JPS60100592A - 新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用いるα−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 - Google Patents
新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用いるα−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法Info
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- JPS60100592A JPS60100592A JP20807083A JP20807083A JPS60100592A JP S60100592 A JPS60100592 A JP S60100592A JP 20807083 A JP20807083 A JP 20807083A JP 20807083 A JP20807083 A JP 20807083A JP S60100592 A JPS60100592 A JP S60100592A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なオリゴ糖誘導体、並ｃノ・にこれを基
質として用いるα−アミラーセアイソサイムの分別測定
法に関する。
質として用いるα−アミラーセアイソサイムの分別測定
法に関する。
更に詳しくは、新規なオリゴ糖誘導体を基質として用い
、α−アミラーゼの各アイソザイム即ち膵由来α−アミ
ラーゼ及び唾液腺由来α−アミラーゼによる加水分解反
応で生じる生成物量の差を生体試料など被検試料、特に
ヒトの唾液、膵液、血液、尿中のα−アミラーゼ活性の
測定は医学上の診断において重要である。例オば、膵炎
、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液や尿中のα−アミ
ラーゼ活性は通常の値に比べて著］２い上昇を示す。
、α−アミラーゼの各アイソザイム即ち膵由来α−アミ
ラーゼ及び唾液腺由来α−アミラーゼによる加水分解反
応で生じる生成物量の差を生体試料など被検試料、特に
ヒトの唾液、膵液、血液、尿中のα−アミラーゼ活性の
測定は医学上の診断において重要である。例オば、膵炎
、膵臓癌、耳下腺炎においては、血液や尿中のα−アミ
ラーゼ活性は通常の値に比べて著］２い上昇を示す。
更に、例えば血中α−アミラーゼ活性をアイソザイムに
分離して測定することＶｌ高アミラーセ血症の解析や病
態の解明に市−鮫であり、日常臨床検査にも応用されて
いる。
分離して測定することＶｌ高アミラーセ血症の解析や病
態の解明に市−鮫であり、日常臨床検査にも応用されて
いる。
α−アミラーセアイソザイムの分離法は現在まで多岐に
わたっており、（１）荷’ＮＩＪ、の差による分離、（
２）ゲル濾過ｍ１３）アフイニテイクロマトグラフイー
による方法、（４）免疫学的方法、（５）α−アミラー
ゼイ／ヒビターによる方法、などがある。
わたっており、（１）荷’ＮＩＪ、の差による分離、（
２）ゲル濾過ｍ１３）アフイニテイクロマトグラフイー
による方法、（４）免疫学的方法、（５）α−アミラー
ゼイ／ヒビターによる方法、などがある。
これらの内、現在のところ臨床検査に応用し得るものと
しては、公知文献（臨床病理、臨時増刊第４：３号、ｌ
５ＯｅｎＺ：Ｙｍｅの分析とイ二の意義 １７頁（１９
８１））にも記載があるように、（１）の荷電の差によ
る分離を電気泳動法に、１ニって行うものと、最近多〈
実施されるようになってきている（５）のアミラーゼイ
ンヒビターによる方法がある。
しては、公知文献（臨床病理、臨時増刊第４：３号、ｌ
５ＯｅｎＺ：Ｙｍｅの分析とイ二の意義 １７頁（１９
８１））にも記載があるように、（１）の荷電の差によ
る分離を電気泳動法に、１ニって行うものと、最近多〈
実施されるようになってきている（５）のアミラーゼイ
ンヒビターによる方法がある。
電気泳動法に於て、臨床検査と１〜で適しているのけセ
ルロースアセテート膜、薄層ポリアクリルアミドゲルを
用いる電気泳動法などがあるが、いずれも測定操作が煩
雑で、しかも測定に長時間を要する欠点がある。
ルロースアセテート膜、薄層ポリアクリルアミドゲルを
用いる電気泳動法などがあるが、いずれも測定操作が煩
雑で、しかも測定に長時間を要する欠点がある。
一方、α−アミラーセインヒビターを用いる方法は、小
麦由来のアミラーゼインヒビターが膵由来α−アミラー
ゼよりも唾液腺由来α−アミラーゼをより強く阻害する
ことを利用して両渚の割合を算出するものであるが、現
在のところ、膵あるいは唾液腺由来のα−アミラーゼの
いずれかを特異的に完全に阻害するインヒビターが見出
されていない為、検体中の膵及び唾液腺由来のα−アミ
ラーゼの活性比率を既知の酵素標準液を用いて作成した
検量線から読みとる方法かとられているが、比較的操作
も簡便な為、最近多く使用されるようになってきている
。
麦由来のアミラーゼインヒビターが膵由来α−アミラー
ゼよりも唾液腺由来α−アミラーゼをより強く阻害する
ことを利用して両渚の割合を算出するものであるが、現
在のところ、膵あるいは唾液腺由来のα−アミラーゼの
いずれかを特異的に完全に阻害するインヒビターが見出
されていない為、検体中の膵及び唾液腺由来のα−アミ
ラーゼの活性比率を既知の酵素標準液を用いて作成した
検量線から読みとる方法かとられているが、比較的操作
も簡便な為、最近多く使用されるようになってきている
。
しかし７ながら、この方法で膵由来α−アミラーゼと唾
液腺由来α−アミラーゼの活性比率をめるには、阻害剤
を入れた場合と入れない場合の２回の測定が必要であり
、操作が煩雑である。 〜本発明者らは、先に、α−ア
ミラーゼアイソザイムの新規な分別測定法とし、（、下
記構造式［Ａ）及び〔Ｉ３］で示される２種のオリゴ糖
誘導体を組合せ℃用い、該基質にα−アミラーゼが作用
して起こる糖転位反応により生成した。ｌ ＩＪコ゛糖
誘導体カニ、史にα−アミラーゼの加水分ブψｒＩ’を
用を受けて生じる加水分解物を測定するか、又１１下記
構造式（Ｃ’３で示されるオリゴ糖誘導体を川ｌ／）、
α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ乙分解生成
物を測定することによってヒト膵由来１１−アミラーゼ
とヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定を行う方法
に関して特許出願している（！１￥願昭５８−１３８３
４／Ｉ号）。
液腺由来α−アミラーゼの活性比率をめるには、阻害剤
を入れた場合と入れない場合の２回の測定が必要であり
、操作が煩雑である。 〜本発明者らは、先に、α−ア
ミラーゼアイソザイムの新規な分別測定法とし、（、下
記構造式［Ａ）及び〔Ｉ３］で示される２種のオリゴ糖
誘導体を組合せ℃用い、該基質にα−アミラーゼが作用
して起こる糖転位反応により生成した。ｌ ＩＪコ゛糖
誘導体カニ、史にα−アミラーゼの加水分ブψｒＩ’を
用を受けて生じる加水分解物を測定するか、又１１下記
構造式（Ｃ’３で示されるオリゴ糖誘導体を川ｌ／）、
α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ乙分解生成
物を測定することによってヒト膵由来１１−アミラーゼ
とヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定を行う方法
に関して特許出願している（！１￥願昭５８−１３８３
４／Ｉ号）。
〔式中Ｒ，、１（，２け２−ピリジルアミノ基、３−ピ
リジルアミノ基の如く螢光性を廟する置換基、若しくは
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒト゛ロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基の夕日〈ＵＶ吸収を有
する置換基を表わす。〕即ち、先の出願は、本発明者ら
が鋭意研究の結果、オリゴ糖誘導体の反応性がα−アミ
ラーゼアイソザイムによって異なり、従って生成物のト
し率がアイソザイムによって異なることを見出し、これ
を利用しだα−アミラーゼアイソツーイトの分５３１］
測定法について更に研究を重ね、ある種の修飾基即ち螢
光性を有する修飾基或いはＵＶ吸収を有する修飾基を基
質に導入することｌ／ｒより、生成物が高速液体クロマ
トグラフィーに」、って容易に分別測定することができ
ることを見出し完成した発明である。
リジルアミノ基の如く螢光性を廟する置換基、若しくは
アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒト゛ロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基の夕日〈ＵＶ吸収を有
する置換基を表わす。〕即ち、先の出願は、本発明者ら
が鋭意研究の結果、オリゴ糖誘導体の反応性がα−アミ
ラーゼアイソザイムによって異なり、従って生成物のト
し率がアイソザイムによって異なることを見出し、これ
を利用しだα−アミラーゼアイソツーイトの分５３１］
測定法について更に研究を重ね、ある種の修飾基即ち螢
光性を有する修飾基或いはＵＶ吸収を有する修飾基を基
質に導入することｌ／ｒより、生成物が高速液体クロマ
トグラフィーに」、って容易に分別測定することができ
ることを見出し完成した発明である。
今回、本発明者らは、これを更に発展させ、前記構−↓
式［Ｃ）で示されるオリゴ糖誘導体よりも合成し易く、
より実用的なオリゴ籾１誘導体について鋭意研究を行な
った結果、製；４’ｉ １’：程が短かく、合ＩＪｌｊ
が答易な下記構造式〔１〕で示さｉする新規なオリゴ糖
誘？ｎ体を見出し、これを基ｑ＋＋とじ℃用いることに
より、ｈＩＪ記構造式（’Ｃ〕で示７＼Ｊしるオリゴ糖
誘導体を用いた場合よりも、更に高４ｙ度にヒト膵由来
α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別
測定が可能となることイト見出し、本発明を完成するに
到った。
式［Ｃ）で示されるオリゴ糖誘導体よりも合成し易く、
より実用的なオリゴ籾１誘導体について鋭意研究を行な
った結果、製；４’ｉ １’：程が短かく、合ＩＪｌｊ
が答易な下記構造式〔１〕で示さｉする新規なオリゴ糖
誘？ｎ体を見出し、これを基ｑ＋＋とじ℃用いることに
より、ｈＩＪ記構造式（’Ｃ〕で示７＼Ｊしるオリゴ糖
誘導体を用いた場合よりも、更に高４ｙ度にヒト膵由来
α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別
測定が可能となることイト見出し、本発明を完成するに
到った。
〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリジＨ３
性を有する置換基、若しくは、アニリノ基、メチルアニ
リノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルア
ミノ基の如くＵＶ吸収を有する置換基を表わす。〕 本発明の目的は、α−アミラーゼアイソザイム、特にヒ
ト膵由来のα−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラ
ーゼを分別測定せんとするイ）のであり、本発明の方法
によれば、極めて微量の検体を用いて高感度の測定が可
能となる。又、本発明の方法では、１回の測定で検体中
の膵及び唾液腺由来のα−アミラーゼの活性比率をめる
ことができる。
リノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルア
ミノ基の如くＵＶ吸収を有する置換基を表わす。〕 本発明の目的は、α−アミラーゼアイソザイム、特にヒ
ト膵由来のα−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラ
ーゼを分別測定せんとするイ）のであり、本発明の方法
によれば、極めて微量の検体を用いて高感度の測定が可
能となる。又、本発明の方法では、１回の測定で検体中
の膵及び唾液腺由来のα−アミラーゼの活性比率をめる
ことができる。
本発明の方法は、α−アミラーゼの加水分解反応を利用
するものであり、その要旨は次の如くである。
するものであり、その要旨は次の如くである。
即ち、ヒトα−アミラーゼアイソザイムの分別測定に際
し、グルコースが６個からなる直鎖状オリゴ糖の非還元
末端グルコースのに１位の１級アルコール（、−ＣＨ２
０Ｈ）が一般式−（：Ｉ１２几で表わされる基で置換さ
れ、更に、還元末端グルコースがグリント−ルに還元さ
れた下記構造式〔１〕を有するオリゴ糖誘導体を基質と
して、α−アミラーゼを作用させると、主として１と２
の位置で加水分解が起とゆ、非還元末端に置換基を有す
る、グルコースが３個のオリゴ糖（構造式［１１１）と
非還元末端に１に換基を有する、グルコースが４個のオ
リゴ糖（構造式〔■〕）が得られてくる。
し、グルコースが６個からなる直鎖状オリゴ糖の非還元
末端グルコースのに１位の１級アルコール（、−ＣＨ２
０Ｈ）が一般式−（：Ｉ１２几で表わされる基で置換さ
れ、更に、還元末端グルコースがグリント−ルに還元さ
れた下記構造式〔１〕を有するオリゴ糖誘導体を基質と
して、α−アミラーゼを作用させると、主として１と２
の位置で加水分解が起とゆ、非還元末端に置換基を有す
る、グルコースが３個のオリゴ糖（構造式［１１１）と
非還元末端に１に換基を有する、グルコースが４個のオ
リゴ糖（構造式〔■〕）が得られてくる。
構造式〔Ｉ〕
■２
〔式中、Ｒ１２−ピリジルアミノ基、３−ビリジ光性を
有する置換基、若しくは、アニリノ基、メーチルアニリ
ノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミ
ノ基の如（ＵＶ吸収を有する置換基を表わす。尚、ｌ（
１と２）はα−アミラーゼの主として２種の加水分解位
置を示す。〕牌危式［■’］ 〔式中、凡は前記に同じ。〕 Ｓ、↓式［１［１） 〔式中、Ｒは前記に同じ。〕 そうして、この２種の加水分解位置に対する分解反応率
がアイソザイムの種類により定まっているため、ヒト膵
由来とヒト唾液腺由来のα−アミラーゼとで反応の最も
異なる条件を選ぶことにより、両者の分別測定が可能と
なるわけである。
有する置換基、若しくは、アニリノ基、メーチルアニリ
ノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミ
ノ基の如（ＵＶ吸収を有する置換基を表わす。尚、ｌ（
１と２）はα−アミラーゼの主として２種の加水分解位
置を示す。〕牌危式［■’］ 〔式中、凡は前記に同じ。〕 Ｓ、↓式［１［１） 〔式中、Ｒは前記に同じ。〕 そうして、この２種の加水分解位置に対する分解反応率
がアイソザイムの種類により定まっているため、ヒト膵
由来とヒト唾液腺由来のα−アミラーゼとで反応の最も
異なる条件を選ぶことにより、両者の分別測定が可能と
なるわけである。
例えば、几が２−ピリジルアミノ基である本発明の基質
（以下、Ｆ′Ｇ６という。）に、ヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼ及びヒト膵由来α−アミラーゼをそれぞれ作用
させた場合、１の位置で起こる加水分解に対する２の位
置で起こる加水分解の割合が、唾液腺由来のα−アミラ
ーゼの場合を１としたとき、膵由来のα−アミラーゼの
場合はその３．５倍になる。因に、先の出願に於ける前
記構造式〔Ｃ〕のオリゴ糖誘導体の中の１つである下記
、（’ Ｉ＝” ０６ Ｆ 〕を用いた場合には、唾液
腺由来α−アミラーゼ１に対して、膵由来のＣχ−アミ
ラーゼは３倍であった。
（以下、Ｆ′Ｇ６という。）に、ヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼ及びヒト膵由来α−アミラーゼをそれぞれ作用
させた場合、１の位置で起こる加水分解に対する２の位
置で起こる加水分解の割合が、唾液腺由来のα−アミラ
ーゼの場合を１としたとき、膵由来のα−アミラーゼの
場合はその３．５倍になる。因に、先の出願に於ける前
記構造式〔Ｃ〕のオリゴ糖誘導体の中の１つである下記
、（’ Ｉ＝” ０６ Ｆ 〕を用いた場合には、唾液
腺由来α−アミラーゼ１に対して、膵由来のＣχ−アミ
ラーゼは３倍であった。
即ち、本発明に於いて、還元末端グルコースをグリシド
ールに還元することに」、す、合成が容易であるばかり
でなく、意外にも測定精度も高くなったのである。
ールに還元することに」、す、合成が容易であるばかり
でなく、意外にも測定精度も高くなったのである。
［Ｆ Ｇ ６ Ｆ”］
本発明の基質はＦ０６Ｆに比べ、製造工程が短く、製造
が容易であり、且つ２つのα−アミラーゼアイソザイム
による基質に対する反応性の差が更に大きいという利点
を有するものであるから、α−アミラーゼアイソザイム
の分別測定に於て、更に有用な化合物である。
が容易であり、且つ２つのα−アミラーゼアイソザイム
による基質に対する反応性の差が更に大きいという利点
を有するものであるから、α−アミラーゼアイソザイム
の分別測定に於て、更に有用な化合物である。
また、本基質を用いる方法では、基質を全て加水分解す
る必要がないため、反応時間が短い等の利点を有する。
る必要がないため、反応時間が短い等の利点を有する。
以下、本発明について例を挙げて詳細に説明する０
先ず、本発明に使用するオリゴ糖誘導体は、次のように
合成したが、合成方法ｒ、ｌ１１′ケにこれに限定され
るものではない。
合成したが、合成方法ｒ、ｌ１１′ケにこれに限定され
るものではない。
〔合成例１〕
まず０−６−ジオキシ−６−（（２−ピリジル）アミノ
−１−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−〇−α
−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルー（１→４）−〇−α−１）−グルコピ
ラノシル−（１→４）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコビラノースは公知文
献〔ジャーナルオブ ザ バイオケミストリー、９３巻
、１Ｏ５５貞（１９８３年）〕に記載のオリゴ糖誘導体
の合成法に準じて合成した。
−１−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−〇−α
−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシルー（１→４）−〇−α−１）−グルコピ
ラノシル−（１→４）−０−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコビラノースは公知文
献〔ジャーナルオブ ザ バイオケミストリー、９３巻
、１Ｏ５５貞（１９８３年）〕に記載のオリゴ糖誘導体
の合成法に準じて合成した。
即ち、デキストリ／のグルコース残基の６位の１級アル
コールをジメチルスルホキシドとＮ 、 Ｎ’−ジシク
ロへキシルカルボジイミドで部分酸化後、２−アミノピ
リジンを作用させシッフの塩基とし、シアノ水素化ホウ
素ナトリウムで還元して、２−ピリジルアミノ基が導入
されたデキストリンを得る。次いで、これにバチルス属
由来液化型アミラーゼとグルコアミラーゼを作用させ、
酵素的加水分解を行ない、非還元末端グルコースに２−
ピリジルアミノ基が導入されたオリゴ糖を得る。ゲル濾
過後、本画分を凍結乾燥して得た。このオリゴ糖誘導体
５ｍｇを蒸留水１ｍｌで溶解した溶液に、２５ｍ９／
ｍｌの水素化ホウ素すｌ−ＩＪウム水溶液を２ ｍｌ加
え、４°Ｃで１８時間反応させ、還元末端グルコースを
グリシドールに還元した後、酢酸 １００μｔを加え過
剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解する。
コールをジメチルスルホキシドとＮ 、 Ｎ’−ジシク
ロへキシルカルボジイミドで部分酸化後、２−アミノピ
リジンを作用させシッフの塩基とし、シアノ水素化ホウ
素ナトリウムで還元して、２−ピリジルアミノ基が導入
されたデキストリンを得る。次いで、これにバチルス属
由来液化型アミラーゼとグルコアミラーゼを作用させ、
酵素的加水分解を行ない、非還元末端グルコースに２−
ピリジルアミノ基が導入されたオリゴ糖を得る。ゲル濾
過後、本画分を凍結乾燥して得た。このオリゴ糖誘導体
５ｍｇを蒸留水１ｍｌで溶解した溶液に、２５ｍ９／
ｍｌの水素化ホウ素すｌ−ＩＪウム水溶液を２ ｍｌ加
え、４°Ｃで１８時間反応させ、還元末端グルコースを
グリシドールに還元した後、酢酸 １００μｔを加え過
剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解する。
この溶液のゲル濾過を行ない目的とするＯ −６−デオ
キシ−６−４（２−ピリジル）アミン〕−α−Ｄ−クル
コビラノシルー（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シルー（１→４）−〇−α−】）−グルコピラノシル−
（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコビラ）シル−（Ｉ−ｚ
ｌ ）−Ｏ−ｔｘ−Ｉ）−グルコピラノシル−（ｌ→４
）−Ｄ−グリシドール（ＦＧ６）のＡ第を凍結乾燥して
得る。必要により高速液体クロマトグラフィーにより精
製する。
キシ−６−４（２−ピリジル）アミン〕−α−Ｄ−クル
コビラノシルー（ｌ→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノ
シルー（１→４）−〇−α−】）−グルコピラノシル−
（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコビラ）シル−（Ｉ−ｚ
ｌ ）−Ｏ−ｔｘ−Ｉ）−グルコピラノシル−（ｌ→４
）−Ｄ−グリシドール（ＦＧ６）のＡ第を凍結乾燥して
得る。必要により高速液体クロマトグラフィーにより精
製する。
本発明に用いる上記の基質のα−アミラーゼアインサイ
ム分別測定時に於ける濃度は、特に限定されないが、３
０〜５００μｔｏ ｏ １．／ ｌが好ましい。
ム分別測定時に於ける濃度は、特に限定されないが、３
０〜５００μｔｏ ｏ １．／ ｌが好ましい。
反応の液性は、ｐＨ４〜８の範囲であれば、通常問題は
ないが、中でもｐＨ５〜７の範囲が好ましく用いられる
。
ないが、中でもｐＨ５〜７の範囲が好ましく用いられる
。
基質に導入する修飾基はピリジルアミノ基、１−１３
が好まし１．いが、これに限定さノシるものではなく、
酸化多糖体中のアルデヒド基と反応してシック塩基を形
成するアミン基を有するイＪ機アミン類残基、例えば、
アニリノ基、メチルア、−リノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基なビ、ＵＶ法により測
定可能となる修飾基も当然のことながら用いることがで
きる。
酸化多糖体中のアルデヒド基と反応してシック塩基を形
成するアミン基を有するイＪ機アミン類残基、例えば、
アニリノ基、メチルア、−リノ基、ヒドロキシアニリノ
基、カルボキシフェニルアミノ基なビ、ＵＶ法により測
定可能となる修飾基も当然のことながら用いることがで
きる。
本発明の方法では、生成する物質の量的関係からアイソ
ザイムの比率をめるのであるから、生成物の比率を活性
比率既知のα−アミラーゼアイソザイム標準液で前もっ
て測定しておけばよい。
ザイムの比率をめるのであるから、生成物の比率を活性
比率既知のα−アミラーゼアイソザイム標準液で前もっ
て測定しておけばよい。
生成物の分離、定量には高速液体クロマトグラフィーを
用いる。
用いる。
液体クロマトグラフィーに於ては、ゲルノーミエーショ
ン法あるいは逆相法等が効果的に使用される。
ン法あるいは逆相法等が効果的に使用される。
液体クロマトグラフィーの条件の一例を示せば、逆相ク
ロマトグラフィーでは、オクタデフルシラン基等のアル
キル基を導入した化学結合型シリカゲルを充填剤として
用いる。溶離液としては、６１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液 ｐＨ３，０〜４５で、１−ブタノールを０．０５〜
Ｏ１％含有するものが分離能に優れており、流速 １５
〜２．０ ｍｅ ／ ｍｉｄで測定が可能であるが、特
にこれらに限定されるものではない。検出は通常、螢光
法かｒＪ Ｖ法で行なわれる。例えば、合成例１に於て
、検出に利用するために置換基として導入した２−ピリ
ジルアミノ基は、螢光性を有し、通常、励起点及び螢光
をそれぞれ３２０ ｎｍ、４００ ｎｍの波長を用いて
測定する。
ロマトグラフィーでは、オクタデフルシラン基等のアル
キル基を導入した化学結合型シリカゲルを充填剤として
用いる。溶離液としては、６１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液 ｐＨ３，０〜４５で、１−ブタノールを０．０５〜
Ｏ１％含有するものが分離能に優れており、流速 １５
〜２．０ ｍｅ ／ ｍｉｄで測定が可能であるが、特
にこれらに限定されるものではない。検出は通常、螢光
法かｒＪ Ｖ法で行なわれる。例えば、合成例１に於て
、検出に利用するために置換基として導入した２−ピリ
ジルアミノ基は、螢光性を有し、通常、励起点及び螢光
をそれぞれ３２０ ｎｍ、４００ ｎｍの波長を用いて
測定する。
本発明の方法は、α−アミラーゼアイソザイムの活性比
率を知るものであるが、別に既存の方法で試料中のα−
アミラーゼの総活性をめれば、そ力そ７′１．のフイン
ザイムの活刊、値は当然のことながらａ１算でめられる
。
率を知るものであるが、別に既存の方法で試料中のα−
アミラーゼの総活性をめれば、そ力そ７′１．のフイン
ザイムの活刊、値は当然のことながらａ１算でめられる
。
本発明は、本発明者ら独自の知見に基づき完成された全
く新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用い
るα−アミラー・（トアインザイムの分別測定法に関す
るものである。
く新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用い
るα−アミラー・（トアインザイムの分別測定法に関す
るものである。
本発明は、微量の検体で高感ＩＪＪ−の測定がｉ］”能
となり、又−回の測定で検体中の；ニド膵由来及びヒト
唾液腺由来のα−アミラーゼの活性比率をめることがで
きる点に特徴を有する発明であり、斯業に貢献するとこ
ろ甚だ犬なるイ、のがある。
となり、又−回の測定で検体中の；ニド膵由来及びヒト
唾液腺由来のα−アミラーゼの活性比率をめることがで
きる点に特徴を有する発明であり、斯業に貢献するとこ
ろ甚だ犬なるイ、のがある。
以下に実施例を示し本発明を史に詳しく説明するが、本
発明はこれらに限定さノするものでない。
発明はこれらに限定さノするものでない。
実施例 １
（イ） 試薬の調製
〔６）り定試液〕
グルコースが６個からなる的鎖状オリゴ糖の非還元末端
グルコースの６位の１級アルコールが２−ピリジルアミ
ノ基で置換され、さらに還元末端グルコースをダリシト
ールに還元したオリゴ糖誘導体（’ＦＣ）５．下記構造
式ＣＶ 〕） ２．５ ｍｙを、１０ｍＭ塩化ナトリウ
ムと５ｒｎＭ酢酸カルシウムを含む□ＩＯＭ：３．３−
ジメチルゲルタール酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５，９） ２ ｏｍｔでＰａ Ｗ（する。
グルコースの６位の１級アルコールが２−ピリジルアミ
ノ基で置換され、さらに還元末端グルコースをダリシト
ールに還元したオリゴ糖誘導体（’ＦＣ）５．下記構造
式ＣＶ 〕） ２．５ ｍｙを、１０ｍＭ塩化ナトリウ
ムと５ｒｎＭ酢酸カルシウムを含む□ＩＯＭ：３．３−
ジメチルゲルタール酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５，９） ２ ｏｍｔでＰａ Ｗ（する。
構造式〔ｖ〕
（ロ）標準液の調製
ヒト唾液から精製した唾液腺由来α−アミラーセ ｌ
Ｏｌ） ＬＪを１ｍＭ塩化カルシウム水溶液 １００ｍ
１で溶解した液を調製する。ヒト膵液から精製した膵由
来α−アミラーセ １００１１を１ｍＭ塩化カルシウム
水溶液 １００岨′で溶ｊｌｌ’ｌ： した液を調製す
る０試験管を３本用意し、各／、に篇１ 、２ ’＋
３を（＝Ｊけ、下記の様に唾液腺由来に膵由来のα−ア
ミラーゼを混合する〇 表 １、 （ハ） 測定操作法 （１） α−アミラーゼ反応 調製した各標準液又は血清１５Ｉｌｌに測定試液３０μ
ｔを試験管にと９、よく混合後３７°Ｃで６分間反応さ
せる。反応後０．１０ Ｍ酢酸（１，３ｍｌを加え、１
００°Ｃで１０分間加熱しα−アミラーゼ反応を停止さ
せる。
Ｏｌ） ＬＪを１ｍＭ塩化カルシウム水溶液 １００ｍ
１で溶解した液を調製する。ヒト膵液から精製した膵由
来α−アミラーセ １００１１を１ｍＭ塩化カルシウム
水溶液 １００岨′で溶ｊｌｌ’ｌ： した液を調製す
る０試験管を３本用意し、各／、に篇１ 、２ ’＋
３を（＝Ｊけ、下記の様に唾液腺由来に膵由来のα−ア
ミラーゼを混合する〇 表 １、 （ハ） 測定操作法 （１） α−アミラーゼ反応 調製した各標準液又は血清１５Ｉｌｌに測定試液３０μ
ｔを試験管にと９、よく混合後３７°Ｃで６分間反応さ
せる。反応後０．１０ Ｍ酢酸（１，３ｍｌを加え、１
００°Ｃで１０分間加熱しα−アミラーゼ反応を停止さ
せる。
（２）高速液体クロマトクラフィー
上記反応１１０μｔをとり、高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、非還元末端グルコースに２−ピリジルアミン
基が導入されたマルトトリオース誘導体（）”０３．下
記構造式〔■〕）及び還元末端グルコースに２−ピリジ
ルアミノ基が導入されたマルトテトラオース誘導体（Ｆ
Ｇ４．下記構造式（Ｖｌｌ ］ ）の生成量をピーク面
積からめる。高速液体クロマトグラフィーの測定条件四
［−１・記の通りである。
ーにかけ、非還元末端グルコースに２−ピリジルアミン
基が導入されたマルトトリオース誘導体（）”０３．下
記構造式〔■〕）及び還元末端グルコースに２−ピリジ
ルアミノ基が導入されたマルトテトラオース誘導体（Ｆ
Ｇ４．下記構造式（Ｖｌｌ ］ ）の生成量をピーク面
積からめる。高速液体クロマトグラフィーの測定条件四
［−１・記の通りである。
カラム及び充填剤：オクタデシルシラ／を結合させた逆
相部ゲル（商品名Ｃｏ Ｓｍａ ｓ’ ｉ ］、５Ｃ］
、 ｓ ＋Ｎａｋａｒａｉ Ｃｈｅｍ、Ｌｔｄ、）を充
填したツノラム（４Ｘ、１５０朋） 溶出液二００５％１−ブタノールを含む０． ］ ＯＭ
酢酸 流速：２．０ｍ１１分 検出：螢光検出器 励起波長 ３２０ｎｍ、、螢光波長 ４００ｎｍ構造式
ｒＶＩ］ 溝端式〔■１］ に）計算 高速液体クロマトグラフィーによってめたＦＧ３とＦ
Ｇ ４の生成量の比を計算する。膵由来α−アミラーゼ
の比率と、ＦＧ３とＦＯ４の生成量比の関係から第１図
に示すような検量線が得られ、標準と同様に操作した血
清のＰ（Ｅ３とＪパＧ４の生成量比から、この検量線を
用いて膵由来α−アミラーゼの比率をめる。
相部ゲル（商品名Ｃｏ Ｓｍａ ｓ’ ｉ ］、５Ｃ］
、 ｓ ＋Ｎａｋａｒａｉ Ｃｈｅｍ、Ｌｔｄ、）を充
填したツノラム（４Ｘ、１５０朋） 溶出液二００５％１−ブタノールを含む０． ］ ＯＭ
酢酸 流速：２．０ｍ１１分 検出：螢光検出器 励起波長 ３２０ｎｍ、、螢光波長 ４００ｎｍ構造式
ｒＶＩ］ 溝端式〔■１］ に）計算 高速液体クロマトグラフィーによってめたＦＧ３とＦ
Ｇ ４の生成量の比を計算する。膵由来α−アミラーゼ
の比率と、ＦＧ３とＦＯ４の生成量比の関係から第１図
に示すような検量線が得られ、標準と同様に操作した血
清のＰ（Ｅ３とＪパＧ４の生成量比から、この検量線を
用いて膵由来α−アミラーゼの比率をめる。
血清中の膵由来α−アミラーゼの比率か−まると、通常
用いられているα−アミラーセ活性測定法による総アミ
ラーセ活性測定値より、ＩＩ’仁山来及び唾液腺由来α
−アミラーセ活性値を算出することができる。
用いられているα−アミラーセ活性測定法による総アミ
ラーセ活性測定値より、ＩＩ’仁山来及び唾液腺由来α
−アミラーセ活性値を算出することができる。
第１図に、実施例１に於て、各標準液について高速液体
クロマトグラフィーによりめｆ、 Ｊ’ ０３とｌ”
Ｇ ４との生成量比（縦軸）とこれに対する膵由来α−
アミラーゼ活性の百分率（横軸）との関係をプロットし
たものである。 第２図、第３図は、それぞれ０−６−ジオキシ−ｃ、−
Ｃ（２−ピリジル）アミン〕−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（］→４）−〇−α−１〕−グルコピラノシル−（
１→４）−〇−α−Ｄ−クルコビラノシルー（１→４）
−０−α−Ｄ−グルコビラノンル＝（１→４）−〇−α
−Ｄ−グルコピラノシルー 吸収スペクトルとＩ）２０中の１３Ｃ−ＮＭＲスペクト
ルを示ず○ 第１図
クロマトグラフィーによりめｆ、 Ｊ’ ０３とｌ”
Ｇ ４との生成量比（縦軸）とこれに対する膵由来α−
アミラーゼ活性の百分率（横軸）との関係をプロットし
たものである。 第２図、第３図は、それぞれ０−６−ジオキシ−ｃ、−
Ｃ（２−ピリジル）アミン〕−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（］→４）−〇−α−１〕−グルコピラノシル−（
１→４）−〇−α−Ｄ−クルコビラノシルー（１→４）
−０−α−Ｄ−グルコビラノンル＝（１→４）−〇−α
−Ｄ−グルコピラノシルー 吸収スペクトルとＩ）２０中の１３Ｃ−ＮＭＲスペクト
ルを示ず○ 第１図
Claims (5)
- （１） グルコースが６個からなる直鎖状オリゴ糖の非
還元末端グルコースの６位の１級アルコール（−Ｃ）−
１２０１−１）が一般式−（ＩＩ２几で表わされる基で
置換され、更に還元末端クルコースがグリシドールに還
元された、「記構造式（１）を有する刃リボ糖誘導体。 ’ｆ：ＩＩ造式〔■〕 〔式中、几は２−ビリジルアζ゛）基、３−ビリジジル
アミノ基及び Ｈ３ 換基、若しくは、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒド
ロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基の如く
ＵＶ吸収を有する置換基を表わす。〕 - （２） 基質に下記構造式（１）で示されるオリゴ糖誘
導体を用い、α−アミラーセの加水分解作用を受けて生
じる分解生成物を測定することによって、ヒト膵由来α
−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測
定を行うことを特徴とする、α−アミラーゼアイソザイ
ムの分別測定法。 〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ビリＣＩ＋、
。 螢光性を有する置換基、若しくは、アニリノ基、メチル
アニリノ基、ヒドロギンアニリノ基、カルボキンフェニ
ルアミノ基の如＜［ＪＶ吸収ヲ有する置換基を表わす。 〕 - （３） α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
用いる特許請求の範囲第２項に記載のα−アミラーセア
イノザ・ｆムの分別測定法。 - （４） α−アミラーゼの加水分フ竹作用を受けて生じ
る分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィー
を用い、基質に導入したビリジルアＣ１，，１３ 用して検出を行う特許請求の１ｉｉ）囲第２項又Ｖｉ第
３項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分別測定法
。 - （５） α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラフィーを
用い、基質に導入したアニリノ基、メチルアニリノ基、
ヒドロキシアニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基等
のＬＩＶ吸収を利用して検出を行う特許請求の範囲第２
項又は第３項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分
別測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20807083A JPS60100592A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用いるα−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20807083A JPS60100592A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用いるα−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60100592A true JPS60100592A (ja) | 1985-06-04 |
| JPH0452279B2 JPH0452279B2 (ja) | 1992-08-21 |
Family
ID=16550143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20807083A Granted JPS60100592A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれを基質として用いるα−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60100592A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2617485A1 (fr) * | 1987-07-02 | 1989-01-06 | Takara Shuzo Co | Methode de marquage fluorescent des sucres |
-
1983
- 1983-11-04 JP JP20807083A patent/JPS60100592A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2617485A1 (fr) * | 1987-07-02 | 1989-01-06 | Takara Shuzo Co | Methode de marquage fluorescent des sucres |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0452279B2 (ja) | 1992-08-21 |
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