combination is K180P + V324T.
  • K180P + T369L Another preferred combination is K180P + A346Q.
  • K180P with M199I having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of K180P with Q276A with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • K180P with A198D having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • K180P with Y219F with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • K180P with V324T with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • K180P with T369L with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • K180P with A346Q with at least one other or just one more selected from the group consisting of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L.
  • Another preferred combination is K180P + M199I + Q276A.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • K180P + M199I + Q276A + A198D K180P + M199I + Q276A + Y219F, K180P + M199I + Q276A + V324T, K180P + M199I + Q276A + T369L and / or K180P + M199I + Q276A + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + M199I + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + M199I + A198D + Y219F, K180P + M199I + A198D + V324T, K180P + M199I + A198D + T369L and / or K180P + M199I + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + 199I + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + M199I + Y219F + V324T, K180P + M199I + Y219F + T369L and / or K180P + M199I + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + M199I + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + M199I + V324T + T369L, K180P + M199I + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + M199I + T369L is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more from: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is K180P + M199I + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + M199I + A346Q is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + Q276A + A198D is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + Q276A + A198D + Y219F, K180P + Q276A + A198D + V324T, K180P + Q276A + A198D + T369L and / or K180P + Q276A + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + Q276A + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + Q276A + Y219F + V324T, K180P + Q276A + Y219F + T369L, and / or K180P + Q276A + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is K180P + Q276A + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + Q276A + V324T + T369L and / or K180P + Q276A + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is K180P + Q276A + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is K180P + Q276A + T369L + A346Q.
  • K180P + Q276A + A346Q is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is K180P + A198D + Y219F. In further variants, this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, 199I, Q276A, V324T, T369L and A346Q.
  • K180P + A198D + Y219F + V324T K180P + A198D + Y219F + T369L and / or K180P + A198D + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + A198D + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + A198D + V324T + T369L and / or K180P + A198D + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + A198D + T369L is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is K180P + A198D + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + A198D + A346Q is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T and T369L.
  • S303P S303P
  • D302Y D302Y
  • M199I M199I
  • Q276A Y219F
  • V324T V324T
  • T369L Other preferred versions thereof are mentioned above.
  • K180P + Y219F + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, T369L and A346Q.
  • Preferred is K180P + Y219F + V324T + T369L, K180P + Y219F + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + Y219F + T369L is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T and A346Q.
  • Preferred is K180P + Y219F + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + Y219F + A346Q Another preferred combination is K180P + Y219F + A346Q. In further variants this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is K180P + V324T + T369L. In further variants, this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F and A346Q. Preferred is K180P + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • K180P + V324T + A346Q Another preferred combination is K180P + V324T + A346Q. In further variants this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is K180P + T369L + A346Q. In further variants this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I is a combination of M199I with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Another preferred combination is M199I + Q276A.
  • Another preferred combination is M199I + A198D.
  • Another preferred combination is M199I + Y219F.
  • Another preferred combination is M199I + V324T.
  • Another preferred combination is M199I + T369L.
  • Another preferred combination is M199I + A346Q.
  • M199I with Q276A with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of M199I with A198D with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • M199I with Y219F with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of 199I with V324T with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • a combination of M199I with T369L with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • M199I with A346Q with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T and T369L.
  • M199I + Q276A + A198D is M199I + Q276A + A198D.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Preference is given to M199I + Q276A + A198D + Y219F, M199I + Q276A + A198D + V324T, M199I + Q276A + A198D + T369L and / or M199I + Q276A + A198D + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I + Q276A + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • M199I + Q276A + V324T is M199I + Q276A + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, T369L and A346Q. Preference is given to M199I + Q276A + V324T + T369L and / or M199I + Q276A + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I + Q276A + T369L Another preferred combination is M199I + Q276A + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • Preferred is M199I + Q276A + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is M199I + Q276A + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I + A198D + Y219F is additionally combined with one or more from: S303P, D302Y, K180P, Q276A, V324T, T369L and A346Q. Preference is given to M199I + A198D + Y219F + V324T and / or M199I + A198D + Y219F + T369L, M199I + A198D + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above. Another preferred combination is M199I + A198D + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is M199I + A198D + V324T + T369L, M199I + A198D + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is M199I + A198D + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is M199I + A198D + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is M199I + A198D + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I + Y219F + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, T369L and A346Q.
  • M199I + Y219F + T369L Another preferred combination is M199I + Y219F + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T and A346Q.
  • Preferred is M199I + Y219F + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is M199I + Y219F + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • M199I + V324T + T369L Another preferred combination is M199I + V324T + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more from: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F and A346Q.
  • Preferred is M199I + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is M199I + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is M199I + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + A198D.
  • Another preferred combination is Q276A + Y219F.
  • Another preferred combination is Q276A + V324T.
  • Another preferred combination is Q276A + T369L.
  • Q276A with A198D with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of Q276A with Y219F with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • a combination of Q276A with V324T with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • Q276A with T369L with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • a combination of Q276A with A346Q with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T and T369L. Also preferred is a combination of Q276A with at least one other or exactly one more selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • Q276A + A198D + Y219F is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, V324T, T369L and A346Q.
  • Preferred is Q276A + A198D + Y219F + V324T and / or Q276A + A198D + Y219F + T369L, Q276A + A198D + Y219F + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + A198D + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, T369L and A346Q.
  • Preferred is Q276A + A198D + V324T + T369L and / or Q276A + A198D + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + A198D + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T and A346Q. Preferred is Q276A + A198D + T369L + A346Q.
  • Another preferred combination is Q276A + A198D + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Q276A + Y219F + V324T is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, T369L and A346Q.
  • Preferred is Q276A + Y219F + V324T + T369L and / or Q276A + Y219F + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + Y219F + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T and A346Q.
  • Preferred is Q276A + Y219F + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + Y219F + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + V324T + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F and A346Q.
  • Preferred is Q276A + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Q276A + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • a preferred combination is a combination of A198D with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a preferred combination is A198D + Y219F.
  • Another preferred combination is A198D + V324T.
  • Another preferred combination is A198D + T369L.
  • Another preferred combination is A198D + A346Q.
  • A198D with Y219F having at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L and A346Q.
  • A198D with V324T with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L and A346Q.
  • a combination of A198D with T369L with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and A346Q.
  • A198D with A346Q with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T and T369L.
  • A198D with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L and A346Q.
  • a preferred combination is A198D + Y219F + V324T.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, T369L and A346Q.
  • Preferred is A198D + Y219F + V324T + T369L and / or A198D + Y219F + V324T + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • A198D + Y219F + T369L is Another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T and A346Q.
  • Preferred is A198D + Y219F + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • A198D + Y219F + A346Q is Another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T and T369L.
  • S303P S303P
  • D302Y D302Y
  • K180P K180P
  • M199I M199I
  • Q276A V324T
  • T369L Other preferred versions thereof are mentioned above.
  • A198D + V324T + T369L is another preferred combination.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F and A346Q.
  • Preferred is A198D + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is A198D + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, 199I, Q276A, Y219F and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is A198D + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F and V324T. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • a preferred combination is Y219F + V324T.
  • Another preferred combination is Y219F + T369L.
  • Another preferred combination is Y219F + A346Q.
  • Y219F with V324T with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L and A346Q.
  • Y219F with T369L with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and A346Q.
  • a combination of Y219F with A346Q with at least one other or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T and T369L. Also preferred is a combination of Y219F with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L and A346Q.
  • Another preferred combination is Y219F + V324T + T369L.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D and A346Q.
  • Preferred is Y219F + V324T + T369L + A346Q. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Y219F + V324T + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D and T369L. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • Another preferred combination is Y219F + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D and V324T. Other preferred versions thereof are mentioned above.
  • V324T with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L and A346Q.
  • a favorite called combination is V324T + T369L.
  • Another preferred combination is V324T + A346Q.
  • V324T with T369L with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and A346Q.
  • V324T with A346Q with at least one further or exactly one further, selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and T369L.
  • a preferred combination is V324T + T369L + A346Q.
  • this combination is additionally combined with one or more of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D and Y219F. Further preferred embodiments thereof are mentioned above.
  • T369L is a combination of T369L with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T and A346Q.
  • a preferred combination is T369L + A346Q.
  • T369L with A346Q with at least one further or exactly one further selected from the group consisting of: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F and V324T.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules, that is to say polynucleotide molecules which in each case encode the abovementioned amino acid sequences of SmuA modified by amino acid substitution. It will be understood that it includes a variety of polynucleotide molecules which, due to the degenerative genetic code, may be present in a number of embodiments, but which still encode the same polyamino acid molecules of the invention. The skilled worker knows bioinformatic methods which are suitable for finding the defined group of polynucleotide molecules coding for this amino acid sequence from a given amino acid sequence according to the invention.
  • the polynucleotide molecule according to the invention is present as an isolated polynucleic acid molecule.
  • the polynucleotide molecule according to the invention is in the form of or as part of a construct which expresses the expression of the modified sucrose mutase according to the invention in a biological System, especially in a biological cell, preferably in a bacterial cell, mediated.
  • a construct is a first embodiment of an expression cassette containing the polynucleotide molecule of the invention in one or more copies.
  • the expression cassette additionally contains at least one promoter element for controlling the expression of the polynucleotide molecule and optionally additionally a terminator sequence.
  • the invention also provides a vector construct which contains at least one or preferably more of the expression cassettes.
  • promoters of the expression cassette and the vector construct promoters known per se for the expression of the polynucleotide molecule according to the invention in a biological system are possible.
  • Preferred is the native promoter of the sucrosemutase wild-type gene.
  • a promoter element which improves the expression of the modified Sucrosemutase modified according to the invention, in particular a multi-enhanced activity, that is, especially volume activity of the expressed Sucrosemutase allows.
  • the invention also relates to a construct which is suitable to exchange a wild-type gene encoding a genome of a biological cell for the polynucleotide molecule according to the invention encoding the modified Sucrosemutase according to the invention.
  • a replacement plasmid serves to integrate the polynucleotide molecule according to the invention into the chromosomal genome of the cell.
  • the gene exchange mediating exchange plasmid is particularly designed such that it does not replicate itself in the host cell into which it is introduced.
  • a preferred vector construct is a pUT derivative based on an R6K origin of replication. In particular, this vector does not replicate in host cells of strain P. rubrum, at least not conditionally.
  • the polynucleotide molecule of the invention can be introduced into a host cell selected from host cells otherwise capable of converting sucrose to isomaltulose.
  • the invention also relates to the use of the above-characterized polynucleotide molecules of the invention, exchange promoters and their Fragments or complete sucrose mutase expression cassettes for the production of a cell according to the invention.
  • the invention also relates to the use of the above-characterized vector, according to the first aspect of the invention thus an exchange plasmid, according to the second aspect of the invention thus an expression vector, for the production of such a cell.
  • the invention also encompasses biological cells with a novel product spectrum, namely cells capable of synthesizing from a sucrose-containing substrate an isomaltulose composition which is at least 85% by weight or more (based on the dry matter weight of the isomaltulose composition ), preferably 86 wt% or more, 87 wt% or more, 88 wt% or more, 89 wt% or more, 90 wt% or more, 91 wt% or more , 92 wt% or more, 93 wt% or more, 94 wt% or more, particularly preferably 95 wt% or more.
  • a host cell selected from microorganisms of the groups of Gammaproteobacteria and unclassified Gammaproteobacteria.
  • the cell is selected from the group consisting of microorganisms of the genera: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pectobacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea, Leucanea and Protaminobacter.
  • the cell is selected from the group consisting of: Klebsiella sp., Especially strain LX3 and strain NK33-98-8, Klebsiella pneumoniae, especially strain 342; Enterobacter sp., Especially strain SZ62; Enterobacter sp., Especially strain FMB1; Rauoltella planticola; Pantoea dispersa; Erwinia rhapontici; Erwinia tasmaniensis, especially strain Et1 / 99; Pectobacterium atrosepticum, especially strain SCRI 1043; Pectobacterium carovotum, especially subspecies brasiliensis, especially strain PBR 1692; Protaminobacter rubrum; Pseudomonas mesoacidophila; Serratia plymuthica and Azotobacter vinelandii and Leucanea leucocephalia.
  • the cell is Protaminobacter rubrum (P. rubrum) or a biotechnologically usable strain derived therefrom.
  • the invention also extends to immobilized and / or otherwise modified forms of these host cells, which may be particularly suitable for biotechnological processes.
  • the host cells are deletion mutants for a possibly present in the cell Sucrosemutase wild-type gene.
  • a preferred variant is a cell in which the chromosomal Sucrosemutase wild-type gene present in the cell has been exchanged for a nucleotide sequence coding for the modified Sucrosemutase enzyme according to the invention in the chromosome.
  • this modified gene according to the invention is under the control of the promoter of the Sucrosemutase wild-type gene.
  • this modified gene according to the invention under the control of a, preferably endogenous, homologous, replacement promoter.
  • Such a promoter is in particular selected from the group consisting of: promoter of the gene of the 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase ribB, promoter of the gene which encodes the alter-membrane protein ompA, promoter of the gene which contains the putative transcriptional activator ECA2934, promoter of the gene of the ribonuclease E rne, promoter of the operon of the 50S ribosomal L21 protein, promoter of the operon of the cold shock protein CspE, promoter of the operon of the 50S ribosomal L28 protein and promoter of the NAD-dependent epimerase gene Dehydratase and functional promoter fragments thereof which are capable of directing the expression of the modified sucrose mutase of the invention.
  • the invention also relates to cells in which the modified Sucrosemutase according to the invention, especially under the regulation of at least one of the promoters characterized above, is expressed extrachromosomally (episomally).
  • the invention also relates to means for producing such cells.
  • an agent is the polynucleotide molecule which contains an expressible section which codes for the modified Sucrosemutase according to the invention in at least one or multiple copies and additionally at least one additional element regulating the expression of this Sucrosemutase in at least one or multiple copies, in particular a promoter element .
  • the polynucleotide molecule of the invention as an expression cassette, is present in isolated form. For example, it can thus be transferred into a host cell in a manner known per se.
  • the invention also provides a process for preparing a cell according to the invention which is capable of converting sucrose into isomaltulose or isomaltulose compositions, the process comprising at least the following steps: In a first step, a wild-type strain or an already classically or recombinantly modified Strain of the cell riding made; in a second step, this strain is contacted or associated with at least one of the above-characterized polynucleotide molecules of the invention encoding the modified Sucrosemutase of the invention and / or at least one of the above-characterized vectors such that the polynucleotide molecule of the invention is introduced into the cell in expressible form becomes.
  • an "isomaltulose composition” is understood to mean the isomerization product due to the activity of the sucrose mutase from the substrate sucrose, which contains predominantly isomaltulose.
  • Other ingredients are, in particular, trehalulose, isomelenzitose and fructose and glucose 80 to 99% isomaltulose, 1 to 10% trehalulose, 0 to 0.5% isomelezitose, 0 to 0.2% trisaccharides, 0 to 5% monosaccharides and 0 to 0.2% residual saccharides
  • the proportion of isomaltulose in the isomaltulose composition of at least 85% by weight or more (based on the dry matter weight of the isomaltulose composition), preferably 86% by weight or more, 87% by weight or more, 88% by weight or more , 89 wt% or more, 90 wt% or more, 91 wt% or more, 92 wt% or more, 93
  • this is a process for biotechnologically producing isomaltulose or an isomaltulose composition from a sucrose-containing substrate, wherein, in a first step, sucrose-containing substrate is contacted with the sucrose mutase or biocatalyst of the present invention under conditions which enable the substrate to be converted to isomaltulose or an isomaltulose composition.
  • this is a process for the biotechnological production of isomaltulose or an isomaltulose composition from a sucrose-containing substrate, wherein in a first step comprising the step: cultivating the above-characterized cell in a culture medium containing the substrate, and although under conditions that allow the substrate to be converted to isomaltulose or an isomaltulose composition. Isomaltulose is preferred in a preferred subsequent step or isolating the isomaltulose composition from the culture medium.
  • the cell is immobilized on or in a matrix, in particular an alginate matrix or the like, in a manner known per se. This is especially intended for the large-scale conversion of sucrose into isomaltulose or the isomaltulose composition.
  • the invention accordingly also provides for the use of a cell according to the invention characterized above for the biotechnological production of isomaltulose or of an isomaltulose composition, preferably of sucrose or of a sucrose-containing substrate, and preferably by the process described here.
  • the polynucleotide molecule of the invention is further envisaged to use the polynucleotide molecule of the invention, especially in isolated form or as part of a cell fragment, for the development of cell-free systems and biocatalysts.
  • the biocatalyst has a carrier, to which the modified Sucrosemutase according to the invention is immobilized.
  • the polynucleotide molecule according to the invention, especially in isolated form is not used immobilized as sucrose mutase biocatalyst, in particular in soluble form.
  • the invention thus also relates to biocatalysts which are substantially cell-free, and which are preferably characterized in that the modified sucrase mutase according to the invention is immobilized thereon.
  • a preferred first variant is to a substrate, preferably to a filter membrane, immobilized cell fragments.
  • a substrate preferably to a filter membrane, immobilized cell fragments.
  • an isolated, preferably synthetically prepared in a conventional manner, according to the invention Polyaminoklaremo- molecule is present, which has the modified Sucrosemutase effettician invention.
  • the biocatalyst is formed by the non-immobilized isolated polynucleotide molecule of the invention having sucrosase activity.
  • FIG. 1 shows, by way of example, a vector map of the smuA deletion plasmid pUT-GntR-P3C1-DSmuA prepared in connection with the invention, containing the replacement sequence according to SEQ ID NO: 1 (dark gray box).
  • This area shows upstream of the smuA deletion region 1267 bp homology to P. rubrum chromosome.
  • This region carries homology to a GntR-type transcriptional regulatory gene and the 3C1 promoter introduced without scarring.
  • Downstream of the smuA deletion region are 655 bp of homologous DNA sequence.
  • the actual deletion region of the smuA gene within the replacement sequence is highlighted as a nucleotide sequence.
  • the native smu A start codon ATG and a TAA stop codon are underlined. Introduced restriction site Nsil and Pmel interface recognition sequences are also marked by dashed lines.
  • the pUT derivative is based on an R6K ori ("origin of transfer") and carries the selection of the kanamycin resistance gene aphl1 and the xy / E gene, which codes for a catechol-2,3 dioxygenase.
  • Figure 2 illustrates schematically and by way of example the procedure according to the invention for the preparation of the smi /> 4 deletion mutant P. rubrum 3C1 DsmuA: replacement of the native smuA gene by homologous recombination.
  • a non-replicative vector e.g., pUT vector
  • a smu> 4 exchange plasmid is preferably constructed in E. coli.
  • two DNA fragments upstream and downstream of the smuA gene are amplified and fused to the base (see Fig. 1).
  • an Xmal / PstI fragment (see SEQ ID No: 2) is created, which upstream of the deleted smuA gene is a 1267 bp DNA fragment which codes for the putative gntR regulator and carries the 3C1 promoter and downstream of Flanking a 655 bp DNA fragment.
  • the generated plasmid is transferred into the host cell, here: P. rubrum 3C1.
  • P. rubrum 3C1 By selecting for preferably kanamycin, such colonies are selected therefrom which carry exchange plasmids in the chromosome, which preferably integrate into the chromosome via at least one of the two homologous regions.
  • the incubation on kanamycin-free medium allows the selection of deletion strains in which the integrated plasmid disintegrates again from the chromosome via a second cross-over (second recombination event).
  • Such colonies are preferably phenotypically detectable by the absence of xy / E activity after catechol addition in a conventional manner (no yellowing).
  • the successful production of the deletion strain can then be checked by methods of molecular biology (for example PCR) in a manner known per se in order to be able to additionally rule out the complete disintegration of the replacement plasmid which leads to the reconstruction of the wild-type.
  • FIG. 3 illustrates, schematically and by way of example, the procedure according to the invention for the expression of smty> A sequence variants in the smu> A deletion mutant P. rubrum 3C1DsmuA: Based on a preferably non-replicative vector (eg, pUT vector) in the host cell P. rubrum 3C1 DsmuA, an integrative smty1 expression plasmid is preferably constructed in E. coli.
  • a non-replicative vector eg, pUT vector
  • smuA * genes which encode the abovementioned amino acid sequences of SmuA converted by amino acid exchange are fused with a 1267 bp DNA fragment which encodes the putative gffff regulator and carries the 3C1 promoter necessary for expression , Subsequently, the insertion of the fusion product into the preferably non-replicative vector (eg, pUT vector) takes place.
  • the plasmids produced are transferred into the host cell, here: P. rubrum 3C1 DSmuA.
  • P. rubrum 3C1 DSmuA By selection on preferably kanamycin, such colonies are selected from which the smt * expression plasmids integrated into the chromosome via homologous recombination.
  • the successful preparation of the integration strains can then be checked by molecular biological methods (eg PCR) in a conventional manner.
  • the expression of the integrated s / 77t7> 4 * variant genes is performed by the strong 3C
  • the sequence log contains:
  • the DNA sequence results from a fusion of two DNA fragments located in P. rubrum 3C1 upstream and downstream of the smuA gene to be deleted.
  • genes coding for SmuA * variants are integrated into the smoA deletion mutant by homologous recombination. This procedure allows the expression of sequence-modified genes in the homologous system and the detailed determination of the product specificity of sequence variants according to the invention without any influence from SmuA wild-type activities.
  • the deletion of the Smu l wild-type gene in P. rubrum 3C1 / Z12A is by homologous recombination.
  • two DNA fragments upstream and downstream of the smuA gene are amplified in a base-accurate manner and combined by, for example, ligase-free cloning (Geu-Flores, F. et al., 2007, Nucleic Acids Research 35 (7): e55) (see FIG ).
  • ligase-free cloning Gib-Flores, F. et al., 2007, Nucleic Acids Research 35 (7): e55
  • it is possible to produce the desired DNA fragment by DNA synthesis. After ligation or synthesis, an Xmal / PstI fragment is formed (see SEQ ID No: 2), which has a region of 1267 bp of homologous sequence to the P.
  • rubrum 3C1 chromosome upstream of the deleted smuA gene.
  • This region encodes for an "open reading frame" (ORF), which has high homologies to GntR-type transcriptional regulators and, secondly, carries the P. rubrum homologous promoter 3C1 of the 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase gene downstream of the deleted smtv> A gene, the region homologous to the P. rubrum chromosome is 655 bp.
  • ORF open reading frame
  • suitable base vectors for gene replacement are so-called pUT derivatives based on an R6K origin of replication (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172: 6557-67) .These vectors only replicate when the pir gene encoding ⁇ -protein replication is present, such strain is E. coli S17-1pir (Herrero et al. 1990, J. Bacteriol., 172: 6557-67), it is used to construct the respective promoter exchange plasmids.
  • An exemplary final deletion construct (pUT-GntR-P3C1-DSmuA), which after homologous recombination mediates the base-exact deletion of smuA, is shown in FIG.
  • the transfer of the prepared smu ⁇ deletion plasmid to P. rubrum 3C1 is preferably realized by an intergeneric conjugation between E. coli S17-1 ⁇ and P. rubrum.
  • the used pUT plasmids carry an "ori gin of Transfer" (oriT) of the RP4 plasmid and can be mobilized by P. rubrum (Herrero et al by the integrated in E. coli S17- ⁇ / 'r chromosomally RP4 plasmid., 1990, J. Bacteriol., 172: 6557-67).
  • P. rubrum 3C1 transconjugants requires a P. rubrum selectable plasmid marker (e.g., aphlI, kanamycin resistance) and a way to selectively inhibit the E. coli donor.
  • P. rubrum selectable plasmid marker e.g., aphlI, kanamycin resistance
  • Plating on rifamycin-containing medium 100 pg / ml
  • spontaneously generates rifamycin-resistant P. rubrum 3C1 colonies (P. rubrum 3C1 Rif) which otherwise do not differ from the wild-type.
  • the conjugation is carried out as follows:
  • E. coli SM ⁇ / 'r donor strains carrying the smivA' replacement are grown overnight in 5 ml dYT medium (per 1 liter: 16 g Bacto tryptone, 10 g Bacto Yeast Extract, and 5 g NaCl) supplemented with kanamycin (50 pg / ml) at 37 ° C.
  • the recipient P. rubrum 3C1 was also grown overnight in 5 ml dYT with the addition of rifamycin (100 pg / ml) at 30 ° C.
  • the cells are then washed off the filter with 1 ml of dYT, diluted, plated on selection plates (dYT + kanamycin 50 ⁇ g / ml and rifamycin 100 ⁇ g / ml) and incubated overnight at 30 ° C.
  • Kanamycin selection such P. rubrum 3C1 transconjugants are obtained in which the plasmids preferably integrated into the chromosome via one of the two homologous regions ( Figure 1).
  • Incubation on kanamycin-free medium allows the selection of smuA deletion strains in which the integrated plasmid is disintegrated from the chromosome via a second crossover.
  • a color marker xylE present on the replacement plasmids can be used.
  • the xy / E gene codes for a catechol-2,3 dioxygenase, which converts catechol to 2-hydroxymuconic acid semialdehyde, which is phenotypically recognizable by striking yellowing.
  • the disintegration of the previously integrated exchange plasmids is a rare event (1 in 1000 colonies) and can with the help of this marker by the missing in the desired clones yellowing after catechol (spray reagent: 0.2 ml of a 0.5 mol / l aqueous solution ) are detected.
  • the smuA deletion strain is designated P. rubrum 3C1 DSmuA ( Figure 2). 1.2. Preparation of sequence variants and their integration in P. rubrum 3C1 DSmuA
  • Polynucleotide molecules encoding the aforementioned amino acid sequences of SmuA modified by amino acid substitution according to the invention may be prepared by various methods known to those skilled in the art, e.g. Gene synthesis, ligase-free cloning, or overlap extension PCR can be generated. As an example, the preparation and testing of two sequence variants, D302Y and the double mutant D302Y / S303P is described (reference sequence is SEQ ID No: 1). SEQ ID No. 3 describes the nucleotide sequence of the full length gene which codes for the SmuA amino acid substitution variant D302Y and SEQ ID No. Figure 4 describes the nucleotide sequence of the full-length gene encoding the SmuA double mutant D302Y / S303P.
  • smuA * Modified smuA gene sequence variants (smuA *), which code for inventive amino acid substitutions of SmuA (SmuA *), for expression in the under Example 1.1. described SmuA deletion strain are transferred.
  • the corresponding smUiA * variant gene is prepared by using methods known to the person skilled in the art, such as, for example, ligase-free cloning (see above). Sengenau cloned into a non-replicative pUT derivative.
  • such a plasmid as pUT-GntR-P3C1-SmuA * carries, in addition to the smuA variant gene smuA *, upstream of smuA *, a 1267 bp region homologous to the chromosome of the smty> A deletion strain P rubrum 3C1 DSmuA.
  • the plasmid can integrate into the chromosome of P. rubrum 3C1 DSmuA by homologous recombination ( Figure 3).
  • the transfer can be carried out by intergeneric conjugation (see Example 1.1.). By kanamycin selection, such transconjugants are obtained in which the plasmids integrated into the chromosome via the homologous region upstream of smuA *.
  • Verified transconjugants carry smtv / l * variant genes that are constitutively expressed by the strong 3C1 promoter.
  • the SmuA sequence variants according to the invention produced in these strains modified by amino acid substitution are then analyzed with regard to their product spectra in whole-cell biotransformations.
  • Example 2 Product spectrum of SmuA variant strains according to the invention in P. rubrum 3C1 / Z12A
  • HPLC high-density polyethylene glycol
  • Sampler Sampler
  • Rl reactive index detector
  • Guard column 10 mm x 4.6 mm, aminophase (e.g., Zorbax-NH2)
  • Separation column 250 mm x 4.6 mm, amino phase (e.g., Zorbax-NH2)
  • Interface computer and software for measuring data acquisition and evaluation.
  • Running medium acetonitrile 73% (v / v) flow: 1, 400 ml / min
  • the cultivation of the strains according to the invention and wild-type control strains was carried out in 30 ml LB medium (starting OD 60 o of 0.05). The cultures were each incubated at 30 ° C, 200 rpm in a horizontal shaker. After initially fermentation for 24 hours, 5 ⁇ OD cells are removed, centrifuged off and washed with 1 ml CaC acetate buffer (0.01 mol / l, pH 5.5). The cell pellets (corresponding to 5 ⁇ OD cells) were each resuspended in 1.25 ml CaAcetate buffer (0.01 mol / l, pH 5.5) with a sucrose solution of 0.584 mol / l (200 g / l). The batches were incubated for biotransformation in deep-well plates with gentle shaking at room temperature for 90 min. The reaction was stopped by heat treatment (5 min. 98 ° C).
  • Table 2 shows the results of HPLC analysis of the supernatants after fermentation under sucrose cultivation.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose und Isomaltulosehaltigen Zusammensetzungen aus Saccharose stellt die Erfindung verbesserte Mittel, besonders eine Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifität sowie mikrobielle Zellen, enthaltend die verbesserte Sucrosemutase, bereit.

Description

SUCROSEMUTASE MIT VERBESSERTER PRODUKTSPEZIFITÄT Beschreibung
Die Erfindung betrifft die biotechnologische Herstellung von Isomaltulose und Isomaltulose-haltigen Zusammensetzungen aus Saccharose und stellt dazu ver- besserte Mittel, besonders eine Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifi- tät sowie mikrobielle Zellen, enthaltend die verbesserte Sucrosemutase, bereit.
Bekanntermaßen ist Isomaltulose (Palatinose) in einem biotechnologischen Pro- zess durch enzymatische Isomerisierung aus Saccharose (Rohrzucker, Rübenzucker) herstellbar. Isomaltulose ist ein physiologisch wertvoller Zucker, der als Saccharoseaustauschstoff in Lebensmitteln und verwandten Produkten zunehmend an Bedeutung gewinnt. Isomaltulose ist nicht kariogen und besitzt einen niedrigen glykämischen Index bei im Wesentlichen demselben Energiegehalt wie Saccharose. Isomaltulose ist seit 2005 zur Verwendung in Lebensmitteln zugelassen ist. Isomaltulose ist außerdem Ausgangsstoff für die Herstellung des Zu- ckeralkohols Isomalt, eines razemischen Gemisches aus 1 ,6-GPS (6-O-a-D- Glucopyranosyl-D-sorbit) und 1 ,1 -GPM (1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannit) sowie Abwandlungen davon, besonders GPS- oder GPM-angereicherter Gemische.
Die biotechnologische Herstellung von Isomaltulose aus Saccharose erfolgt be- kanntermaßen unter Verwendung von vorzugsweise immobilisierten Bakterienzellen oder Fragmenten davon, welche die Aktivität des bakteriellen Enzyms Sucrosemutase, E.C. 5.4.99.11 (synonym: Saccharosemutase, Sucroseisomera- se, Saccharoseisomerase, Isomaltulosesynthase), aufweisen. Mikroorganismen, die bekanntermaßen Sucrosemutaseaktivität besitzen und in biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden können, sind insbesondere Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontici, Pseudomonas mesoacidophila, Pantoea dispersa und Serratia plymuthica. Deren endogenen Sucrosemutase(n) sind unter den Kurzbezeichnungen SmuA, Pal I, SmtA, MutB, SIM und weiteren bekannt. Die Sucrosemutasen werden durch ein chromosomales Gen kodiert. In den bekannten biotechnologischen Systemen wird Saccharose enzymatisch nicht vollständig zu Isomaltulose isomerisiert. Es entstehen vielmehr weitere Isomerisierungsprodukte und Nebenprodukte. Ein wesentliches weiteres Isome- risierungsprodukt ist Trehalulose. In dem Mikroorganismus Protaminobacter rubrum liegt eine Sucrosemutase SmuA vor, deren Produktspezifität derart aus- gestaltet ist, dass Saccharose auch unter optimierten Kultivierungsbedingungen nur zu etwa 85 % zu Isomaltulose isomerisiert wird. Die Produktspezifität der Sucrosemutase SmuA ist verbesserungswürdig. Die technische Isomaltulo- seproduktion mit biotechnologischen Mitteln basiert aber auf der Sucrosemutase SmuA von P. rubrum. Die vorliegende Erfindung hat sich deshalb zur Aufgabe gestellt, eine verbesserte Sucrosemutase auf Basis von SmuA sowie auch einen diese verbesserte Sucrosemutase enthaltenden Mikroorganismus bereitzustellen, die eine verbesserte Produktspezifität und Selektivität für Isomaltulose besitzt, wodurch der Anteil an Isomaltulose im Isomerisierungsprodukt erhöht wird, womit die Umwandlung von Saccharose zu Isomaltulose auch in ansonsten bekannten biotechnologischen Prozessen effizienter durchgeführt werden kann. Die Erfindung hat sich dabei besonders zur Aufgabe gestellt, eine verbesserte Sucrosemutase auf Basis von SmuA bereitzustellen, die in im Wesentlichen unveränderten, bereits etablierten industriellen biotechnologischen Prozessen eingesetzt werden kann, ohne dass Reaktionsbedingungen und Verfahrensabläufe in den etablierten Prozessen aufwändig angepasst werden müssten. Eine Verwendung von Sucrosemutasen aus anderen Organismen und die Umstellung auf neue biotechnologische Pro- zess soll vermieden werden.
Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird vollständig gelöst durch die Bereitstellung eines neuartigen Polyaminosäuremoleküls, das eine verbesserte Sucrosemutaseaktivität in Bezug auf die Umsetzung von Saccharose in Isomaltulose, das heißt eine höhere Produktspezifität für Isomaltulose, aufweist. Erfindungsgemäß weist die verbesserte Sucrosemutase, eine Aminosäuresequenz auf, die bevorzugt unmittelbar abgeleitet ist aus der Wildtypsequenz der Sucrosemutase SmuA aus Protaminobacter rubrum, wobei in zumindest einer der nachfolgend genannten Aminosäurepositionen, jeweils bezogen auf die Positionsnummer einer Wildtypsequenz, die in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, einen oder mehrere der nachfolgend angeführten Aminosäureaustausche aufweist: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q sowie Kombinationen aus zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben acht, neun oder allen zehn. Dabei wird erfindungsgemäß die Position in Abhängigkeit zur Lage des aktiven Zentrums bestimmt.
Die Erfindung stellt demgemäß zur Lösung bereit: Ein verbessertes neuartiges Sucrosemutaseenzym, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine abgewan- delte Aminosäuresequenz aufweist, ausschließlich aufweist oder diese enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz einen oder mehrere der folgenden Aminosäureaustausche aufweisen: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Die Erfindung betrifft auch eine funktionelle Abwandlung davon, das heißt ein Polyaminosäuremolekül, das Abschnitte dieser erfindungsgemäß abgewandelten Aminosäuresequenz der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz aufweist, ausschließlich aufweist oder diese enthält, soweit dieses Polyaminosäuremolekül die erfindungsgemäße Funktion des verbesserten neuartigen Sucrosemutaseenzym aufweist. Der Fachmann kann entsprechende funktionelle Abwandlungen aus den hierin angegebenen Sequenzdaten leicht herstellen und in an sich bekannter Weise auf deren Funktion als Sucrosemutaseenzym testen.
In einer ersten Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position S303; bevorzugt wird gegen Aminosäure P ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position D302; bevorzugt ist gegen Aminosäure Y ausge- tauscht. Besonders bevorzugt ist eine Kombination der Austausche S303P mit D302Y.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position K180; bevorzugt ist gegen Aminosäure P ausgetauscht. In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position M199; bevorzugt ist gegen Aminosäure I ausgetauscht (M199I).
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position Q276; bevorzugt ist gegen Aminosäure A ausge- tauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position A198; bevorzugt ist gegen Aminosäure D ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Ami- nosäureaustausch an Position Y219; bevorzugt ist gegen Aminosäure F ausgetauscht. In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position V324; bevorzugt ist gegen Aminosäure T ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Ami- nosäureaustausch an Position T369; bevorzugt ist gegen Aminosäure L ausgetauscht.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausgestaltung der Erfindung ist der Aminosäureaustausch an Position A346; bevorzugt ist gegen Aminosäure Q ausgetauscht. Zusätzlich zu den nachfolgend im Detail beschriebenen bevorzugten Kombinationen mehrerer Aminosäureaustausche sind folgende zusätzliche Aminosäuren einzeln oder in Kombination möglich: M199I in Kombination mit V1 14I, Q122R, Q276A, N423E, L426I, L426F.
Bevorzugt ist eine Kombination von S303P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M 99I. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von S303P mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L.
Eine bevorzugte Kombination davon ist S303P + D302Y + K180P. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + M199I, S303P + D302Y + K180P + S303P + D302Y + K180P + Q276A, S303P + D302Y + K180P + A198D, S303P + D302Y + K180P + Y219F, S303P + D302Y + K180P + V324T, S303P + D302Y + K180P + T369L und/oder S303P + D302Y + K180P + A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + M199I + S303P + D302Y + M199I + Q276A, S303P + D302Y + M199I + A198D, S303P + D302Y + M199I + Y219F, S303P + D302Y + M199I + V324T, S303P + D302Y + M199I + T369L und/oder S303P + D302Y + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + Q276A + A198D, S303P + D302Y + Q276A + Y219F, S303P + D302Y + Q276A + V324T, S303P + D302Y + Q276A + T369L, S303P + D302Y + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + A198D + Y219F, S303P + D302Y + A198D + V324T, S303P + D302Y + A198D + T369L und/oder S303P + D302Y + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + Y219F + V324T, S303P + D302Y + Y219F + T369L und/oder S303P + D302Y + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + V324T + T369L und/oder S303P + D302Y + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + D302Y + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + D302Y + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + M199I + S303P + K180P + M199I + Q276A, S303P + K180P + M199I + A198D, S303P + K180P + M199I + Y219F, S303P + K180P + M199I + V324T, S303P + K180P + M199I + T369L und/oder S303P + K180P + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + Q276A + A198D, S303P + K180P + Q276A + Y219F, S303P + K180P + Q276A + V324T, S303P + K180P + Q276A + T369L und/oder S303P + K180P + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + A198D + Y219F, S303P + K180P + A198D + V324T, S303P + K180P + A198D + T369L und/oder S303P + K180P + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + Y219F + V324T, S303P + K180P + Y219F + T369L und/oder S303P + K180P + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + V324T + T369L und/oder S303P + K180P + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, 199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + K180P + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + K180P + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + Q276A + S303P + M199I + Q276A + A198D, S303P + M199I + Q276A + Y219F, S303P + M199I + Q276A + V324T, und/oder S303P + M199I + Q276A + T369L, S303P + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + A198D + Y219F, S303P + M199I + A198D + V324T, S303P + M199I + A198D + T369L und/oder S303P + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + Y219F + V324T und/oder S303P + M199I + Y219F + T369L, S303P + M199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + V324T + T369L und/oder S303P + M199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + M199I + T369L + A346Q Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + A198D + Y219F, S303P + Q276A + A198D + V324T, S303P + Q276A + A198D + T369L und/oder S303P + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und, A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + Y219F + V324T, S303P + Q276A + Y219F + T369L und/oder S303P + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + V324T + T369L, und/oder S303P + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + Y219F + V324T, S303P + A198D + Y219F + T369L und/oder S303P + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + V324T + T369L, S303P + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Y219F + V324T + T369L und/oder S303P + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist S303P + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist S303P + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist S303P + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von D302Y mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + M199I. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + M199I + D302Y + K180P + M199I + Q276A, D302Y + K180P + M199I + A198D, D302Y + K180P + M199I + Y219F, D302Y + K180P + M199I + V324T, D302Y + K180P + M199I + T369L und/oder D302Y + K180P + M199I + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. D302Y + K180P + Q276A + A198D, D302Y + K180P + Q276A + Y219F, D302Y + K180P + Q276A + V324T, D302Y + K180P + Q276A + T369L und/oder D302Y + K180P + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + A198D + Y219F, D302Y + K180P + A198D + V324T, D302Y + K180P + A198D + T369L und/oder D302Y + K180P + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, 199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + Y219F + V324T, D302Y + K180P + Y219F + T369L und/oder D302Y + K180P + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + V324T + T369L und/oder D302Y + K180P + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + K180P + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + K180P + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. D302Y + M199I + Q276A + A198D, D302Y + M199I + Q276A + Y219F, D302Y + M199I + Q276A + V324T, und/oder D302Y + M199I + Q276A + T369L, D302Y + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + A198D + Y219F, D302Y + M199I + A198D + V324T, D302Y + M199I + A198D + T369L und/oder D302Y + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + 199I + Y219F + V324T, D302Y + M199I + Y219F + T369L und/oder D302Y + 199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + V324T + T369L, D302Y + 199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + M199I + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + A198D + Y219F, D302Y + Q276A + A198D + V324T, D302Y + Q276A + A198D + T369L, und/oder D302Y + Q276A + A198D + A346Q. Wei- tere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + Y219F + V324T und/oder D302Y + Q276A + Y219F + T369L, D302Y + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + V324T + T369L, D302Y + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + A198D + V324T + T369L, und/oder D302Y + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Y219F + V324T + T369L, D302Y + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist D302Y + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist D302Y + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von K180P mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A. Eine andere bevorzugte Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von K180P mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + Q276A. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. K180P + M199I + Q276A + A198D, K180P + M199I + Q276A + Y219F, K180P + M199I + Q276A + V324T, K180P + M199I + Q276A + T369L und/oder K180P + M199I + Q276A + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + A198D + Y219F, K180P + M199I + A198D + V324T, K180P + M199I + A198D + T369L und/oder K180P + M199I + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + 199I + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + Y219F + V324T, K180P + M199I + Y219F + T369L und/oder K180P + M199I + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + V324T + T369L, K180P + M199I + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + M199I + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + M199I + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + A198D + Y219F, K180P + Q276A + A198D + V324T, K180P + Q276A + A198D + T369L und/oder K180P + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + Y219F + V324T, K180P + Q276A + Y219F + T369L, und/oder K180P + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + V324T + T369L und/oder K180P + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, 199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + Y219F + V324T, K180P + A198D + Y219F + T369L und/oder K180P + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + V324T + T369L und/oder K180P + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Y219F + V324T + T369L, K180P + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist K180P + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist K180P + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist K180P + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von M199I mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T. Eine andere bevorzug- te Kombination ist M199I + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von 199I mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von M199I mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F, V324T und T369L.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + A198D. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + A198D + Y219F, M199I + Q276A + A198D + V324T, M199I + Q276A + A198D + T369L und/oder M199I + Q276A + A198D + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + Y219F + V324T und/oder M199I + Q276A + Y219F + T369L, M199I + Q276A + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + V324T + T369L und/oder M199I + Q276A + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Q276A + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Q276A + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, A198D, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + Y219F + V324T und/oder M199I + A198D + Y219F + T369L, M199I + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + V324T + T369L, M199I + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Y219F + V324T + T369L und/oder M199I + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist M199I + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist M199I + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist M199I + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von Q276A mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, 199I, A198D, Y219F, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Q276A mit mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + Y219F. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, V324T, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + Y219F + V324T und/oder Q276A + A198D + Y219F + T369L, Q276A + A198D + Y219F + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + V324T + T369L und/oder Q276A + A198D + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + A198D + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + A198D + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Y219F, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, T369L und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + Y219F + V324T + T369L und/oder Q276A + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, V324T und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist Q276A + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Q276A + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, A198D, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von A198D mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, T369L und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und A346Q. Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T und T369L.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von A198D mit mit mindestens einer weite- ren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F, V324T, T369L und A346Q.
Eine bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + V324T. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, T369L und A346Q. Bevorzugt ist A198D + Y219F + V324T + T369L und/oder A198D + Y219F + V324T + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T und A346Q. Bevorzugt ist A198D + Y219F + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + Y219F + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, V324T und T369L. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F und A346Q. Bevorzugt ist A198D + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, 199I, Q276A, Y219F und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Eine andere bevorzugte Kombination ist A198D + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, Y219F und V324T. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt. Bevorzugt ist eine Kombination von Y219F mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T. Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, T369L und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T und T369L. Bevorzugt ist auch eine Kombination von Y219F mit mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, V324T, T369L und A346Q.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T + T369L. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und A346Q. Bevorzugt ist Y219F + V324T + T369L + A346Q. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + V324T + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und T369L. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Eine andere bevorzugte Kombination ist Y219F + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und V324T. Weitere bevor- zugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von V324T mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, T369L und A346Q. Eine bevor- zugte Kombination ist V324T + T369L. Eine andere bevorzugte Kombination ist V324T + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von V324T mit T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von V324T mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und T369L.
Eine bevorzugte Kombination ist V324T + T369L + A346Q. In weiteren Varianten ist diese Kombination zusätzlich kombiniert mit einer oder mehreren aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D und Y219F. Weitere bevorzugte Ausführungen davon sind oben genannt.
Bevorzugt ist eine Kombination von T369L mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T und A346Q. Eine bevorzugte Kombination ist T369L + A346Q.
Bevorzugt ist auch eine Kombination von T369L mit A346Q mit mindestens einer weiteren oder genau einer weiteren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F und V324T. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, das heißt Polynukleotidmole- küle, welche jeweils die vorgenannten, durch Aminosäureaustausch abgewandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren. Es versteht sich, dass darunter eine Vielzahl von Polynukleotidmolekülen fällt, die aufgrund des degenerativen genetischen Codes in mehreren Ausgestaltungen vorkommen können, den- noch aber dieselben erfindungsgemäßen Polyaminosäuremoleküle kodieren. Der Fachmann kennt bioinformatische Verfahren, die geeignet sind, aus einer gegebenen erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz die definierte Gruppe der diese Aminosäuresequenz kodierenden Polynukleotidmoleküle zu finden.
In einer ersten Ausführung liegt das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül als isoliertes Polynukleinsäuremolekül vor.
In einer alternativen Ausgestaltung liegt das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in Form oder als Bestandteil eines Konstrukts vor, welches die Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase in einem biologischen System, insbesondere in einer biologischen Zelle, bevorzugt in einer Bakterienzelle, vermittelt. Ein solches Konstrukt ist ein einer ersten Ausgestaltung eine Expressionskassette, die das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in einer oder mehreren Kopien enthält. Vorzugsweise enthält die Expressionskassette zusätzlich mindestens ein Promotorelement zur Steuerung der Expression des Polynukleotidmoleküls und gegebenenfalls zusätzlich eine Terminatorsequenz.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektorkonstrukt, welches zumindest eine oder bevorzugt mehrere der Expressionskassetten enthält.
Als Promotor der Expressionskassette und des Vektorkonstrukts sind an sich bekannte Promotoren zur Expression des erfindungsgemäßen Polynukleotidmoleküls in einem biologischen System möglich. Bevorzugt ist der native Promotor des Sucrosemutase-Wildtypgens. Alternativ bevorzugt ist ein Promotorelement, welches die Expression der erfindungsgemäß modifizierten Sucrosemutase verbessert vermittelt, insbesondere eine mehrfach gesteigerte Aktivität, das heißt besonders Volumenaktivität der exprimierten Sucrosemutase ermöglicht.
Neben dem vorgenannten Expressionsvektor zur bevorzugt extrachromosomalen Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase betrifft die Erfindung auch ein Konstrukt, welches geeignet ist, ein im Genom einer biologischen Zelle enthaltenes, eine Sucrosemutase kodierendes Wildtypgen gegen das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül, kodierend die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, auszutauschen. Ein solches Austauschplasmid dient dazu, das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül in das chromosomale Genom der Zelle zu integrieren. Das den Genaustausch vermittelnde Austauschplasmid ist besonders derart ausgestaltet, dass es in die Wirtszelle, in die es eingebracht wird, selbst nicht repliziert. Ein bevorzugtes Vektorkonstrukt ist ein pUT-Derivat, das auf einem R6K Replikationsursprung basiert. Dieser Vektor repliziert insbesondere nicht in Wirtszellen vom Stamm P. rubrum, zumindest nicht konditional.
Das erfindungsgemäße Polynukleotidmolekül, kann entweder in Form eines extrachromosomalen Expressionskonstrukts oder durch chromosomalen Genaustausch, in eine Wirtszelle eingebracht werden die ausgewählt ist aus Wirtszellen, die ansonsten geeignet sind, Saccharose in Isomaltulose zu konvertieren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle, Austauschpromotoren und deren Fragmente oder vollständige Sucrosemutase-Expressionskassetten, zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des vorstehend charakterisierten Vektors, gemäß des ersten Aspekts der Erfindung also ein Austauschplasmid, gemäß des zweiten Aspekts der Erfindung also ein Expressionsvektor, zur Herstellung einer solchen Zelle.
Die Erfindung umfasst auch biologische Zellen mit neuartigem Produktspektrum, und zwar Zellen, die in der Lage sind, aus einem Saccharose-haltigen Substrat eine Isomaltulose-Zusammensetzung zu synthetisieren, die zumindest 85 Gew.- % oder mehr (bezogen auf Trockensubstanzgewicht der Isomaltulose- Zusammensetzung), bevorzugt 86 Gew.-% oder mehr, 87 Gew.-% oder mehr, 88 Gew.-% oder mehr, 89 Gew.-% oder mehr, 90 Gew.-% oder mehr, 91 Gew.-% oder mehr, 92 Gew.-% oder mehr, 93 Gew.-% oder mehr, 94 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 95 Gew.-% oder mehr aufweist. Bevorzugt ist eine Wirtszelle, die ausgewählt ist aus Mikroorganismen den Gruppen der Gammaproteobacteria und der unklassifizierten Gammaproteobacteria. Vorzugsweise ist die Zelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mikroorganismen der Gattungen: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pectobacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea, Leucanea sowie Protaminobacter. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Klebsiella sp., besonders Stamm LX3 und Stamm NK33-98-8, Klebsiella pneumoniae, besonders Stamm 342; Enterobacter sp., besonders Stamm SZ62; Enterobacter sp., besonders Stamm FMB1 ; Rauoltella planticola; Pantoea dispersa; Erwinia rhapontici; Erwinia tasmaniensis, be- sonders Stamm Et1/99; Pectobacterium atrosepticum, besonders Stamm SCRI 1043; Pectobacterium carovotum, besonders Subspezies brasiliensis, besonders Stamm PBR 1692; Protaminobacter rubrum; Pseudomonas mesoacidophila; Serratia plymuthica sowie Azotobacter vinelandii und Leucanea leucocephalia. In einer besonders bevorzugten Variante ist die Zelle Protaminobacter rubrum (P. rubrum) oder ein davon abgeleiteter biotechnologisch einsetzbarer Stamm. Die Erfindung erstreckt sich auch auf immobilisierte und/oder auf andere Weise modifizierte Formen dieser Wirtszellen, die für biotechnologische Verfahren besonders geeignet sein können.
Besonders sind die Wirtszellen Deletionsmutanten für ein in der Zelle gegebe- nenfalls vorhandenes Sucrosemutase-Wildtypgen. Eine bevorzugte Variante ist eine Zelle, worin das in der Zelle vorhandene chromosomale Sucrosemutase Wildtypgen, gegen eine das erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutaseenzym kodierende Nucleotidsequenz im Chromosom ausgetauscht ist. In einer ersten Variante steht dieses erfindungsgemäße modifi- zierte Gen unter der Kontrolle des Promotors des Sucrosemutase Wildtypgens. In einer weiteren bevorzugten Variante dieses erfindungsgemäße modifizierte Gen unter der Kontrolle eines, bevorzugt endogenen homologen, Austauschpromotors. Ein solcher Promotor ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Promotor des Gens der 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat Synthase ribB, Promotor des Gens, welches das alter membrane Protein kodiert ompA, Promotor des Gens, welches den putativen Transkriptionsaktivator ECA2934 kodiert, Promotor des Gens der Ribonuklease E rne, Promotor des Operons des 50S-ribosomalen L21 -Proteins, Promotor des Operons des Kälteschockproteins CspE, Promotor des Operons des 50S-ribosomalen L28-Proteins und Promotor des Gens der NAD-abhängigen Epimerase-Dehydratase und funktioneller Promotorfragmente davon, die in der Lage sind, die Expression der erfindungsgemäßen modifizierten Sucrosemutase zu steuern. Es wird auf den Offenbarungsgehalt der DE 10 2009 053566 voll inhaltlich Bezug genommen, insbesondere auf die Tabellen 1A, 1 B und die Sequenzen SEQ ID No: 2 bis 21 des Sequenzprotokolls.
Die Erfindung betrifft auch Zellen, worin die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, besonders unter der Regulation mindestens eines der vorstehend charakterisierten Promotoren extrachromosomal (episomal) exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft auch Mittel zur Herstellung solcher Zellen. Ein solches Mit- tel ist das Polynucleotidmolekül, welches einen die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase kodierenden exprimierbaren Abschnitt in mindestens einer oder in mehrfacher Kopie enthält und zusätzlich zumindest ein weiteres, die Expression dieser Sucrosemutase regulierendes Element in mindestens einer oder in mehrfacher Kopie, insbesondere also ein Promotorelement. In einer alternati- ven Variante dieses Aspekts der Erfindung liegt das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, als Expressionskassette, in isolierter Form vor. Beispielsweise kann es so in eine Wirtszelle in an sich bekannter Weise transferiert werden. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen, zur Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose oder Isomal- tulose-Zusammensetzungen befähigten Zelle, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte enthält: In einem ersten Schritt wird ein Wildtypstamm oder ein bereits klassisch oder rekombinant modifizierter Stamm der Zelle be- reitgestellt; in einem zweiten Schritt wird dieser Stamm mit mindestens einem der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle, codierend die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase, und/oder mindestens einem der vorstehend charakterisierten Vektoren in Kontakt oder in Verbindung gebracht, so dass das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül in exprimierbarer Form in die Zelle eingeschleust wird.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „Isomaltulose- Zusammensetzung" das Isomerisierungsprodukt durch Aktivität der Sucrosemutase aus dem Substrat Saccharose verstanden. Dieses enthält zum weitaus überwiegenden Anteil Isomaltulose. Weitere Bestandteile sind insbesondere Trehalulose, Isomelezitose und Fructose und Glucose. Besonders wird darunter vor allem folgende Zusammensetzung verstanden: 80 bis 99 % Isomaltulose, 1 bis 10 % Trehalulose, 0 bis 0,5 % Isomelezitose, 0 bis 0,2 % Trisaccharide, 0 bis 5 % Monosaccharide und 0 bis 0,2 % Restsaccharide. Besonders bevorzugt beträgt der Anteil der Isomaltulose in der Isomaltulose- Zusammensetzung zumindest 85 Gew.-% oder mehr (bezogen auf Trockensubstanzgewicht der Isomaltulose-Zusammensetzung), bevorzugt 86 Gew.-% oder mehr, 87 Gew.-% oder mehr, 88 Gew.-% oder mehr, 89 Gew.-% oder mehr, 90 Gew.-% oder mehr, 91 Gew.-% oder mehr, 92 Gew.-% oder mehr, 93 Gew.-% oder mehr, 94 Gew.-% oder mehr, besonders bevorzugt 95 Gew.-% oder mehr. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose und/oder einer Isomaltulose-haltigen Zusammensetzung, aus dem Substrat Saccharose oder einem Saccharose-haltigen Substrat.
In einem ersten Aspekt ist dies ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose- haltigem Substrat, worin in einem ersten Schritt Saccharose-haltiges Substrat mit der erfindungsgemäßen Sucrosemutase oder mit dem Biokatalysator in Kontakt gebracht wird, und zwar unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. In einem weiteren Aspekt ist dies ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, worin in einem ersten Schritt enthaltend den Schritt: die vorstehend charakterisierte Zelle in einem Kulturmedium, welches das Substrat enthält, kultiviert wird, und zwar unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen. Bevorzugt wird in einem bevorzugt nachfolgenden Schritt die Isomaltulose oder die Isomaltulose-Zusammensetzung aus dem Kulturmedium isoliert. In einer besonderen Ausgestaltung der zellbasierten Herstellung sind die Zelle an oder in einer Matrix, besonders einer Alginatmatrix oder ähnliche, in an sich bekannter Weise immobilisiert. Dies ist besonders für die großtechnische Umset- zung von Saccharose in Isomaltulose oder die Isomaltulose-Zusammensetzung vorgesehen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen, vorstehend charakterisierten Zelle zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung, bevorzugt aus Saccharose oder einem Saccharose-haltigen Substrat, und bevorzugt nach dem hier beschriebenen Verfahren.
Weiter ist vorgesehen, das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, besonders in isolierter Form oder als Bestandteil eines Zellfragmentes, zur Entwicklung zellfreier Systeme und Biokatalysatoren zu verwenden. In einer bevorzugten Aus- gestaltung weist der Biokatalysator einen Träger auf, woran die erfindungsgemäß modifizierte Sucrosemutase immobilisiert vorliegt. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung wird das erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül, besonders in isolierter Form, nicht immobilisiert als Sucrosemutase-Biokatalysator eingesetzt, insbesondere in löslicher Form. Die Erfindung betrifft somit auch Biokatalysatoren, die im Wesentlichen zellfrei sind, und sich bevorzugt dadurch auszeichnen, dass die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutase daran immobilisiert vorliegt. Eine bevorzugte erste Variante sind an ein Substrat, vorzugsweise an eine Filtermembran, immobilisierte Zellfragmente. Alternativ bevorzugt liegt ein isoliertes, bevorzugt synthetisch in an sich bekannter Weise hergestelltes, erfindungsgemäßes Polyaminosäuremo- lekül vor, das die erfindungsgemäße modifizierte Sucrosemutaseaktivität aufweist. In einer alternativen bevorzugten Ausgestaltung ist der Biokatalysator durch das nicht immobilisierte isolierte erfindungsgemäße Polynucleotidmolekül mit Sucrosemutaseaktivität gebildet. Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären:
Figur 1 zeigt beispielhaft ein Vektormap des in Zusammenhang mit der Erfindung hergestellten smuA-Deletionsplasmids pUT-GntR-P3C1-DSmuA, enthaltend die Austauschsequenz nach SEQ ID NO: 1 (dunkelgraue Box). Dieser Be- reich zeigt stromaufwärts der smuA-Deletionsbereichs 1267 bp Homologie zum P. rubrum Chromosom. Dieser Bereich trägt Homologien zu einem GntR-Typ Transkriptionsregulatorgen und den narbenfrei eingeführten 3C1 -Promotor. Stromabwärts des smuA-Deletionsbereiches sind 655 bp homologe DNA- Sequenz vorhanden. Der eigentliche Deletionsbereich des smuA-Gens innerhalb der Austauschsequenz ist als Nukleotidsequenz vergrößert hervorgehoben. Das native smu-A-Startcodon ATG und ein TAA Stoppcodon sind unterstrichen. Eingeführte Schnittstellen-Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Nsil und Pmel sind ebenfalls durch gestrichelte Linien markiert. Das pUT-Derivat basiert auf einen R6K ori („origin of transfer") und trägt zur Selektion das Kanamy- cin-Resistenzgen aphll und das xy/E-Gen, das für eine Catechol-2,3 Dioxygena- se kodiert.
Figur 2 illustriert schematisch und beispielhaft das erfindungsgemäße Vorgehen zur Herstellung der smi/>4-Deletionsmutante P. rubrum 3C1 DsmuA: Austausch des nativen smuA-Gens durch homologe Rekombination. Auf Basis eines in der Wirtszelle P. rubrum 3C1 bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT-Vektor) wird bevorzugt in E. coli ein smu>4-Austauschplasmid konstruiert. Hierzu werden zwei DNA Fragmente stromaufwärts und stromabwärts des smuA-Gens basengenau amplifiziert und fusioniert (s. Fig. 1). Nach Ligation entsteht ein Xmal/Pstl- Fragment (s. SEQ ID No:2), das stromaufwärts des deletierten smuA-Gens ein 1267 bp großes DNA-Fragment, das den putativen gntR-Regulator kodiert und den 3C1 -Promotor trägt und stromabwärts von einem 655 bp großen DNA- Fragment flankiert wird. Das erzeugte Plasmid wird in der Wirtszelle, hier: P. rubrum 3C1 , transferiert. Durch Selektion auf vorzugsweise Kanamycin werden daraus solche Kolonien selektioniert, die Austauschplasmide im Chromosom tragen, die vorzugsweise über mindestens eine der beiden homologen Regionen ins Chromosom integrierten. Die Inkubation auf Kanamycin-freiem Medium erlaubt die Selektion von Deletionsstämmen, in denen das integrierte Plasmid über ein zweites Cross-over (zweites Rekombinationsereignis) wieder aus dem Chromosom desintegrierte. Solche Kolonien sind vorzugsweise durch das Fehlen der xy/E-Aktivität nach Catecholzugabe in an sich bekannter Weise phänotypisch nachweisbar (keine Gelbfärbung). Die erfolgreiche Herstellung des Deleti- onsstammes kann anschließend durch molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) in an sich bekannter Weise überprüft werden, um die vollständige Desintegration des Austauschplasmids, die zur Rekonstruktion des Wildtyps führt, zusätzlich ausschließen zu können.
Figur 3 illustriert schematisch und beispielhaft das erfindungsgemäße Vorgehen zur Expression von smty>A-Sequenzvarianten in der smu>A-Deletionsmutante P. rubrum 3C1DsmuA: Auf Basis eines in der Wirtszelle P. rubrum 3C1 DsmuA bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT-Vektor) wird bevorzugt in E. coli ein integratives smty \*-Expressionsplasmid konstruiert. Hierzu werden smuA*-Gene, die die vorgenannten erfindungsgemäßen durch Aminosäureaustausch abge- wandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren mit einem 1267 bp großen DNA-Fragment fusioniert, das den putativen g/?ff?-Regulator kodiert und den zur Expression notwendigen 3C1 -Promotor trägt. Anschließend erfolgt die Insertion des Fusionsprodukts in den bevorzugt nicht-replikativen Vektors (z.B. pUT- Vektor) Die erzeugten Plasmide werden in die Wirtszelle, hier: P. rubrum 3C1 DSmuA, transferiert. Durch Selektion auf vorzugsweise Kanamycin werden daraus solche Kolonien selektioniert, deren smt *-Expressionsplasmide über homologe Rekombination ins Chromosom integrierten. Die erfolgreiche Herstellung der Integrationsstämme kann anschließend durch molekularbiologische Methoden (z.B. PCR) in an sich bekannter Weise überprüft werden. Die Expres- sion der integrierten s/77t7>4*-Variantengene erfolgt durch den starken 3C1- Promotor.
Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID NO: 1 Aminosäuresequenz des Wildtyps Sucrosemutase SmuA aus P. rubrum nach Ravaud et al. 2009 (FEBS Letters 583, 1964-1968): TQQPLLNEKSIEQSKTIPKWWKEAVFYQVYPRSFKDTNGDGIGDINGIIEKLDYLKALGI DAIWINPHYDSPNTDNGYDIRDYRKIMKEYGTMEDFDRLISEMKKRNMRLMIDWINHTS DQNEWFVKSKSSKDNPYRGYYFWKDAKEGQAPNNYPSFFGGSAWQKDEKTNQYYLHYFAK QQPDLNWDNPKVRQDLYA LRFWLDKGVSGLRFDTVATYSKIPDFPNLTQQQLKNFAAEY TKGPNIHRYVNEMNKEVLSHYDIATAGEIFGVPLDQSIKFFDRRRDELNIAFTFDLIRLD RDSDQRWRRKDWKLSQFRQIIDNVDRTAGEYGWNAFFLDNHDNPRAVSHFGDDRPQWREP SAKALATLTLTQRATPFIYQGSELGMTNYPFKAIDEFDDIEVKGFWHDYVETGKVKADEF LQNVRLTSRDNSRTPFQ DGSKNAGFTSGKPWFKVNPNYQEINAVSQVTQPDSVFNYYRQ LIKIRHDIPALTYGTYTDLDPANDSVYAYTRSLGAEKYLWVNFKEQMMRYKLPDNLSIE KVI I DSNSKNVVKKNDSLLELKP QSGVYKLNQ SEQ ID NO:2 DNA Sequenz des 1942 bp großen Xmal/Pstl Fragmentes, das nach Klonierung in einen nichtreplikativen Vektor, z.B. in das smuA- Deletionsplasmid pUT-GntR-P3C1-DSmuA (Fig. 1) resultiert und zur Deletion des smuA-Gens durch homologe Rekombination eingesetzt werden kann. Die DNA-Sequenz resultiert aus einer Fusion von zwei DNA-Fragmenten, die in P. rubrum 3C1 stromaufwärts und -abwärts des zu deletierenden smuA-Gens lokalisiert sind. CCCGGGATCGCATTCATGTTTTCTCCTTCGGTGAAGTGGTCTACTTTTATGGCGATTTGT ATACATTAAAGTGATCAAGGAAAAAATAGCCAGAGGAATAGCCAAATAAATTTCAGGTTT TACAGTGCGGTAACCTCTTTTTGTTGCGCGGTTATCAGGATTCATTTAGGGATAAAGAGG TCTTCAAGTGATCTACAAAACGCTTGCTGAACGTCTGAGAATACGTATCAATTCTGCTGA TTTTGCTATCGGCGATGCTTTACCCAGTGAGAAACGTCTGGCTGCCGAATTTTCTGTATC GAGGATGACACTCCGCAAAGCGGTAAATTTACTGATTGAATGGGGGCTGGTACGTCGCTG TCACGGCAGCGGAACCTTCGTCGCGCAGAAAGATCTCCAACATGAAACTCGTGGGCTGAT GGGGTTTTCAGAACTGATGAAAGAACTGGGCCGCCCCACGGTGAGCGAGGTGCTGGAGTT TCGAATGATGGGAGCCCCCCCAGCCATCGCCAGCCAGCTGCGAATCAAGGCCGATGAACG CATTTACTATTCGCGTCGCGTAAGGTTTGTGGAAGGGAAGCCTGTGGTGCTGGAAGATAG TTACATGCCTGGCAGGTTATTTGGCAACCTTTCAGTCGCACATCTGGAGGGTTCAAAGTT TTCGTATATAGAAGACGAATGCCATATCAATATCGCAGGGAATTACGAAAGCTTCAGCCC GATCTTGGCAGACAGCACGATCGGCGCGCTACTGCACGTTGCCGAAGGCACGCCGCTGCT GCGCCTGACATCGCTTTCTTACAGTGATACCGGCGACTATATCAACTATTCGGTGATATT CAGAAA GC C AAT GAA AC C AC GT G GAC T AC C AT T T GAAG AGGAA AAAT AGC GGGC GAA
GGGGAGCTACATTCCTACTATATAGCAATTCTGTTGCCTAGTGTAATGCGAGTTGCCCGC CGGATAAACCAATAACCGCATTCTCCGCAGGGGGCCGAATTGTGCTTTTGCCAATTGCCC TGATTAATCATTAGCGTTATAGTCAGAATGCTTATTCTCAGGGCGGGGTGCAAGTCCCCA CCGGCGGTAAATCACCTTCTACGGTGAAAGCCCGCGAGCGCTCAGCCAGTCTCTTGTAGT TTGGTTAGAGGTCAGCAGATCCGGTGTAATTCCGGGGCCGACGGTTATAGTCCGGATGGG AGAGAGTAACGGTATCTGCCGGGCTTGCGCCCGCTTGCGTTATTTTTTTAGAAACAGGAG AGTATTGTAATGCATTTTGTTTAAACTAAATCAATAAATCTCATAGTCACGCCAAATAAT GTAAATATATTGAAACTATTAAAACCGGCATTTTATGCCGGTTTTTTTAGCGCAAAATAG GGCTGGCAAAGATAAAGCAGGAGGCTACCACCGTGAGCTATATGCTTTTTTAAAAGGCAA GATTCTCCATCGAGGCTCTGCCGTCACCCGAACGCGATAAACCGCGTTTATCCTCAGATG CCTGGCCGTTGCGCGCAAACGAAGACCGGGGTTTGAGGGCTTGTGGGGCAACGCCGGCGA GCCAGTCAGCTTCTCGTGGGTGCGAGCACATTGCTAATGAACAATCTCGCTTCAAATGTT ATCGTGAGAATGAAGTGTTGCAGTGGCGCCGCCGGGGTTTGCGCTCGATTCAGGTCTGAT TCACATAACAAGGTCACATGGAAATGAAAGTGTTATTCATCGCTTCGCTAGGCGCTTTAT CGTTAATGCAAGCATCATTCTCCTTCGCGGATAATGCCAATGGGAAAAACATCTATTCAC AGAGATGTACTATGTGCCACGGAACCGATCTCAAAGGCACGGGGCCATTGGCTGATAAAA CCAACCCGCCGACACCTGATCTGACAACCCCCGCTTTCAAAGCACGCCTCAATGATTATC CGGGCGTTATTGTATCCTGCAG
SEQ ID No: 3 Nukleotidsequenz des Vollängengens, das für die SmuA- Aminosäureaustauschvariante D302Y kodiert. Ausgetauschte Nukleotide sind hervorgehoben. ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATC TCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAG TCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCC TTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGAC TATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAAC ACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATG GAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGAT GTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAG GATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAAT AATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATAC TACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGT CAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTT GATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTG AAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATG AATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCC TTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACC TTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATTCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAA TTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGG AATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGAT CGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGA GCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCT ATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGA AAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGG ACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTC AAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCA GTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTAT GGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTT GGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTA CCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAA AAGAAT GAT T C AT T AC T C GAGC T AAAAC C AT GGC AGT C AGGGGT T A AAAC T ΑΆΑΤ C AA
TAA
SEQ ID No: 4 Nukleotidsequenz des Vollängengens, das für die SmuA- Doppelmutante D302Y/S303P kodiert. Ausgetauschte Nukleotide sind hervorgehoben. ATGCCCCGTCAAGGATTGAAAACTGCACTAGCGATTTTTCTAACCACATCATTATGCATC TCATGCCAGCAAGCCTTCGGTACGCAACAACCCTTGCTTAACGAAAAGAGTATCGAACAG TCGAAAACCATACCTAAATGGTGGAAGGAGGCTGTTTTTTATCAGGTGTATCCGCGCTCC TTTAAAGACACCAACGGAGATGGCATCGGGGATATTAACGGCATCATAGAAAAATTAGAC TATCTAAAAGCCTTGGGGATTGATGCCATTTGGATCAACCCACATTATGATTCTCCGAAC ACGGATAATGGTTACGATATACGTGATTATCGAAAAATCATGAAAGAATATGGCACGATG GAGGATTTTGACCGCCTGATTTCTGAAATGAAAAAACGGAATATGCGGTTGATGATTGAT GTGGTCATCAACCACACCAGCGATCAAAACGAATGGTTTGTTAAAAGTAAAAGCAGTAAG GATAATCCTTATCGCGGCTATTATTTCTGGAAAGATGCTAAAGAAGGGCAGGCGCCTAAT AATTACCCTTCATTCTTTGGTGGCTCGGCGTGGCAAAAAGATGAAAAGACCAATCAATAC TACCTGCACTATTTTGCTAAACAACAGCCTGACCTAAACTGGGATAATCCCAAAGTCCGT CAAGATCTTTATGCAATGTTACGTTTCTGGTTAGATAAAGGCGTGTCTGGTTTACGTTTT GATACGGTAGCGACCTACTCAAAAATTCCGGATTTCCCAAATCTCACCCAACAACAGCTG AAGAATTTTGCAGCGGAGTATACCAAGGGCCCTAATATTCATCGTTACGTCAATGAAATG AATAAAGAGGTCTTGTCTCATTACGACATTGCGACTGCCGGTGAAATCTTTGGCGTACCC TTGGATCAATCGATAAAGTTCTTCGATCGCCGCCGTGATGAGCTGAACATTGCATTTACC TTTGACTTAATCAGACTCGATCGATATCCTGATCAAAGATGGCGTCGAAAAGATTGGAAA TTGTCGCAATTCCGGCAGATCATCGATAACGTTGACCGTACTGCAGGAGAATATGGTTGG AATGCCTTCTTCTTGGATAACCACGACAATCCGCGCGCTGTCTCGCACTTTGGCGATGAT CGCCCACAATGGCGTGAGCCATCGGCTAAAGCGCTTGCAACCTTGACGCTGACTCAACGA GCAACACCTTTTATTTATCAAGGTTCAGAATTGGGCATGACCAATTACCCGTTTAAAGCT ATTGATGAATTCGATGATATTGAGGTGAAAGGTTTTTGGCATGACTACGTTGAGACAGGA AAGGTCAAAGCCGACGAGTTCTTGCAAAATGTACGCCTGACGAGCAGGGATAACAGCCGG ACGCCGTTCCAATGGGATGGGAGCAAAAATGCAGGATTCACGAGCGGAAAACCTTGGTTC AAGGTCAACCCAAACTACCAGGAAATCAATGCAGTAAGTCAAGTCACACAACCCGACTCA GTATTTAACTATTATCGTCAGTTGATCAAGATAAGGCATGACATCCCGGCACTGACCTAT GGTACATACACCGATTTGGATCCTGCAAATGATTCGGTCTACGCCTATACACGCAGCCTT GGGGCGGAAAAATATCTTGTTGTTGTTAACTTCAAGGAGCAAATGATGAGATATAAATTA CCGGATAATTTATCCATTGAGAAAGTGATTATAGACAGCAACAGCAAAAACGTGGTGAAA AAGAATGATTCATTACTCGAGCTAAAACCATGGCAGTCAGGGGTTTATAAACTAAATCAA TAA
Beispiel : Austausch des smuA Wildtypgens gegen smuA-
Seguenzvariantengene in P. rubrum 3C1/Z12A
Die Charakterisierung erfindungsgemäßer modifizierter Sucrosemutaseenzymva- rianten (SmuA*) erfolgt in dem P. rubrum Stamm 3C1. In diesem Stamm ist die SmuA Expression durch den narbenfreien Austausch des nativen smuA- Promotors gegen den homologen Promotor des 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4- Phosphat-Synthasegens ribB signifikant erhöht (r/bß-Promotorsequenz in Stamm 3C1 , s, SEQ ID No:2 Nukleotidposition 1013-1270). Zur Bestimmung der Sucro- semutase-Produktspezifität erfindungsgemäßer SmuA*-Sequenzvarianten, wurde zunächst das im P. rubrum Stamm 3C1 vorhandene smuA-Wildtypgen durch homologe Rekombination deletiert. Im Anschluss werden SmuA*-Varianten kodierende Gene in die smoA-Deletionsmutante durch homologe Rekombination integriert. Diese Vorgehensweise erlaubt die Expression von sequenzmodifizierten Genen im homologen System und die detaillierte Bestimmung der Produkts pezifität erfindungsgemäßer Sequenzvarianten ohne eine Beeinflussung durch SmuA-Wildtypaktivitäten.
1.1. Deletion des s/7?u>A-Wildtypgens in P. rubrum 3C1 /Z12A Alle Klonierungen und DNA-Modifikationen werden wie unter Sambrook et al., 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Labo- ratory, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben, durchgeführt. PCR-Ansätze, Kits zur Nukleinsäureisolie-rung, Detektions- und Selektionsverfahren und die Kultivierung wurden in an sich bekannter Weise, soweit nicht anderes angegeben, nach Angaben der jeweiligen Hersteller durchgeführt.
Die Deletion des smu l-Wildtypgens in P. rubrum 3C1/Z12A erfolgt durch homologe Rekombination. Hierzu werden zwei DNA Fragmente stromaufwärts und stromabwärts des smuA-Gens basengenau amplifiziert und durch z.B. ligasefreie Klonierung (Geu-Flores, F. et al. 2007, Nucleic Acids Research 35 (7): e55) zu- sammengefügt (s. Fig. 1 ). Alternativ besteht die Möglichkeit, das gewünschte DNA-Fragment durch DNA-Synthese herzustellen. Nach Ligation oder Synthese entsteht ein Xmal/Pstl-Fragment (s. SEQ ID No:2), das stromaufwärts des dele- tierten smuA-Gens einen Bereich von 1267 bp homologer Sequenz zum P. rubrum 3C1 Chromosom aufweist. Dieser Bereich kodiert zum einen für einen „Offenen Leserahmen" (ORF), der hohe Homologien zu GntR-Typ Transkriptionsregulatoren aufweist und trägt zum anderen den P. rubrum homologen Promotor 3C1 des 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat Synthasegens ribB. Stromabwärts des deletierten smtv>A-Gens beträgt der zum P. rubrum Chromosom homologe Bereich 655 bp. Zur Durchführung der eigentlichen smuA-Deletion wird das 1942 bp große Xmal/Pstl-Fragment in einen geeigneten Genaustauschvektor Moniert, der in P. rubrum nicht repliziert. In P. rubrum zum Genaustausch geeignete Basisvektoren stellen sogenannte pUT-Derivate dar, die auf einen R6K Replikationsursprung basieren (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67). Diese Vektoren repli- zieren nur dann, wenn das für die Replikation essentielle π-Protein kodierende pir-Gen anwesend ist. Ein solcher Stamm ist E. coli S17-1 pir (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67), er wird zur Konstruktion der jeweiligen Promo- toraustauschplasmide eingesetzt. Ein exemplarisches finales Deletionskonstrukt (pUT-GntR-P3C1-DSmuA), das nach homologer Rekombination die basengenaue Deletion von smuA vermittelt, ist in Figur 1 dargestellt. Der Transfer des hergestellten smu^-Deletionsplasmids nach P. rubrum 3C1 wird bevorzugt durch eine intergenerische Konjugation zwischen E. coli S17- 1 λρΐΓ und P. rubrum realisiert. Die eingesetzten pUT-Plasmide tragen einen„Ori- gin of Transfer" (oriT) des RP4 Plasmids und können durch das in E. coli S17- λρ/'r chromosomal integrierte RP4 Plasmid nach P. rubrum mobilisiert werden (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67).
Die Bedingungen der intergenerischen Konjugation wurden wie folgt optimiert: Die Selektion potentieller P. rubrum 3C1 Transkonjuganten erfordert einen in P. rubrum selektionierbaren Plasmidmarker (z.B. aphll, Kanamycin-Resistenz), und eine Möglichkeit, den E. coli Donor selektiv zu inhibieren. Durch Ausplattieren auf Rifamycin-haltigem Medium (100 pg/ml) werden spontan Rifamycin-resistente P. rubrum 3C1 Kolonien generiert (P. rubrum 3C1 Rif), die sich ansonsten nicht vom Wildtyp unterscheiden. Die Konjugation wird wie folgt ausgeführt:
E. coli SM- λρ/'r Donorstämme, die das smivA-Austauschplasmid tragen, werden über Nacht in 5 ml dYT Medium (pro 1 Liter: 16 g Bacto Trypton, 10 g Bacto Yeast Extract und 5 g NaCI) unter Zusatz von Kanamycin (50 pg/ml) bei 37°C angezogen. Der Rezipient P. rubrum 3C1 wurde ebenfalls über Nacht in 5 ml dYT unter Zusatz von Rifamycin (100 pg/ml) bei 30°C angezogen. Jeweils 1 ml der Übernachtkultur werden in Erlenmeyerkolben mit 100 ml dYT-Medium (Zusätze siehe oben) überimpft und bei 30°C (P. rubrum 3C1 ) bzw. 37°C (E. coli) und 250 Upm bis zu einer OD (600 nm) von 0,4 bis 0,8 inkubiert. Donor und Rezipient werden im Verhältnis 1 :4 gemischt, abzentrifugiert, mit 1 ml dYT gewaschen und final in 100 μΙ dYT-Medium aufgenommen. Die Suspension wird auf einen Nitrocellulose-Filter (0,45 pm Porengröße) pipettiert, der sich auf einer dYT-Platte befindet und über Nacht bei 30° inkubiert. Die Zellen werden an- schließend mit 1 ml dYT vom Filter abgeschwemmt, verdünnt, auf Selektionsplatten ausplattiert (dYT + Kanamycin 50 pg/ml und Rifamycin 100 pg/ml) und über Nacht bei 30°C inkubiert. Durch die Kanamycin Selektion werden solche P. rubrum 3C1 Transkonjuganten erhalten, in denen die Plasmide vorzugsweise über eine der beiden homologen Regionen ins Chromosom integrierten (Figur 1 ). Die Inkubation auf Kanamycin- freiem Medium erlaubt die Selektion von smuA Deletionsstämmen, in denen das integrierte Plasmid über ein zweites cross-over aus dem Chromosom desintegriert ist.
Zum Nachweis einer erfolgreichen Desintegration kann ein auf den Austauschplasmiden vorhandenes Farbmarkergen xylE eingesetzt werden. Das xy/E-Gen kodiert für eine Catechol-2,3 Dioxygenase, die Catechol zur 2- Hydroxymuconsäure-Semialdehyd umsetzt, was phänotypisch durch markante Gelbfärbung erkennbar ist. Die Desintegration der zuvor integrierten Austauschplasmide ist ein seltenes Ereignis (1 unter 1000 Kolonien) und kann mit Hilfe dieses Markers durch die in den gewünschten Klonen ausbleibende Gelbfärbung nach Catecholzugabe (Sprühreagenz: 0,2 ml einer 0,5 mol/l wässri- gen Lösung) detektiert werden. Da die Desintegration des Austauschplasmids auch die Rekonstitution des Wildtyps zur Folge haben könnte, können alle generierten smuA-Deletionsstämme durch PCR-Experimente, Southern-Blot Analysen und genomische Sequenzierungen überprüft und verifiziert werden. Der smuA- Deletionsstamm wird mit P. rubrum 3C1 DSmuA bezeichnet (Fig. 2). 1.2. Herstellung von Sequenzvarianten und deren Integration in P. rubrum 3C1 DSmuA
Polynukleotidmoleküle, die die vorgenannten erfindungsgemäßen durch Aminosäureaustausch abgewandelten Aminosäuresequenzen von SmuA kodieren, können durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Methoden, wie z.B. Gen- Synthese, Ligase-freie Klonierung, oder Overlap-Extension-PCR generiert werden. Exemplarisch wird die Herstellung und Testung von zwei Sequenzvarianten, D302Y und der Doppelmutante D302Y/S303P beschrieben (Referenzsequenz ist SEQ-ID No: 1). SEQ-ID-No. 3 beschreibt die Nukleotidsequenz des Vollängen- gens, das für die SmuA-Aminosäureaustauschvariante D302Y kodiert und SEQ- ID-No. 4 beschreibt die Nukleotidsequenz des Volllängengens, das für die SmuA-Doppelmutante D302Y/S303P kodiert.
Modifizierte smuA Gensequenzvarianten (smuA*), die für erfindungsgemäße Aminosäureaustausche von SmuA (SmuA*) kodieren, können zur Expression in den unter Beispiel 1.1. beschriebenen SmuA-Deletionsstamm transferiert wer- den. Dazu wird das entsprechende smUiA*-Variantengen durch Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden, wie z.B. ligasefreie Klonierung (s.o.), ba- Sengenau in ein nichtreplikatives pUT-Derivat kloniert. Wie in Fig. 3 dargestellt trägt ein solches Plasmid, wie pUT-GntR-P3C1-SmuA*, neben dem smuA- Variantengen smuA*, stromaufwärts von smuA* einen 1267 bp großen Bereich, der Homologien zum Chromosom des smty>A-Deletionsstammes P. rubrum 3C1 DSmuA aufweist. Über diesen Bereich kann das Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom von P. rubrum 3C1 DSmuA integrieren (Fig. 3). Der Transfer kann durch intergenerische Konjugation (s. Beispiel 1.1.) erfolgen. Durch Kanamycin Selektion werden solche Transkonjuganten erhalten, in denen die Plasmide über die homologe Region stromaufwärts von smuA* ins Chromosom integrierten.
Der Nachweis der korrekten Integration erfolgt über PCR-Experimente. Verifizierte Transkonjuganten tragen smtv/l *-Variantengene, die durch den starken 3C1 Promotor konstitutiv exprimiert werden. Die in diesen Stämmen produzierten erfindungsgemäßen, durch Aminosäureaustausch abgewandelten SmuA- Sequenzvarianten werden anschließend hinsichtlich ihrer Produktspektren in Ganzzellbiotransformationen analysiert.
Beispiel 2: Produktspektrum erfindungsgemäßer SmuA-Variantenstämme in P. rubrum 3C1/Z12A
2.1 Analyse der Kohlenhydratzusammensetzung mittels HPLC
Die Bestimmung der aufgetrennten Kohlenhydrate erfolgt über HPLC mit folgenden Komponenten: HPLC Pumpe; Probengeber; Rl (Brechungsindex)-Detektor; Vorsäule: 10 mm x 4,6 mm, Aminophase (z.B. Zorbax-NH2); Trennsäule: 250 mm x 4,6 mm, Aminophase (z.B. Zorbax-NH2); Interface, Computer und Software zur Messdatenerfassung und -auswertung.
Die Messung wurde unter folgenden chromatographischen Bedingungen durchgeführt: Injektionsvolumen: 10 μΙ; Flussrate: 1 ,0 bis 1 ,8 ml/min. Die einzustellende Flussrate für eine optimale Trennung hängt von Art und Zustand der Trennsäule sowie der Laufmittelzusammensetzung ab. Weitere Analyseparameter siehe Tabelle 1. Tabelle 1 :
Gerät: HP1 100 HPLC-System
Säule(n): Zorbax-NH2 250 x 4,6 mm, bei Raumtemp.
5 pm mit Vorsäule 10 x 4,6 mm
Detektor: Brechungsindex-Detektor auf 30 °C temperiert
Lauf mittel: Acetonitril 73 % (v/v) Fluß: 1 ,400 ml/min
Injektionsvolumen: 10 μί
Analysenzeit: 30 min
Proben10 %ige Probelösung
konzentration
2.2 Ganzzellbiotransformation im Schüttelkolben
Die Anzucht der erfindungsgemäßen Stämme und von Wildtyp-Kontrollstämmen erfolgte in 30 ml LB-Medium (Start-OD60o von 0,05). Die Kulturen wurden jeweils bei 30 °C, 200 Upm im Horizontalschüttler inkubiert. Nach zunächst 24 Stunden Fermentation werden 5 x OD Zellen entnommen, abzentrifugiert und mit 1 ml CaAcetat-Puffer (0,01 mol/l, pH 5,5) gewaschen. Die Zellpellets (entsprechend 5 x OD Zellen) wurden jeweils in 1 ,25 ml CaAcetat-Puffer (0,01 mol/l, pH 5,5) mit einer Saccharoselösung von 0,584 mol/l (200 g/l) resuspendiert. Die Ansätze wurden zu Biotransformation in Deep-Well Platten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 90 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzebehandlung (5 min 98 °C) gestoppt.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der HPLC-Analyse der Überstände nach Fermentation unter Saccharoseanzucht.
Tabelle 2:
Figure imgf000044_0001

Claims

Patentansprüche
1. Sucrosemutaseenzym mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Aminosäuresequenzen, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz einen oder mehrere Aminosäureaustausche, ausgewählt aus: S303P, D302Y, K180P, M199I, Q276A, A198D, Y219F, V324T, T369L und A346Q, aufweisen:
2. Sucrosemutaseenzym nach dem vorstehenden Anspruch mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz den Aminosäureaustausch S303P aufweist.
3. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch D302Y aufweist.
4. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 darge- stellten Sequenz zumindest die Aminosäureaustausche S303P und D302Y aufweist.
5. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch K180P aufweist.
6. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch M199I aufweist.
7. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 darge- stellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch Q276A aufweist.
8. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch A198D aufweist.
9. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch Y219F aufweist.
10. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch V324T aufweist.
11. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch T369L aufweist.
12. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz zumindest den Aminosäureaustausch A346Q aufweist.
13. Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Enzym als isoliertes Polyaminosäuremolekül vorliegt.
14. Biokatalysator, enthaltend an einen Träger immobilisiert das Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche.
15. Polynucleotidmolekül, codierend das Sucrosemutaseenzym nach einem der vorstehenden Ansprüche.
16. Vektor, enthaltend eines oder mehrere Polynucleotidmoleküle nach Anspruch 15.
17. Zelle, enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 16.
18. Zelle nach Anspruch 17 enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 im Chromosom der Zelle.
19. Zelle nach Anspruch 17, enthaltend das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 extrachromosomal (episomal).
20. Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Mikroorganismen der Gattungen: Escherichia, Salmonella, Serratia, Erwinia, Enterobacter, Klebsiella, Rauoltella, Pecto- bacterium, Pseudomonas, Azotobacter, Pantoea Leucanea und Protami- nobacter.
21. Zelle nach Anspruch 20, ausgewählt aus Organismen der Species Protaminobacter rubrum.
22. Verfahren zur Herstellung einer in einem der Ansprüche 17 bis 21 charakterisierten Zelle, enthaltend die Schritte:
- Bereitstellen einer Zelle und
- Inkontaktbringen des Stamms mit dem Polynucleotidmolekül nach Anspruch 15 und/oder dem Vektor nach Anspruch 16.
23. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, enthaltend den Schritt: Inkontaktbringen des Saccharose- haltigen Substrats mit dem Sucrosemutaseenzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder des Biokatalysators nach Anspruch 14 unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen.
24. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Isomaltulose oder einer Isomaltulose-Zusammensetzung aus Saccharose-haltigem Substrat, enthaltend den Schritt: Kultivieren der Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 21 oder der gemäß dem Verfahren nach Anspruch 22 herstellbaren Zelle in einem Kulturmedium enthaltend das Substrat, unter Bedingungen, die eine Umsetzung des Substrats in Isomaltulose oder eine Isomaltulose-Zusammensetzung ermöglichen.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Zelle bei der Umsetzung in einer Matrix immobilisiert ist.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, weiter enthaltend Schritt: Isolieren der Isomaltulose oder Isomaltulose-Zusammensetzung aus dem Kulturedium und/oder der Zelle.
PCT/EP2010/007767 2009-12-23 2010-12-18 Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität WO2011076370A1 (de)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012545146A JP2013515462A (ja) 2009-12-23 2010-12-18 改善された生成物特異性を有するスクロースムターゼ
EP10794900A EP2516642A1 (de) 2009-12-23 2010-12-18 Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität
US13/518,849 US8691535B2 (en) 2009-12-23 2010-12-18 Sucrose mutase with improved product specificity
CN2010800585706A CN102695793A (zh) 2009-12-23 2010-12-18 具有改进的产品特异性的蔗糖变位酶

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009060935.0 2009-12-23
DE102009060935A DE102009060935A1 (de) 2009-12-23 2009-12-23 Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifität

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011076370A1 true WO2011076370A1 (de) 2011-06-30

Family

ID=43836815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/007767 WO2011076370A1 (de) 2009-12-23 2010-12-18 Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8691535B2 (de)
EP (1) EP2516642A1 (de)
JP (1) JP2013515462A (de)
CN (1) CN102695793A (de)
DE (1) DE102009060935A1 (de)
WO (1) WO2011076370A1 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210196804A1 (en) * 2018-08-22 2021-07-01 Dsm Ip Assets B.V. Sucrose isomerases as food and nutritional supplements
EP3653708A1 (de) * 2018-11-14 2020-05-20 Evonik Operations GmbH Isomaltuloseherstellung

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985622A (en) * 1994-01-19 1999-11-16 Sudzucker Aktiengesellschaft Preparation of acariogenic sugar substitutes
DE10045182A1 (de) * 2000-02-14 2001-08-16 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen
WO2004005504A1 (de) * 2002-07-04 2004-01-15 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
DE102009053566A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3528752A1 (de) 1985-04-27 1986-10-30 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Kontinuierliches verfahren zur enzymatischen herstellung von isomaltulose
BR9709100A (pt) * 1996-05-17 2000-01-11 Xyrofin Oy Processos para a isomerização de sacarose em isomaltulose e para a produção de isomalte a partir de sacarose, e, veìculo adaptado para uso em um processo microbiano para a isomerização de sacarose em isomaltulose.
AUPQ976800A0 (en) * 2000-08-29 2000-09-21 University Of Queensland, The Novel polypeptides and polynucleotides and uses therefor

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985622A (en) * 1994-01-19 1999-11-16 Sudzucker Aktiengesellschaft Preparation of acariogenic sugar substitutes
DE10045182A1 (de) * 2000-02-14 2001-08-16 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen
WO2004005504A1 (de) * 2002-07-04 2004-01-15 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Verfahren zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
DE102009053566A1 (de) 2009-11-11 2011-05-12 Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt Mikroorganismen mit gesteigerter Sucrosemutaseaktivität

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE UniProt [online] 1 June 2001 (2001-06-01), "SubName: Full=Sucrose isomerase;", XP002633286, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9AI64 Database accession no. Q9AI64 *
DATABASE UniProt [online] 1 October 2000 (2000-10-01), "RecName: Full=Oligo-1,6-glucosidase; EC=3.2.1.10; AltName: Full=Dextrin 6-alpha-D-glucanohydrolase; AltName: Full=Oligosaccharide alpha-1,6-glucosidase; AltName: Full=Sucrase-isomaltase; Short=Isomaltase;", XP002633288, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q9K8U9 Database accession no. Q9K8U9 *
DATABASE UniProt [online] 5 July 2004 (2004-07-05), "SubName: Full=Sucrose isomerase;", XP002633287, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:Q6XNK5 Database accession no. Q6XNK5 *
GEU-FLORES, F. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 7, 2007, pages E55
HERRERO ET AL., J. BACTERIOL., vol. 172, 1990, pages 6557 - 67
P. RUBRUM NACH RAVAUD ET AL., FEBS LETTERS, vol. 583, 2009, pages 1964 - 1968
SAMBROOK ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY

Also Published As

Publication number Publication date
DE102009060935A1 (de) 2011-06-30
US8691535B2 (en) 2014-04-08
CN102695793A (zh) 2012-09-26
EP2516642A1 (de) 2012-10-31
JP2013515462A (ja) 2013-05-09
US20120315673A1 (en) 2012-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AT504347A4 (de) Verfahren zur herstellung von glucosederivaten
DE4447471C2 (de) Protein mit Palatinase-Aktivität und dafür codierende Nukleinsäure
US9885030B2 (en) Polynucleotide for recombinant expression of sucrose isomerase
EP2836592B1 (de) Acetyltransferase von wickerhamomyces ciferrii
DE60035801T2 (de) Bakterielle stämme von genus klebsiella und deren gen kodierend für isomaltulose synthase
WO2001000847A1 (de) Die sequenz der dihydroorotat-dehydrogenase aus corynebacterium glutamicum und deren einsatz bei der mikrobiellen produktion von pyrimidinen und/oder mit pyrimidin verwandten verbindungen
DE102008063234B4 (de) Biotechnologische Herstellung von Riboflavin mit hoher Ausbeute
DE19622783A1 (de) Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung
WO2020083415A1 (de) Bereitstellung von malonyl-coa in coryneformen bakterien sowie verfahren zur herstellung von polyphenolen und polyketiden mit coryneformen bakterien
EP2516642A1 (de) Sucrosemutase mit verbesserter produktspezifität
EP2499253B1 (de) Mikroorganismen mit gesteigerter sucrosemutaseaktivität
CN110872586B (zh) 固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷d的方法
DE69731807T2 (de) Prozess für die präparation von daunorubicin
DE60029818T2 (de) Neue verwendung von uridindiphosphat-glukose 4-epimerase
KR20160014818A (ko) 변이된 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법
DE60200426T2 (de) Polynukleotide, die für die Typ III, II und I Erythrose Reductasen aus Trichosporonoides megachilensis kodieren und ihre Verwendung zur Herstellung von Erythritol
EP1244791B1 (de) Verfahren zur herstellung von 6-o-alpha-d-glucopyranosyl-d-sorbit
KR20230095539A (ko) 패니바실러스 무실라지노서스 유래 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도
WO2020011294A1 (de) D-xylose-dehydrogenase aus coryneformen bakterien und verfahren zur herstellung von d-xylonat

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10794900

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010794900

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012545146

Country of ref document: JP

Ref document number: 13518849

Country of ref document: US