JPS6062999A - α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダー
ゼの存在下で、アグリコンがβ−グリコシド状に結合し
ている置換ニトロフェニル化マルトヘプタオシドを酵素
的に分裂さぜ次いで遊離したアグリコンを測定すること
によりα−アミラーゼを分析するための方法および試薬
に関する。

たとえば血清、血漿、尿、十二指腸液、ＩＩＩＩＱ　？
（ｋのような体液中のα−アミラーゼ活性の定Ｉｊは膵
臓病を認知するだめの臨床−化学診断において格別の重
要性を有する。

α−アミラーゼ定量用の従来既知の方法はデンプンをα
−アミラーゼで分解し、生成した分解部分を分光光度計
で測定することであった。

これらの方法の重大な欠点は、デンプンが巨大分子のた
め特定化および標準化が困難であることにある。

従って、さらに最近では、グルコースと同程度にまでα
−グルコシダーゼの存在下で分解される明確に定義され
たオリゴ糖を基質として使用し、その定量はそれ自体既
知の方法で行なう／　という方法が用いられている。し
かしながら、これらの反応は非常に複雑であり、内生的
のグルコースによりかく乱される。α−アミラーゼ用基
質として、３〜１２個のグルコース単位（０３〜Ｇ１２
）の鎖長を有する４−ニトロフェニル化オリゴ糖の使用
により、可成り簡易化が達成された。この場合には後続
のα−グルコシダーセ反応により、遊離したｐ−二トロ
フェノールを測定する（ドイツ連邦共和国特許出願公告
第２７３１４２１号）。米国特許第４，１４５，５２７
号明細書には、６個までのグルコース単位を有するα−
アミラーゼ用基質が記載されており、このものの製造の
際にα−およびβ−異性体が常に得られ、これはα−お
よびβ−グルコシダーゼと一緒に使用する。しかしなが
ら、］’　ｒ　ｅ　Ｓ　ｅ　ｒｌ　１．　ＬＩ　Ｓ　Ｚ
、；Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　３０１．１６９（１９８
０年）により、β−異性体を使用するとα−異性体と比
較して小実上常に小さい活性しか測定されないことが知
られている。

従来技術において、ｐ−二ｉ・ロフェノールを好適に測
定変数として使用する場合に、さらに別な欠点が生じる
。すなわちｐ−二トロフェノールのｐＫａ値は７．０９
にあり、このことシ、１１．α−アミラーゼ定量中の最
適ｐ［、ｉ条件（６８８〜７１）下において、遊離した
ｐ−二トロフェノールの僅かに約５０係だけが着色した
フェル−トアニオンとして存在し、この結果化じる１ｌ
ｌｌｌ定４Ｎ示度が相応して低いことを意味している。

さらにまた、多分、尿または十二指腸液のような酸性ま
たはアルカリ性の試料を使用することに起因すると考え
られるところの試験系の水素イオン濃度の変化は、遊離
したｐ−ニトロフェノールの解離度を変えることがあり
、従って、見かけモル吸光係数も変化する恐れがある。

本発明の基礎を形成する課題は、α−アミラーゼの検出
感度を格別に増大させるとともに、前記した欠点を回避
できるα−アミラーゼを定量するだめの方法ならびにそ
の試薬を入手し得るようにすることにある。

驚くべきことに、基質として置換された４−ニトロフェ
ニルーβ、Ｄ−マルトヘフタオントヲ使用することによ
りこの課題が解決できることが見い出された。また、β
−マルトヘプタオシド誘導体が相当するα−異性体より
α−アミン−七に対して良好なハタ１であるという事実
は、その反対の事実が文献により知られていることから
みて、篤くべきことである。

従って、本発明の主題は、α−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼの存在下にα−アミラー七基質を酵素
的に分裂させ、それにより生じ、た分裂生成物を測定す
ることによ一υα−アミラーゼを定量する方法にあり、
フェニル核が電気陰性的に置換されている４−ニトロフ
ェニル−β、Ｄ−マルトヘプタオシドを基質とし−ご使
用することを特徴とするα−アミラーゼの定量方法にあ
る。

さらにまた、本発明は、フェニル核が電気陰性的に置換
されている４−ニトロフェニル−β、Ｉ）−マルトヘプ
タオシドとα−グルコシグー−ヒトβ−グルコシダー七
とを基本的に含イＪするα−アミラーゼ定量用の試薬に
関する。

電気陰性置換基、すなわち二１・口糸、シアン基、ハロ
ゲン、エステル基、好ましくは塩素、臭素、フッ素のよ
うなハロゲン、特に塩素のような一ニー効果を有する置
換基を４−二トロノエニル核に導入することにより、ｐ
Ｋａ値が酸性領域に移行する。この場合の好適置換位置
ｔまニトロフェノールの２位置である。これにノ：す、
グルコシダーゼとの反応により遊離する置換４−ニトロ
フェノールがその他の点では同一条件下において指示薬
反応の感度の増加を示す追加の利点が達成される。

本発明゛による好適基質は、２−クロル−４−ニトロフ
ェニル−β、Ｄ−マルトヘフタオシトテある。α−アミ
ラーゼ定量の場合で、β−位置アグリコンが分裂する場
合には、α−グルコ／ダーゼに加えてさらにβ−グルコ
シダーゼも使用しなければならないことが必要になる。

試験条件下で、本発明による基質を使用すると、測定信
号が４０５ｎｍでのハロニトロフェノールと４−二トロ
フェノールとの吸光係数の比率に相当する成る因数だけ
大きくなることが、当然予想された。しかしながら、驚
くべきととに、４測定信号は実質的にさらに強力に増強
され、これはさらに本発明によるα−アミラーゼ測定の
感度を格別に増加することになる。

ｉＩ図１ｄ２−１’ロルー４−二トロフェニルーβ、Ｄ
−マルトヘプタオシド（＋）および相当するα一体（Ｉ
Ｉ）並ヒニ４−二トロフェニルーα、Ｄ−マルトヘプタ
オシド（ＩＩＩ）について、α−アミラーゼ定幇の場合
の時間−反応曲線の比較を示すものである。この図から
、たとえば４−ニトロフェニル−α、Ｄ−マルトヘプタ
オシドの場合に、１分当り００２４の吸光係数の変化が
生じ、フェニル核に塩素を置換することによりこの数値
ば［Ｊ、０５６に増大し、β一体に変えることにより、
１分当りの吸光係数の変化を００７５以上、すなわち６
倍だけ増大できることが明白になる３、２−りＩＪシル
−−ニトロフェニル−α、Ｄ−マルトヘフタオシドの場
合には本発明による基質による吸光値の明確な増加に加
えてグラフ中での非直線状経過を注目すべきである。

２種のアイソチーム、膵＋１１＆α−アミラーセおよび
唾液α−アミラーゼは巨大分子基質にえｊして異なる活
性を示す。驚くへきことに、本発明による基質を用いる
と、これらのアイソチームが同一活性値を与える。

α−アミラーゼ定量の場合に、基り′１はα−アミラー
ゼにより小さい単位（Ｇ３、（」４）に分裂され、これ
らは順次、α−グルコ／ダーゼによりド β−グルコシ≠＝４寸で分解される。β−ダルコンダー
ゼの作用は最終的に二トロフコニノール基の分離を導き
、とのニトロフェノールが測定変数としてはたらく。

この試験における本発明による基質の濃度は、０１〜ろ
ＯＯミリモル／ｌ、好ましくは約２〜１０ミリモル／ｌ
に相当すべきである。α−グルコシダーゼの濃度は通常
、１０２〜２．５　Ｘ　１０６　Ｕ／ｌの範囲、好まし
くは約８Ｘ１０４Ｕ／７であり、β−グルコシダーゼの
濃度は通常、１０２〜１０５Ｕ／ｌの範囲、好ましくは
約２．５　Ｘ　１０”　ｌＪ／ｌである。

本発明の方法を実施するには、α−アミラー上反応中に
できるだけ最適のｐＨ条件、すなわち５〜９のｐＨ値、
好ましくは約６．５〜７１のｐＨ値を維持することがで
きる緩衝物質が必要である。

〕雌当な緩衝剤としては、たとえばリン酸塩緩衝剤、Ｎ
　−（２−ヒト゛ロキシエチルンービはう／ノーＮ−２
−エタンースルホン酸（□Ｉ−ＩＥ１）ＥＳ緩衝剤）、
イミダゾール、トリエタノールアミン、リン＝グリセロ
ール、好ましくはリン酸塩緩衝剤がある。緩衝剤の濃度
は１０〜２００ミリモノｅｔの範囲、好適には約５０ミ
リモル／ｌである。

前記諸成分とは別に、本発明による試薬は、慣用の活性
化剤、たとえば塩化ナトリウム寸たは塩化カリウムを含
有する。

α−アミラーゼを定量するには、基質、α−グルコシダ
ーゼ、β−ゲルコツダーゼ、緩衝剤および活性化、剤１
の試薬溶液を試料溶液と混合し、吸光値を４０５ｎｍで
、たとえば６０°Ｃにおいて記録する。

本発明による試薬はまた、試薬を含浸させ／こ吸着性物
質の形で、またはホイル中に配合した形で、α−アミラ
ーゼ定量用の指示剤としても適している。

例　１ α−アミラーゼの定量 試験容量１−当りで次の成分を含有する試薬組成物を作
る。

成　分　試験における濃度 α−グルコシダーゼ　８０　Ｌｌ　／ｍｅβ−グルコシ
ダー七　１０Ｕ／ｍ／！ リン酸塩緩衝剤（ｐＨ６，８）　０．０５モル／ｌ塩化
ナトリウム　０３０５モル／ｌ 測定条件： 温度＝６０℃ 波長：　４０５　ｎｍ 試験の実施：試薬１　ｍｌ＋試料１０μｌこの試薬によ
る時間−反応曲線を、フェニル核上にハロゲンが置換さ
れていない場合と比較して、第１図に示す。

１ｊｌｌＩ　（基質：４−＝）ロフェニルーα、Ｄ−マ
ルトヘブタオ牟シト）に比較して、線Ｉ（基質：２−１
０ルー４−二トロフェニルーβ、Ｄ−マルトヘプタオシ
ド）は吸光値の変化が明らかに増大している（△Ｅ１５
）〜０．０５）。

例　２ α−アミラーゼの定量と吸光値のｐＨ依存性例１と同一
条件下に、一方が２−クロル−４−二トロフェノールを
含有し、他方が４−二トロフェノールを含有し、７．１
のｐＨ値に調節した２種の試薬溶液の吸光値を測定する
。次いで、ｐＨ値を段階的に僅かに増減し、各場合の吸
光値のふれを測定する。第２図にその結果を示す。

上方に示した線（２−クロル−４−二トロフェノールを
含む試薬溶液）の小さい力の勾配は。

吸光値が４−二トロフェノールを含む場合（下方に示し
た線）に比較して可］の変化により強い作用を受けない
ことを示している。

例　６ α−アミラーゼの定量および純粋基質（２−クロル−４
−ニトロスエニルーβ、Ｄ−マルトヘプタオシド）とα
体およびβ体の混合物との比較：基質が等量のα一体お
よびβ一体よりなる点で異なる以外は例１と同一の試薬
組成物を作る。

吸光値の変化量はこの混合物を使用した場合に、純粋な
各異性体の各数値の正確に中間にある。

【図面の簡単な説明】

第１図は６種の基質を使用した場合のそれぞれの時間−
反応曲線であり、そして第２図は２種の試薬のｐＨ変化
による吸光値の変化を示す曲線である。 Ｉ・・・基’ｆｔ＝　２−　クロル−４−二トロフェニ
ルーβ、Ｄ−マルトヘプタオシド ■・・・基質＝　２−　クロル−４−二トロフェニルー
α、Ｄ−マルトヘプタオシド ＩＩＩ・・・基質＝４−二トロフェニルーα、Ｄ−マル
トヘプタオシド 代　理　人　弁理士　南　孝　夫 ４ 第１頁め続き ０発　明　者　ローランド・ヘルゲル　ドイツ連邦共和
国Ｄルチルーシュトラ− ０発　明　者　ライナー・クリフク　ドイツ連邦共和国
Ｄルチル拳シュトラ− ０発　明　者　ウーヴ工・ヴユール□ツ　ドイツ連邦共
和国Ｄブルグ　ルチル・シュトラー −６１００ダルムシユタツト、フランクフセ２５０ 一６１００ダルムシュタット、フランクフセ２５０ −６１００ダルムシユタツト、フランクフセ２５０

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ
   の存在下でα−アミラーゼ基質を酵素的に分裂させ１次
   いで分裂生成物を測定することによりα−アミラーゼを
   分析する方法であって、基質としてフェニル核が電気陰
   性的に置換されている４−ニトロフェニル−β、Ｄ−マ
   ルトヘプタオシドを使用することを特徴とする、α−ア
   ミラーゼの分析方法。
2. （２）ハロゲンで置換されている４−ニトロフェニル−
   β、Ｄ−マルトヘプタオシドを前記の基質として使用す
   る、特許請求の範囲第１項の方法。
3. （３）　２−クロル−４−二トロンエニルーβ、Ｄ−マ
   ルトヘゾタオシドを前記の基質として使用する、特許請
   求の範囲第１項または第２項の方法。
4. （４）　７’エニル核が電気陰性的に置換されている４
   −ニトロフェニル−β、Ｄ−マルトヘソタオシド、α−
   グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを基本的に含
   有するα−アミラーゼ分析用試薬。