JPH11510710A - ダウノルビシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの変換率を向上させる能力を、該変換に有用な適切なタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した細菌宿主に付与し得る。さらに、該細菌宿主は、ダウノルビシン代謝遺伝子の機能を遮断する変異を有し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ダウノルビシンの製造法 発明の分野 本発明は、ダウノルビシン代謝遺伝子中に１つの欠失を有し且つ別のダウノル ビシン生合成酵素をコードする遺伝子で形質転換した組換え株を用いてε−ロド マイシノン（ε-rhodomycinone）をダウノルビシンに変換することによりダウノ ルビシンの生産量を増大させる方法に関する。発明の背景 抗腫瘍治療に最も広く用いられている物質には、アンスラサイクリン類のダウ ノルビシン群、例えば、ドキソルビシン、カルミノマイシン及びアクラシノマイ シン、並びにそれらの合成類似体が含まれる〔Ｆ．Ａｒｃａｍｏｎｅ，Ｄｏｘｏ ｒｕｂｉｃｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１ ，１２−２５ページ；Ａ．Ｇｒｅｉｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６ ：３４（１９８１）；Ｔ．Ｋａｎｅｋｏ，Ｃｈｉｍｉｃａｏｇｇｉ ５月号：１ １（１９８８）；Ｃ．Ｅ．Ｍｙｅｒｓら，“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｃｈ ａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌ”．Ｉｎ：Ａｎｔｈｒａ ｃｙｃｌｉｎｅ ａｎｄ Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｎ ｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ（Ｊ．Ｗ．Ｌｏｗｎ編），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，５２７−５６９ページ，１９８８；Ｊ．Ｗ．Ｌｏｗｎ， Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６０：１８５−２１４（１９９３）〕 。 アンスラサイクリン類のダウノルビシン群は、種々のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ株やＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｍｉｎａｔａにより生産される天然化合 物である。ドキソルビシンは主としてＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓの亜種ｃａｅｓｉ ｕｓにより生産されるが、ダウノルビシンは、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓや他のＳ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにより生産され、例えば、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ Ａ ＴＣＣ２７９５２は、ＵＳＡ３，５９０，０２８号に、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０は、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓと共に、ＵＳＡ４，０１２，２ ８４号に記載されている。 特に、ドキソルビシン及びダウノルビシンは、Ｇｒｅｉｎ，Ａｄｖａｎ．Ａｐ ｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：２０３（１９８７）や、Ｅｃｋａｒｄｔ及び Ｗａｇｎｅｒ， Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：１３７（１９８８）に概説されて いる経路を介して、マロン酸、プロピオン酸及びグルコースからＳ．ｐｅｕｃｅ ｔｉｕｓ、ＡＴＣＣ ２９０５０及び２７９５２によって生産される。アクラビ ノン（１１−デオキシ−ε−ロドマイシノン）、ε−ロドマイシノン及びカルミ ノマイシンはこのプロセスにおける確立された中間体である。Ｓ．ｐｅｕｃｅｔ ｉｕｓ ２７９５２におけるこの経路の最終ステップには、ダウノルビシンのド キソルビシンへのヒドロキシル化が含まれる〔Ｆ．Ａｒｃａｍｏｎｅら，Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１：１１０１（１９６９）〕。 ダウノルビシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種においてバウマイシンと称さ れる４′−Ｏ−グリコシドに変換されることが公知となっている〔Ｙ．Ｋａｋａ ｈａｓｈｉ，Ｈ．Ｎａｇａｎａｗａ，Ｔ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．Ｕｍｅｚａｗ ａ，Ｔ．Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｔ．Ｏｋｉ及びＴ．Ｉｎｕｉ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏ ｔ．３０：６２２（１９７７）〕。 さらに、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０及び２７９５２株は、通常、ダ ウノルビシンやドキソルビシンより はるかに多くのε−ロドマイシノンを生産する。化学合成法又は酵素法（生物学 的形質転換法）により治療上無価値なε−ロドマイシノンを治療上重要な抗腫瘍 アンスラサイクリン剤に変換させるのは容易ではなく、従って、ε−ロドマイシ ノンは商業上無用なダウノルビシン発酵副産物である。 これまでに、クローニング実験により、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０ 及びＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２７９５２から数種のダウノルビシン及びドキソ ルビシンの生合成遺伝子及び耐性遺伝子が得られたが、いずれの遺伝子もその宿 主にε−ロドマイシノンをダウノルビシンに変換する能力を付与するものとは認 められなかった。 発明の要旨 本発明は、ε−ロドマイシノンをダウノルビシンに変換させるのに必要なタン パク質をコードするＤＮＡを含み、好ましくは、前記タンパク質若しくは機能的 に同等なタンパク質をコードする遺伝子を含む図１に示されている制限部位構造 又は該制限部位由来の制限フラグメントを有する組換えベクターで形質転換した 細菌宿主を用いてダウノルビシンを製造する方法を提供する。 該細菌宿主は、ダウノルビシン代謝遺伝子の機能を遮断する変異を有するダウ ノルビシン生産Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種株であるのが好ましい。この遮断さ れる遺伝子は、図２に示されている制限部位構造を有するＤＮＡフラグメント又 は該制限部位由来の、ダウノルビシンの代謝に関与するタンパク質をコードする 遺伝子ｄｎｒ−ＯＲＦ６を含むフラグメント中に含まれるのが好ましい。ｄｎｒ −ＯＲＦ６に変異を有するストレプトマイセス宿主を、ε−ロドマイシノン変換 タンパク質をコードする挿入体ＤＮＡを有する組換えベクター、好ましくは、図 １に示されている制限部位構造、又は前記タンパク質をコードする遺伝子ｄｎｒ Ｔを含む該制限部位由来の制限フラグメントを有する組 換えベクターで形質転換する。 さらに、本発明は、 （ａ） ε−ロドマイシノン変換タンパク質をコードするＤＮＡセグメント、好 ましくは、図１の配列番号１に示されているＤＮＡセグメント、又は前記タンパ タ質をコードする遺伝子ｄｎｒＴを含む該ＤＮＡセグメント由来の制限フラグメ ント、 （ｂ） ｄｎｒＴ遺伝子のコピー数、及びダウノルビシンを生産するＳｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓ種株中の該遺伝子産物の量を増大させ得る組換えベクター、 （ｃ） 該組換えベクターを形質転換により導入し得るｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子 の機能を遮断する変異を有し、それによってε−ロドマイシノンからダウノルビ シンへの変換率を向上させるＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ株、好ましくはＡＴＣＣ ２９０５０ を提供する。図面の簡単な説明 図１は、本発明のＤＮＡ、ｐＷＨＭ９５４の制限マップ分析である。これは、 組換えプラスミドｐＷＨＭ３中の挿入体ＤＮＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ−Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ シャトルベクター〔Ｖａｒａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ．１７１：５８７２（１９８９）〕であり、該ベクターは、Ｓｔｕｔｚｍａｎ− Ｅｎｇｗａｌｌ及びＨｕｃｈｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８６：３１３５（１９８８）並びにＯｔｔｅｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ．１７２：３４２７（１９９０）に記載のクローンから得たｄｎｒＴ遺 伝子又は全ｄｎｒＴ遺伝子を含む１．５２ｋｂ以上の任意の他のフラグメントを 含む２．９７ｋｂのＳａｃＩ−ＢｓａＡＩＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ１９〔 Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３：１０３（１９８５）〕のポ リリンカー領域のＳａｃＩ−ＨｉｎｃII部位に挿入し、次いで、該遺伝子をＥｃ ｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIセグメントとしてｐＷＨＭ３のポリリンカー領域に導入し て構築した。図１に示されているマップは必ずしも該ＤＮＡセグメントに存在す る全ての制限部位を網羅しているわけではないが、記載されている部位は、該セ グメントを明確に認識するには十分である。 配列番号１は、ダウノルビシン生合成に必要なタンパク質をコードするＤＮＡ セグメントに対応するｄｎｒＴ Ｄ ＮＡセグメントのヌクレオチド配列の概略図である。該配列は、ｐＷＨＭ９５４ のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIの制限部位間の領域の殆どをカバーしており、５′ から３′方向のコードＤＮＡ鎖を示している。ダウノルビシンの生合成に必要な タンパク質をコードする翻訳読み取りフレームの誘導アミノ酸配列が配列番号２ としてｄｎｒＴ遺伝子のヌクレオチド配列の下に示されている。 図２は、本発明の他の目的のためにその機能が遮断された第２のＤＮＡ ｐＷ ＨＭ９５２の制限マップ分析である。該ＤＮＡは、Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗ ａｌｌ及びＨｕｃｈｉｎｓｏｎ（前掲）並びにＯｔｔｅｎら（前掲）に記載のク ローンから得た２．９３ｋｂのＡｇｅＩ−ＡｖｒIIＤＮＡフラグメントを、ｐＵ Ｃ１９のポリリンカー領域のＸｍａＩ−ＸｂａＩ部位に挿入し、次いで、該遺伝 子をＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩセグメントとしてｐＷＨＭ３のポリリンカー領域に導 入して構築した、組換えプラスミドｐＷＨＭ３中の挿入体である。図２に示され ているマップは必ずしも該ＤＮＡセグメント中に存在する全ての制限部位を網羅 しているわけではないが、記載されている部位は該セグメントを明確に認識する には十分である。 配列番号３は、ダウノルビシンの代謝に必要なタンパク質をコードするＤＮＡ セグメントに対応するｄｎｒ−ＯＲＦ６ ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列 の概略図である。該配列は、ｐＷＨＭ９５２のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩの制限部 位間の領域の殆どをカバーしており、５′から３′方向のコードＤＮＡ鎖を示し ている。ダウノルビシンの代謝に必要なタンパク質をコードする翻訳読み取りフ レームの誘導アミノ酸配列が配列番号４としてｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子のヌクレ オチド配列の下に示されている。 図３は、ｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子及びｄｎｒＴ遺伝子の領域の制限マップであ る。この２つの遺伝子の転写の位置及び方向が矢印で示されている。プラスミド ｐＷＨＭ９６２、ｐＷＨＭ９５９，ｐＷＨＭ９５４及びｐＷＨＭ９５２の構築に 用いられるフラグメントが下部に示されている。制限部位の略号は以下の通りで ある：Ａｃ＝ＡｃｃＩ；Ａｇ＝ＡｇｅＩ；Ａｌ＝ＡｌｗＮＩ；Ａｖ＝ＡｖｒII； Ｂａ＝ＢａｍＨＩ；Ｂｓ＝ＢｓａＡＩ；Ｎａ＝ＮａｒＩ；Ｓａ＝ＳａｃＩ；Ｓｐ ＝ＳｐｈＩ。発明の詳細な説明 本発明は、ε−ロドマイシノン変換タンパク質をコード する単離されたＤＮＡ分子を提供する。 該ＤＮＡ分子は、典型的には、実質的に配列番号１の配列からなり、該配列は 以下「ｄｎｒＴ」配列と称される。配列番号１によってコードされるε−ロドマ イシノン変換タンパク質の推定アミノ酸配列が配列番号２として示されている。 本発明のＤＮＡ分子は、図１の２．９７ｋｂのＳａｃＩ−ＢｓａＡＩフラグメ ントの全て又は一部を含み得る。 本発明のＤＮＡ分子が２．９７ｋｂのＳａｃＩ−ＢｓａＡＩフラグメントの一 部しか含んでいない場合、該部分はε−ロドマイシノン変換タンパク質として機 能しなければならない。該部分は典型的には長さが１．５２ｋｂ以上である。 本発明は、配列番号２の配列と７５％以上相同の配列を有するε−ロドマイシ ノン変換タンパク質をコードするＤＮＡ分子を包含する。該配列は、配列番号２ の配列と、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上 相同であり得る。 配列番号２の配列は、置換、欠失、挿入、延長、官能化又は化学修飾により改 変し得る。置換、欠失、挿入又は延 長には、１個以上のアミノ酸、例えば、２個、３個、４個、５個、８個、１５個 又は２０個のアミノ酸が関与し得る。一般に、配列番号２の配列の物理的及び化 学的性質は、改変配列中にも保存されていなければならない。改変配列は、一般 に、電荷、疎水性／親水性及び大きさが類似していなければならない。候補置換 体は、以下の群の中の１つの群由来のアミノ酸を該群由来の異なるアミノ酸で置 換して得られるものである： Ｈ、Ｒ及びＫ Ｉ、Ｌ、Ｖ及びＭ Ａ、Ｇ、Ｓ及びＴ Ｄ、Ｅ、Ｐ及びＮ。 改変配列をコードするＤＮＡ分子は慣用法を用いて作製し得る。例えば、該分 子は、慣用的なＤＮＡ合成法、部位特異的変異誘発法及び組換えＤＮＡ法を用い て作製し得る。適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。 ｄｎｒＴを発現させるために、該ＤＮＡは、固有の転写調節配列、特に、遺伝 子に操作可能に結合し且つ宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼにより認識される固有 のプロモーターを保有し得る。あるいは、挿入体ＤＮＡ又は制限フラグメントは 、別の転写調節配列に正しく連結されるか、又はベクターの転写調節配列に近接 して適切に配置された制限部位にクローン化し得る。 ｄｎｒＴ遺伝子を保有する挿入体ＤＮＡ又は制限フラグメントは、組換えＤＮ Ａクローニングベクター中にクローン化し得る。１個以上の追加のＤＮＡセグメ ントを付加し得るＤＮＡ分子を含む任意の自律複製物質及び／又は組込み物質を 用いてもよい。しかし、典型的には、該ベクターはプラスミドである。好ましい プラスミドは、高コピー数のプラスミドｐＷＨＭ３又はｐＩＪ７０２〔Ｋａｔｚ ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９：２７０３（１９８３）〕である 。他の適当なプラスミドは、ｐＩＪ３８５〔Ｍａｙｅｒｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ．１７２：６０６１（１９０）〕、ｐＩＪ６８０（Ｈｏｐｗｏｏｄら，Ｇ ｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ ｕａｌ，Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ ，１９８５）、ｐＷＨＭ６０１〔Ｇｕｉｌｆｏｉｌｅ及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８５５３（９９１） 〕又はｐＳＥＴ１５２〔Ｂｉｅｒｍａｎら，Ｇｅｎｅ １１６：４３−４９（１ ９９２）〕である。任意の適当な方法を用いて挿入体ＤＮＡ又はその制限フラグ メントをベクターに挿入し得る。挿入は、ＤＮＡを適切な制限部位で直線状ベク ターに連結して行うことができる。このために、突出末端又は平滑末端を直接組 み合わせる方法、ホモポリマーをテーリングする方法又はリンカー若しくはアダ プター分子を使用する方法を用い得る。 適当な宿主細胞の形質転換には組換えベクターを用いる。宿主細胞は、ダウノ ルビシン又はドキソルビシン感受性のもの、即ち、一定量のダウノルビシン若し くはドキソルビシンの存在下には増殖しないもの、又はダウノルビシン若しくは ドキソルビシン耐性のものであってよい。該宿主は微生物であってよい。従って 、それぞれアンスラサイクリンを生産するか又は生産しないＳ．ｐｅｕｃｅｔｉ ｕｓ株を形質転換し得る。特に適当な宿主は、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔ ｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ変異株（ＡＴＣＣ ５５７６１，寄託日：１９９６年４ 月１６日）である。該株は、ｐＫＣ１１３９（Ｍ．Ｂｉｅｒｍａｎら，前掲）の ような温度感受性プラスミド上でクローン化したｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子の０． ４１１ｋｂのＢｓａＡ１内部セグメントを２９０５０株に導入し、次いで、組換 えプラスミドをｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子と組換えて不活化したアプラマイシン耐 性形質転換体を単離して得た（実施例１参照）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株の 形質転換体は典型的にはプロトプラストの形質転換により得られる。 変換プロセスは、直接、遊離するか又は固定化された形質転換細胞を用いて行 うことができる。 ε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの生物学的変換を促進するために、 本発明の組換えベクターを用いてダウノルビシンを生産する適当な宿主細胞を形 質転換することもできる。 宿主細胞は、ダウノルビシン又はドキソルビシン耐性のもの、即ち、任意の量 のダウノルビシン又はドキソルビシンの存在下に増殖し得るものであってよい。 従って、アンスラサイクリンを生産するＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ株、特 に、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０及び他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種 株を形質転換し得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株の形質転換体は、典型的には 、プロトプラストの形質転換により得られる。 本発明は、ダウノルビシンを製造する方法を包含し、該方法は、 （ｉ） 本発明の宿主細胞を培養するステップ、 （ii） 該宿主を本発明のベクターで形質転換するステップ、 （iii） 培養物からダウノルビシンを単離するステップを含む。 該方法において、宿主細胞は、２０〜４０℃、例えば、０〜３７℃で培養し得 る。 培養は攪拌しながら行うのが好ましい。 挿入体ＤＮＡは、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０のゲノムＤＮＡから得 る。この株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡにアクセス番号ＡＴＣＣ２９０５０ のもとに寄託されている。Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２７９５２のようなＳ．ｐ ｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９ ０５０由来の株を用いてもよく、典型的には該株もε−ロドマイシノンをダウノ ルビシンに変換し得る。従って、挿入体ＤＮＡは、 （ａ） Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０又は該株由来の株のゲノムＤＮＡ ライブラリーを作製し、 （ｂ） 該ライブラリーを、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒＴ変異体において ε−ロドマイシノンをダウノルビシンに変換する能力を有するクローンについて スクリーニングし、次いで （ｃ） 該ライブラリーの一部を構成し且つスクリーニングによりＳ．ｐｅｕｃ ｅｔｉｕｓ ｄｎｒＴ変異体においてε−ロドマイシノンをダウノルビシンに変 換する正の能力を有すると同定された組換えベクターから挿入体ＤＮＡを得る ことにより作製し得る。ｄｎｒＴ変異株（ＡＴＣＣ ５５７６２、寄託日：１９ ９６年４月１６日）は、実施例２に記載のｄｎｒ−ＯＲＦ６遺伝子の不活化と類 似の方法で、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０中に存在するｄｎｒＴ遺伝子 を挿入的不活化することにより得られる。 ｄｎｒＴ遺伝子を得るためには、該ライブラリーは、ス テップ（ａ）で、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０又は該株由来の株のゲノ ムＤＮＡを部分消化するか、あるいはダウノルビシン生合成遺伝子集団が集積さ れるか又は該遺伝子集団を特異的に含むＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓゲノムＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。ゲノムＤＮＡに対して は制限酵素ＭｂｏＩを用いるのが好ましいが、ダウノルビシン生合成遺伝子集団 を含むライブラリーに対しては制限酵素ＳａｃＩ又はＢｓａＡＩを用いるのが好 ましい。このようにして得られたＤＮＡフラグメントをサイズ分別し得る。ゲノ ムＤＮＡには３〜５ｋｂサイズのフラグメントが好ましく、ダウノルビシン生合 成遺伝子集団を含むライブラリー由来のＤＮＡフラグメントには２．１ｋｂのＳ ａｃＩ又は又は１．３〜３．３ｋｂのＢｓａＡＩが好ましい。これらのフラグメ ントをｐＷＨＭ３、ｐＩＪ７０２又はｐＫＣ５０５〔Ｍ．Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｏｎら，Ｇｅｎｅ ６１：２３１（１９８７）〕のような直線状ベクターに連結 する。宿主細胞を連結混合物で形質転換する。典型的には、宿主細胞はダウノル ビシンを生産し得ず、ダウノルビシン及びドキソルビシン感受性である、例えば 、１ｍｌ当たり１０μｇ以下のダ ウノルビシン又はドキソルビシンに対して感受性であり得る。例えば、Ｓ．ｐｅ ｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒＴ変異プロトプラスト（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａ ｌｌ及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，前掲）を形質転換し得る。 ステップ（ｂ）で、このようにして得られた形質転換体を、蓄積されたε−ロ ドマイシノンをダウノルビシンに変換してダウノルビシンを分泌させる能力につ いてスクリーニングする。ε−ロドマイシノンを含む培養培地抽出物をダウノル ビシンの存在についてクロマトグラフィー分析して、ε−ロドマイシノンをダウ ノルビシンに変換し得るクローンを同定する。そのようなクローンを単離し、該 クローンに含まれている組換えベクターを抽出する。ステップ（ｃ）では、組換 えベクターを適当な制限酵素で消化することにより、各ベクターに挿入されてい るＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５０ ＤＮＡを同定、サイズ分別、マッピン グし得る。この方法で、該ベクターが本発明の挿入体ＤＮＡを含んでいるかどう かを調べることができる。 さらに、全体的又は部分的に本発明のＤＮＡ内に包含されている２つ以上のオ ーバーラップ挿入体を単離し得る。該挿入体を共通の制限部位で切断し、次いで 連結融合させ て本発明のＤＮＡを得、必要なら適切な制限酵素を用いて長さを短縮することが できる。ｄｎｒＴ遺伝子を含む挿入体ＤＮＡの制限フラグメントは、ステップ（ ｃ）で挿入体ＤＮＡを適切な制限酵素で切断することにより得ることもできる。 以下の実施例により本発明を説明する。 材料及び方法細菌株及びプラスミド ：ＤＮＡフラグメントのサブクローン化には、アンピシリ ン及びアプラマイシン感受性のＥ．ｃｏｌｉ株 ＤＨ５α又はＪＭ１０９を用い る。ｄｎｒ−ＯＲＦ６又はｄｎｒＴ遺伝子を発現させるには、ダウノルビシング リコシドを生産しないＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６変異株を用い る。プラスミドクローニングベクターは、ｐＵＣ１８／１９（Ｙａｎｉｓｃｈ− Ｐｅｒｒｏｎら，前掲）及びｐＷＨＭ３（Ｖａｒａら，前掲）である。培地及び緩衝液 ：Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ及びＪＭ１０９を、ＬＢ寒天（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら、前掲）上に維持する。形質転換体を選択する場合には、アンピシ リン又はアプラマイシンをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ の濃度で加える。Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６を、胞子形成のた めにはＩＳＰ４寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ，ＭＩ）上に、またプロトプラスト再生のためにはＲ２ＹＥ寒天（Ｈｏｐｗｏｏ ｄら，前掲）上に維持する。ＤＮＡフラグメントのサブクローニング ：ＤＮＡ試料を適切な制限酵素で消化し 、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に従ってアガロースゲル上で分離する。 目的のＤＮＡフラグメントを含むアガローススライスをゲルから切り出し、ＧＥ ＮＥＣＬＥＡＮ装置（Ｂｉｏ１０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）又は同等装置を 用い、これらのスライスからＤＮＡを単離する。標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 前掲）を用い、単離したＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ配列決定を含む慣用操作 のためにはＥ．ｃｏｌｉに、また発現実験及び生物形質転換実験のためにはＥ． ｃｏｌｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクター又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙ ｃｅｓベクター中にサブクローン化する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種及びＥ．ｃｏｌｉの形質転換 ：塩化カルシウム法（ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に従ってＥ．ｃｏｌｉのコンピテント細胞を調製し 、標準法 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に従って形質転換する。Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６菌糸体をＲ２ＹＥ培地（Ｈｏｐｗｏｏｄら，前掲）中で増殖 させ、４８時間後に収穫する。菌糸体ペレットを１０．３％（ｗｇｔ／ｖｏｌ） スクロース溶液で２回洗浄し、該ペレットを用い、Ｈｏｐｗｏｏｄマニュアル（ Ｈｏｐｗｏｏｄら，前掲）に概説されている方法に従ってプロトプラストを調製 する。プロトプラストペレットを約３００μｌのＰ緩衝液（Ｈｏｐｗｏｏｄら， 前掲）に懸濁し、この懸濁液の５０μｌアリコートを用いてそれぞれの形質転換 を行う。Ｈｏｐｗｏｏｄら（Ｈｏｐｗｏｏｄら，前掲）、Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅ ｎｇｗａｌｌ及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（前掲）又はＯｔｔｅｎら（前掲）の小 規模形質転換法に従って、プロトプラストをプラスミドＤＮＡで形質転換する。 Ｒ２ＹＥ培地上３０℃で１７時間再生させた後、プレートを２５〜５０μｇ／ｍ ｌのチオストレプトンで覆い、胞子が形成されるまで３０℃で増殖させる。発酵によるε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの変換 ：本発明のプラスミ ド（ｐＷＨＭ９５４）を保有するＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６形 質転換体を、１ ０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む液体Ｒ２ＹＥ培地中に接種する。２日間 ２７〜３０℃で増殖させた後、この培養物２．５〜３．５ｍｌを、１０μｇ／ｍ ｌのチオストレプトンを含む２５〜３５ｍｌのＧＰＳ産生培地〔Ｍ．Ｌ．Ｄｅｋ ｌｅｖａ．Ｊ．Ａ．Ｔｉｔｕｓ及びＷ．Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ．３１：２８７（１９８５）〕に移し、回転速度２５０〜２８０ｒ ｐｍの回転振とう盤上２７〜３０℃で３〜５日間インキュベートする。培養物に ２５ｍｇ／ｍｌのシュウ酸を添加した後、該培養物を水浴中５５℃で６０分間イ ンキュベートして、グリコシド形態のアンスラサイクリン代謝物を加水分解する 。回転速度２８０ｒｐｍの回転振とう盤上３０℃で３０〜５０分間、同量のアセ トニトリル：メタノール（１：１，容量：容量）で培養物から代謝物を抽出する 。抽出物を濾過し、濾液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ） にかけて分析する。ＲＰ−ＨＰＬＣは、流速０．３８５ｍｌ／分のＶｙｄａｃ Ｃ₁₈カラム（４．６×２５０ｍｍ；粒径 ５μｍ）を用いて行う。移動相Ａは、 Ｈ₂Ｏ中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ Ｃｏ．製）であり、移動相Ｂは、アセ トニトリル中０．０７８％のＴＦＡ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）である。溶離は、相Ａ中２０→６０％相Ｂの線形勾配で３３分間行い 、４８８ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器（バンド幅 １２μｍ）でモニ ターする。外部標準としてダウノルビシン及びドキソルビシン（メタノール１ｍ ｌ中１０μｇ）を用い、培養物から単離したこれらの代謝物の量を定量する。 実施例１ｄｎｒ−ＯＲＦ６の破壊 ４１１ｂｐのＢｓａＩ内部フラグメント（ｄｎｒ−ＯＲＦ６のハイポセティカ ル翻訳開始部位の下流の６９３ｐｂ）をｐＵＣ１９のユニークなＨｉｎｃII部位 にサブクローン化し、この構築物をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとし てプラスミドｐＫＣ１１３９（Ｍ．Ｂｉｅｒｍａｎら，前掲）に導入して、ｐＷ ＨＭ９５９（図３）を構築した。ベクターｐＫＣ１１３９は、３４℃以下の温度 で十分に機能する温度感受性レプリコンを含んでいる。２９０５０株をｐＷＨＭ ９５９で形質転換し、アプラマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を用い形質転換体を３ ０℃で選択する。この形質転換体由来のコロニーを、アプラマイシン（１０ μｇ／ｍｌ）を含む５ｍｌの液体Ｒ２ＹＥ中３０℃で２日間、次いで３９℃で５ 〜７日間増殖させ、自律ベクターを除去し、クローン化ＤＮＡと染色体との間で 同種組換えが生じた形質転換体を選択した。これらの培養物からの０．５ｍｌポ ーションを、アプラマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＩＳＰ４プレート上で培 養し、プラスミドの組込みを検証した。得られたコロニーの中でアプラマイシン 耐性表現型を含むもの１つをサザーン分析法に従って調べ、ｄｎｒ−ＯＲＦ６遺 伝子の破壊を検証した。染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ｐＷＨＭ９５９Ｄ ＮＡでプローブした。プローブは、ｄｎｒ−ＯＲＦ６変異株の７．２ｋｂ及び１ ．７ｋｂのフラグメントにハイブリダイズしたが、これは、ｄｎｒ−ＯＲＦ６遺 伝子へのプラスミドｐＫＣ１１３９の挿入と一致する。野生型株は、予測された ２．０ｋｂのＢａｍＨＩ ｄｎｒ−ＯＲＦ６フラグメントを示した。 実施例２ｄｎｒＴの破壊 ５５５ｐｂのＡｃｃＩ−ＮａｒＩ内部フラグメント（ｄｎｒＴのハイポセティ カル翻訳開始部位の下流の２２７ｂｐ）をｐＵＣ１９のユニークなＡｃｃＩ部位 にサブクロー ン化し、この構築物をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてｐＫＣ１１ ３９に導入してｐＷＨＭ９６２（図３）を構築した。該２９０５０株をｐＷＨＭ ９６２で形質転換し、アプラマイシン耐性について選択した後、形質転換体をア プラマイシン選択下に３９℃で増殖させて、取り込まれなかったプラスミドを除 去した。得られたアプラマイシン耐性コロニーの１つ由来のＤＮＡをサザーンブ ロットハイブリダイゼーションにかけて分析し、ｄｎｒＴ遺伝子の破壊を確認し た。ＢａｍＨＩで消化した染色体ＤＮＡを不活化に用いた５５５ｂｐのＡｃｃＩ −ＮａｒＩフラグメントでプローブすると、ｄｎｒＴ変異株の８．２ｋｂ及び４ ．９ｋｂのフラグメントにハイブリダイズしたことが知見された。これは、野生 型株が予測された６．０ｋｂのＢａｍＨＩ ｄｎｒＴフラグメントを示したこと により、ｄｎｒＴ遺伝子へのプラスミドｐＫＣ１１３９の挿入と一致する。 実施例３ε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの変換に必要な酵素をコードするｄｎ ｒＴ遺伝子のクローニング 約２０〜９０ｋｂのＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ２９０５ ０ゲノムＤＮＡを構成する、ｐＷＨＭ３３５若しくはｐＷＨＭ３３７のような、 Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（前掲）並びにＯ ｔｔｅｎら（前掲）により記載されたコスミドクローンのうちの数種又は同等の 株から得た類似のクローンを、ＢａｍＨＩ＋ＳｐｈＩで消化し、該ＤＮＡを、Ｂ ａｍＨＩ＋ＳｐｈＩで消化した後再連結しておいたＥ．ｃｏｌｉ及びＳｔｏｒｅ ｐｕｔｏｍｙｃｅｓ種のいずれにおいても複製可能なｐＷＨＭ３ベクター又は同 等ベクターと結合させ、得られたプラスミド混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄ Ｈ５αをアンピシリン耐性体（又は用いたベクターの選択に適切な耐性体）に形 質転換する。数種のアンピシリン耐性Ｅ．ｃｏｌｉクローン由来のプラスミドＤ ＮＡをＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒＴ変異体に導入し、形質転換体を、材料 及び方法の項に記載の方法に従ってε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの 生物学的形質転換について分析した。図１に示されている制限マップ領域を包含 する挿入体を含むプラスミドを単離し、所望の挿入体を２．９７ｋｂのＳａｃＩ −ＢｓａＡＩ ＤＮＡフラグメントとしてｐＵＣ１９のポリリンカー領域のＳａ ｃＩ及びＨｉｎｃII部位にサブ クローン化し、次いで、該遺伝子をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIセグメントとして ｐＷＨＭ３のポリリンカー領域に導入して、ｐＷＨＭ９５４を得た。材料及び方 法の項に記載の方法でＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒＴ（ｐＷＨＭ９５４）形 質転換体を作製し、該形質転換体をε−ロドマイシノンからダウノルビシンへの 生物学的変換能についてテストした。 実施例４Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６（ｐＷＨＭ９５４）形質転換株の作 製 上記のプラスミド媒介形質転換法に従い、組換え株を選択するためにチオスト レプトン（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、ｐＷＨＭ９５４ ＤＮＡをＳ．ｐｅｕｃ ｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６変異体に導入した。Ｈｏｐｗｏｏｄら（前掲）に 記載のプラスミド単離プロトコルに従ってｐＷＨＭ９５４を再単離して、Ｓ．ｐ ｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６（ｐＷＨＭ９５４）形質転換体を検証し、 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）により記載の標準法に従って制限酵素消化によりｐ ＷＨＭ９５４ ＤＮＡを分析した。 実施例５ｄｎｒＴ遺伝子を保有するｐＷＨＭ９５４プラスミドを有するＳ．ｐｅｕｃｅｔ ｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６形質転換体によるε−ロドマイシノン（ＲＨＯ）から ダウノルビシンへの変換率の向上 ｐＷＨＭ９５４を保有するＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ｄｎｒ−ＯＲＦ６変異体 を、５０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含むＲ２ＹＥ寒天培地の傾斜面上２８ ℃で１２日間増殖させた。該培養物の胞子を回収し、１０μｇ／ｍｌのチオスト レプトンを含む３０ｍｌの２ＹＥ液体培地を含有する３００ｍｌ容のＥｒｌｅｎ ｍｅｙｅｒフラスコ中で懸濁し、フラスコを直径５ｃｍの回転振とう盤（回転速 度２８０ｒｐｍ）上３０℃で２日間振とうした。この培養物３ｍｌを用い、３０ ０ｍｌ容のＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中の、１０μｇ／ｍｌのチオストレプ トンを含むＧＰＳ培地３０ｍｌに接種した。種培養について記載のしたものと同 一条件下にフラスコを３０℃で５日間インキュベートし、次いで、固体シュウ酸 ２５ｍｇ／ｍｌを添加した後、フラスコを５５℃で６０分間水浴中に置いて、グ リコシド形態のアンスラサイクリン代謝物を加水分解した。回転速度２８０ｒｐ ｍの回転振とう盤上３０℃で３０分間、３０ ｍｌのアセトニトリル：メタノール（１：１容量／容量）で培養物から代謝物を 抽出した。 抽出物を濾過し、濾液を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ） にかけて分析した。ＲＰ−ＨＰＬＣは、流速０．３８５ｍｌ／分のＶｙｄａｃ Ｃ₁₈カラム（４．６＋２５０ｍｍ；粒径 ５μｍ）を用いて行った。移動相Ａは 、Ｈ₂Ｏ中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ ｃｏ．製）であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０７８％のＴＦＡ （Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）である。溶離は、相Ａ中 ２０→６０％相Ｂの線形勾配で３３分間行い、４８８ｎｍに設定したダイオード アレイ検出器（バンド幅 １２μｍ）でモニターした。外部標準としてダウノル ビシン（ＤＮＲ）及びドキソルビシン（ＤＸＲ）（メタノール１ｍｌ中１０μｇ ）を用い、培養物から単離したこれらの代謝物の量を定量した（表１）。 ^aμg/ml^b 測定せず

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 コロンボ，アンナ・ルイザ イタリー国、イ−20144・ミラン、ビア・ エルバ、14 (72)発明者 フイリツピーニ，シルビア イタリー国、イ−20144・ミラン、ビア・ エルバ、30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２の配列と９０％以上相同な配列を有するε−ロドマイシノン変 換タンパタ質をコードする単離されたＤＮＡ分子。 ２． ε−ロドマイシノン変換タンパク質が配列番号２の配列を有する、請求項 １に記載のＤＮＡ分子。 ３． 配列番号１の配列からなる、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ４． 請求項１に記載のε−ロドマイシノン変換タンパク質をコードするベクタ ー。 ５． 配列番号２の配列を有するε−ロドマイシノン変換タンパク質をコードす る、請求項４に記載のベクター。 ６． 配列番号１の配列を含む、請求項４に記載のベクター。 ７． プラスミドである、請求項４に記載のベクター。 ８． ｐＷＨＭ９５４である、請求項７に記載のプラスミド。 ９． 請求項４に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトした細菌宿主 。 １０． ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞である、請求項 ９に記載の宿主。 １１． ダウノルビシン代謝遺伝子の機能を遮断する変異を有するストレプトマ イセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞である、請求項１０に記載の宿主。 １２． 遺伝子がｄｎｒ−ＯＲＦ６である、請求項１１に記載の宿主。 １３． ダウノルビシンを製造する方法であって、 （ｉ） 請求項４のベクターを有する請求項１１に記載の宿主を培養するステッ プ、及び （ii） 培養物からダウノルビシンを単離するステップ を含む方法。 １４． ダウノルビシンを製造する方法であって、 （ｉ） 請求項８のプラスミドを有する請求項１２に記載の宿主を培養するステ ップ、及び （ii） 培養物からダウノルビシンを単離するステップ を含む方法。 １５． 請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子を製造する方法であって、 （ａ） Ｓ．ポセティウス（Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ） ２９０５０又は該株由来の株のゲノムＤＮＡのライブラリーを作製するステップ 、 （ｂ） 該ライブラリーを、Ｓ．ポセティウス（Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）ｄｎ ｒＴ遮断変異体においてε−ロドマイシノンをダウノルビシンに変換する能力を 有するクローンについてスクリーニングするステップ、及び （ｃ） 該ライブラリーの一部を構成し且つＳ．ポセティウス（Ｓ．ｐｅｕｃｅ ｔｉｕｓ）ｄｎｒＴ遮断変異体においてε−ロドマイシノンをダウノルビシンに 変換する正の能力を有するとスクリーニングされた組換えベクターから挿入体Ｄ ＮＡを得るステップ を含む方法。 １６． 遺伝子ｄｎｒ−ＯＲＦ６の機能を遮断する変異を有するストレプトマイ セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞。