CN106967779A - 适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法 - Google Patents

适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法，涉及微生物技术领域。所述筛选培养基包括基础培养基、促进铜绿假单胞菌生长的营养物质、多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素和蒸馏水。所述方法：制备促进铜绿假单胞菌生长的营养物质，将所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质添加到所述基础培养基中，高压灭菌得到初始培养基；灭菌后，将初始培养基的温度在室温至60℃之间时，添加多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素，混匀，分注到排样板不同孔，室温冷却，得到适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基。本发明所述筛查培养基具有缩短检测时间、灵敏度高和配制方法简便的有点。

Description

适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法。
背景技术
铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，能引起化脓性病变，感染后因脓汁和渗出液呈绿色，故又名绿脓杆菌，是临床上重要的条件致病菌之一。
在临床样本检验中，常常通过使用血液琼脂培养基培养从由检测样本获得的众多菌落中挑取高度怀疑的菌落进行分离培养，并在确认所培养聚落无杂菌污染后，再对该培养菌落进行系统鉴定和药物敏感性实验。该传统检测方法检测时间常常达72小时或以上，耗时较长。目前，认为使用NAC琼脂培养基能够大大缩短检测时间的常用培养基，但，NAC琼脂培养基配方中含有能影响铜绿假单胞菌生长速度的奈叮酸抗生素，故应用NAC琼脂培养基的检测方法也需48小时。另外，上述检测方法往往只能从几百或上千菌落中挑选出1～3个菌落进行药物敏感性试验，容易漏检耐药菌株，灵敏度较低。
故，需要一种培养基能够在保证铜绿假单胞菌生长的条件下，实现快速挑选得到属于铜绿假单胞菌的菌落。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基及制备方法，从而解决现有技术中存在的前述问题。
为了实现上述目的，本发明所述适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基，所述筛选培养基包括基础培养基、促进铜绿假单胞菌生长的营养物质、多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素和蒸馏水；所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质与所述蒸馏水的体积比例为1：(9～99)，所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质为恒温动物血液在高温高压下的水解产物；所述多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素为碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素中的一种或多种。
优选地，所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质的制备方法为：
S11，将恒温动物血液与蒸馏水按照1：(10～20)的体积比例混合，得到混合液；
S12，使用搅拌机充分搅拌所述混合液，得到原料液；
S13，将所述原料液置于反应釜中，将反应釜置于190℃～200℃、大于等于2个大气压强的条件下，对反应釜中的所述原料液进行水解，将水解液过滤后，得到滤液，所述滤液即为促进铜绿假单胞菌生长的营养物质。
优选地，所述基础培养基为NAC基础培养基，所述NAC基础培养基配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。
优选地，所述碳青霉烯类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为32mg/L～256mg/L，所述氨基糖苷类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为1mg/L～8mg/L，所述喹诺酮类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为8mg/L～64mg/L。
优选地，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
本发明所述适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的制备方法，所述制备方法包括：
S21，制备促进铜绿假单胞菌生长的营养物质
在温度为190℃～200℃、压强大于等于2个大气压强的条件下，对pH＞8的恒温动物血液与蒸馏水的混合液进行水解、过滤，得到的滤液即为促进铜绿假单胞菌生长的营养物质；
S22，将所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质添加到所述基础培养基中，高压灭菌得到初始培养基；
所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质与所述蒸馏水的体积比例为1：(9～99)；
S23，灭菌后，将初始培养基的温度在室温至60℃之间时，添加多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素，混匀，分注到排样板不同孔，室温冷却，得到适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基；
所述多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素为碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素中的一种或多种；所述碳青霉烯类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为32mg/L～256mg/L，所述氨基糖苷类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为1mg/L～8mg/L，所述喹诺酮类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为8mg/L～64mg/L。
优选地，所述恒温动物血液为恒温哺乳动物血液或恒温鸟类血液。
优选地，所述基础培养基为NAC基础培养基，所述NAC基础培养基配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。
优选地，步骤S22中的灭菌条件为温度121℃，灭菌时间25min。
优选地，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
本发明的有益效果是：
本发明所述筛查培养基具有缩短检测时间、灵敏度高和配制方法简便的特点。更详细的：
(1)本发明培养基利用了细菌生长促进剂，可促进铜绿假单胞菌的生长和铜绿色素的分泌，缩短检测时间，根据需要也可以添加TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)等氧化还原指示剂。
(2)本发明培养基包括抗生素组合为不同浓度的不同抗生素组合，根据结果可以大致判断耐药药物和耐药药物浓度。
(3)本发明筛查方法，无需纯化培养，直接使用临床样本进行筛查，筛查时间至少缩短24小时以上。
附图说明
图1是选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌琼脂平板的平面示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
①关于适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的解释说明：
所述筛查培养基的形状为含有各种浓度抗生素组合的格子组成的方形，或为含有不同浓度抗生素组合的孔隙或孔状培养基组合的板状。
所述筛查培养基上只生长广泛耐药铜绿假单胞菌，其他细菌或敏感铜绿假单胞菌以及其他耐药铜绿假单胞菌均不能生长。
②关于基于适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的制备方法
所述筛查方法为在筛查培养基的各个方格或孔隙或孔状中接种待检临床标本，或利用毛细管现象使待检临床标本均匀分布到筛查培养基中，或利用微流控原理均匀滴入方格或孔隙或孔状，肉眼观察菌落或自动监测浊度变化、指示剂颜色变化进行筛查同时测定铜绿假单胞菌的最低生长抑制药物浓度(MIC)。
所述筛查方法进行筛查时，设置三组模块(每组模块由任意两种抗生素组成)均能生长的菌落只有广泛耐药铜绿假单胞菌，其他细菌或敏感铜绿假单胞菌不能生长，双重耐药铜绿假单胞菌按照理论可以在三组模块中某一个模块生长。
实施例1：促进铜绿假单胞菌生长的营养物质的制备
1、动物血液前处理：在农贸市场采购猪血1000ml，取100ml加入900ml蒸馏水，使用SKG 1246破壁料理机进行搅拌打碎凝血块，得到血液混合液，转速为1200转/min，时间为3分钟。
2、调整pH值：使用1mol/L浓度的氢氧化钠(pH：14)，调整血液混合液的pH值为8.5，得到血液原料液；
3、高温高压水解：将血液原料液放入高温高压反映釜，，在温度195℃、大气压2.1个大气压、搅拌转速为100转/分钟的条件下，边搅拌边进行高温高压水解反应，反应时间为1h，得到水解液，所述高温高压反映釜为威海化工机械有限公司GSH高温高压反映釜；
4、使用无菌纱布对水解液进行过滤，获得过滤液即为促进铜绿假单胞菌生长的营养物质，在一个大气压、20℃的条件下对过滤液进行采用VSM自动粘度计进行动力粘度和运动粘度测试，所述动力粘度μ＝1.09×10-3Pa·s，所述运动粘度v＝1.11×10-6㎡/s，粘稠度低，流动性好，与其它液体混合容易。
5、将过滤液在121℃、1.2个大气压的条件下，高温高压灭菌15分钟，冷却至室温保存备用。
实施例2：NAC琼脂平板和添加促进铜绿假单胞菌生长的营养物质的NAC琼脂平板(无添加抗生素组合)对比测试
1、配制NAC琼脂平板
称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得NAC琼脂平板，设为对照组。
2、配制促进铜绿假单胞菌生长的营养物质的NAC琼脂平板(无添加抗生素组合)
称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入实施例1中的50ml过滤液和950ml蒸馏水，混匀，121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌琼脂平板(无添加抗生素组合)，设为试验组。
3、取100株从临床样本中分离纯化获得的铜绿假单胞菌(经梅里埃VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定)，分别在以上两种琼脂平板上，36℃～37.5℃培养8h后，观察这些细菌分别在对照组和试验组上的菌落大小和荧光深浅，荧光强度检测使用Quantum，紫外线波长350nm。经对比发现，试验组3个小时后已经形成铜绿色菌落，对照组在8个小时后形成肉眼可见菌落，对照组菌落较小，荧光值较低，详见表1。
表1 NAC琼脂平板和添加促进铜绿假单胞菌生长的营养物质NAC琼脂平板(无添加抗生素组合)对比测试结果
对照组 实验组(50ml动物血液水解产物)
平均菌落形成时间 8.3小时 3.1小时
平均菌落大小 0.6mm 2.1mm
平均荧光值 231 783
实验结果说明促进铜绿假单胞菌生长的营养物质能促进铜绿假单胞菌的生长，作为本发明培养基中的关键组分。
实施例3：NAC琼脂平板和基于适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的筛查方法及其筛查培养基对比测试
1、配制NAC琼脂平板
称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得NAC琼脂平板，设为对照组。
2、配制选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌琼脂平板(添加抗生素组合)
(1)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、琼脂15g，加入100mL添加液和900mL蒸馏水，混匀，分装到48个小三角瓶中，121℃高压灭菌25min。
(2)灭菌后放置室温冷却至60℃后分别添加不同浓度的亚胺培南、阿卡米星和环丙沙星，混匀，浇注到48孔长方形平板上，放置冷却，获得选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌琼脂平板，设为试验组，长方形平板形状见图1，各孔抗生素组合和浓度，见表2。
表二：长方形平板各孔抗生素组合和浓度碳青霉烯类抗生素：32～256mg/L，氨基糖苷类抗生素：1～8mg/L，喹诺酮类抗生素：8～64mg/L
3、将100个临床样本直接接种到本发明培养基进行筛查同时接种到不含抗生素的NAC平板培养基作为对照组，37度培养24小时后本发明筛查培养基三组抗生素组合都生长的铜绿假单胞菌菌株有7株，耐药范围见表3，对照组获得25株铜绿假单胞菌菌株。
表3筛查培养基上培养菌株最低抑制生长药物浓度(MIC)
实验组 实验组 实验组
菌株 阿米卡星 亚安培南 环丙沙星
1 4 64 16
2 2 64 16
3 8 32 64
4 2 64 16
5 4 64 32
6 4 128 64
7 2 32 32
挑取对照组单菌落进行液体培养24小时后使用梅里埃VITEK 2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定和MIC测定，25株分离细菌中敏感菌：13株；单一药物耐药铜绿假单胞菌：5株；广泛耐药铜绿假单胞菌7株，分离出广泛耐药铜绿假单胞菌的临床样本和实验组分离出广泛耐药铜绿假单胞菌临床样本相同，7株广泛耐药铜绿假单胞菌在本发明筛查培养基和梅里埃VITEK 2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统各自的MIC详见表4。
表4 7株广泛耐药铜绿假单胞菌耐药水平
实验组 对照组 实验组 对照组 实验组 对照组
菌株 阿米卡星 阿米卡星 亚安培南 亚安培南 环丙沙星 环丙沙星
1 4 8 64 128 16 16
2 2 2 64 64 16 16
3 8 8 32 64 64 32
4 2 2 64 32 16 16
5 4 4 64 64 32 32
6 4 4 128 64 64 32
7 2 2 32 32 32 64
可见两种方法所测MIC相近，但是本发明筛查方法缩短时间48个小时。
实施例4：适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的保质期测试
1、将实施例2中所制备的未经测试的空白平板于4℃冰箱中储存一周、1个月和3个月后取出培养基平板，作为试验组。
2、制备NAC培养基平板，作为对照组。
3、分别在以上两种培养基平板接种从临床样本中分离纯化获得的药物敏感铜绿假单胞菌、单一药物耐药铜绿假单胞菌和广泛耐药铜绿假单胞菌，进行培养观察这些细菌是否能在这两种培养基平板上生长及生长速度、其生长形态。
测试结果显示，药物敏感株和单一药物耐药株在试验组中无生长，广泛耐药株能在试验组上生长且形成铜绿色菌落，其生长速度和菌落大小、以及耐药水平与实施例2实验结果一致。说明该选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的琼脂平板在储存上述时间后仍有效，说明本发明培养基耐储存，保存性能良好。
实施例5：阴性对照试验
进行实施例3的同时进行了阴性对照试验，在广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查方法及其筛查培养基(添加抗生素组合)，接种临床分离的耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs酶)阳性大肠杆菌、肺炎克雷博菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、不动杆菌，均未见生长，说明本发明所述适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的特异性较好。
通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：本发明所述筛查培养基具有缩短检测时间、灵敏度高和配制方法简便的特点。更详细的：
(1)本发明培养基利用了细菌生长促进剂，可促进铜绿假单胞菌的生长和铜绿色素的分泌，缩短检测时间，根据需要也可以添加TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)等氧化还原指示剂。
(2)本发明培养基包括抗生素组合为不同浓度的不同抗生素组合，根据结果可以大致判断耐药药物和耐药药物浓度。
(3)本发明筛查方法，无需纯化培养，直接使用临床样本进行筛查，筛查时间至少缩短24小时以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基，其特征在于，所述筛选培养基包括基础培养基、促进铜绿假单胞菌生长的营养物质、多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素和蒸馏水；
所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质与所述蒸馏水的体积比例为1：(9～99)，所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质为恒温动物血液在高温高压下的水解产物；
所述多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素为碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述筛选培养基，其特征在于，所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质的制备方法为：
S11，将恒温动物血液与蒸馏水按照1：(10～20)的体积比例混合，得到混合液；
S12，使用搅拌机充分搅拌所述混合液，得到原料液；
S13，将所述原料液置于反应釜中，将反应釜置于190℃～200℃、大于等于2个大气压强的条件下，对反应釜中的所述原料液进行水解，将水解液过滤后，得到滤液，所述滤液即为促进铜绿假单胞菌生长的营养物质。
3.根据权利要求1所述筛选培养基，其特征在于，所述基础培养基为NAC基础培养基，所述NAC基础培养基配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。
4.根据权利要求1所述筛选培养基，其特征在于，所述碳青霉烯类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为32mg/L～256mg/L，所述氨基糖苷类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为1mg/L～8mg/L，所述喹诺酮类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为8mg/L～64mg/L。
5.根据权利要求1所述筛选培养基，其特征在于，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
6.一种如权利要求1至5任意一项所述适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S21，制备促进铜绿假单胞菌生长的营养物质
在温度为190℃～200℃、压强大于等于2个大气压强的条件下，对pH＞8的恒温动物血液与蒸馏水的混合液进行水解、过滤，得到的滤液即为促进铜绿假单胞菌生长的营养物质；
S22，将所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质添加到所述基础培养基中，高压灭菌得到初始培养基；
所述促进铜绿假单胞菌生长的营养物质与所述蒸馏水的体积比例为1：(9～99)；
S23，灭菌后，将初始培养基的温度在室温至60℃之间时，添加多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素，混匀，分注到排样板不同孔，室温冷却，得到适用于广泛耐药铜绿假单胞菌的筛查培养基；
所述多耐药铜绿假单胞菌检测用抗生素为碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素中的一种或多种；所述碳青霉烯类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为32mg/L～256mg/L，所述氨基糖苷类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为1mg/L～8mg/L，所述喹诺酮类抗生素与所述蒸馏水的质量体积比为8mg/L～64mg/L。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述恒温动物血液为恒温哺乳动物血液或恒温鸟类血液。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述基础培养基为NAC基础培养基，所述NAC基础培养基配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S22中的灭菌条件为温度121℃，灭菌时间25min。
10.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
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