JPH01309684A - 新規キシラナーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規キシラナーゼＷＩＩおよびその製造法に関
し、更に詳細にはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
する新規キシラナーゼＷＩＩ生産菌を培養し、該培養物
より新規キシラナーゼＷＩＩを分離、採取することを特
徴とする新規キシラナーゼＷＩＩの製造法に関するもの
である。

キシラナーゼは主としてβ−１，４結合キシロースから
成る多糖キシランを加水分解してその構成成分であるキ
シロースや低分子のキシロオリゴ糖を生成する作用を有
する酵素で、動植物中に広く存在している。微生物にも
キシラナーゼを生成するものがあり、これまでに酵母、
カビ、細菌、放線菌などの酵素について研究されてきた
。一方、近年、バイオマスの利用に対するキシラナーゼ
の有用性が注目されている。即ち、キシランは木材やイ
ネ科植物などに存在し、その含有量もセルロースに次い
で多く、また加水分解生成物のキシロースは食品、医薬
品の原料などに広い用途がある。

このような目的に使用しつる酵素は安価な原料から大量
に生産され、かつ酸、アルカリや熱に対して安定である
ことが望まれる。しかしながら現在までこれらの条件を
全て満たすキシラナーゼは見出されていない。

本発明者らはこれらの条件に適合する性質を有する酵素
キシラナーゼを生産する方法について鋭意研究の結果、
バチルス属に属する新規微生物が、従来知られていない
特徴的な理化学的性質を有する新規キシラナーゼを生産
することの知見を得、本発明を完成するに至った。

本発明はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、ｐＨ
８−１１の強アルカリ性培地で４５”−５５℃の高温度
において生育しろる好アルカリ性好熱性細菌を培養し、
培養物より安定ｐＨ範囲が４．５−１０．０、安定温度
範囲が最高６０℃の耐アルカリ性耐熱性キシラナーゼを
採取する方法に関するものである。

該キシラナーゼ製造法において使用する細菌種は、ｐＨ
８−１１の強アルカリ性培地にのみ生育でき、特にｐＨ
９−１０において最大の生育量と酵素生産を示し、かつ
温度は最高５５℃まで生育でき、特に４５°−５０℃に
おいて最大の生育量と酵素生産を示す両性質を併せもつ
好アルカリ性好熱性の、新たに分離同定されたバチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌である。さらに、該細菌を
用いて該酵素を生産する際の培地としては、炭素源とし
て小麦麹のみ約４％を含有する強アルカリ性培地を用い
ることができる。従来、本発明のごとくバチルス属の好
アルカリ性好熱性細菌を用いて強アルカリ性培地にて高
温度にて培養する方法は全く知られていない。

このような培養条件下では、菌体生育が極めて速く、培
養時間を短縮でき、また雑菌汚染が防止されるので培養
管理上も有利である。

以下、本発明について詳述する。

まず本発明において用いる微生物は、キシラナーゼＷＩ
Ｉの生産能を有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に
属する菌種であり、その−例として、バチルス・エスピ
ー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｎ（Ｎｏ．Ｗ　２
およびＮ（Ｎｏ．Ｗ４（以下単にそれぞれＷ２およびＷ
４という）と呼称される微生物が挙げられる。

以下これらの微生物につき詳述する。

（１）好アルカリ性好熱性細菌Ｗ２およびＷ４の分離方
法 本発明方法に用いられる上記２菌種は、以下の方法によ
り分離された。

まず、日本国内各地より採取した土壌試料から、第１表
に示す組成のアルカリ性基本培地に寒天１５．ＯＣｇ／
ｊｌりおよびキシラン１０．ＯＣｇ／Ｉ）〕または小麦
融４０．０［ｇ／ｊ’：ｌを加えた固形培地を用いて、
５５℃の恒温器内にて２−３日間培養して出現した細菌
コロニーを分離する。次に、分離した細菌を、第１表に
示した基本培地にキシラン１０．Ｏ［ｇ／β〕を加えた
液体培地を用いて４７℃の恒温器とう機にて２日間培養
し、その培養物について下記の方法によりキシラナーゼ
活性を測定し、その活性の強力なものを選択した。標記
の２細菌はこのような方法により分離し、そして純化し
たものである。

第１表　基本培地組成 組　　　成　　　　　　ｇ／Ｒ 酵母エキス　　　　　５．０ ポリペプトン　　　　５．０ に２ＨＰＯ，１，０ ！ＩｇＳＯ＝　・７　Ｈ２Ｏ０，２ キシラナーゼ活性は、基質として０．５％キシランをｐ
）１８．０のマツキルベン緩衝液（０，１Ｍクエン酸−
０，２Ｍリン酸二す）　ＩＪウム）に懸濁し、超音波に
て均一に分散したもの０．３ｒｄに、培養濾過液の希釈
したちの０．０５ｍ７！を加え、６０℃にて１０分間反
応させ、生成した還元糖を３゜５−ジニトロサリチル酸
試薬法により定量し、１分間に１μｍｏｌのキシロース
を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。

このようにして分離、選択、純化された細菌Ｗ２及びＷ
４の２菌種は後述のようにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属細菌と同定され、昭和５８年９月７日付工業技術院
微生物工業技術研究所へ寄託された。その微生物寄託番
号は、Ｗ２が第７２２１号、Ｗ４が第７２２３号である
。

（２）’ｖＶ２および＼・Ｖ４の菌学的性質菌学的性質
は２菌種ともｐｉ（１０のアルカリ性培地に４７℃で生
育させ、“Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　？Ｊａｎｕａｌ　ｏｆＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
’（１９７４）および“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ″　（１９７３）に記載の方法に基づいておこ
なった。

〔ａ二　形　態 固形は２菌種とも桿状で、大きさ（０，３〜０．５）　
Ｘ　（２，０〜５．０）μｍ、単一または連鎖状をなし
、長い菌糸状の図形を示すこともある。細胞はダラム陽
性、非抗酸性、運動性があり、楕円形の胞子を形成する
。

〔ｂ〕培地における生育状態 イ）肉汁寒天平板培養＝２２菌とも集落は円形で扁平状
ないし凸円状に隆起し、周辺は余禄、表面は滑らかで不
透明である。

口）肉汁寒天斜面培養：２菌種とも生育は良好で糸状な
いし工状に生育する。表面は平滑で、不透明である。い
ずれも培地に色素を生産しない。

ハ）肉汁液体培地：２菌種とも菌生育にともないいくぶ
ん混濁を呈し、粘調性のある軟らかい沈滓を生ずる。歯
環は形成しない。

ユ）肉汁ゼラチン培養：２菌種ともゼラチンを液化する
。

ホ）リドマスミルク：ミルクを凝固させる。

〔Ｃ〕生理学的性質 イ）硝酸塩の還元：２菌種とも陽性 口）脱　窒　反　応：２菌種とも　陰　性ハ）Ｖ　　Ｐ
　　テ　ス　トコ２菌種とも　陽　性功インドールの生
成：２菌種とも　陰　性ホ）硫化水素の生成：２菌種と
も　陰性へ）でん粉の加水分解：２菌種とも　陰　性ト
）カゼインの加水分解：２菌種とも　陽　性す）色素の
産生＝２２菌とも　陰性 ヌ）ウ　し　ア　−　ゼ：２菌種とも　陰　性ル）オキ
シダーゼ：２菌種とも　陰性 ｔ）カ　タ　ラ　−　ゼ：２菌種とも　陽　性グ）酸素
に対する態度：２菌種とも　好気性：？）　Ｏ−Ｆ　　
テス　ト：好気的および嫌気的に酸を生成 り）耐　　　塩　　　性：ＮａＣｊ２１０％で生育する
。

以上の菌学的性質をもとに、前記文献中に２菌種Ｗ２、
Ｗ４を検索したところバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
に属することが明らかとなったが、いずれの菌種も、ｐ
Ｈ８−１１のアルカリ性域；二おいてのみ生育できる点
において公知の菌種とは明らかに異なり、また後述のよ
うに４５℃以上の高温においてキシラナーゼ産生が最大
となる点！こおいて文献記載の好アルカリ性バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌とも異なり、区別される。よ
って、２菌種とも公知の菌種とは一致せず、これらをバ
チルス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）属の新菌種として設定す
るのが適当であるとの結論に達した。

（３）キシラナーゼの製造方法 〔ａ〕酵素生産に対するｐＨの影響 ２菌種Ｗ２、Ｗ４は、すでに述べたようにｐＨ８−１１
において生育できる。そこで、第１表に示した基本培地
にキシラン１０．０［ｇ／ｌ〕を加えた液体培地を調製
し、そのｐＨを７から１１までに調整したものを用いて
培養し、キシラナーゼの生産量を調べた。その結果を第
２表に示す。

第２表 ９　　１００　１（ｔ。

なお、培養はｐＨ７−１１の各培地１０ｒｎｌを試験管
に分注し、２菌種をそれぞれ接種して４５℃にて４７時
間振とうした。培養物から遠心分離機により菌体を除去
して得た上澄液については酵素活性を測定した。酵素活
性の測定法は前記の通りであるが、ここではｐＨ８、０
！：代１）ｐＨ６，０のマツキルベン緩衝液を使用した
（以後の検討においても同様である）。

第２表に示したように２菌種ともｐ）１８乃至１０にお
いて酵素産生は最大となる。このように２菌種を用いて
キシラナーゼを生産するには、培地の初発ｐＨを８乃至
１０！、：調製すれば良いことが明ろかにされた。

〔ｂ〕酵素生産に対する温度の影響 法に酵素生産に及ぼす温度の影響について述べる。前項
〔ａ）の液体培地をｐ）１１０に調製したものを試験管
に分注し、温度３０−５１℃にて４７時間振とう培養し
てキシラナーゼ生産を比較した。その結果を第３表に示
す。なお、酵素活性の測定法は前項〔ａ〕に記した通り
である。

第３表 ３Ｑ　　　３４　　− ３６７２　　−・ 第３表かみ明らかなように、２菌種とも温度４２°乃至
４８℃において培養したとき酵素産生は最大となる。こ
のように２菌種によるキシラナーゼ生産には培養温度を
４２°乃至４８℃に設定すれば良いことが明らかにされ
た。

以上、（ａＥおよび〔ｂ〕の結果より、新菌種バチルス
・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　ＮａＷ　
２　、ＮＱ、Ｗ　４によるキシラナーゼ生産の最適培養
条件は、ｐＨ８乃至１０、温度４２°乃至４８℃にある
ことが判明した。

〔Ｃ〕培地の炭素源の影響 酵素生産に対する培地の炭素源の影響について述べる。

第１表に示した基本培地に各種の炭素源（糖類および小
麦麹）を加えて培養し、培養物の酵素活性を測定した結
果を第４表に示す。なお、培養条件は前項までの結果よ
り、培地をｐＨ１０に調製し、培養温度を４５℃に設定
して試験管を用いて４７時間振とう培養した。

第　　　４　　　表 キシラン　１０３７３４ キシロース　　１０３６３１ グルコース　　１０　　　　３　　３ 小麦融　１０　　２４　７ （り小麦麹／水　　４０　　　　５３　　４２第４表か
ら明らかなように２菌種とも培地の炭素源にキシラン１
．０％を用いたとき顕著な酵素生産を示し、またグルコ
ースが炭素源のときは酵素生産はほとんどない。さらに
キシロース１％も有効に用いられる。さらに小麦麹４％
を添加した場合、キシランまたはキシロースを添加した
場合と同等ないしそれ以上の酵素生産が認められ、安価
な炭素源として小麦粉が有効に用いられることが明らか
にされた。なお、第４表の最下段（＊印を附した）に示
した結果は、第１表に示した基本培地の代りに水を用い
て小麦粉４％を添加しただけの培地を用いて同様の培養
条件で培養した場合のｖｔ焉生産を示したものである。

即ち、培地組成：小麦麹　　　４０ｇ 水　　　１０００ｍｌ ｐＨ１０ 培養条件：４５℃にて４７時間振とう 培養。

この結果から明らかな通り、この２菌種はこのような簡
単な組成の培地を用いて上記の培養条件により酵素生産
が可能である。

以上の検討の結果より、耐アルカリ性耐熱性キシラナー
ゼ生産に用いる最も効果的な培地組成とｐＨおよび培養
温度は次の通り設定される。

培地組成：炭素源キシラン　１０．０（ｇ）（または小
麦麹　４０．０　） 酵母エキス　　　　５．０ ポリペプトン　　　５．０ に２ＨＰ４　　　　　　　　１．０ Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ２００，２ 水　　　　　　　　　　１０００ｄ 培地のｐ）１：１０．０（〜ａ２ＣＯ３により調整）培
養温度＝４５℃ 培養方法：振とう培養または通気撹拌培養または 培地組成：炭素源キシロース　１０．ＯＣｇ）酵母エキ
ス　　　　　５．０ ポリペプトン　　　　５．Ｏ Ｋ、ＨＰ、　　　　　　　　１．０ ｉＪ　ｇ　Ｓ　０４・７１１２０　　　　０．２水　　
　　　　　　　　１０００（−〕または 小麦勉　　　　　　４０．０（ｇ） 水　　　　　　　　　１０００［ｍｊ２”１培地のｐＨ
１培養温度、培養方法は上記と同様に設定する。

（４）酵素の精製方法と性質 前項までに述べた方法により得られた培養物からｕｓを
分離精製する方法および酵素の性質について説明する。

培養物かみ菌体を除去し、その清澄液に硫酸アンモニウ
ムを加えて酵素を沈澱せしめ、これを脱水乾燥して粗酵
素粉末を得る。粗酵素粉末をｐＨ７，２の０．０５Ｍト
リス塩酸緩衝液に溶解してＤ　Ｅ　、Ａ、　Ｅ−セルロ
ースによりキシラナーゼ画分を分離し、次にセファデッ
クスＧ−１００により濾過して精製する。この精製酵素
を濃縮し、凍結乾燥すると目的の酵素キシラナーゼｗ■
を得る。かくしてＷ２およびＷ４の２菌種から得られた
本発明の２種のキシラナーゼ、それぞれＷ２およびＷ４
は次のような理化学的性質を有する。

■作用および基質特異性 キシランおよびキシロオリゴ糖に特異的に作用し、その
β−１，４−キシロシド結合を切断して、キシロースお
よびキシロビオースを生成する。

■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ範囲はｐＨ６，０〜７，０（第１図参照）、安
定ｐＨ範囲はｐＨ４，５〜１０．０（４５℃、６０分処
理の場合、第３図参照〉にある。

■力価の測定法 基質として０．５％キシランをｐＨ８，０のマツキルベ
ンａｔ液（０，１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン酸二ナトリ
ウム）に懸濁し、超音波により均一に分散したもの０．
５　ｍｊ２に、キシラナーゼＷＩＩを含む試料０．０５
ｍ１を加え、６０℃で１０分間反応させ、生成した還元
糖を３，５−ジニトロサリチル酸試薬法により定量し、
１分間に１μｍＯβのキシロースを生成する酵素量を１
単位（Ｕ）とする。

■作用適温の範囲 ｐＨ６，０〜７．０において６０〜゛７０℃である（第
２図参照）。

■熱安定性 １０分間処理の場合、６０℃まで安定である。

■精製方法 キシラナーゼＷＩＩ生産菌培養物から菌体を除去し、そ
の清澄液に硫酸アンモニウムを加えて酵素を沈澱させ、
これを脱水乾燥して粗酵素粉末を得る。粗酵素粉末をｐ
Ｈ７，２の０．０５Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液に溶解してＤ
ＥＡＥ−セルロースにより分離し、さらにセファデック
スＧ−１００により濾過してＭ製する。

■分子量 限外濾過法による分子量はＷ２が５０．０００、Ｗ４が
４２，０００である。

■阻害、活性化 銀イオン、銅イオンにより阻害される。

本発明に係る酵素は安定ｐＨ範囲が酸性側（ｐＨ４，５
）からアルカリ性側（ｐＨ１０，０）までと広く、至適
作用温度が６０℃ないし７０℃にあり、さらに反応生成
物は主としてキシロースとキシロビオースであるなどの
特徴を有し、従来の酵素とは相違する。

以下に本発明方法を実施例によって説明する。

実施例１ （培地組成）キシラン　　　　　　１．０ｇ酵母エキス
　　　　　０．５ ポリペプトン　　　　０．５ に、ＨＰ’０．　　　　　０．１ ！、！　ｇ　Ｓ　Ｏ、・’ｒ＋、ｏ　　　　　Ｏ，０２
水　　　　　　　　　　１００ｍ１ ｐＨ１０，０（Ｎａ２Ｃ［］ｓにて調整）上記組成の培
地１００ｍｌを３００ｍｊ！容のフラスコに分注し、１
２１℃にて１０分間蒸気殺菌した後、バチルス（ｆ３ａ
ｃｉｌｌｕｓ）属細菌ＮＱ、Ｗ２　（微工研菌寄第７２
２１号）、Ｎ（Ｎｏ．Ｗ４　（微工研菌寄第７２２３号
）をそれぞれ別々のフラスコに接種して４５℃で４８時
間振とう培養した。培養物より菌体を除去した清澄液に
ついてキシラナーゼ活性を測定したところ次の結果を得
た。

菌　　種　　　　酵素生産量ＣＵ／ｄ〕Ｗ２　　　　　
　　　３４ Ｗ４　　　　　　　　３４ 前記清澄液それぞれに硫酸アンモニウムを加工て酵素を
沈澱させ、これを脱水乾燥して、それぞれキシラナーゼ
Ｗ２およびＷ４の粗粉末を得る。

これをｐ）１７．２の０．０５ンエトリス塩酸援衡液に
溶解し、Ｄ　Ｅ　、Ａ、　Ｅ−セルロースにより分離し
、さらにセファデックスＧ−１００により濾過精製し、
これをａ縮機、凍結乾燥すると、精製キシラナーゼＷ２
およびＷ４がそれぞれ得られる。

実施例２ 実施例１に示した培地組成のうちキシラン１．０ｇの代
りにキシロース１．０ｇを加えた培地を用いて、実施例
１記載の方法によりバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細
菌Ｎｏ、Ｗ２（微工研菌寄第７２２１号）、ＮαＷ４　
（微工研菌寄第７２２３号）を培養し、同様に清澄液に
ついて酵素活性を測定して次の結果を得Ｗ２　　　　　
　　　３４ Ｗ４　　　　　　　　３８ 実施例３ （培地組成）小麦麹　　　　　　　４．０ｇ水　　　　
　　　　　　１００ｒｎｌ ｐＨ１０，０（ＮａｚＣＯ，、！：　テｇａ）上記組成
の培地１００ｍｊ！を３００−の容のフラスコに分注し
、１２１℃にて１０分間蒸気殺菌した後、バチルｘ　（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌Ｎｃ１２およびＮｏ。

Ｗ４を接種して、それぞれ４５℃で４８時間振とう培養
を行なった。培養物より菌体を除去した清澄液について
酵素生産量を測定して次の結果を得た。

菌　　種　　　　酵素生産量［：Ｕ／ｍβ］Ｗ２　　　
　　　　　４８ Ｗ４　　　　　　　　４４

【図面の簡単な説明】

本発明の２種のキシラナーゼについて、第１図は至適ｐ
Ｈ範囲、第２図は作用適温の範囲、第３図は安定ｐＨ範
囲を示すグラフである。 第１図 一２→−マーｙＫルベンーＮＱＯＨ４ｉイ１５ｉ　ｆＰ
Ｈ８−１０，５）第２図 漬度代）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するキシラナーゼＷ２及
   びＷ４から成る群から選ばれるキシラナーゼＷII。 ［１］作用および基質特異性 キシランおよびキシロオリゴ糖に特異的に 作用し、そのβ−１、４−キシロシド結合を切断して、
   キシロースおよびキシロビオースを生成する。 ［２］至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨ範囲はｐＨ６．０〜７．０、安定ｐＨ範囲はｐ
   Ｈ４．５〜１０．０（４５℃、６０分処理の場合）にあ
   る。 ［３］力価の測定法 基質として０．５％キシランをｐＨ８．０のマッキルベ
   ン緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸二ナトリ
   ウム）に懸濁し、超音波により均一に分散したもの０．
   ５ｍｌに、キシラナーゼＷを含む試料０．０５ｍｌを加
   え、６０℃で１０分間反応させ、生成した還元糖を３，
   ５−ジニトロサリチル酸試薬法により定量し、１分間に
   １μｍｏｌのキシロースを生成する酵素量を１単位（Ｕ
   ）とする。 ［４］作用適温の範囲 ｐＨ６．０〜７．０において６０〜７０℃である。 ［５］熱安定性 １０分間処理の場合、６０℃まで安定であ る。 ［６］精製方法 キシラナーゼＷII生産菌培養物から菌体を 除去し、その清澄液に硫酸アンモニウムを加えて酵素を
   沈澱させ、これを脱水乾燥して粗酵素粉末を得る。粗酵
   素粉末をｐＨ７．２の０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液に溶
   解してＤＥＡＥ−セルロースにより分離し、さらにセフ
   ァデックスＧ−１００により濾過して精製する。 ［７］分子量 限外濾過法による分子量はＷ２が５０，０００、Ｗ４が
   ４２，０００である。 ［８］阻害、活性化 銀イオン、銅イオンにより阻害される。
2. （２）バチルス属に属するキシラナーゼＷII生産菌を培
   養し、該培養物よりキシラナーゼＷIIを分離、採取する
   ことを特徴とするキシラナーゼＷIIの製造法。
3. （３）バチルス属に属するキシラナーゼＷII生産菌が、
   バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）Ｎｏ
   ．Ｗ２およびＮｏ．Ｗ４から成る群から選ばれる特許請
   求の範囲第（２）項記載の製造法。
4. （４）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．
   ）Ｎｏ．Ｗ２およびＮｏ．Ｗ４を、炭素源として小麦■
   のみ約４％を含有する強アルカリ性培地で培養すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の製造法。