CN102888377A - 一种铜绿假单胞菌用培养基 - Google Patents

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Abstract

一种铜绿假单胞菌用培养基，每1000mL培养基中含有葡萄糖7～10g，尿素2～4g，磷酸氢二钾2～3g，磷酸二氢钾0.5～2g，硫酸镁0.5～1.5g，氯化钠3～5g，微量元素和生长因子溶液1～3mL，去离子水余量，其中微量元素和生长因子溶液中含MnCl23.5～4.5mmol/L，MoSO42.0～2.8mmol/L，FeSO43.6～4.6mmol/L，嘌呤碱10～20mmol/L，VB218～23mmol/L，乙酰胺12～20mmol/L。本发明提供的培养基为铜绿假单胞菌提供了优良的生长环境，使用本发明培养基培养铜绿假单胞菌培养时间快，菌株耐受性高，适应能力强，对苯酚的降解效率达96%以上，对氯苯的降解效率达93%以上。

Description

一种铜绿假单胞菌用培养基
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种微生物培养基，特别是涉及一种用于培养铜绿假单胞菌的培养基。
背景技术
含酚废水是一种污染范围广，排放数量多，危害农业生产、动植物生长繁殖的工业废水，如不经处理而任意排放，则会威胁人类健康。苯酚摄入量到达一定值时，会引起急性中毒，具体表现为头痛乏力、视线模糊、水肿等。目前国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法和生物法。化学法和物理法处理酚类废水较多，但普遍存在二次污染的问题。生物法，特别是利用微生物处理该类废水是目前研究的热点。
有关苯酚降解菌和氯苯降解菌的研究已有文献报道，具有降解功能的菌种主要有恶臭假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌、棒杆菌、产碱杆菌和铜绿假单胞菌等，其中，铜绿假单孢菌对苯酚的耐受性和降解效果相对较好。目前，关于铜绿假单孢菌的研究比较多，但存在微生物生长缓慢，降解作用时间较长，微生物耐受性较低的问题。
上述问题的本质是微生物数量少，培养条件差造成的。其原因是现在针对培养基的研究主要集中在菌种生长所需碳源、氮源和无机盐等常规营养元素上，并未考虑到培养基中假单孢菌生长过程中所需要的限制成份。
发明内容
本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌用培养基，以本发明的培养基培养出的铜绿假单胞菌培养时间快，生长速度快、菌株耐受性高，适应能力强。
每1000mL本发明的铜绿假单胞菌用培养基中，各组分的含量分别为：
葡萄糖7～10g，尿素2～4g，磷酸氢二钾2～3g，磷酸二氢钾0.5～2g，硫酸镁0.5～1.5g，氯化钠3～5g，微量元素和生长因子溶液1～3mL，去离子水余量。
其中，所述的微量元素和生长因子溶液中含MnCl2 3.5～4.5mmol/L，MoSO4 2.0～2.8mmol/L，FeSO4 3.6～4.6mmol/L，嘌呤碱10～20mmol/L，VB2 18～23mmol/L，乙酰胺12～20mmol/L。
本发明制备得到的培养基的pH值范围调节为6.5～7.5。
进一步地，每1000mL本发明的铜绿假单胞菌用培养基中，各组分的含量分别为：
葡萄糖7.5～9.5g，尿素3.0～4.0g，磷酸氢二钾2.5～2.9g，磷酸二氢钾0.5～1.2g，硫酸镁0.7～1.1g，氯化钠3.5～4.5g，微量元素和生长因子溶液1mL，去离子水余量。
优选地，每1000mL本发明的铜绿假单胞菌用培养基中含有葡萄糖8g，尿素3.5g，磷酸氢二钾2.84g，磷酸二氢钾0.96g，硫酸镁1g，氯化钠5g，微量元素和生长因子溶液1mL，去离子水余量。
将铜绿假单胞菌株接入本发明的培养基，于27～32℃，摇床转速90～120r/min下培养24～36h，即可得到高浓度铜绿假单孢菌液。
本发明根据铜绿假单胞菌的生理特性，筛选配制出了适合于铜绿假单胞菌生长的培养基，并在培养基中引入了Mn2+，Mo2+，Fe2+，嘌呤碱，VB2，乙酰胺等微量元素和生长因子。其中，无机盐有助于促进苯酚降解相关酶类的合成和提高其酶活，促进微生物的生长速率，提高微生物对苯酚的降解效率，而嘌呤碱、乙酰胺和VB2能够促进细胞的生长和分裂。
本发明提供的培养基为铜绿假单胞菌提供了优良的生长环境，经本发明培养基培养的铜绿假单胞菌培养时间短，可在24h内达到较高浓度（OD值达1.2以上），在自然条件下适应能力强，具有较高的活力及苯酚降解能力，对苯酚的降解效率达96%以上，对氯苯的降解效率达93%以上。同时还具有较高的苯酚耐受性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步说明本发明。但不能将实施例理解为是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据其内容对本发明进行的一些非本质的改进和调整，仍应属于本发明的保护范围。
实施例1
分别称取MnCl2 0.48g，MoSO4 0.44g，FeSO4 0.6g，嘌呤碱1.4g，VB2 7.36g，乙酰胺1.12g，加入1000mL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。
取葡萄糖7.6g，尿素3.3g，磷酸氢二钾2.64g，磷酸二氢钾0.86g，硫酸镁1g，氯化钠4.5g，微量元素和生长因子溶液1mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至1000mL，并调节培养基的pH值范围为6.5～7.5，得到铜绿假单胞菌用培养基。
实施例2
分别称取MnCl2 0.52g，MoSO4 0.5g，FeSO4 0.63g，嘌呤碱2.35g，VB2 8.38g，乙酰胺0.81g，加入1000mL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。
取葡萄糖8g，尿素3.5g，磷酸氢二钾2.78g，磷酸二氢钾0.72g，硫酸镁0.7g，氯化钠4.1g，微量元素和生长因子溶液1mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至1000mL，并调节培养基的pH值范围为6.5～7.5，得到铜绿假单胞菌用培养基。
实施例3
分别称取MnCl2 0.55g，MoSO4 0.48g，FeSO4 0.58g，嘌呤碱1.95g，VB2 6.93g，乙酰胺0.99g，加入1000mL去离子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生长因子溶液。
取葡萄糖9.3g，尿素3.8g，磷酸氢二钾2.84g，磷酸二氢钾0.96g，硫酸镁0.8g，氯化钠3.6g，微量元素和生长因子溶液1mL，加去离子水搅拌溶解完全后，以去离子水补足至1000mL，并调节培养基的pH值范围为6.5～7.5，得到铜绿假单胞菌用培养基。
应用例1
1、采集太原焦化厂温度为23～26℃的污水水样。
2、取上述水样1mL，加入到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃、100r/min的恒温摇床上振荡培养24h。取培养物1mL，转移到新鲜的同样牛肉膏蛋白胨培养基中，于30℃、100r/min的恒温摇床上振荡重复培养24h，得到富集培养液。
3、移取1mL上述富集培养液，转接入含2mmol/L苯酚和1mmol/L氯苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度30℃下培养48h后，逐步提高苯酚浓度（依次为4、8、12、16mmol/L）和氯苯浓度（2、3、4、5mmol/L）以及培养时间，进行重复培养，对菌种进行驯化，得到驯化培养液。
4、在无菌条件下，用接种环蘸取上述苯酚浓度为16mmol/L和氯苯浓度为5mmol/L时的驯化培养液，在含苯酚的牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线分离，于30℃恒温培养箱中培养72h后，得到独立的典型菌落，将纯化后的单一菌落的菌株接种至斜面培养基上培养48h后，保存于4℃冰箱中。
5、将菌种接入实施例1提供的培养基中，27～32℃下，摇床转速90～120r/min培养24～36h（对数期），得到菌种，较平均培养时间缩短6～12h。
6、取上述菌种5mL（OD值0.8），加入到含苯酚8mmol/L、氯苯3mmol/L的100mL溶液中，30℃下，95r/min摇床振荡培养72h后测定苯酚和氯苯含量。经测定，苯酚降解率为97.2%，氯苯降解率为93.5%。
7、将上述菌种按伯杰氏手册进行菌种分类鉴定，经初步鉴定，该菌种为铜绿假单胞菌。
应用例2
1、采集太钢焦化厂的污水水样，采样时污水温度为22℃。
2、取上述水样1mL，加入到100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、100r/min的恒温摇床上振荡培养24h。取培养物1ml，转移到新鲜的同样牛肉膏蛋白胨培养基中，于30℃、100r/min的恒温摇床上振荡重复培养24h，得到富集培养液。
3、移取1ml富集培养液，转接入含2mmol/L苯酚和1mmol/L氯苯的新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度30℃下培养48h后，逐步提高苯酚浓度（依次为4、8、12、16mmol/L）和氯苯浓度（2、3、4、5mmol/L）以及培养时间，进行重复培养，对菌种进行驯化，得到驯化培养液。
4、在无菌的条件下，用接种环蘸取上述苯酚浓度为18mmol/L和氯苯浓度为4mmol/L时的驯化培养液，在含苯酚的牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线分离，于30℃恒温培养箱中培养72h后，得到独立的典型菌落，将纯化后的单一菌落的菌株接种至斜面培养基上培养48h后，保存于4℃冰箱中。
5、将菌种接入实施例2提供的培养基中，28～32℃下，摇床转速100～120r/min培养24～32h（对数期），得到菌种，较平均培养时间缩短8～12h。
6、取上述菌种5mL（OD值1.1），加入到含苯酚10mmol/L、氯苯5mmol/L的100ml溶液中，30℃下，100r/min摇床振荡培养72h，经测定，苯酚降解率为96.6%，氯苯降解率为93.3%。
7、将上述菌种按伯杰氏手册进行菌种分类鉴定，经初步鉴定，该菌种为铜绿假单胞菌。

Claims (3)

1.一种铜绿假单胞菌用培养基，每1000mL培养基中含有：
葡萄糖7～10g，尿素2～4g，磷酸氢二钾2～3g，磷酸二氢钾0.5～2g，硫酸镁0.5～1.5g，氯化钠3～5g，微量元素和生长因子溶液1～3mL，去离子水余量；
其中，所述的微量元素和生长因子溶液中含MnCl2 3.5～4.5mmol/L，MoSO4 2.0～2.8mmol/L，FeSO4 3.6～4.6mmol/L，嘌呤碱10～20mmol/L，VB2 18～23mmol/L，乙酰胺12～20mmol/L；
调节培养基的pH值范围为6.5～7.5。
2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌用培养基，每1000mL培养基中各组分的含量分别为：葡萄糖7.5～9.5g，尿素3.0～4.0g，磷酸氢二钾2.5～2.9g，磷酸二氢钾0.5～1.2g，硫酸镁0.7～1.1g，氯化钠3.5～4.5g，微量元素和生长因子溶液1mL，去离子水余量。
3.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌用培养基，每1000mL培养基中各组分的含量分别为：葡萄糖8g，尿素3.5g，磷酸氢二钾2.84g，磷酸二氢钾0.96g，硫酸镁1g，氯化钠5g，微量元素和生长因子溶液1mL，去离子水余量。
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