JPH0269502A

JPH0269502A - 水溶性低分子化キトサンおよびその製造法

Info

Publication number: JPH0269502A
Application number: JP22037788A
Authority: JP
Inventors: Kazutsune Tanaka; 一経田中; Kayoko Tsumaki; 妻木　佳代子; Tadashi Miwa; 三輪　端
Original assignee: K I KASEI KK
Current assignee: K I KASEI KK
Priority date: 1988-09-05
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1990-03-08
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: JP2763112B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野］本発明は、種々の工業的用途に用いられる（極大分子量
４．０００−１２，０００の低分子化キトサンを主に含
む）水溶性低分子化キトサン及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

キトサンは、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコー
スがβ−１，４結合した塩基性多糖類で、通常はキチン
を脱アセチル−化することにより得られる。このキトサ
ンは水には溶解しないが希酸水溶液には溶ける。しかし
ながら高分子化合物であるために粘度が高く、また中性
乃至アルカリ性にすると不溶化するためにキトサンの使
用用途はおのずから限定されてくる。従って水溶性の低
分子キトサンを得る技術の確立が強く要望されている。

そこでキトサンの低分子化が種々検討されてきたが、従
来技術でキトサンを処理して低分子化しても極大分子量
４．０００−１２．０００で酸性乃至アルカリ性の水溶
液に溶けるものは得られない。

従来、中性の水にも溶解可能な低分子キトサンを得る方
法としては、キトサンに塩素ガスを接触させて低分子化
する方法（特開昭６０−１８６５０４号）、あるいは亜
硝酸塩処理による方法（特開昭６０−１８４００２号）
がある。しかしながらこれらの方法により生成した水溶
性の低分子化キトサンはいずれも極大分子量が３．００
０以下と小さく、またこれらの酸化分解法は、酸化によ
る脱アミノ化のために純粋な低分子化キトサンを得るこ
とが困難であるという欠点を有している。

キトサンを低分子化する別法として、過酸化水素水によ
る分解法（特開昭５４〜１４８８９０号）または過硼酸
ソーダ水溶液で処理する方法があるが、これらの方法で
得られる低分子化キトサンはその分子量が低（でも１２
．０００程度であるため、中性乃至アルカリ性の水にこ
れを溶解させることは出来ない。

これに対して、酵素法によりキトサンを低分子化する方
法がある。キトサンを分解する酵素としては主にキトサ
ナーゼが報告されている。キトサナーゼを生産する微生
物としてミクソバクター（Ｍｙｘｄ＋１ａｃｔｅｒ）Ａ
Ｌ−１［ヘッジ＆ウォル）ニジ＋−ナル・オブ・バクテ
リオロジ−（Ａ、Ｈｅｄｇｅｓ　＆　Ｒ，Ｓ。

Ｗｏｌｆｅ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）第１２０巻。

第８４４〜８５３頁（１９７４年）〕、バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｐ、）Ｒ−４（１−ミナガ他：ビオヒミ
カ・工・ビオフィジカ・アクタ（Ｙ、Ｔｏｍｉｎａｇａ
　ｅｔ　ａｌ　：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　［１ｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）第４１０巻、第１４５〜
１５５頁（１９７５年）］、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｐ、）　ｋｇ９−５〔堀内：特開昭６０−１８０
５８５号：日本農芸化学会昭和５９年度大会講演要旨集
、第５５０頁（１９８４年）〕。

バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｎａ７−Ｍ　　
［大室ら：特開昭６１−２８０２フ７ＭＨＫ−１株〔矢吹ら：特開昭６２−２０１５フ１１株
〔矢吹ら：特開昭６３−９４９フ１プミルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）　ＢＮ−２６２　　（代部
ら：特開昭６３ー６３３８２号）、アルカリゲネス・フ
ァエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ）ＩＫ−５　（市川ら二日本農芸化学会昭和６３年度
大会講演要旨集．第５３６頁〕といった細菌が知られて
いる．また、以上の他にストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）　Ｎ（１６　（プライスら；
ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｓ．Ｐｒ１
ｃｅ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１２４巻，第１５７４〜１５８
４頁（１９７５年）〕、ストレプトミセス・グリセウス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）ＨＵＴ
　６０３７　（大室ら：キチン・キトサン・アンド・リ
レイテッド・エンザイム（Ｃｈｉｔｉｎ，　Ｃｈｉｔｏ
ｓａｎ　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）
第１４７　〜１６０頁（１９８５年）アカデミツク・プ
レス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ））　＋　ストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏａ＋ｙｃｅｓ　ｓｐ．）Ｗ
ＡＫ−８６１　　［寺田ら：日本農芸化学会　昭和６２
年度大会講演要旨集第６５１頁］およびペニシリウム・
イスランディクム（Ｐｅｎ’ｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｉｓｌ
ａｎｄｉｃｕｍ）　０Ｍ７５７１　（フェントン他：ジ
ャーナル・オプ・ジェネラル・ミクロバイオロジー（Ｄ
．Ｍ．Ｆｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第
１２６巻，第１５１〜１６５頁（１９８１年）〕がキト
サナーゼを生産することが知られている。

これらのうちバチルスＮα９９−５のキトサナーゼとペ
ニシリウム・イスランディクムのキトサナーゼについて
はキトサンの脱アセチル化度と酵素分解性との関係につ
いて研究されているが、分子量の比較的大きな生成物に
関する報告は見あたらない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明らは、キトサンに関する上記の事情に鑑みて、極
大分子量が主として４　、０００−１２．０００であリ
、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な水溶性低分子
化キトサンおよびその製造技術を確立することが当業界
における重要な技術的課題であるとの認識を有するに至
った。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、水溶性低分子化キトサンについ
て鋭意検討した結果、原料として種々の脱アセチル化度
を有するキトサンを用いてこれにキトサナーゼを作用さ
せ、膜処理により低分子化キトサンを得たところ原料の
キトサンの脱アセチル化度と得られた水溶性低分子化キ
トサンの分子量とに関連があることを見出した。すなわ
ち、脱アセチル化度の比較的低いキトサンを用いると極
大分子量１０，０００前後の水溶性低分子化キトサンが
得られるが、原料のキトサンの脱アセチル化度が９０％
を超えると得られる水溶性低分子化キトサンの分子量が
低下する傾向が認められ、更に脱アセチル化度１００％
付近のキトサンを用いた場合には、極大分子量的１　、
０００の低分子化キトサンは水溶性となるが、極大分子
量的２，０００の低分子化キトサンは水に不溶であった
。また、従来の化学的処理方法によるキトサンの低分子
化では、生成した低分子キトサンの脱アミノ化が避けら
れなかったが、反応特異性の高い酵素（キトサナーゼ）
を用いることにより、脱アミノ化の程度の極めて低い水
溶性低分子化キトサンを温和な条件で得ることが可能と
なった。この脱アミノ化の程度を規定するために、フェ
ノール硫酸法を採用した。すなわち、キトサンを構成す
るグルコサミンやＮ−アセチルグルコサミンといったア
ミノ糖をフェノール硫酸法により発色した場合には４９
０ｎｍ付近の吸収が認められないが、脱アミン化により
生した糖はフェノール硫酸法により４９０ｎｍ付近にピ
ークが認められるようになることを利用したものである
。本発明者らはこれらの知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。

本発明は、極大分子量が主として４．０００−１２，０
００であり、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な水
溶性低分子化キトサン及びその製造法を堤供することを
目的とするものである。

本発明は、以下の（１）〜（６）の技術的事項によって
構成されるのもであり、当該（１）〜（６）の各発明は
全て本発明の範囲に含まれる。

（１）脱アセチル化度が６０−９０％であるところのキ
トサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反
応後にアルカリを加えて反応液ｐＨを７−１０に上げ、
更に必要に応じて濾過または膜処理により酵素反応生成
物を分離して得られる極大分子量が主として４．０００
−１２，０００であり、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液
に可溶な水溶性低分子化キトサン。

（２）　　フェノール硫酸法によるグルコース換算Ｉ！
量が１０％以下であることを特徴とする上記（１）の水
溶性低分子化キトサン。

（３）脱アセチル化度が６０−９０％であるところのキ
トサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反
応後にアルカリを加えて反応液ｐＨを７−１Ｏに上げ、
更に必要に応じて濾過または膜処理により酵素反応生成
物を分離し、極大分子量が主として４．０００−１２，
０００であり、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な
低分子化キトナンを得ることを特徴とする水溶性低分子
化キトサンの製造法。

（４）キトサナーゼがバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、）Ｎ（ＬＫ−８８１（微工研閑寄第１０２５７
号）により生産されたものであることを特徴とす上記（
３）の水溶性低分子化キトサンの製造法。

（５）膜が孔径０．０５μｍ乃至５μｍの精密濾過膜ま
たは分画分子量１万以上の限外濾過膜である上記（３）
の水溶性低分子化キトサンの製造法。

（６）膜が孔径０．０５μｍ乃至５μｍのセラミックフ
ィルターである上記（３）の水溶性低分子化キトサンの
製造法。

続いて、本発明の構成につき更に詳しく説明する。

本発明において用いられる原料のキトサンは、従来公知
のキトサンのうち脱アセチル化度６０−９０％のものが
使用でき、例えば市販されているキチンまたは天然に存
在するキチンを常法により脱アセチル化して得られるキ
トサンや、脱アセチル化度９０％以上のキトサンをアセ
チル化して得られるキトサン等が挙げられる。前者の例
としては例えばかに殻を脱灰、脱蛋白してえられるキチ
ンを濃度３０−５０％の水酸化ナトリウム水溶液に浸清
し、５０−１３０°Ｃで目的の脱アセチル化度になるよ
うに反応時間を設定して反応させた後、アルカリを除去
し、次いで水洗乾燥して得られたフレーク状または更に
粉砕された粉末状の乾燥物質が挙げられる。また、脱ア
セチル化度６０％未満の原料キトサンを用いて本発明の
製造法に従って調製した場合には、より高分子で水溶性
の低分子化キトサンが得られる。酵素処理量を増やすか
、または反応時間を長（することにより、極大分子量が
４．０００−１２．０００の水溶性の低分子化キトサン
を得ることも不可能ではないが、生産効率は脱アセチル
化度６０−９０％のキトサンに比べて劣る。また、この
場合に得られた低分子化キトサンは、単位重量あたりの
アミノ基含量が少なく、ポリカチオン性の効果が劣り、
本発明の実施には適当ではない。

本発明において、キトサナーゼを原料キトサンに作用さ
せるためにキトサン溶液を調製しなければならないが、
キトサンは酸に溶けるので、キトサンに酸水溶液−を加
えてキトサン濃度が１−３０％、好ましくは５−１０％
の溶液とする。この場合、溶液のｐＨがキトサナーゼの
作用最適ｐＨ付近となるように添加する酸の量を加減す
る。例えばバチルスＮａＫ−８８１由来のキトサナーゼ
の場合、至適ｐＨは６であるのでキトサン溶液のｐＨが
５−６になるように酸の添加量を調整する。

キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサンを溶解し
うるものであれば、有機酸または無機酸のいずれであっ
てもこれを使用することができるが、塩酸、蟻酸、酢酸
、乳酸、グルタミン酸等が好ましい。このキトサン溶液
にキトサナーゼの粉末または溶液を加え、キトサナーゼ
の作用温度においてキトサンを分解する。キトサナーゼ
の作用温度は、例えはバチルス由来のキトサナーゼの場
合、３０−６０°Ｃであるが、４０°Ｃ前後にするのが
好ましい。

本発明において酵素反応によって生ずる低分子化キトサ
ンの分子量分布は反応時間あるいは酵素１等によって変
化するため、目的とする分子量の水溶性キトサンを高収
率に得るためには反応時間（または酵素量）と生成物の
分子量との関係に基づいて、反応条件を厳密に決定する
必要がある。

なお、本発明に使用するキトサナーゼは、脱アセチル化
度６０−９０％のキトサンを分解して、極大分子量４　
、０００−１２．０００の低分子化キトサンを主として
生成することができる酵素であれば、いかなるものであ
ってもこれを使用することができる。

例えば、市販のキトサナーゼ（販売；和光純薬。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　　０Ｎ−２６２由
来）は本発明に使用し得るものであるが、非常に高価で
あるため、酵素処理によって製造する水溶性低分子化キ
トサンも非常に高価なものとなる。

そこで本発明者らは、広く自然界より安価にキトサナー
ゼを生産しうる微生物の検索を行った結果、土壌中より
分離したバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、）Ｎａ
Ｋ−８８１（微工研菌寄第１０２５７号）がキトサナー
ゼを効率良く生産すること等の知見を得た。

本国（バチルス属菌Ｎαに−８８１）の菌学的性質は以
下に示す通りである。

（ａ）　　細胞の形態肉汁または肉汁寒天培地で３７℃、２４〜７２時間培養
し、観察。

■　細胞の形及び大きさ：短桿菌。

０、５〜１．　ＯＸ　１．　Ｏ〜３．０　ａ　ｍ■　細
胞の多形性の有無：未定 ■　運動性の有無：無し ■　胞子の有無：有り９球形〜楕円形の内生胞子、胞子
の位置は亜、端室または端室 ■　グラム染色性：陽性 ■　抗酸性：陰性い）各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（３７℃、２４〜７２時間）：不
透明で厚く、乳白色の円形コロニを形成する。

コロニーの表面には凹凸や光沢が有り色素は産生しない。

■　肉汁寒天斜面培養（３７℃、２４時間〜７２時間）
：生育は良好で、時間とともに拡がり、 ■の記載に同じ。

■　肉汁液体培養（３７°Ｃ３２４〜７２時間）：培地
表面に乳白色の菌膜を形成するが液は濁らない。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（２５°Ｃ１２４〜７２時間
）；穿刺線に浴って生育し、ゼラチンは液化される。

■　リドマスミルク　（３７°Ｃ１２４〜７２時間）：
２８目ころより液化及び変色が認められ、酸性となる。凝固は認められない。

時間の経過とともに液化は進み、半透明となる。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元：陽性（酵母エキス添加コハク酸硝酸塩培地、３７’Ｃ，２４
〜１２０時間）： ■　脱窒反応：陰性（駒形らの方法、３７°Ｃ１２４〜７２時間）■　ＭＲ
テスト：陰性（３７°Ｃ１２４〜７２時間） ■　ＶＰテスト：陽性（３７°Ｃ１２４〜７２時間） ■　インドールの生成：陰性（３７°Ｃ１２４〜７２時間） ■　硫化水素の生成；陰性（ＴＳＩ寒天法、３７°Ｃ１２４〜７２時間）■　デン
プンの加水分解：陰性（３７°Ｃ１２４〜７２時間） ■　クエン酸の利用：（コーザーの培地、３７°Ｃ１２４〜７２時間）：未利
用（クリステンセンの培地、３７°Ｃ１２４〜７２時間
）−利用 ■　無機窒素源の利用硝酸塩：未利用アンモニウム塩：アンモニウム塩を唯一の窒素源として
生育できる。

［相］　色素の生成（キングＡ寒天斜面培地）：陰性 ■　ウレアーゼ：陽性（クリステンセン・ウレア寒天培地、３７°Ｃ１２４〜
７２時間） ■　オキシダーゼ：陽性（肉汁寒天培地、３７°Ｃ１２４〜４８時間）■　カタ
ラーゼ：陽性（肉汁寒天培地、３７°Ｃ１２４〜４８時間）［相］　
生育の範囲至適温度−２５〜３５°ＣｐＨ：５〜９７％ＮａＣ１存在下での生育：生育する■　酸素に対す
る態度：好気性（１％グルコース肉汁高層寒天培地、３７°Ｃ９２４〜
７２時間） ■　Ｏ−Ｆテスト：酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）（ヒユ
ー・ライフラン法、　２Ｂ”Ｃ，Ｄ−グルコース） ■　糖類からの酸およびガスの生成の有無（２８°Ｃ１
２４〜７２時間）ｔＪ！　　　類　　　　　酸　　ガス（１）Ｌ−アラビノース（２）Ｄ−キシロース（３）Ｄ−グルコース　　　　＋（４）Ｄ−マンノース　　　　＋（５）Ｄ−フラクトース　　　＋〔６）Ｄ−ガラクトース（７）麦芽糖（８）　　　シ　　　　ョ　　　　ネ唐　　　　　　　
　　　　　　　　十（９）乳糖００）トレハロース川）　Ｄ−ソルビット　　　　　＋０２）Ｄ−マンニット　　　　＋０３）イノジット０４）グリセリン　　　　　士０９　　デンプン θｅ　サリシン　　　　　　士（ｄ）　　その他の性質 ■　エラグヨーク反応（３７℃、２４〜４８時間）：陽性以上の菌学的性質に基づいて、パージエイズ・マニュア
ル・オブ・デターミネイティブ・ハタテリオロジ−（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ３ａｃｔｅｒｉｏ１ｏｇｙ）の第８版（１
９７４年）を検索したところ、Ｎｏ．Ｋ−８８１株はバ
チルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）属に属することがわか
った。

バチルス属菌Ｎｏ．Ｋ−８８１により生産されたキトサ
ナーゼの酵素化学的性質は以下に示す通りである。

（１）作用キトサンに作用し、β−１，４結合を加水分解する。分
解型式はエンド型と考えられる。

（２）基質特異性本キトサナーゼは、キトサンやコロイダルキトサンには
作用するが、粉末キチン、コロイダルキチン、グリコー
ルキチン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）およ
びα−１，４−ポリガラクトサミンには作用しない。本
キトサナーゼは脱アセチル化度８０％前後のキトサンを
最もよ（分解し、さらに脱アセチル化度が低下すると、
分解率は急激に低下する。

ｐｌ（６，０，４０°Ｃにおいて１０分間反応させた場
合のキトサンの脱アセチル化度と相対活性の関係を第１
図に示す。

（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨｐＨ４〜８の範囲において作用し、至適ｐＨは６．０で
ある。４０°Ｃにおいて１０分間反応させた場合の反応
液ｐＨと相対活性の関係を第２図に示す。

また４０゛Ｃにおいて３０分間加熱処理した場合、安定
ｐＨの範囲は第３図に示すとおり５〜８である。

（４）　　酵素力価の測定法キトサン（脱アセチル化度７５〜９０％、１６メツシユ
以下）０．５ｇを、０．０７５Ｎ酢酸９０ｍ１に溶解し
、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６，０に調整した後、水
で全容を１００Ｉｎｉとして基質のキトサン溶液を調製
する。

このキトサン溶液０．５　ｄに酵素溶液０．５　ｄ（約
０．０２５ｕｎｉｔのキトサナーゼを含む）を添加し、
４０℃で１０分間酵素反応を行わせる。その後反応液に
アセチルアセトン溶液１ｍｌを加え、ロンドル・モルガ
ン法により反応液中に生成した還元［量を測定する。

上記条件下において１分間に１ｇｍｏｌのグルコサミン
に相当する還元糖を遊離する酵素力価を、１単位（ｕｎ
ｉ　ｔ）とする。

（５）作用適温の範囲６０°Ｃまで作用し最適温度は５５°Ｃである。

ｐＨ６，０において１０分間反応させた場合の温度と相
対活性の関係を第４図に示す。

（６）熱安定性及び安定化ｐＨ６，１５分間の加熱処理では５０’Ｃ以下で安定で
あるが９０°Ｃでは完全に失活する。

温度と残存活性の関係を第５図に示す。

なお、本キトサナーゼの熱安定性は、イオン強度によっ
て影響を受け、透析した場合、ｐＨ６，６０°Ｃ１１５
分間の加熱処理により完全に失活する。

本キトサナーゼは０．１　Ｍ以上の塩化ナトリウムによ
って安定化される。

ｐＨ６，５０°Ｃにおいて１５分間加熱処理した場合の
残存活性の塩化ナトリウム濃度による影響を第６図に示
す。

（７）阻害及び活性化本キトサナーゼは０．０５ＭのＮｌ５Ｏ４１ＺｎＳＯ４
゜Ｃｕ５Ｏ，、Ｃａ（ＯＨ）ｚによりほぼ１００％が阻
害される。

また、０．０５ＭのＮａＣ１，ＫＣ１＋　ＮＨ４Ｃｌ、
（ＮＨ４）ｚＳＯａ。

ＭｇＳＯ４９ＭｎＣ１ｚによる活性化が認められる。た
だし、活性化の程度は基質のキトサンによって異なる。

なお、本キトサナーゼはＥＤＴＡによる活性化は認めら
れない。

（８）精製方法本キトサナーゼの精製は、例えば次のように行う、培養
液の水溶性画分を硫安塩析または有機溶媒沈澱により分
画した後、透析を行い、さらに０．００５Ｍの酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５）で平衡化したＳＰ−トヨパール６５０
３カラム（東ソー製）を用いてイオン交換クロマトグラ
フィーを行う。

次にトヨパールＩＩＷ−５０Ｓによるゲル濾過クロマト
グラフィーにより精製する。

（９）分子量０、１　Ｍリン酸緩衝液（０，２Ｍ硫酸ナトリウム含有
）を用い、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷグラス　カラム（
東ソー製）によるゲル濾過クロマト法により測定すると
、分子計約３１，０００である。

００）等電点アクリルアミド焦点電気泳動法により等電点を氾１１定
すると８．４である。

本発明においてキトサナーゼ処理の後、または酵素反応
途中において、アルカリを加えて反応液のｐＨを７−１
０に上げ、キトサン中のアミノ基のアンモニウム塩形成
を破壊し、水不溶性キトサンを析出させる。本発明に使
用するアルカリとしては、水溶液中においてアルカリ性
を示す物質であれば良く、例えばナトリウムやカリウム
の水酸化物を用いることができるが、水酸化ナトリウム
の水溶液を用いることが好ましい。水不溶性キトサンの
量が少ない場合には、使用用途によってはそのままでも
利用可能である。この場合は必要に応して脱塩操作を行
い、凍結乾燥法または噴霧乾燥法等により乾燥粉末化す
る。−力水不溶性キトサンを除去した水溶性低分子化キ
トサンを調製する場合には、濾過または膜分離操作を行
った後に用途により乾燥粉末化を行う。また必要に応し
て膜分離工程の前あるいは後で脱塩操作を行う。本発明
においてキトサンの膜処理に使用できる膜としては、孔
径０．０５μｍ乃至５μｍの精密濾過膜または分画分子
量１万以上の限外濾過膜がある。ここで言う精密濾過膜
としては、たとえばセラミック膜（東芝セラミックス社
製　メンブラロノクスセラミックフィルター９日本ガイ
シ社製　セラミックフィルター、日本セメント社製　セ
ラミックフィルター、久保田鉄工社製セラミックフィル
ター等）、　ポリオレフィン系膜（旭化成社製　マイク
ローザ膜等）、　ポリビニルアルコール系膜（クラレ社
製　ＳＦフィルター等）、　ポリプロピレン系膜（日東
電工社製　ＮＴＭ膜等）、　ポリカーボネート系膜（ス
ルザー社製　ＷＯ膜等）、　ポリスルホン系膜（富士フ
ィルム社製　ＰＳＥ膜等）、　ポリビニリデンフロライ
ド系膜（ミリポア・リミテッド製　デュラポア膜等）、
　テフロン系膜（ザルトリウス社製　ザル（・フロル膜
、キュノ社製　テフロンフィルター等）、　セルロース
系膜（富士フィルム社製　ＦＭ膜、ミリポア・リミテッ
ド製ＭＩ”−ミリポア膜、ザルトリウス社製　ザルドブ
ラン等）等を挙げることができる。またここで言う限外
濾過膜としては、たとえばポリスルホン系膜（ミリポア
・リミテッド製　ＰＴ膜１日東電工社製　ＮＵＴ膜等）
１　セルロース系膜（ミリポア・リミテッド製　ＰＴ膜
等）、　ポリアクリルニトリル系膜（旭化成社製　ＡＣ
Ｖ膜等）などを挙げることができる。

〔発明の効果］以上説明したように、本発明の製造方法によれば脱アセ
チル化度６０−９０％のキトサンから比較的分子量の大
きな水溶性低分子化キトサンを温和な条件で収率よ（製
造することができ、しがも従来の方法では極大分子量３
，０００以下あるいは１２，０００をこえるものしか得
られず、しかも脱アミノ化による品質低下といった欠点
があったのを、本発明の製造方法によってこれらの欠点
を解消することができた。本来、キトサンはポリカチオ
ン性、皮膜形成能等の性質を持つ機能性の高い高分子で
あり、食品・医薬品・化粧品等の分野で広く利用できる
ものであるが、生体のｐＨである中性付近では不溶性で
あるという難点を有する。しかるに本発明の製造方法に
よって得られる水溶性低分子化キトサンは、極大分子量
が主として４．０００−１２０００と高く、キトサン本
来のポリカチオン性、皮膜形成能という特性を有しなが
ら、酸性乃至アルカリ性の水溶液に可溶であり、更に化
学的な修飾を行っていないため原料のキトサンと同様に
安全性が高く、食品、医薬品、化粧品をはじめとして広
く利用することができる。

以下に参考例、実施例及び比較例を示して本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

参考例（１）（種培養）５００ｒＩ！容三角フラスコに、デンプン３％、ベプト
ン５％１　リン酸−カリウムＯ９１％、硝酸ナトリウム
０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％を含む液体培地
（ｐ　Ｈ６，０）１００−を入れ、常法により滅菌した
後、バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）Ｎｏ．
Ｋ−８８１（微工研菌寄第１０２５７号）を接種し、２
８°Ｃにおいて１日間振とう培養し、種培養液とした。

（酵素生産用培＃）５２容三角フラスコ５本に、上記と同一の組成の液体培
地をそれぞれ６００ｍ１ずつ入れ、常法により滅菌した
後、この培地に上記の種培養液１０ｄを接種し、２８℃
において５日間振とう培養した。

（酵素の調製）上記で得られた培養液を遠心分離（７０００ｒｐｌＩ＋
）により菌体を除去した。得られた上澄液のキトサナー
ゼ活性は５．２ｕ／ｄであった。この上澄液２７００ｄ
に固体硫安１５１５ｇ（硫安８０％飽和に相当）を加え
、濾過し、得られた沈澱物をイオン交換水に溶解し、イ
オン交換水に対して１日間透析を行った後、真空凍結乾
燥を行い、粗酵素キトサナーゼの粉末７７．５ｇを得た
。本品のキトサナーゼ活性は１０５ｕ／ｇであった。

参考例（２）参考例（１）で得られた粗酵素キトサナーゼ粉末１０ｇ
を０．００５Ｍの酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ４，５）１５０Ｉ
ｄに溶解し、遠心分離で不溶物を除去した後、０．００
５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）で平衡化したＳＰ−）コ
バール６５０Ｓカラム（直径２．２　ｃｍ　Ｘ長さ２０
ｃｍ、東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィー
（流速＝３Ｉ１１／分）を行った。０〜０．５Ｍの塩化
ナトリウムの直線濃度勾配により、酵素を溶出させ、酵
素活性フラクションを集め、次にダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）で濃縮した。

この液を０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化し
たトヨバールＨＷ５０５カラム（直径２　ｃｍ　Ｘ長さ
１００ａｎ。

東ソー製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーを行っ
た。活性フラクションを集め、精製キトサナーゼ溶液１
５−（総括性３２６ｕｎｉｔｓ）を得た。比活性は３９
．４ｕｎｉｔ／タンパク質■であった。

参考例（３）脱アセチル化度８１％のキトサン〔和光純薬、キトサ７
８０Ｈ；粘度（０，５Ｗ／Ｖ％、２０°Ｃ）１８０ｃｐ
）　７．５ｇにイオン交換水１１５−及びＩＮ酢酸水溶
液２５ｍを加えて溶解した（ｐＨ５，９）。このキトサ
ン溶液を１４−ずつＬ字試験管に取り、キトサナーゼ溶
液（参考例（１）のキトサナーゼ粉末０．１４３ｇを水
１ｍｌに溶かす：　１５ｕ／Ｉｌ！ｉり　　１　ｕｔｌ
を加え４０℃の恒温水槽内で振とうしながら１５分間、
１時間、５時間、２３時間反応した後、Ｌ字試験管を沸
とう水浴中に浸漬し、反応を停止させた。これらの反応
液につき、ＡｓａｈｉｐａｋＧＳ−３２０カラム（旭化
成工業製）を用いた高速液体クロマトグラフィー法によ
り分子量を測定した。

その結果は第７図に示すとおりであった。

上記条件下で反応した場合、反応時間は１５分前後が適
当であった。

実施例　（１）５０（ｌｄ容のビーカーに脱アセチル化度７２％のキト
サン（和光純薬、キトサン７０Ｂ）　１２．５ｇを取り
、これにイオン交換水２１０Ｊｄ及びＩＮ酢酸水溶液３
９−を加えて充分撹拌し、均一な溶液とした。このキト
サン酢酸溶液のｐＨは５．８であった。このキトサン酢
酸溶液にキトサナーゼ溶液（参考例（１）のキトサナー
ゼ粉末３８■を水ｌＩｄに溶かす：４ｕ／ｄ）１１ｄを
加え４０℃の恒温水槽内で撹拌しながら１２時間反応し
た後、反応液を加熱して酵素反応を停止させた。つぎに
１０％水酸化ナトリウム溶液１４−を加えてｐＨを８に
調整すると不溶物を生ずる。

この反応液を透析膜を用いた透析により脱塩した後、脱
塩液３４５−を孔径０．２μｍ、膜面積０．０２Ｍのセ
ラミックフィルター（日本セメント社製）を用いて濾過
し、３０５−の透明な濾過液を得た。この液を凍結真空
乾燥法で乾燥し、粉末の水溶性低分子化キトサン８．２
ｇを得た。（なおセラミックフィルター濾過残を乾燥し
たところ３．０ｇであった。）実施例　（２）脱アセチル化度８１％のキトサン（和光純薬、キトサン
８０８）　１２．５ｇを取り、これにイオン交換水２０
７−及びＩＮ酢酸水溶液４２−を加えて溶解した（ｐＨ
５，９）、そして、実施例（１）と同様な条件で酵素処
理、ｐＨｌ整、脱塩、膜処理、乾燥を行い、水溶性低分
子化キトサン８．８ｇを得た。　（なおセラミツタフィ
ルター濾過残を乾燥したところ２．７ｇであった。）実施例　（３）脱アセチル化度８７％のキトサン（和光純薬、キトサン
９０Ｍ）　１２．５ｇを取り、これにイオン交換水１９
９ｍ１及びＩＮ！￥酸水溶液５０ｍを加えてン容解した
（ｐＨ５，８）。そして実施例（１）と同様な条件で酵
素処理、ｐＨ調整、脱塩、膜処理、乾燥を行い、水溶性
低分子化キトサン７．３ｇを得た。　（なおセラミック
フィルター濾過残を乾燥したところ３．６ｇであった。

）比較例　（１）脱アセチル化度５９％のキトサン１２．５ｇを取り、こ
れにイオン交換水２２３−及びＩＮ酢酸水溶液２６ｍ１
を加えて溶解した（ｐＨ５，３）。そして実施例（１）
と同様な条件で酵素処理、ｐＨ調整、脱塩、膜処理、乾
燥を行い、水溶性の低分子化キトサン７．７ｇを得た。

　（なおセラミックフィルター濾過残はほとんどなかっ
た。）比較例　（２）脱アセチル化度９３％のキトサン（北海道曹達Ｃ８−９
０）１２．５ｇを取り、これにイオン交換水１６６ｍｅ
及びＩＮ酢酸水溶液８３ｍ１を力Ｕえて溶解した（ｐＨ
５，３）。

そして実施例（１）と同様な条件で酵素処理、ｐＨｆｉ
１ｍ整、脱塩、膜処理、乾燥を行い、水溶性の低分子化
キトサン３．Ｏｇを得た。　（なおセラミンクフィルタ
ー濾過残を乾燥したところ５．４ｇであった。）比較例
　（３）脱アセチル化度１００％のキトサン（和光純薬。

キトサンＩＱＯＬ）　１２．５ｇを取り、これにイオン
交換水１８５ｒｄ及びＩＮ酢酸水溶液６４ｒｎｌを加え
て溶解した（ρ）（５，５）。そして実施例（１）と同
様な条件で酵素処理、ｐＨ調整、脱塩、膜処理、乾燥を
行い、水溶性の低分子化キトサン１．２ｇを得た。　（
なおセラミックフィルター濾過残を乾燥したところ４．
９ｇであった。）つぎに実施例（１）、（２）、（３）および比較例（１
）、（２）、（３）で得た水溶性低分子化キトサン及び
低分子化キトサンの分子量および加熱時の色調増加の比
較を第１表に示す。

極大分子量はウォーターズ社製高速液体りロマトグラフ
装Ｗ　（Ｍ６００マルチソルヘント送液システム、７１
０Ｂ型全自動サンプルプロセンサー、Ｍ４１０型示差屈
折計）およびＡｓａｈｉｐａｋＧＳ−３２０カラム（旭
化成工業製）を用い、標準物質としてプルランを用いる
ＧＰＣ法で測定した（ピーク頂点の保持時間より求めた
分子量を、極大分子量とする）。また脱アセチル化度は
、メチレンブルーを指示薬としてキトサンの酢酸水溶液
をポリビニル硫酸カリウム水溶液で滴定するコロイド滴
定法により測定した。

第１表の結果より、原料キトサンの脱アセチル化度と、
得られた水溶性の低分子化キトサンの分子量とに関連性
が認められ、特に脱アセチル化度が９０％を超えると水
溶性となる低分子化キトサンの分子量が低下する傾向が
認められる。そして低分子化すると、還元基の割合が増
えるために水溶液中においてアミノ・カルボニル反応（
メイラード反応）等により褐変しやすくなる。一方、本
発明により得られた水溶性の低分子化キトサンは褐変の
程度が低く、また分子量も比較的大きい。

（本頁以下余白）実施例　（４）脱アセチル化度８７％のキトサン（和光純薬、キトサン
９０Ｍ）　１２．５ｇを用いて実施例（３）と同様な条
件で酵素処理、ｐＨ調整を行い、精密濾過膜　旭化成工
業社製　マイクローザＸＰＷ−１１（孔径０．１μ。

膜面積０．１　ｒｄ）を用いて濾過し、濾液を電気透析
装置マイクロアシライザーＧ３（旭化成工業社製）によ
り脱塩した後、凍結真空乾燥法で乾燥し、粉末の水溶性
低分子化キトサン９．７ｇを得た。

比較例　（４）脱アセチル化度８７％のキトサン（和光純薬、キトサン
９０Ｍ）　１３．９ｇを亜硝酸ナトリウム０．９５ｇを
含む水溶液６５ａｔｆに室温で５分間浸漬した後、酢酸
７．５ｇを添加し、室温で２時間反応させる。反応後、
水２１０ｒＤＩを加え、４０％水酸化ナトリウム溶液で
ｐＨを９に調整し、実施例（４）と同様にして濾過を行
い、透析した後、凍結真空乾燥を行い６．２ｇの粉末を
得た。

次に実施例（４）および比較例（４）で得た粉末の分子
量及びフェノール硫酸法によるグルコース換算糖量の比
較を第２表に示す。

第２表の結果により、従来技術である亜硝酸塩処理によ
り得られた低分子化キトサンでは、極大分子量が３００
０付近と低く、また脱アミノ化が生じるために、フェノ
ール硫酸法によるグルコース換算糖量値が高い値を示す
。一方、本発明により得られた水溶性低分子化キトサン
では、掘大分子量が比較的大きく、また、脱アミノ化の
程度も低いことがフェノール硫酸法によるグルコース換
算糖量値より類推される。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は、キトサンの脱アセチル化度と本発明により得
られたキトサナーゼの相対活性の関係を示す図であり、
第２回は至適ｐＨ，第３図は安定ｐＨ範囲、第４図は作
用適温の範囲、第５図は熱安定、第６図は熱安定性に対
する塩化ナトリウム濃度の影響を示す図である。第７図
は、参考例（３）における酵素反応の時間とキトサンの
分子量分布を示す図である。出願人　ケイ・アイ化成株式会社代理人　弁理士　平　木　祐　輔同　　弁理士　石　井　貞　次ｐＨ第２図７ｉ充了−ａ＋＋しくヒ度第第ラ；彦（０Ｃ）遺産（０ｃ）第５図Ｇ塾＼吐乗−２手続補正書平成　元年１１月２９日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）脱アセチル化度が６０−９０％であるところのキ
トサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反
応後にアルカリを加えて反応液ｐＨを７−１０に上げ、
更に必要に応じて濾過または膜処理により酵素反応生成
物を分離して得られる極大分子量が主として４，０００
−１２，０００であり、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液
に可溶な水溶性低分子化キトサン。
（２）フェノール硫酸法によるグルコース換算糖量が１
０％以下であることを特徴とする請求項１記載の水溶性
低分子化キトサン。
（３）脱アセチル化度が６０−９０％であるところのキ
トサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反
応後にアルカリを加えて反応液ｐＨを７−１０に上げ、
更に必要に応じて濾過または膜処理により酵素反応生成
物を分離し、極大分子量が主として４，０００−１２，
０００であり、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な
低分子化キトサンを得ることを特徴とする水溶性低分子
化キトサンの製造法。
（４）キトサナーゼがバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ．）Ｎｏ．Ｋ−８８１（微工研菌寄第１０２５７
号）により生産されたものであることを特徴とする請求
項３記載の水溶性低分子化キトサンの製造法。
（５）膜が孔径０．０５μｍ乃至５μｍの精密濾過膜ま
たは分画分子量１万以上の限外濾過膜である請求項３記
載の水溶性低分子化キトサンの製造法。
（６）膜が孔径０．０５μｍ乃至５μｍのセラミックフ
ィルターである請求項３記載の水溶性低分子化キトサン
の製造法。