DE69731807T2

DE69731807T2 - Prozess für die präparation von daunorubicin

Info

Publication number: DE69731807T2
Application number: DE69731807T
Authority: DE
Inventors: Claudio Scotti; R. Charles HUTCHINSON; Luisa Anna COLOMBO; Silvia Filippini
Original assignee: Pharmacia Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-05-17
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2017-05-18
Also published as: EP0846175B1; JPH11510710A; DE69731807D1; WO1997047747A1; US5652125A; EP0846175A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Herstellung von Daunorubicin durch Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin durch einen rekombinanten Stamm, der eine Deletion in einem Gen des Daunorubicin-Metabolismus trägt und mit dem Gen, das für ein anderes Enzym der Daunorubicin-Biosynthese kodiert, transformiert ist.
Hintergrund der Erfindung
Die Anthracycline der Daunorubicin-Gruppe, wie zum Beispiel Doxorubicin, Carbinomycin und Aclacinomycin und ihre synthetischen Analoge sind unter den am weitest verwendeten Wirkstoffen in der Anti-Tumor-Therapie [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, Seiten 12–25; A. Grein, Process Biochem. 16: 34 (1981); T. Kaneko, Chimicaoggi May: 11 (1988); C. E. Myers et al., "Biochemical mechanismus of tumor cell kill". In: Anthracycline and Anthracenedione-Based Anti-Cancer Agents (Lown, J. W., Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, Seiten 527–569, 1988; J. W. Lown, Pharmac. Ther. 60: 185–214 (1993)].
Die Anthracycline der Daunorubicin-Gruppe sind natürlich vorkommende Verbindungen, die durch verschieden Stämme von Streptomyces und durch Actinomyces carminata produziert werden. Doxorubicin wird hauptsächlich von S. peucetius subsp. caesius produziert, während Daunorubicin von S. peucetius, ebenso wie anderen Streptomyces produziert wird, zum Beispiel ist S. peucetius ATCC 27952 beschrieben in USA 3,590,028, S. peucetius 29050 in USA 4,012,284, ebenso wie die anderen Streptomyces.
Insbesondere werden das Doxorubicin und das Daunorubicin von S. peucetius, ATCC 29050 und 27952, aus Malonsäure, Propionsäure und Glucose gemacht, durch den Synthese-Weg, der in Grein, Advan. Appl. Microbiol. 32: 203 (1987) und in Eckardt und Wagner, J. Basic Microbiol. 28: 137 (1988) zusammengefaßt ist. Aklavinon (11-deoxy-ε-Rhodomycinon), ε-Rhodomycinon und Carminomycin sind feststehende Intermediate in diesem Verfahren. Der letzte Schritt in diesem Synthese-Weg in S. peucetius 27952 schließt die Hydroxylierung von Daunorubicin zu Doxorubicin ein [F. Arcamone et al., Biotechnol. Bioeng. 11: 1101 (1969)].
Daunorubicin ist dafür bekannt, dass es in 4'-O-Glycoside, genannt Baumycine, in Streptomyces Spezies umgewandelt wird [Y. Takahashi, H. Naganawa, T. Takeuchi, H. Umezawa, T. Komiyama, t. Oki und T. Inui. J. Antibiot. 30: 622 (1977)].
Desweiteren produzieren die S. peucetius 29050- und 27952-Stämme üblicherweise viel mehr ε-Rhodomycinon als Daunorubicin oder Doxorubicin. Da das therapeutisch wertlose ε-Rhodomycinon nicht leicht in die wichtigen Anti-Tumor-Anthracyclin-Arzneistoffe durch chemische Synthese oder Biotransformation umgewandelt werden kann, stellt es ein kommerziell nutzloses Nebenprodukt von Daunorubicin-Fermentationen dar.
Bis jetzt wurden verschieden Gene für die Daunorubicin- und Doxorubicin-Biosynthese und Resistenz aus S. peucetius 29050 und S. peucetius 27952 durch Klonierungs-Experimente erhalten, aber keines von ihnen wurde dahingehend identifiziert, dass es seinem Wirt die Fähigkeit zur Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin verleihen würde.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung von Daunorubicin durch einen bakteriellen Wirt, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert wurde, der eine DNA umfasst, die für ein Protein kodiert, das erforderlich ist für die Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin, vorzugsweise mit der Konfiguration von Restriktions-Stellen, die in 1 gezeigt ist, oder einem Restriktions-Fragment, das davon angeleitet ist, das ein Gen enthält, das für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Protein kodiert.
Vorzugsweise ist der bakterielle Wirt ein Stamm von Streptomyces spp, der Daunorubicin produziert, mit einer Mutation, die die Funktion eines Gens des Daunorubicin-Metabolsimus blockiert. Das blockierte Gen ist vorzugsweise in dem DNA-Fragment umfasst, das die Konfiguration von Restriktions-Stellen hat, die in 2 gezeigt ist, oder in einem Fragment, das davon angeleitet ist, welches ein Gen enthält, dnr-ORF6, das für ein Protein kodiert, das in den Metabolismus von Daunorubicin involviert ist. Der Streptomyces-Wirt mit einer Mutation in dnr-ORF6 wird mit einem rekombinanten Vektor transformiert, der eine Insert-DNA hat, die für ein ε-Rhodomycinon-Konversions-Protein kodiert, vorzugsweise mit der Konfiguration von Restriktions-Stellen, die in 1 gezeigt ist, oder einem Restriktions-Fragment, das davon abgeleitet ist, welches ein Gen enthält, dnrT, das für dieses Protein kodiert.
Die Erfindung stell ebenfalls folgendes bereit:

a) Ein DNA-Segment, das ein ε-Rhodomycinon-Konversions-Protein kodiert, vorzugsweise das, welches in 1 gezeigt ist, Sequenzidentifikationsnr. 1, oder ein Restriktions-Fragment, das davon angeleitet ist, das ein Gen dnrT enthält, welches für dieses Protein kodiert;
b) rekombinante Vektoren, die in der Lage sind, die Anzahl von Kopien des dnrT-Gens und die Menge seines Produkts in einem Stamm von Streptomyces spp, der Daunorubicin produziert, zu erhöhen;
c) ein Stamm von S. peucetius, vorzugsweise ATCC 29050, der eine Mutation hat, die die Funktion des dnr-ORF6-Gens blockiert, in welchen solche rekombinanten Vektoren durch Transformation eingeführt werden können, wodurch die Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin erhöht wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktions-Karten-Analyse der DNA der Erfindung, pWHM954. Dies ist ein Insert in das rekombinante Plasmid pWHM3, ein Escherichia coli-Streptomyces Shuttle-Vektor [Vara et al., J. Bacteriol. 171: 5872 (1989)], welcher konstruiert wurde durch Insertion eines 2,97 kb SacI-BsaAI DNA-Fragments, das das dnrT-Gen enthält, oder irgend eines anderen Fragments von mindestens 1,52 kb, das das gesamte dnrT-Gen enthält, welches erhalten wurde aus Klonen, die in Stutzman-Engwall und Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3135 (1988) und Otten et al., J. Bacteriol. 172: 3427 (1990) beschrieben sind, in die SacI-HincII-Stellen der Polylinker-Region von pUC19 [Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103 (1985)], wonach das Gen als ein EcoRI-HindIII-Segment in die Polylinker-Region von pWHM3 bewegt wird. Die Karte, die in 1 gezeigt ist, stellt nicht notwendigerweise eine abschließende Auflistung von allen Restriktions-Stellen bereit, die in dem DNA-Segment vorhanden sind. Jedoch sind die gezeigten Stellen ausreichend für eine unzweifelhafte Erkennung der Segmente.
Sequenzidentifikationsnr. 1 ist eine schematische Veranschaulichung einer Nukleotid-Sequenz des dnrT DNA-Segments, welches dem entspricht, das ein Protein kodiert, das für die Daunorubicin-Biosynthese erforderlich ist. Dies deckt das meiste der Region zwischen der EcoRi- und der HindIII-Restriktions-Stelle von pWHM954 ab und zeigt den kodierenden Strang in der 5'- bis 3'-Richtung. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des translatierten offenen Lese-Rahmens, die ein Protein kodiert, das für die Daunorubicin-Biosynthese erforderlich ist, ist unten, unter der Nukleotid-Sequenz des dnrT-Gens, als Sequenzidentifikationsnr. 2 gezeigt.
2 ist die Restriktions-Karten-Analyse der zweiten DNA, pWHM952, deren Funktion blockiert ist, für eine weitere Aufgabe der Erfindung. Dies ist ein Insert in das rekombinante Plasmid pWHM3, welches konstruiert wurde durch Insertion eines 2,93 kb AgeI-AvrII DNA-Fragments, welches erhalten wurde aus Klonen, die in Stutzman-Engwall und Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3135 (1988) und Otten et al., J. Bacteriol. 172: 3427 (1990) beschrieben sind, in die XmaI-XbaI-Stellen der Polylinker-Region von pUC19, wonach das Gen als ein EcoRi-PstI-Segment in die Polylinker-Region von PWHM3 bewegt wird. Die Karte, die in 2 gezeigt ist, stellt nicht notwendigerweise eine abschließende Auflistung von allen Restriktions-Stellen bereit, die in dem DNA-Segment vorhanden sind. Jedoch sind die gezeigten Stellen ausreichend für eine unzweifelhafte Erkennung der Segmente.
Sequenzidentifikationsnr. 3 ist eine schematische Veranschaulichung einer Nukleotid-Sequenz des dnr-ORF6 DNA-Segments, welches dem entspricht, das ein Protein kodiert, das erforderlich ist, für den Daunorubicin-Metabolismus. Dies deckt das meiste der Region zwischen der EcoRi und der PstI-Restriktions-Stelle von pWHM952 ab und zeigt den kodierenden Strang in der 5'- zu 3'-Richtung. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von dem translatierten offenen Lese-Rahmen, die ein Protein kodiert, das für den Daunorubicin-Metabolismus erforderlich ist, ist unten, unter der Nukleotid-Sequenz des dnr-ORF6-Gens, als Sequenzidentifikationsnr. 4 gezeigt.
3 ist eine Restriktions-Karte für die dnr-ORF6 und dnrT-Gen-Region. Der Ort und die Richtung der Transkription der zwei Gene sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die Fragmente, die für die Konstruktion der Plasmide pWHM962, pWHM959, pWHM954 und pWHM952 verwendet wurden, sind in dem unteren Abschnitt gezeigt. Restriktions-Stellen-Abkürzungen: Ac, AccI; Ag, AgeI; Al, AlwNI; Av, AvrII; Ba, BamHI, Bs, BsaAI; NarI; Sa, SacI; p, SphI.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes DNA-Molekül bereit, das ein ε-Rhodomycinon-Umwandlungs-Protein kodiert.
Das DNA-Molekül besteht typischerweise im Wesentlichen aus der Sequenz von Sequenzidentifikationsnr. 1, wobei die Sequenz als die "dnrT"-Sequenz bezeichnet wird. Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des ε-Rhodomycinon-Konversions-Proteins, das durch Sequenzidentifikationsnr. 1 kodiert wird, ist in Sequenzidentifikationsnr. 2 gezeigt.
Das DNA-Molekül der Erfindung kann alles oder einen Teil des 2,97 kb SacI-BsaAI-Fragments von 1 umfassen.
Wenn das DNA-Molekül der Erfindung nur einen Teil des 2,97 kb SacI-BsaAI-Fragments umfasst, muss der Teil als ein ε-Rhodomycinon-Konversions-Protein funktionieren. Der Teil ist typischerweise mindestens 1,52 kb lang.
Die Erfindung schließt ein isoliertes DNA-Molekül ein, welches ein ε-Rhodomycinon-Konversions-Protein kodiert, mit einer Sequenz, die mindestens 90% identisch ist mit der Sequenz von Sequenzidentifikationsnr. 2.
Die Sequenz kann mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch sein mit der Sequenz von Sequenzidentifikationsnr. 2.
Die Sequenz von Sequenzidentifikationsnr. 2 kann modifiziert sein durch Substitution, Deletion, Insertion, Extension, Funktionalisierung oder chemische Modifikation. Eine Substitution, Deletion, Insertion oder Extension kann eine oder mehrere Aminosäuren einschließen, zum Beispiel eine, zwei, drei, vier, fünf, acht, fünfzehn oder zwanzig Aminosäuren. Im Allgemeinen sollte die physikochemische Natur von Sequenzidentifikationsnr. 2 in einer modifizierten Sequenz bewahrt werden. Die modifizierte Sequenz sollte im Allgemeinen ähnlich sein in der Ladung, Hydrophobie/Hydrophilie und der Größe. Geeignete Substitutionen sind diejenigen, welche zu einer Aminosäure aus einer der folgenden Gruppen führen, die mit einer unterschiedlichen Aminosäure aus der selben Gruppe substituiert ist.
H, R und K
I, L, V und M
A, G, S und T
D, E, P und N.
DNA-Moleküle, die die modifizierten Sequenzen kodieren, können unter Verwendung von konventionellen Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel können sie unter Verwendung von konventioneller DNA-Synthese, Seiten-gerichteter Mutagenese und rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Geeignete Techniken sind beschrieben in Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Damit dnrT exprimiert wird, kann die DNA ihre eigene Transkriptions-Kontroll-Sequenz tragen und insbesondere ihren eignen Promoter, der operativ verbunden ist mit dem Gen, und welcher durch eine Wirtszell-RNA-Polymerase erkannt wird. Alternativ kann die Insert-DNA oder das Restriktions-Fragment an eine andere Transkriptions-Kontroll-Sequenz in der richtigen Art und Weise ligiert werden, oder in einem Vektor an einer geeignet angeordneten Restriktions-Stelle in der Nähe einer Transkriptions-Kontroll-Sequenz in dem Vektor kloniert werden.
Eine Insert-DNA oder ein Restriktions-Fragment, das ein dnrT-Gen trägt, kann in einen rekombinanten DNA-Klonierungs-Vektor kloniert werden. Jeder sich selbst replizierende und/oder sich integrierende Stoff, der ein DNA-Molekül umfasst, an welches eines oder mehrere zusätzliche DNA-Segmente hinzugefügt werden können, kann verwendet werden. Typischerweise ist der Vektor jedoch ein Plasmid. Ein bevorzugtes Plasmid ist das Plasmid pWHM3 oder pIJ702 mit hoher Kopie-Anzahl [Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2703 (1983)]. Andere geeignete Plasmide sind pIJ385 [Mayeri et al., J. Bacteriol. 172: 6061 (1990)], pIJ680 (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), pWHN601 [Guilfoile and Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8553 (1991)] oder pSET152 [Bierman et al., Gene 116: 43–49 (1992)]. Jede geeignete Technik kann verwendet werden, um die Insert-DNA oder ein Restriktions-Fragment davon in den Vektor einzuführen. Die Insertion kann durch Ligieren der DNA in einen linearisierten Vektor an der geeigneten Restriktions-Stelle erreicht werden. Dafür kann die direkte Kombination von Sticky- oder abgestumpften (blunt) Enden, homopolymer Tailing, oder die Verwendung eines Linkers oder Adapter-Moleküls verwendet werden.
Der rekombinante Vektor wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Die Wirtszellen können solche sein, die Daunorubicin- oder Doxorubicin-empfindlich sind, das heißt, sie können nicht in der Anwesenheit einer bestimmten Menge von Daunorubicin oder Doxorubicin wachsen oder sie sind Daunorubicin- oder Doxorubicin-resistent. Der Wirt kann ein Mikroorganismus sein. Stämme von S. peucetius, die Anthracycline produzieren bzw. nicht produzieren, können daher transformiert werden. Der S. peucetius dnr-ORF6-Mutanten-Stamm (ATCC 55761, Datum der Hinterlegung: 16. April 1996) stellt einen insbesondere geeigneten Wirt dar. Er wurde erhalten durch Einführen des internen 0,411-kb BsaAI-Segments des dnr-ORF6-Gens, kloniert auf einem Temperatur-empfindlichen Plasmid, wie zum Beispiel pKC1139 (M. Bierman et al., Gene 116: 43–49 [1992]), in den 29050 Stamm und darauffolgende Isolation von Apramycin-resistenten Transformanden, in welchen sich das rekombinante Plasmid wieder mit dem dnr-ORMF6-Gen kombiniert hat und es inaktiviert hat (siehe auch Beispiel 1).
Transformanden von Streptomyces-Stämmen werden typischerweise durch Protoplasten-Transformation erhalten.
Der Umwandlungs-Prozess kann entweder durch die Verwendung direkt der freien oder der immobilisierten transformierten Zellen durchgeführt werden.
Die rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, welche Daunorubicin produziert, um die Biokonversion von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin zu verstärken. Die Wirtszellen können solche sein, die Daunorubicin- oder Doxorubicin-resistent sind, das heißt, sie können in der Anwesenheit von irgendeiner Menge von Daunorubicin oder Doxorubicin wachsen. Stämme von S. peucetius, insbesondere S. peucetius 29050 und andere Stämme von Streptomyces spp, die Anthracycline produzieren, können deshalb transformiert werden. Transformanden von Streptomyces-Stämmen werden typischerweise durch Protoplasten-Transformation erhalten.
Die Erfindung schließt ein Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin ein, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(i) Kultivieren einer Wirtszelle der Erfindung,
(ii) Transformieren des Wirts mit einem Vektor der Erfindung und
(iii) Isolieren des Daunorubicins aus der Kultur;

In diesem Verfahren kann die Wirtszelle bei von 20 bis 40°C, zum Beispiel von 30 bis 37°C kultiviert werden.
Die Kultur wird vorzugsweise unter Schütteln ausgeführt.
Die Insert-DNAs werden aus der genomischen DNA von S. peucetius 29050 erhalten. Dieser Stamm wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, unter der Zugriffsnummer ATCC 29050. Ein Stamm, der von S. peucetius 29050 abgeleitet ist, wie S. peucetius 27952, kann auch verwendet werden, welcher typischerweise auch in der Lage ist, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin umzuwandeln. Insert-DNAs können deshalb folgendermaßen erhalten werden:

(a) Herstellen einer Bibliothek der genomischen DNA von S. peucetius 29050 oder eines Stamms, der davon abgeleitet ist;
(b) Screenen der Bibliothek nach Klonen mit der Fähigkeit, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin in dem S. peucetius dnrT-Mutanten umzuwandeln; und
(c) Erhalten einer Insert-DNA aus einem rekombinanten Vektor, der ein Teil der Bibliothek ist und der als positiv auf die Fähigkeit gescreent wurde, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin in dem S. peucetius dnrT-Mutanten umzuwandeln. Der dnrT-Mutanten-Stamm (ATCC 55762, Datum der Hinterlegung: 16. April 1996) wird erhalten durch insertionale Inaktivierung des dnrT-Gens, das in S. peucetius 29050 vorhanden ist, in einer Art und Weise, die analog ist zu derjenigen, welche oben für die Inaktivierung des dnr-ORF6-Gens beschrieben ist, wie in Beispiel 2 erläutert.

Um das dnrT-Gen zu erhalten, kann die Bibliothek in Schritt a) durch teilweises Verdauen der genomischen DNA von S. peucetius 29050 oder einem Stamm, der davon abgeleitet ist, hergestellt werden; oder durch Screenen einer Bibliothek von S. peucetius genomischer DNA, welche mit dem Cluster der Daunorubicin-Biosynthese-Gene angereichert wurde oder sie spezifisch enthält. Das Restriktions-Enzym MboI wird insbesondere verwendet für genomische DNA, aber für die Bibliothek, die die Cluster der Daunorubicin-Biosynthese-Gene enthält, sind die Restriktions-Enzyme SacI oder BsaAI bevorzugt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente können der Größe nach fraktioniert werden; Fragmente von 3 bis 5 kb in der Größe sind bevorzugt für genomische DNA, und 2,1 kb SacI oder 1,3 bis 3,3 kb BsaAI für DNA-Fragmente aus der Bibliothek, welche den Cluster der Daunorubicin-Biosynthese-Gene enthalten. Diese Fragmente werden in einen linearisierten Vektor ligiert, wie zum Beispiel pWHM3, pIJ702 oder pKC505 [M. A. Richardson et al., Gene 61: 231 (1987)]. Wirtszellen werden mit der Ligationsmischung transformiert. Typischerweise können die Wirtszellen nicht Daunorubicin produzieren und sie können Daunorubicin- und Doxorubicin-empfindlich sein; zum Beispiel empfindlich gegenüber 10 μg oder weniger von Daunorubicin oder Doxorubicin pro ml. Zum Beispiel können S. peucetius dnrT-Mutanten-Protoplasten [Stutzman-Engwall und Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3136 (1988) und Otten et al., J. Bacteriol. 172: 3427 (1990)] transformiert werden.
In Schritt b) werden die so erhaltenen Transformanden auf die Fähigkeit gescreent, das akkumulierte ε-Rhodomycinon in Daunorubicin umzuwandeln und Daunorubicin abzusondern. Klone, die in der Lage sind, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin umzuwandeln, werden durch chromatographische Analyse von Extrakten eines Kulturmediums identifiziert, das ε-Rhodomycinon enthält, für die Anwesenheit von Daunorubicin. Solche Klone werden isoliert und rekombinante Vektoren, die darin enthalten sind, werden extrahiert. Nach der Verdauung der rekombinanten Vektoren mit geeigneten Restriktions-Enzymen in Schritt c), kann die S. peucetius 29050 DNA, die in jeden Vektor eingefügt ist, identifiziert, nach Größe geordnet und kartographiert werden. Auf diese Weise kann überprüft werden, dass der Vektor eine Insert-DNA der Erfindung enthält.
Desweiteren können zwei oder mehr überlappende Inserte isoliert werden, die vollständig oder teilweise innerhalb der DNA der Erfindung eingeschlossen sind. Diese können durch Spalten an einer üblichen Restriktion-Stelle und nachfolgende Ligierung zusammen fusioniert werden, um eine DNA der Erfindung zu erhalten, und sie können, wenn nötig, unter Verwendung von geeigneten Restriktions-Enzymen in der Länge beschnitten werden. Restriktions-Fragmente einer Insert-DNA, welche das dnrT-Gen enthält, können in Schritt c) auch durch Abspalten einer Insert-DNA mit einem geeigneten Restriktions-Enzym erhalten werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Materialien und Verfahren
Bakterielle Stämme und Plasmide
E. coli Stämme DH5α oder JM109, die empfindlich gegenüber Ampicillin und Apramycin sind, werden für die Subklonierung von DNA-Fragmenten verwendet. Ein S. peucetius dnr-ORF6-Mutant, der keine Daunorubicin-Glycoside produziert, wird für die Expression der dnr-ORF6- oder dnrT-Gene verwendet. Die Plasmid-klonierenden Vektoren sind pUC18/19 [(Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103 (1985)] und pWHM3 [Vara et al., J. Bacteriol. 171: 5872 (1989)].
Medien und Puffer
E. coli DH5α und JM109 werden auf LB-Agar gehalten [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te Ausg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Wenn Transformanden ausgewählt werden, wird Ampicillin oder Apramycin bei Konzentrationen von 100 Mikrogramm pro ml bzw. 50 Mikrogramm pro ml hinzugefügt. S. peucetius dnr-ORF6 wird auf ISP4-Agar gehalten (Difco Laboratories, Detroit, MI) für die Herstellung von Sporen, und auf R2YE-Agar (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) für die Regeneration von Protoplasten.
Subklonierung von DNA-Fragmenten
DNA-Proben werden mit geeigneten Restriktions-Enzymen verdaut und auf Agarose-Gelen durch Standard-Verfahren getrennt (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te Ausg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Agarose-Streifen, die DNA-Fragmente von Interesse enthalten, werden aus einem Gel ausgeschnitten und die DNA wird aus diesen Streifen isoliert, unter Verwendung der GENECLEAN-Vorrichtung (Bio101, La Jolla, CA) oder einem Äquivalent. Die isolierten DNA-Fragmente werden subkloniert, unter Verwendung von Standard-Techniken (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te Ausg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in E. coli für Routine-mäßige Manipulationen, einschließlich der DNA-Sequenzierung und E. coli/Streptomyces Shuttle-Vektoren oder Streptomyces-Vektoren für Expressions- und Biotransformations-Experimente.
Transformation von Streptomyces Species und E. coli
Kompetente Zellen von E. coli werden durch das Kalzium-Chlorid-Verfahren hergestellt (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te Ausg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und transformiert durch Standard-Techniken (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2te Ausg. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). S. peucetius dnr-ORF6 Mycel wird in R2YE-Medium gezüchtet (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) und nach 48 Stunden geerntet. Das Mycel-Pellet wird zweimal mit 10,3% (Gewicht/Volumen) Saccharose-Lösung gewaschen und verwendet, um Protoplasten gemäß dem Verfahren, das in dem Hopwood Manual dargelegt ist, herzustellen (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985). Das Protoplasten-Pellet wird in ungefähr 300 Mikrolitern von P-Puffer suspendiert (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) und ein 50 Mikroliter Aliquot dieser Suspension wird für jede Transformation verwendet. Die Protoplasten werden mit Plasmid-DNA entsprechend dem kleinen Maßstabs-Transformations-Verfahren von Hopwood et al., transformiert (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985), Stutzman-Engwall und Hutchinson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3135 (1988)] oder Otten et al. [J. Bacteriol. 172: 3427 (1990)]. Nach 17 Stunden Regeneration auf R2YE-Medium bei 30°C werden die Platten mit 25 bis 50 μg/ml Thiostrepton überschichtet und man lässt sie bei 30°C bis zur Sporen-Bildung wachsen.
Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin durch Fermentation
S. peucetius dnr-ORF6-Transformanden, die ein Plasmid der Erfindung beherbergen (pWHM954) werden in flüssiges R2YE-Medium, das 10 μg/ml Thiostrepton enthält, inokuliert. Nach 2 Tagen Wachstum bei 27 bis 30°C werden 2,5 bis 3,5 ml dieser Kultur in 25–35 ml des GPS-Produktions-Mediums überführt [M. L. Dekleva, J. A. Titus, und W. R. Strohl. Can. J. Microbiol. 31: 287 (1985)], das 10 μg/ml Thiostrepton enthielt und bei 27 bis 30°C für 3 bis 5 Tage auf einem rotierenden Schüttler bei 250–280 rpm inkubiert. Die Kulturen werden in einem Wasserbad bei 55°C für 60 Minuten inkubiert, nach der Zugabe von 25 mg/ml von Oxalsäure, um die glycosidischen Formen der Anthracyclin-Metabolite zu hydrolysieren. Die Metabolite werden aus den Kulturen mit demselben Volumen an Acetonitril : Methanol (1 : 1, vol : vol) bei 30°C für 30–50 Minuten auf einem rotierenden Schüttler bei 280 rpm extrahiert. Der Extrakt wird filtriert und das Filtrat wird durch Reverse-Phase Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (RP-HPLC) analysiert. RP-HPLC wird unter Verwendung einer Vydac C₁₈ Säule (4,6 × 250 mm; 5 Mikrometer Partikelgröße) bei einer Flußrate von 0,385 ml/Min durchgeführt. Die mobile Phase A ist 0,1% Trifluoressigsäure (TFA, von Pierce Chemical Co.) in H₂O und die mobile Phase B ist 0,078% TFA in Acetonitril (von J. T. Baker Chemical Co.). Die Elution wird mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% Phase B in Phase A in 33 Minuten durchgeführt und mit einem Dioden-Array-Detektor-Set bei 488 nm (Bandbreite 12 Mikrometer) überwacht. Daunorubicin und Doxorubicin (10 mg/ml in Methanol) werden als externe Standards verwendet, um die Menge dieser Metaboliten quantitativ zu erfassen, die aus den Kulturen isoliert wurden.
Beispiel 1
Zerstörung von dnr-ORF6
pWHM959 (3) wurde konstruiert durch Sub-Klonieren eines 411 bp BsaAI internen Fragments (693 bp stromabwärts der hypothetischen Translations-Start-Stelle von dnr-ORF6) in eine einzigartige HincII-Stelle von pUC19 und Überführen dieser Konstruktion als ein EcoRI-HindIII-Fragment in Plasmid pKC1139 (M. Bierman et al., Gene 116: 43–49 [1992]). Der Vektor pKC1139 enthält ein Temperatur-empfindliches Replikon, das bei Temperaturen unterhalb von 34°C gut funktioniert. Der 29050-Stamm wurde mit pWHM959 transformiert und die Transformanden wurden mit Apramycin (25 μg/ml) bei 30°C ausgewählt. Kolonien aus dieser Transformation wurden in 5 ml flüssigem R2YE, das Apramycin (10 μg/ml) enthielt, bei 30°C für 2 Tage gezüchtet, dann auf 39°C für 5 bis 7 Tage überführt, um den autonomen Vektor zu eliminieren und um die Transformanden auszuwählen, in welchen eine homologe Rekombination zwischen der klonierten DNA und dem Chromosom stattgefunden hat. Ein 0,5 ml Teil dieser Kulturen wurde auf ISP4-Platten platziert, die Apramycin (25 μg/ml) enthielten, um die Integration des Plasmids zu bestätigen. Eine der resultierenden Kolonien mit dem Apramycin-resistenten Phenotyp wurde durch Southern-Analyse untersucht, um die Zerstörung des dnr-ORF6-Gens zu bestätigen. Die chromosomale DNA wurde mit BamHI verdaut und mit der pWHM959 DNA gesondet. Die Sonde hypridisierte an 7,2 kb und 1,7 kb Fragmente für den dnr-ORF6-Mutanten-Stamm, was übereinstimmend ist mit der Insertion des Plasmids pKC1139 in das dnr-ORF6-Gen. Der Wildtyp-Stamm zeigte das erwartete 2,9 kb BamHI dnr-ORF6-Fragment.
Beispiel 2
Zerstörung von dnrT
pWHM962 (3) wurde konstruiert durch Subklonierung eines 555 bp AccI-NarI-internen Fragments (227 bp stromabwärts der hypothetischen Translations-Sart-Stelle von dnrT) in eine einzigartige AccI-Stelle von pUC19, und Überführen dieser Konstruktion als ein EciRI-HindIII-Fragment in pKC1139. Der 29050-Stamm wurde mit pWHM962 transformiert und nach dem Selektieren nach einer Apramycin-Restistenz wurden die Transformanden unter Apramycin-Selektion bei 39°C gezüchtet, um einen Verlust des nicht integrierten Plasmids zu bewirken. Die DNA von einer der resultierenden Apramycin resistenten Kolonien wurde durch Southern Blot Hybridisierung analysiert, um die Zerstörung des dnrT-Gens zu bestätigen. BamHI-verdaute chromosomale DNA wurde mit dem 555 bp AccI-NarI-Fragment, das für die Inaktivierung verwendet wurde, gesondet und es wurde gefunden, dass sie an 8,2 kb und 4,9 kb Fragmente für den dnrT-Mutanten-Stamm hybridisiert. Dies ist übereinstimmend mit der Insertion des Plasmids pKC1139 in das dnrT-Gen, da der Wildtyp-Stamm das erwartete 6,0 kb BamHI dnrT-Fragment zeigte.
Beispiel 3
Klonierung des dnrT-Gens, das ein Enzym kodiert, das für die Umwandlung von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin erforderlich ist
Einige der Kosmid-Klone, die durch Stutzman-Engwall und Hutchinson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3135 (1988)] und Otten et al. [J. Bacteriol. 172: 3427 (1990)] beschrieben sind, wie zum Beispiel pWHM335 oder pWHM337 oder ähnliche Klone, die aus äquivalenten Stämmen erhalten wurden, die von ungefähr 20 bis zu 90 kb von S. peucetius 29050 genomischer DNA darstellen, wurden mit BamHI + SphI verdaut, die DNAs wurden mit dem pWHM3-Vektor oder einem äquivalenten Vektor kombiniert, der in der Lage ist, sowohl in E. coli aus auch in Streptomyces spp., das mit BamHI + SphI verdaut und re-ligiert wurde, zu replizieren, und die resultierende Mischung von Plasmiden wurde verwendet, um E. coli DH5α zu einer Ampicillin-Resistenz zu transformieren (oder zu der Resistenz, die geeignet ist für die Selektion des verwendeten Vektors). Die Plasmid-DNAs aus einigen Ampicillin-resistenten E. coli-Klonen wurden in den S. peucetius dnrT-Mutanten eingeführt und die Transformanden wurden für die Biokonversion von ε-Rhodomycinon in Daunorubicin gemäß dem Verfahren, das in dem Materialien- und Verfahren-Abschnitt beschrieben ist, analysiert. Plasmide mit Inserts, welche die Region der Restriktions-Karte einschließen, die in 1 gezeigt ist, wurden isoliert, und das gewünschte Insert wurde als ein 2,97 kb SacI-BsaAI-DNA-Fragment in die SacI und HincII-Stellen der Polylinker-Region von pUC19 subkloniert, dann wurde das Gen als ein EcoRI-HindIII-Segment in die Polylinker-Region von pWHM3 bewegt, um pWHM954 zu erhalten. S. peucetius dnrT (pWHM954)-Transformanden wurden wie in dem Materialien- und Verfahren-Abschnitt beschrieben hergestellt, und diese wurden auf die Fähigkeit getestet, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin zu biokonvertieren.
Beispiel 4
Herstellung des S. peucetius dnr-ORF6 (pWHM954)-Transformanden-Stamms
pWHM954 DNA wurde in den S. peucetius dnr-ORF6-Mutanten durch das Protoplasten-vermittelte Transformations-Verfahren, das oben beschrieben ist, eingeführt, unter Verwendung von Thiostrepton (10 μg/ml) für die Selektion des rekombinanten Stammes. S. peucetius dnr-ORF6 (pWHM954)-Transformanden wurden durch Re-Isolation von pWHM954 gemäß dem Plasmid-Isolations-Protokoll, das in Hopwood et al (Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratory manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) beschrieben ist bestätigt, und die pWHM954-DNA wurde durch Restriktions-Enzym-Verdauung gemäß den Standard-Verfahren, die von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, 2te Ausg., Cold Spring Harbor, NY, 1989) beschrieben sind, analysiert.
Beispiel 5
Verbesserte Umwandlung von ε-Rhodomycinon (RHO) in Daunorubicin durch S. peucetius dnr-ORF6-Transformanden, welche das pWHM954-Plasmid beherbergen, das das dnrT-Gen trägt
Der S. peucetius dnr-ORF6-Mutant, der pWHM954 trägt, wurde für 12 Tage bei 28°C auf Streifen von R2YE-Agar-Medium, das 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, gezüchtet. Die Sporen dieser Kultur werden gesammelt und in 300 ml Erlenmeyer-Kolben, welche 30 ml von R2YE-flüssigem Medium enthielten, das 10 μg/ml von Thiostrepton enthielt, suspendiert und die Kolben wurden für 2 Tage bei 30°C auf einem rotierenden Schüttler, der 280 rpm in einem 5 cm Durchmesser-Kreis lief, geschüttelt. Drei ml dieser Kultur wurden verwendet, um 30 ml des GPS-Mediums, das 10 μg/ml Thiostrepton enthielt, in 300 ml Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Die Kolben wurden bei 30°C für 5 Tage unter den selben Bedingungen, die für die Saat-Kulturen beschrieben wurden, inkubiert, dann nach der Zugabe von 25 mg/ml von fester Oxalsäure in ein Wasserbad bei 55°C für 60 Minuten gegeben, um die glycosidischen Formen der Anthracyclin-Metaboliten zu hydrolysieren. Die Metaboliten wurden aus den Kulturen mit 30 ml Acetonitril : Methanol (1 : 1, vol/vol) bei 30°C für 30 Minuten auf einem rotierenden Schüttler bei 280 rpm extrahiert.
Der Extrakt wurde filtriert und das Filtrat wurde durch Reverse-Phase Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (RP-HPLC) analysiert. RP-HPLC wurde durch die Verwendung einer Vydac C₁₈-Säule durchgeführt. (4,6 + 250 mm; 5 μm Partikelgröße) bei einer Flussrate von 0,385 ml Pro Minute. Die mobile Phase A ist 0,1 Trifluoressigsäure (TFA von Pierce Chemical Co.) in H₂O und die mobile Phase B ist 0,078% TFA in Acetonitril (von J. T. Baker Chemical Co.). Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% Phase B in Phase A in 33 Minuten durchgeführt und mit einem Dioden-Array-Detektor-Set 488 nm (Bandbreite 12 μm) überwacht. Daunorubicin (DNR) und Doxorubicin (DXR) (10 μg/ml in Methanol) wurden als externe Standards verwendet, um die Menge dieser Metaboliten, die aus der Kultur isoliert wurden, (Tabelle 1) quantitativ zu bestimmen.
Tabelle 1 RHO, DNR-Konzentrationen^a und Verhältnis in Extrakten von Kulturen von S. peucetius dnr-ORF6-Mutanten, transformiert mit pWHM954, das das dnrT-Gen enthielt
Sequenzliste

Claims

Ein isoliertes DNA-Molekül, das ein ε-Rhodomycinon-Konversionsprotein kodiert, das eine Sequenz hat, die mindestens 90% Identität mit der Sequenz der Sequenzidentifikationsnr. 2 hat.
Das DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, worin das ε-Rhodomycinon-Konversionsprotein die Sequenz der Sequenzidentifikationsnr. 2 hat.
Das DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, das aus der Sequenz der Sequenzidentifikationsnr. 1 besteht.
Ein Vektor, der das ε-Rhodomycinon-Konversionsprotein gemäß Anspruch 1 kodiert.
Der Vektor gemäß Anspruch 4, der ein ε-Rhodomycinon-Konversionsprotein kodiert, das die Sequenz der Sequenzidentifikationsnr. 2 hat.
Der Vektor gemäß Anspruch 4, der die Sequenz der Sequenzidentifikationsnr. 1 umfaßt.
Der Vektor gemäß Anspruch 4, welcher ein Plasmid ist.
Das Plasmid gemäß Anspruch 7, welches pWHM954 von 1 ist.
Ein bakterieller Wirt, der mit dem Vektor wie in Anspruch 4 beansprucht transformiert oder transfiziert ist.
Der Wirt gemäß Anspruch 9, welcher eine Streptomyces Zelle ist.
Der Wirt gemäß Anspruch 10, welcher eine Streptomyces Zelle ist, die eine Mutation hat, welche die Funktion eines Gens des Daunorubicin-Metabolismus blockiert.
Der Wirt gemäß Anspruch 11, worin das Gen dnr-ORF6 ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (i) Kultivieren eines Wirts gemäß Anspruch 11, der den Vektor von Anspruch 4 hat, und (ii) Isolieren des Daunorubicins aus der Kultur.
Ein Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (i) Kultivieren eines Wirts gemäß Anspruch 12, der das Plasmid von Anspruch 8 hat, und (ii) Isolieren des Daunorubicins aus der Kultur.
Ein Verfahren zur Herstellung des isolierten DNA-Moleküls gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Herstellen einer Bibliothek aus der genomischen DNA von S. Peucetius 29050 oder eines Stammes, der davon abgeleitet ist; (b) Screenen der Bibliothek nach Klonen mit der Fähigkeit, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin umzuwandeln in einem S. Peucetius dnrT blockierten Mutanten; und (c) Erhalten einer insert DNA aus einem rekombinanten Vektor, der einen Teil der Bibliothek bildet, und der als positiv für die Fähigkeit, ε-Rhodomycinon in Daunorubicin in dem S. Peucetius dnrT blockierten Mutanten umzuwandeln, gescreent wurde.
Das Stretomyces Peucetius dnr-ORF6 Mutantenstamm kodierte ATCC55761.