JPS6030698A - α−アミラ−ゼアイソザイムの新規な分別測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はα−アミラーゼアイソザイムの新規な測定法に
関する。

詳しくは、修飾基質を使用し、α−アミラーゼの各アイ
ソザイム即ち膵由来α−アミラーゼ及び唾液腺由来α−
アミラーゼによる糖転位反応及び続いて起る加水分解反
応で生じる生成物量の差を検知することを％徴とするα
−アミラーゼアイソザイムの測定法に関する。

生体試料など被検試料、特にヒトの唾液、膵液、血液、
尿中のα−アミラーゼ活性は医学上の診断において重要
である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、
血液や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著
しい上昇を示す。

更に、例えば血中α−アミラーゼ活性をアイソザイムに
分離して測定することは高アミラーゼ血症の解析や病態
の解明に重要であり、［１常臨床検査にも応用されてい
る。

α−アミラーゼアイソザイムの分離法は現在まで多岐に
わたっており、（１）荷電の差による分離、（２）ゲル
濾過法、（３）アフィニティクロマトグラフィーによる
方法、（４）免疫学的方法、（５）α−アミラーゼイン
ヒビターによる方法、などがある。

これらの内、現在のところ臨床検査に応用し得るものと
しては、公知文献（臨床病理、臨時増刊第４３号、（ｓ
ｏｅｎｚｙｍｅの分析とその意義　１７頁（１９８１）
）にも記載があるように、（１）の荷電の差による分離
を電気泳動法によって行うものと、最近多〈実施される
ようになってきている（５）のアミラーゼインヒビター
による方法がある。

電気泳動法に於て、臨床検査として適しているツバセル
ロースアセテート膜、薄層ポリアクリルアミドゲルを用
いる電気泳動法などがあるが、いずれも測定操作が煩雑
で、しかも測定に長時間を要する欠点がある。

一方、α−アミラーゼインヒビターを用いる方法は、小
麦由来のアミラーゼインヒビターが膵由来α−アミラー
ゼよりも唾液腺由来α−アミラーゼをより強く阻害する
ことを利用して両者の割合を算出するものであるが、現
在のところ、膵あるいは唾液腺由来のα−アミラーゼの
いずれかを特異的に完全に阻害するインヒビターが見出
されていない為、検体中の膵及び唾液腺由来の・ｔ−ア
ミラーゼの活性比率を既知の酵素標準液を用いて作成し
た検量線から読みとる方法がとられている力；、比較的
操作も簡便な為、最近多く使用されるようになってきて
いる。

しかしながら、この方法で膵由来α−アミラーゼと唾液
腺由来α−アミラーゼの活性比率をめるには、阻害剤を
入れた場合と入れない場合の２回の測定が必要であり、
操作が煩雑である。

本発明者らは、α−アミラーゼアイソザイムの分別測定
法について別の観点より鋭意研究を重ねた結果、オリゴ
糖誘導体の反応性がα−アミラーゼアイソザイムによっ
て異なり、従って生成物の比率がアイソザイムによって
異なることを見出し、これを利用しだα−アミラーゼア
イソザイムの分別測定法について更に研究を重ね、ある
種の修飾基即ち蛍光性を有する修飾基或いはＵＶ吸収を
有する修飾基を基質に導入することにより、生成物が高
速液体クロマトグラフィーによって容易に分別測定する
ことができることを見出し本発明を完成するに到った。

本発明の目的Ｉ；Ｉｃｘ−アミラーゼアイソザイム、特
にヒト膵由来＋ｒ−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼを分離測定せんとするものであり、本発明の方
法によれば極めて微量の検体を用いて、高感度の測定が
ｉｉＪ能となる。又、本発明の方法では、１回の測定で
検体中の膵及び唾液腺由来のび−アミラーゼの活性比率
をめることができる。

本発明の方法はα−アミラーゼの糖転位反応と加水分解
反応を併せて利用するものであり、その要旨は次の如く
である。

即ち、ブドウ糖がそれぞれ５個及び３個よりなる２種類
のオリゴ糖誘導体にα−アミラーゼを作用させると次の
ような糖転位反応が起る。

１ ■ Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ　十Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｒ２（Ｒ１，Ｒ２
・・・置換基、Ｇ・・・ブドウ糖）かかる糖転位反応が
起るという事実はこれまでに全く知られておらず、本発
明者等が始めて見出したものである。

糖転位反応によってできたオリゴ糖誘導体は引き続いて
α−アミラーゼの加水分解作用を受け、次式のような反
応が起る。

Ｒ３ Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｒ２ 上記反応例に於ては、糖転位反応ではＧが６個のオリゴ
糖が出来、加水分解反応ではＧが４個と２個に切断され
る例を示したが、一般には糖転位反応ではＧが６個以外
のオリゴ糖誘導体が当然生しるし、加水分解反応ではＧ
が３個と３個に切断される場合もあり、その分解反応率
はアイソザイムの種類によって定まっている。従って、
膵由来α−アミラーゼと唾液腺由来α−アミラーゼとで
反応の最も異なる条件を選ぶことにより、両者の分別測
定が可能となるわけである。

第１反応基質として用いた２種類のオリゴ糖誘導体は次
のように合成したが、合成方法は特にこれに限定される
ものではない。

合成例１（５Ｇオリゴ糖誘導体の合成）１ Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ　で示される０−６−ジオキシ−６
−（（２−ピリジル）アミン〕−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（
１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）
−０−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グ
ルコビラノースは公知文献〔ジャーナル　オブ　ザ　バ
イオケミストリー　９３巻　１０５５頁　（１９８３年
）〕　に従い合成した。即ちデキストリンのグルコース
残基の６位の一級アルコールをジメチルスルホキシドと
Ｎ　、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドで部分
酸化後２−アミノピリジンとシッフの塩基を形成させ、
シアノボロハイドライドで還元し２−アミノピリジル基
が導入されたデキストリンを得る。

これにバチルス属由来液化型アミラーゼとグルコアミラ
ーゼを作用させ、非還元末端グルコースに２−ピリジル
アミノ基が導入されたオリゴサツカライドを得、ゲル濾
過抜本画分を凍結乾燥して得たＯ 合成例２（３Ｇオリゴ糖誘導体の合成）Ｇ−Ｇ７Ｇ−Ｒ
２で示される０−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−１−
デオキシ−１−［：（２−ピリジル）アミン）　−Ｄ−
グルシトールは公知文献〔ジャーナル　オブ　ザ　バイ
オケミストリー　８５巻　２１７頁　（１９７９年）〕
に従い合成した。即ちマルトトリオースの還元末端グル
コースの１位のアルデヒドと２−アミノピリジンとでシ
ッフの塩基を形成させ、その後還元する還元的アミン化
により合成した。必要により、高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製した。

本発明に用いる上記２種の基質のα−アミラーゼ活性測
定時に於ける濃度は、ブドウ糖が５個のオリゴ糖誘導体
では５０〜２００μルｔが好ましく、ブドウ糖が３個の
オリゴ糖誘導体では１〜１０−Ｍ／ｌが好ましい。又、
測定時に於けるｐＨは、一般には４〜７、好ましくは５
〜６で行われる。

基質に導入する修飾基はピリジルアミノ基の如く蛍光を
発するものが好ましいが、これに限定されるものではな
く、酸化多糖体中のアルデヒド基と反応してシッフ塩基
を形成するアミン基を有する有機アミン類残基、例えば
、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基などＵＶ法により測定
可能となる修飾基も当然のことながら用いられ得る。

本発明の方法では基質を全て反応させて、生成する物質
の量的関係からアイソザイムの比率をめる。従って、生
成物の比率を活性比率既知のα−アミラーゼ−ｒインザ
イム標準液で前もって測定しておけば、生成物の一つを
測定すればよく、どの成分を測定するかは分析条件から
最も検出の容易なものを選べばよい。

生成物の分離、定量には高速液体クロマトグラフィーを
用いる。

液体クロマトグラフィーに於てはゲルバーミエーション
法あるいは逆相法等が効果的に使用される。液体クロマ
トグラフィーの条件の一例を示せば、逆相クロマトグラ
フィーではオクタデシルシラン基等のアルキル基を導入
した化学結合型シリカゲルを充填剤として用いる。溶離
液としては、０、１　Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液ｐ）ｉ
ａ、ｏ〜４，５で１−ブタノールを０．１〜０．０５％
含有するものが分離能が優れており、流速１，５〜２．
Ｑ　ｍｌ／ｙ＋ｉｎで測定が可能であるが、特にこれら
に限定されるものではない。検出は通常、蛍光法かＵＶ
法で行われる。

合成例１，２に於て、検出に利用する為に置換基として
導入した２−ピリジルアミノ基は、蛍光性を有し、通常
、励起点及び蛍光をそれぞれ３２０ｎｍ＋　４００　ｎ
ｍの波長を用いて測定する。

本発明の方法はα−アミラーゼアイソザイムの活性比率
を知るものであるが、別に既存の方法で試料中のα−ア
ミラーゼの総括性をめれば、それぞれのアイソザイムの
活性値は当然のことながら計算でめられる。

本発明の方法に従って、精製したヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼとヒト膵由来α−アミラーゼを試料として用い
、ブドウ糖が５個からなる直鎖状のオリゴ糖の非還元末
端ブドウ糖の６位の１級アルコールがα−ピリジルアミ
ノ基で置換されたものと、ブドウ糖が３個からなる直鎖
状オリゴ糖の還元末端の１位の２級アルコールが２−ピ
リジルアミノ基で置換されたものを基質として組合せて
用い、還元末端に２−ピリジルアミノ基を有するブドウ
糖が２個のオリゴ糖の生成量を調べたところ、膵由来ア
ミラーゼの方が約６倍生成量の多いことが確認された。

一方、糖転位反応の結果最も多く生成する非還元末端の
６位及び還元末端の１位のアルコールがα−ピリジルア
ミノ基で置換された、ブドウ糖が６個の直鎖状オリゴ糖
誘導体を基質として用い、加水分解工程のみにてα−ア
ミラーゼアイソザイムの分別測定を行うことも当然のこ
とながら可能である。そこで該オリゴ糖誘導体を次の方
法（合成例３）に従って合成し、これを基質としてヒト
唾液腺由来及びヒト膵由来のα−アミラーゼ活性の比較
を行った。

合成例３（６Ｇオリゴ糖の合成） 公知文献〔ジャーナル　オグ　ザ　バイオケミストリー
　９３巻　１０５５頁　（１９８３年）〕に従い合成し
た。即ちデキストリンのグルコース残基の６位の一級ア
ルコールをジメチルスルホキシドとＮ　、　Ｎ’−ジシ
クロへキシルカルボジイミドで部分的に酸化後２−アミ
ノピリジンとシッフの塩基を形成させ、シアノボロハイ
ドライトで還元し２−アミノピリジル基が導入されたデ
キストリンを得る。これにバチルス属由来液化型アミラ
ーゼとグルコアミラーゼを作用させ、非還元末端グルコ
ースに２−ピリジルアミノ基が導入されたオリゴサツカ
ライドを得、ゲル濾過後非還元末端グルコースの６位の
一級アルコールが２−ピリジルアミン基で置換されたグ
ルコースが６個の直鎖状オリゴ糖の両分を得る。このオ
リゴ糖誘導体に対し、公知文献〔ジャーナル　オブ　ザ
　バイオケミストリー　８５巻　２１７頁　（１９７９
年）〕に従い還元末端グルコースの１位のアルデヒドと
２−アミノピリジンとでシッフの塩基を形成させその後
還元する還元的アミン化をおこない、還元末端グルコー
スに２−ピリジルアミン基を導入した。必要に応じ高速
液体クロマトグラフィーで精製し目的物を得だ。

上記合成例３で得られた基質にヒト唾液腺由来σ−アミ
ラーゼ及びヒト膵由来α−アミラーゼを作用させたとこ
ろ、この場合は膵由来α−アミラーゼがヒト唾液腺由来
α−アミラーゼの約３倍量の生成物即ちブドウ糖が２個
のオリゴ糖誘導体を生成していることが確認できた。

即ち、α−アミラーゼの加水分解作用のみの工程での生
成物にてもα−アミラーゼアインザイムの分別測定は可
能であることが判る。

しかしながら、α−アミラーゼの糖転位反応と加水分解
反応の両工程を組合せた場合には、前述の如く尚一層高
い精度で分別測定が行なえるのでより好ましい。

本発明は本発明者ら独自の知見に基き完成された全く新
規なα−アミラーゼアインザイムの分別測定法に関する
ものである。

本発明は微量の検体で高感度の測定が可能となシ、叉−
回の測定で検体中の膵由来及び唾液腺由来−のα−アミ
ラーゼの活性比率をめることができる点に特徴を有する
発明であり、斯業に貢献するところ甚だ大なるものがあ
る。

以下に実施例を示し本発明を更に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定されるものでないことは云うまでも
ない。

実施例１ ０）試薬の調製 〔測定試液〕 グルコースが５個からなる直鎖状オリゴ糖の非還元末端
グルコースの６位の一級アルコールが２−ピリジルアミ
ノ基で置換されだオリゴ糖誘導体〔下記構造式（１））
２．７労とグルコースが３個からなる直鎖状オリゴ糖の
還元末端の１位の二級アルコールが２−ピリジルアミノ
基で置換されたオリゴ糖誘導体〔下記構造式（２）　）
　３２　Ｔｖと塩化ナトリウム２３．４ｍ９を２０ｍＭ
酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ５，５）１０ｍｌで溶解す
る。

構造式（１） 構造式（２） （ロ）標準液の調整 ヒト唾液から精製した唾液腺由来α−アミラーゼ１００
Ｕを１　ｍＭ塩化カルシウム水溶液１０ｏｍＡ！で溶解
した液を調製する。ヒト膵液から精製した膵由来α−ア
ミラーゼ１００Ｕをｌ　ｍＭ塩化力（レシウム水溶液１
００　ｍｌで溶解した液を調製する。試験管を３本用意
し各々Ｋ　Ｎｏ、　１．２．３．を付け、下記の様に唾
液腺由来と膵由来のα−アミラーゼを混合する。

（ハ）測定操作法 （１）　アミラーゼ反応 調製した各標準液又は血清５０　Ｊ）に測定試液５０μ
ｌを試験管にとり、よく混合後、３７℃で３時間反応さ
せる。

（２）高速液体クロマトグラフィー 上記反応液１０μｌをとシ高速液体クロマトグラフィー
にかけ、還元末端グルコースに２−アミノピリジル基が
導入されたマルトース誘導体〔下記構造式（３）〕の生
成量をピーク面積からめる。高速液体クロマトグラフィ
ーの測定条件は下記の通りである。

カラム及び充填剤：オクタデシルシランを結合させた逆
相型ゲル（商品名、ＴＳＫゲル、ＬＳ−４１０＋　５　
ａｍ　Ｔｏｙｏｓｏｄａ　Ｃｏ、　）を充填り、タカラ
ム（’４　Ｘ　３００ｍｍ）。

溶出液：０．０１５％ｎ−ブタノールを含む０．１Ｍ酢
酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３，３）。

流　速：１．７ｍ１１分。

検　出：蛍光検出器 励起波長３２０ｎｍｌ蛍光波長４００　ｎｍｍ膵由来−
アミラーゼの比率とマルトース誘４体生成量との関係か
ら、検量線を得、標準と同様に操作した血清のマルトー
ス誘導体〔構造式（３）〕の生成量から、この検量線を
用いて膵由来α−アεラーゼの比率をめる。

この検量線の例を図１に示す。血清中の膵由来α−アミ
ラーゼの比率がまると、通常用いられているα−アミラ
ーゼ活性測定法による総α−アミラーゼ活性測定値より
膵由来及び唾液腺由来α−アミラーゼ活性値を算出する
ことができる。

構造式（３） （イ）試液の調製 〔測定試液〕 グルコースが６個からなる直鎖状オリコ゛糖の非還元末
端グルコースの６位の一級アルコールが２−ピリジルア
ミノ基で置換され、さらに還元末端グルコースの１位の
二級アルコール ルアミン基で置換□されたオリゴ誘導体〔下記構造式（
４）　）　２．　２　ｍｇと塩化カルシウム３０ｍ９を
２　０　ｍＭＭ酸カルシウム緩衝液（　ｐＨ５．５　）
　２　０ｍｌで溶解する。

構造式（４） （口）標準液の調製 ヒト唾液から精製した唾液腺由来α−アミラーゼ１００
Ｕを１ｍＭ塩化カルシウム水溶液１００ｍｌで溶解した
液を調製する。ヒト膵液から精製した膵由来α−アミラ
ーゼ１００Ｕをｌ　ｍＭ塩塩化カルシウム水溶液１０屑 ３本用意し各々にＮｏ．　１．　２．　３を付け、下記
の様に唾液腺由来と膵由来のα−アミラーゼを混合する
。

（ハ）測定操作法 （１）　アミラーゼ反応 調製した各標準液又は血清５０μｌに測定試液５０μノ
を試験管にとり、よく混合後、３７℃で３時間反応させ
る。

（２）　高速液体クロマトグラフィー 上記反応液１０μｌをとり高速液体クロマトグラフィー
にかけ、還元末端グルコースに２−アミノピリジル基が
導入されたマルトース誘導体〔下記構造式（５）〕の生
成量をピーク面積からめる。

高速液体クロマトグラフィーの測定条件は下記の通りで
ある。

カラム及び充填剤：オクタデシルシランを結合させた逆
相型ゲル（商品名、Ｔ　Ｓ　Ｋゲル、Ｌ　Ｓ　−４１０
＋　５μｍ　Ｔｏｙｏｓｏｄａ　Ｃｏ、　）を充填した
カラム（４Ｘ　３０Ｑｍｍ）。

溶出液：０．０１５％ｎ−７７ノールを含む０．１Ｍ酢
酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３，３）。

流　速：１．７ｍ１１分 検　出：蛍光検出器 励起波長３２０　ｎｍ　、蛍光波長４００　ｎｍｍ膵由
来−アミラーゼの比率とマルト−ス誘導体（構造式（５
）〕の生成量との関係から、検量線を得、標準と同様に
操作した血清のマルトース誘導体生成量から、この検量
線を用いて膵由来α−アばラーゼの比率をめる。

この検量線の例を図２に示す。血清中の膵由来α−アミ
ラーゼの比率がまると、通常用いられているα−アミラ
ーゼ活性測定法による総ａ−アミラーゼ活性測定値より
膵由来及び唾液腺由来α−アミラーゼ活性値を算出する
ことができる。

構造式（５）

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１において各標準液について、ＨＰＬＣ
（高速液体クロマトグラフ４−）によりめたマルトース
誘導体の生成量（縦軸）と総α−アミラーゼ活性に対す
る膵由来α−アミラーゼ活性の百分率（横軸）との関係
をプロットしたものである。 図２は実施例２において、各標準液について、ＨＰＬＣ
によりめたマルトース誘導体の生成量（縦軸）と総α−
アミラーゼ活性・扛対する膵由来α−アミラーゼ活性の
百分率（横軸）との関係をプロットしたものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 図　１ 膵由来α−アミラーゼ活性の百分率（％）図　２ 膵由来α−アミラーゼ活性の百分率（％）手続補正書 昭和５３年　７１月　４日 １、事件の表示 妬ネａ５ｇ、拝将針層、叉＋３ｆ３１→号２、発明の名
称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５・　補正の対象 明細書の特許請求の範囲の槙及び発明の詳細な説明の欄
。 ６　補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書１０頁１７行目から同頁１８行目にかけて
記載の［２−アミノピリジル基１を［２−ピリジルアミ
ノ基−１と補正する。 （３）明則薔Ｊ５頁８行目から同頁９行目にかけて記載
の「２−アミノピリジル基１を「２−ピリジルアミノ基
」　と補正する。 （４）明細書１９頁１６行目から同頁１７行目にかけて
記載の「２−アミノピリジル基」を「２−ピリジルアミ
ノ基」と補正する。 （５）明卸１書２３頁４行目から同頁５行目にかけて記
載の「２−アミノピリジル基」を［２−ピリジルアミノ
基］と補正する。 以上 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）　第１反応の基質として２ｆｔｉｌのオリゴ糖誘
導体を組合せて用い、該基質にα−アミラーゼが作用し
て糖転位反応が起シ生欣したオリゴ糖誘導体が第２反応
の基質となり、更にα−アミラーゼの加水分解作用を受
け分解生成物を生じる、該加水分解生成物を測定するこ
とによってヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来
α−アミラーゼの分別測定を行うことを特徴とするα−
アミラーゼアイソザイムの分別測定方法。 （２）２種の第１反応の基質が下記構造式（ＩＬ　（Ｉ
Ｉ）で示される特許請求の範囲第１項に記載のα−アミ
ラーゼアイソザイムの分別測定方法。 〔式中Ｒ１＋　Ｒ２は２−ピリジルアミノ基、トコリジ
ルアミノ基の如く螢光性を有する置換基、若しくはアニ
リノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カ
ルボキシフェニルアミノ基の如（”ＵＶ吸収を有する置
換基を表わす。〕（３）加水分解生成物の分別測定に高
速液体クロマトグラフィーを用いる特許請求の範囲Ｗ１
項又は第２項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分
別測定方法。 （４）加水分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグ
ラフィーを用い、基質に導入したピリジルアミノ基の螢
光性を利用して検出を行う特許請求の範囲第１項、第２
項又は箪３項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分
別測定方法。 （５）加水分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグ
ラフィーを用い、基質に導入したアニリノ基、メチルア
ニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニル
アミノ基等のＵＶ吸収を利用して検出を行う特許請求の
範囲第１項、第２項又は第３項に記載のσ−アミラーゼ
アイノザイムの分別測定方法。 （６）基質に下記構造式（［０で示されるオリゴ糖訪導
体を用い、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ
る分解生成物を測定することによってヒト膵由来ば一ア
ミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定を
行うことを特徴とするα−アミラーゼアイソザイムの分
別測定方法。 〔式中Ｒ１１Ｒ２は前記と同じ。〕 （７）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
用いる特許請求の範囲第６項記載のα−アミラーゼアイ
ソザイムの分別測定方法。 （８）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
用い、基質に導入したピリジルアミノ基の螢光性を利用
（−７て検出を行う特許請求の範囲第６項又は第７項に
記載のａ−アミラーゼアイソザイムの分別測定方法・ （９）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
用い、基質に導入したアニリノ基、メチルアニリノ基、
ヒドロキシアニリノ基、カルボキンフェニルアミノ基等
のＵＶ吸収を利用して検出を行う特許請求の範囲第６項
又は第７項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分別
測定方法。 抜工 手続補正書 昭和５７年７り月／ｆ日 １、事件の表示 ２　発明の名称 ベーヱミラー【゛傍ゾテ／／＼の新規た゛仲別刷熱大 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４！ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
４、補正命令の日付 自　応 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６、　補正の内容 （１）　明細書８貞１９行目に記載の「Ｇ・・・ブドウ
糖Ｊ’！ｋｒＧ・・・グルコース単位」と補正する。 （２）明細書１１頁１８行目に記載の［５０〜２００　
ｔｔＭ／ＩＪｋ　ｒ５０〜２００　ｐｍｏｔ／ＬＪと補
正する。 （３）明細書１１負１９行目から同頁２０行目にかけて
記載の「１〜１０ｍＭ／ｌ」を［１〜１０ｍｍｏｔ／ｌ
Ｊと補正する。 （４）明細書１８頁１１行目に記載の「調整」を「調製
」と補正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　第１反応の基質として２種のオリゴ糖誘導体を
   組合せて用い、該基質にα−アミラーゼが作用して糖転
   位反応が起り生成したオリゴ糖誘導体が第２反応の基質
   となり、更にσ−アミラーゼの加水分解作用を受け分解
   生成物を生じる、該加水分解生成物を測定することによ
   ってヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−ア
   ミラーゼの分別測定を行うことを特徴とするα−アミラ
   ーゼアイソザイムの分別測定方法。 （２）２種の第１反応の基質が下記構造式（Ｉ）　ｌ　
   （Ｉｆ）で示される特許請求の範囲第１項に記載のα−
   アミラーゼアイソザイムの分別測定方法。 〔式中Ｒ，、Ｒ２は２−アミノピリジル基、３−アミノ
   ピリジル基の如く蛍光性を有する置換基、若しくはアニ
   リノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カ
   ルボキシフェニルアミ７基の如（ＵＶ吸収を有する置換
   基を表わす。〕（３）加水分解生成物の分別測定に高速
   液体クロマトグラフィーを用いる特許請求の範囲第１項
   又は第２項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分別
   測定方法。 （４）加水分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグ
   ラフィーを用い、基質に導入したピリジルアミン基の蛍
   光性を利用して検出を行う特許請求の範囲第１項、第２
   項又は第３項に記載のび一アミラーゼアイソザイムの分
   別測定方法。 （５）加水分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグ
   ラフィーを用い、基質に導入したアニリノ基、メチルア
   ニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニル
   アミノ基等のＵＶ吸収を利用して検出を行う特許請求の
   範囲第１項、第２項又は第３項に記載のα−アミラーゼ
   アイソザイムの分別測定方法。 （６）基質に下記構造式（ｕＩ）で示されるオリゴ糖誘
   導体を用い、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生
   じる分解生成物を測定することによってヒト膵由来α−
   アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定
   を行うことを特徴とするα−アミラーゼアイソザイムの
   分別測定方法。 〔式中Ｒ，、Ｒ２は前記と同じ。〕 （７）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
   分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
   用いる特許請求の範囲第６項記載のα−アミラーゼアイ
   ソザイムの分別測定方法。 （８）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
   分解生成物の分別測定に高速液体クロマＩ・グラフィー
   を用い、基質に導入したピリジルアミノ基の蛍光性を利
   用して検出を行う特許請求の範囲第６項又は第７項に記
   載のα−アミラーゼアイソザイムの分別側ボ方法。 （９）　α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
   分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
   用い、基質に導入したアニリノ基、メチルアニリノ基、
   ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基等
   のＵＶ吸収を利用して検出を行う特許請求の範囲第６項
   又は第７項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分別
   測定方法。