JPS6128400A - α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 - Google Patents
α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬Info
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- JPS6128400A JPS6128400A JP15081284A JP15081284A JPS6128400A JP S6128400 A JPS6128400 A JP S6128400A JP 15081284 A JP15081284 A JP 15081284A JP 15081284 A JP15081284 A JP 15081284A JP S6128400 A JPS6128400 A JP S6128400A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はα−アミラーゼ活性測定法および測定用試薬に
関するものである。
関するものである。
（従来の技術）
最近、ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基質として
、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えばマルトテトラオ
ース、マルトペンタｌオース、マルトヘキサオースなど
が使用される様になりつつある。これらのうち代表例と
してマルトペンタオースを基質として使用する場合をと
りあげて脱明すると、測定様式は次の様に表わすことが
できる。
、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えばマルトテトラオ
ース、マルトペンタｌオース、マルトヘキサオースなど
が使用される様になりつつある。これらのうち代表例と
してマルトペンタオースを基質として使用する場合をと
りあげて脱明すると、測定様式は次の様に表わすことが
できる。
アミラーゼ
（１ｊマルトヘンタオースー一一一一ラマルトース＋マ
ルトトリオース ｆ２１ マルトース ＋ マルト）ｌ−、’、−−τ
７α−グルコシダーゼ グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例えばグル
コースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系、もし
くはヘキソキナーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコ
ース−６−ホスフエードテヒドログナーゼ／ＮＡＤＨ系
等で測定で２する。
ルトトリオース ｆ２１ マルトース ＋ マルト）ｌ−、’、−−τ
７α−グルコシダーゼ グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例えばグル
コースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系、もし
くはヘキソキナーゼ／ホスフォグルコムターゼ／グルコ
ース−６−ホスフエードテヒドログナーゼ／ＮＡＤＨ系
等で測定で２する。
ところがこの測定系は、グルコースを中間体とするため
、体液中の内因性グルコースの影響を受けるという欠点
があシ、精度の高いα−アミラーゼ活性値が得られない
。
、体液中の内因性グルコースの影響を受けるという欠点
があシ、精度の高いα−アミラーゼ活性値が得られない
。
他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフェニル基、ナフチ
ル基或はそれらの類似体全結合した基質が合成され、次
の様なものを基質とするアミラーゼ測定試薬が提案され
ている。
ル基或はそれらの類似体全結合した基質が合成され、次
の様なものを基質とするアミラーゼ測定試薬が提案され
ている。
ｐ−ニトロフヱニルマルトベンタオサイドＣ特公昭５７
−５３０７９号公報ノ ｐ−ニトロフヱニルマルトヘキサオサイト（４！公昭５
７−５３０７９号公報） これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活性の測定
様式を例示すると、次の様Ｖｒ−なる。
−５３０７９号公報ノ ｐ−ニトロフヱニルマルトヘキサオサイト（４！公昭５
７−５３０７９号公報） これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活性の測定
様式を例示すると、次の様Ｖｒ−なる。
Ｌ二二Σ巳乙王巳色二五二二上上ニア１Ａヱ乙上左場合
１１＋ １１−二トロフェニルーα−マルトヘンタオ
サイドエニ１ユ！二目らｐ−ニトロフェニル−α−マル
トサイド＋マルトトリオース（２＋ｐ−ニトロフェニル
−α−マルトサイ）−＋〜 ル ト ト リ オ −ス
１３−二＝二・ギて二上１−−三已一二七二・シ〔
−二＝１２±’＞ｐ−ニトロフェノール士グルコース ココに遊離したｐ−ニトロフェノールの変化量でα−ア
ミラーゼ活性は測定される。この系は内因性のグルコー
スの影響は受けないが、遊離基であるｐ−ニトロフェノ
ールが若干のｐＨ変化、温度変化で分子吸光係数が大き
く変化したり、α−アミラーゼの活性測定式（α−アミ
ラーゼの至適ｐＨは６．６〜７．５に存在する］で十分
な測定感度が得られないという欠点があった。’ｌｙ
＊基質のグルコース鎖に関しては、マルトテトラオース
以下の低分子オリゴ糖でちるとα−アミラーゼの作用性
が悪く、また追随酵素であるα−グルコシグーゼの作用
ヲ受はブランク値が上昇する。マルトヘキサオース以上
の高分子オリゴ糖であるとα−アミラーゼの切断部位が
増加したり、−次氷解生成物に再にα−アミラーゼが作
用し二次水解生成物を生じたり１７て、α−アミラーゼ
の活性を正確に測定できない等の問題点があつ次〇 そこで本発明者等は、基質としてα−および／またはβ
−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイ
ド金使用することによシこれらの問題点を解決し既に提
案した（特願昭５８−１１１２９６−ｊｔ几遊１１ｉ基
の０−クロル−ｐ−ニトロフェノール１ｄｐＨ変化・温
度変化に非常に安定であり、分子吸光係数の変死が著し
く小さく、ｐＨ６，６からＤＨ７，５で十分な測定感度
が得られる。また糖鎖をマルトペンタオースにすること
によりα−アミラーゼの切断部位が限定さｎ、−次氷解
生成物へのα−アミラーゼの作用もなく、正確なα−ア
ミラーゼ活性ヲ得ることに成功し文。
サイドエニ１ユ！二目らｐ−ニトロフェニル−α−マル
トサイド＋マルトトリオース（２＋ｐ−ニトロフェニル
−α−マルトサイ）−＋〜 ル ト ト リ オ −ス
１３−二＝二・ギて二上１−−三已一二七二・シ〔
−二＝１２±’＞ｐ−ニトロフェノール士グルコース ココに遊離したｐ−ニトロフェノールの変化量でα−ア
ミラーゼ活性は測定される。この系は内因性のグルコー
スの影響は受けないが、遊離基であるｐ−ニトロフェノ
ールが若干のｐＨ変化、温度変化で分子吸光係数が大き
く変化したり、α−アミラーゼの活性測定式（α−アミ
ラーゼの至適ｐＨは６．６〜７．５に存在する］で十分
な測定感度が得られないという欠点があった。’ｌｙ
＊基質のグルコース鎖に関しては、マルトテトラオース
以下の低分子オリゴ糖でちるとα−アミラーゼの作用性
が悪く、また追随酵素であるα−グルコシグーゼの作用
ヲ受はブランク値が上昇する。マルトヘキサオース以上
の高分子オリゴ糖であるとα−アミラーゼの切断部位が
増加したり、−次氷解生成物に再にα−アミラーゼが作
用し二次水解生成物を生じたり１７て、α−アミラーゼ
の活性を正確に測定できない等の問題点があつ次〇 そこで本発明者等は、基質としてα−および／またはβ
−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイ
ド金使用することによシこれらの問題点を解決し既に提
案した（特願昭５８−１１１２９６−ｊｔ几遊１１ｉ基
の０−クロル−ｐ−ニトロフェノール１ｄｐＨ変化・温
度変化に非常に安定であり、分子吸光係数の変死が著し
く小さく、ｐＨ６，６からＤＨ７，５で十分な測定感度
が得られる。また糖鎖をマルトペンタオースにすること
によりα−アミラーゼの切断部位が限定さｎ、−次氷解
生成物へのα−アミラーゼの作用もなく、正確なα−ア
ミラーゼ活性ヲ得ることに成功し文。
これらの特徴を有するα−および／またはβ−ｏ−りｏ
ルール−ニトロフェニルマルトペンタオサイドを基質と
して、α−アミラーゼ活性の至適条件、ｐ）Ｉ６．６か
らｐＨ７，５で測定する場合、遊離基”’Ｃｈ ；ｂ
ｏ−クロル−ｐ−ニトロフェノールが高感度化合物（分
子吸光係数が大きい）の友め、測定の精度が向上し、試
料の少量化も可能になった。
ルール−ニトロフェニルマルトペンタオサイドを基質と
して、α−アミラーゼ活性の至適条件、ｐ）Ｉ６．６か
らｐＨ７，５で測定する場合、遊離基”’Ｃｈ ；ｂ
ｏ−クロル−ｐ−ニトロフェノールが高感度化合物（分
子吸光係数が大きい）の友め、測定の精度が向上し、試
料の少量化も可能になった。
（発明が解決しようとする問題点）
試料の少量化により、試料中の他成分が測定系に与える
影響は／ＪＳさくなったが、試料の測定液中での濃度が
薄くなり、α−アミラーゼが測定液中で失活して正確な
測定値が得られ欧いという新丸な問題点が生じた。
影響は／ＪＳさくなったが、試料の測定液中での濃度が
薄くなり、α−アミラーゼが測定液中で失活して正確な
測定値が得られ欧いという新丸な問題点が生じた。
（問題点全解決する文めの手段〕
そこで本発明者等はこれらの問題点を解決するため種々
イｔ）Ｆ究した結果、ノ・ロゲン化−ｐ−ニトロフェニ
ルマルトサイドを基質として含んだ測定液を使用して、
試料中のα−アミラーゼを測定する場合、無機酸または
有機酸のカルシウム塩および／またはナトリウム塩を共
存させることにより、測定液中のα−アミラーゼが賦活
化さｎ１試料の測定液中での濃度が薄くてもα−アミラ
ーゼ活性の正［な測定値を得ることに成功した。
イｔ）Ｆ究した結果、ノ・ロゲン化−ｐ−ニトロフェニ
ルマルトサイドを基質として含んだ測定液を使用して、
試料中のα−アミラーゼを測定する場合、無機酸または
有機酸のカルシウム塩および／またはナトリウム塩を共
存させることにより、測定液中のα−アミラーゼが賦活
化さｎ１試料の測定液中での濃度が薄くてもα−アミラ
ーゼ活性の正［な測定値を得ることに成功した。
すなわち不発明はハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが
還元性末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
糖に、試料およびα−グルコシダーゼまたはα−グルコ
シダーゼおよびβ−グルコシダーゼｅ［機酸のカルシウ
ム塩および／又はナトリウム塩および／または有機酸の
カルシウム塩および／又はす） ＩＪウム塩の存在下で
作用させ、生成するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノール
を測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を
測定すること全特徴とするα−アミラーゼ活性測定法で
ある。
還元性末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
糖に、試料およびα−グルコシダーゼまたはα−グルコ
シダーゼおよびβ−グルコシダーゼｅ［機酸のカルシウ
ム塩および／又はナトリウム塩および／または有機酸の
カルシウム塩および／又はす） ＩＪウム塩の存在下で
作用させ、生成するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノール
を測定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を
測定すること全特徴とするα−アミラーゼ活性測定法で
ある。
また本発明はハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが還元
性末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼ、訃よび無機酸のカルシウム塩およ
び／又はナトリウム塩および／または有機酸のカルシウ
ム塩および／又はナトリウム塩全含有することを特徴と
するα−アミラーゼ活活性測用用試薬ある。
性末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、
α−グルコシダーゼ、訃よび無機酸のカルシウム塩およ
び／又はナトリウム塩および／または有機酸のカルシウ
ム塩および／又はナトリウム塩全含有することを特徴と
するα−アミラーゼ活活性測用用試薬ある。
本発明において使用するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノ
ールが還元性末端にα−結合またはβ−結合したマルト
オリゴ糖とは、繰返し単位威が４〜１０であるマルトオ
リゴ糖の還元性末端ヒドロキシ基に対して、ハロゲン化
−ｐ−ニトロフェノールがグリコシド結合し足ものであ
り、グリコシド結合はα−結合またはβ−結合のいずれ
でもよい。
ールが還元性末端にα−結合またはβ−結合したマルト
オリゴ糖とは、繰返し単位威が４〜１０であるマルトオ
リゴ糖の還元性末端ヒドロキシ基に対して、ハロゲン化
−ｐ−ニトロフェノールがグリコシド結合し足ものであ
り、グリコシド結合はα−結合またはβ−結合のいずれ
でもよい。
マルトオリゴ糖としては、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス等かめる。ま几ハロゲン化−ｐ −ニトロフェノール
としてｉｆｆ、２−１０ルー４−ニトロフェノール、３
−クロル−４−ニトロフェノール、２−ブロム−４−ニ
トロフェノール、３−ブロム−４−ニトロフェノール、
２−ヨード−４−ニトロフェノール、３−ヨード−４−
ニトロフェノール、２−フルオロ−４−ニトロフェノー
ル、３−フルオロ−４−ニトロフェノールなどのモノハ
ロゲン化−ｐ−ニトロフェノール、２．３−シｐロルー
４−ニトロフェノール、２．６〜シクロルー４−ニトロ
フェノール、２．３−ジブロム−４−ニトロフェノール
、２．６−シｐロルー４−ニトロフェノール、２．３−
シフロム−４−ニトロフェノール、２．３−ヨード−４
−ニトロフェノール、２，６−ヨード−４−ニトロフェ
ノール、２．３−ジフルオロ−４−ニトロフェノール、
２．６−ジフルオロ−４−ニトロフェノール、２−クロ
ル−３−ブロム−４−ニトロフェノールなどのジノＡロ
ゲン化−ｐ−ニトロフェノールなどがある。またトリフ
１０ゲン化−ｐ−ニトロフェノール、テトラノへロゲン
化−ｐ−ニトロフェノールを用いてもよい。さらにアル
キル基、アルコキシ基等が置換されたノ１０ゲン化−ｐ
−ニトロフェノールでちってもよい。
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス等かめる。ま几ハロゲン化−ｐ −ニトロフェノール
としてｉｆｆ、２−１０ルー４−ニトロフェノール、３
−クロル−４−ニトロフェノール、２−ブロム−４−ニ
トロフェノール、３−ブロム−４−ニトロフェノール、
２−ヨード−４−ニトロフェノール、３−ヨード−４−
ニトロフェノール、２−フルオロ−４−ニトロフェノー
ル、３−フルオロ−４−ニトロフェノールなどのモノハ
ロゲン化−ｐ−ニトロフェノール、２．３−シｐロルー
４−ニトロフェノール、２．６〜シクロルー４−ニトロ
フェノール、２．３−ジブロム−４−ニトロフェノール
、２．６−シｐロルー４−ニトロフェノール、２．３−
シフロム−４−ニトロフェノール、２．３−ヨード−４
−ニトロフェノール、２，６−ヨード−４−ニトロフェ
ノール、２．３−ジフルオロ−４−ニトロフェノール、
２．６−ジフルオロ−４−ニトロフェノール、２−クロ
ル−３−ブロム−４−ニトロフェノールなどのジノＡロ
ゲン化−ｐ−ニトロフェノールなどがある。またトリフ
１０ゲン化−ｐ−ニトロフェノール、テトラノへロゲン
化−ｐ−ニトロフェノールを用いてもよい。さらにアル
キル基、アルコキシ基等が置換されたノ１０ゲン化−ｐ
−ニトロフェノールでちってもよい。
特に好ましくは、２−クロル−４−ニトロフェノールで
ちる。
ちる。
マルトオリゴ糖とハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールと
を反応させる方法は通常の方法に従う。
を反応させる方法は通常の方法に従う。
化学的にはマルトオリゴ糖をアセチル化し、このアセチ
ル化マルトオリゴ糖とハロゲン化−ｐ−ニトロフェノー
ル全結合させた後、脱アセチル化することにより合成で
きる〔実験化学講座第２４巻第３０４頁、１９５８年参
照）。
ル化マルトオリゴ糖とハロゲン化−ｐ−ニトロフェノー
ル全結合させた後、脱アセチル化することにより合成で
きる〔実験化学講座第２４巻第３０４頁、１９５８年参
照）。
本発明に使用するα−グルコシダーゼは如何なる起源の
ものを使用してもよく、例えばサッカロマイセスカルロ
スベルゲンシス、酵母などから得られたものがある。
ものを使用してもよく、例えばサッカロマイセスカルロ
スベルゲンシス、酵母などから得られたものがある。
ｔ７ｎβ−グルコシダーゼも如何なる起源のものを使用
してもよく、例えばアーモンドから得られム塩としては
、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、シュウ酸カルシウ
ム、酢酸カルシウム、クエン酸力／ｌ／ −／ ｆ）ム
、グルコン酸カルシウム、乳ｍ ７’Ｊ ／ｌ／ ソウ
ム、リン酸二水素カルシウム、リン酸７：素カルシウム
、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム等がある。
してもよく、例えばアーモンドから得られム塩としては
、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、シュウ酸カルシウ
ム、酢酸カルシウム、クエン酸力／ｌ／ −／ ｆ）ム
、グルコン酸カルシウム、乳ｍ ７’Ｊ ／ｌ／ ソウ
ム、リン酸二水素カルシウム、リン酸７：素カルシウム
、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム等がある。
本発明に使用する無機酸ま几は有機酸のナトリウム塩と
しては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、アスコルビ
ン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、硫酸ナトリウム、
硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム酒石酸水素
ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、ｎ−酪酸ナトリウム、
炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナ
トリウム、プロピオン醗ナトリウム、ギ酸ナトリウム、
グルコン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水
素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等がある。
しては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、アスコルビ
ン酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、硫酸ナトリウム、
硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム酒石酸水素
ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、ｎ−酪酸ナトリウム、
炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナ
トリウム、プロピオン醗ナトリウム、ギ酸ナトリウム、
グルコン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水
素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等がある。
本発明に使用する無機Ｉ！！または有機酸のカルシウム
塩の製置は０．０１ｒｎＭ〜１０ｍＭであり、無機酸ま
たは有機酸のナトリウム塩の濃度は０．００１Ｍ〜ＩＭ
である。
塩の製置は０．０１ｒｎＭ〜１０ｍＭであり、無機酸ま
たは有機酸のナトリウム塩の濃度は０．００１Ｍ〜ＩＭ
である。
本発明に用いる緩衝液はｐＨ６，６からｐＨ７，５の間
で緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツド緩
衝剤等を含有することが好ましい。
で緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツド緩
衝剤等を含有することが好ましい。
本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、ハロゲン化
−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端ニα−結合または
β−結合したマルトオリゴ環、α−グルコシダーゼ′！
！たはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ、
無機酸のカルシウム塩および／またはナトリウム塩、お
よび／または無機酸のカルシウム塩および／マ几はナト
リウム塩および緩衝液からなシ、必要によりその他の成
分を含有していてもよい。例えば抗性物質、化学療法剤
、エチレンジアミン四酢酸塩やアジ化ナトリウム等のキ
レート剤、そして界面活性剤等も添加してよい。
−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端ニα−結合または
β−結合したマルトオリゴ環、α−グルコシダーゼ′！
！たはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼ、
無機酸のカルシウム塩および／またはナトリウム塩、お
よび／または無機酸のカルシウム塩および／マ几はナト
リウム塩および緩衝液からなシ、必要によりその他の成
分を含有していてもよい。例えば抗性物質、化学療法剤
、エチレンジアミン四酢酸塩やアジ化ナトリウム等のキ
レート剤、そして界面活性剤等も添加してよい。
本発明に用いる試料としては、血清、尿、膵液、唾液等
がある。
がある。
本発明のα−アミラーゼ活性測だ法は、ハロゲン化−ｐ
−ニトロフェノールが還元性末端にα−結合し女、マル
トオリゴ環を基質とする場合、該マルトオリゴ環に試料
およびα−グルコシダーゼを前記カルシウム塩および／
′ｆ：たけナトリウム塩の存在下で作用させ、生成する
ハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールＴｈ１ｌｌｌ定する
。またハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端
にβ−結合したマルトオリゴ環を基質とする場合、該マ
ルトオリゴ環に試料およびα−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼを前記カルシウム塩および／またはナ
トリウム塩の存在下で作用させ、生成するハロゲン化−
ｐ−ニトロフェノールヲ測定する。α−グルコシダーゼ
またはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼは
上記マルトオリゴ環と試料との反応と同時に、あるいは
反応後に添加してもよい。
−ニトロフェノールが還元性末端にα−結合し女、マル
トオリゴ環を基質とする場合、該マルトオリゴ環に試料
およびα−グルコシダーゼを前記カルシウム塩および／
′ｆ：たけナトリウム塩の存在下で作用させ、生成する
ハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールＴｈ１ｌｌｌ定する
。またハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端
にβ−結合したマルトオリゴ環を基質とする場合、該マ
ルトオリゴ環に試料およびα−グルコシダーゼおよびβ
−グルコシダーゼを前記カルシウム塩および／またはナ
トリウム塩の存在下で作用させ、生成するハロゲン化−
ｐ−ニトロフェノールヲ測定する。α−グルコシダーゼ
またはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼは
上記マルトオリゴ環と試料との反応と同時に、あるいは
反応後に添加してもよい。
本発明のα−アミラーゼ活性測定は好ましくはｐＨ６，
６〜７．５のＭ １１ｉｉ 、夜中で上記マルトオリゴ
環とα−グルコシダーゼまた１はα−グルコ／ダーゼお
よびβ−グルコシダーゼと試料とを好ましくは約２〜３
０分間反応はせる。反応により生成したハロゲン化−ｐ
−ニトロフェノールの測定に、ハロゲン化−ｐ−ニトロ
フェノールが有する吸光度、例えば２−クロル−４−ニ
トロフェノールの場合、４００ｎｍの吸光度変化を肉眼
判定や分光元展計を用いて測定する。
６〜７．５のＭ １１ｉｉ 、夜中で上記マルトオリゴ
環とα−グルコシダーゼまた１はα−グルコ／ダーゼお
よびβ−グルコシダーゼと試料とを好ましくは約２〜３
０分間反応はせる。反応により生成したハロゲン化−ｐ
−ニトロフェノールの測定に、ハロゲン化−ｐ−ニトロ
フェノールが有する吸光度、例えば２−クロル−４−ニ
トロフェノールの場合、４００ｎｍの吸光度変化を肉眼
判定や分光元展計を用いて測定する。
Ｃ発明の効果】
本発明では、ハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールを還元
性末端にα−結合ま友はβ−結合したマルトオリゴ環を
基質として、無機酸または有機酸のカルシウムおよび／
″またはナトリウム塩の共存下、好ましくはｐＨ６，６
からｐＨ７，５までの緩衝液中で試料を作用させ、生成
するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールを測定して試料
中のα−アミラーゼ活性を測定することにより、従来法
で問題であった、内因性のグルコースの影響、ｐＨ変化
の影響、温度変化の影輯ヲ受けず、高感度で測定が可能
となる。ま几少量の試料でα−アミラーゼを失活ぎせる
ことなく正確に測定できる。
性末端にα−結合ま友はβ−結合したマルトオリゴ環を
基質として、無機酸または有機酸のカルシウムおよび／
″またはナトリウム塩の共存下、好ましくはｐＨ６，６
からｐＨ７，５までの緩衝液中で試料を作用させ、生成
するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールを測定して試料
中のα−アミラーゼ活性を測定することにより、従来法
で問題であった、内因性のグルコースの影響、ｐＨ変化
の影響、温度変化の影輯ヲ受けず、高感度で測定が可能
となる。ま几少量の試料でα−アミラーゼを失活ぎせる
ことなく正確に測定できる。
（実施例］
以下本発明全実施例によシ説明する。
実施例１
下記の試薬を用い、下記方法により試料中のα−アミラ
ーゼ活性を測定した。
ーゼ活性を測定した。
１、試 薬
試薬Ａ ： ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳＣピペラジン−Ｎ
、Ｎ’−ビスＣ２−エタンスルホン酸）） ｐＨ７
，。
、Ｎ’−ビスＣ２−エタンスルホン酸）） ｐＨ７
，。
β−ｏ−１０ルーｐ−エト四フェニルペンタオサイド
５ｍＭα−グルコシダーゼ
８０ ｕ ／ ｄβ−グルコシダーゼ
１０’ｕ／５ｓｆＣａＣ’Ｎ＝
１ｍＭＮａＣ１１＠ １
ｍＭ試［Ｂ ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ Ｐ
Ｈ７，０マルトペンタオース ５ｍＭα−グ
ルコシダーゼ ８０ｕ／ｄヘキンキナーゼ
２ｕ／−グルコース−６一リン瞳デヒドロキ
ナーゼ１０ｕ／ｍ／ アデノシン三リン酸（ＡＴＰｊ ２ｍＭ二；テ
ンアミドシタクレオチド（ＮＡＤ）４ｍＭ ２、サンプル： 血清ａ：水＝９：１ ０血清ａニ
ゲルコース水溶＠（２１／ｄｌ）＝９ ： １ ■尿
ａ：水＝９；１ ■尿ａニゲ
ルコース水溶液（２９７ｄｉ）＝９ ： ｌ ■３、
測定法 各サンプル２０μｌに、３７℃で５分間加温しｔ試薬ｌ
まｋはＨを３ｍｌ加えて反応させ、試薬ブランクを対照
にして、４分から８分までの直線部を試薬１は４００ｎ
ｍで、試薬■は３４０ｎｍで測定した。１分間の吸光度
変化を第１表に示す・第 １ 表 第１衣から明らかなように、試薬Ｂではグルコース含有
試料に対して１分間の吸光度変化が大きい。
５ｍＭα−グルコシダーゼ
８０ ｕ ／ ｄβ−グルコシダーゼ
１０’ｕ／５ｓｆＣａＣ’Ｎ＝
１ｍＭＮａＣ１１＠ １
ｍＭ試［Ｂ ：５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ Ｐ
Ｈ７，０マルトペンタオース ５ｍＭα−グ
ルコシダーゼ ８０ｕ／ｄヘキンキナーゼ
２ｕ／−グルコース−６一リン瞳デヒドロキ
ナーゼ１０ｕ／ｍ／ アデノシン三リン酸（ＡＴＰｊ ２ｍＭ二；テ
ンアミドシタクレオチド（ＮＡＤ）４ｍＭ ２、サンプル： 血清ａ：水＝９：１ ０血清ａニ
ゲルコース水溶＠（２１／ｄｌ）＝９ ： １ ■尿
ａ：水＝９；１ ■尿ａニゲ
ルコース水溶液（２９７ｄｉ）＝９ ： ｌ ■３、
測定法 各サンプル２０μｌに、３７℃で５分間加温しｔ試薬ｌ
まｋはＨを３ｍｌ加えて反応させ、試薬ブランクを対照
にして、４分から８分までの直線部を試薬１は４００ｎ
ｍで、試薬■は３４０ｎｍで測定した。１分間の吸光度
変化を第１表に示す・第 １ 表 第１衣から明らかなように、試薬Ｂではグルコース含有
試料に対して１分間の吸光度変化が大きい。
参考例１
ｐ−ニトロフェノールとｏ−９０ルーｐ−ニトロフェノ
ールのｐＨ変化の影響を下記方法により測定した。
ールのｐＨ変化の影響を下記方法により測定した。
１、試 薬
ｐＨ５，０からｐＨ７，ｏｔでのＭＥＳ（２−（Ｎ−七
ルホリノノエタンスルホン醸〕バッフ１−を調整した。
ルホリノノエタンスルホン醸〕バッフ１−を調整した。
ま几ｐＨ７，０からｐＨ９，０まではトリスバッファー
を調整した。
を調整した。
２、測定法
解し、ブランクを対照にして４００Ｈｍで吸光度を測定
した（温度２０℃）。その結果を第１図に示す。
した（温度２０℃）。その結果を第１図に示す。
本発明ｆ） ｏ−ｐロルーｐ−ニトロフェノール（ＣＮ
Ｐ）はｐＨ６，６からｐＨ７，５の間での吸光度変化が
非常に小さいのに比べ、ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ
）は吸光度変化が大きい。
Ｐ）はｐＨ６，６からｐＨ７，５の間での吸光度変化が
非常に小さいのに比べ、ｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ
）は吸光度変化が大きい。
参考例２
ｐ−ニトロフェノールとｏ−１０ルーｐ−ニトロフェノ
ールの温度変化の影響を下記方法によシ測定した。
ールの温度変化の影響を下記方法によシ測定した。
１、試薬
ｐＨ７，０のＭＥＳバッファーを調整し友。
２、測定法
上記試薬中にｐ−ニトロフェノールｆ ０．０７２ ｍ
Ｍ、 ’！ ｆｃハｏ −クロル−ｐ−ニトロフェノー
ルを０．０３３ｍＭ・濃度で溶解し、試薬の温度を１５
℃から４５℃まで変化させて、試薬ブランクを対照にし
て、４００ ｎｍで吸光度を測定し食。その結果を第２
図に示す。
Ｍ、 ’！ ｆｃハｏ −クロル−ｐ−ニトロフェノー
ルを０．０３３ｍＭ・濃度で溶解し、試薬の温度を１５
℃から４５℃まで変化させて、試薬ブランクを対照にし
て、４００ ｎｍで吸光度を測定し食。その結果を第２
図に示す。
ｐ−二）ｏフェノール（ＰＮＰ）は温度変化に伴い、吸
光度変化が大きいが、本発明のＯ−クロル−ｐ−ニトロ
フェノール（ＰＮＰ）は温夏変化の影ｑＩを受けない。
光度変化が大きいが、本発明のＯ−クロル−ｐ−ニトロ
フェノール（ＰＮＰ）は温夏変化の影ｑＩを受けない。
実施例２
（１）試 薬
下記試薬ＩＫ第２表の化合物を添加剤とする試薬Ａ−に
および試薬■ｔ−調製しｔ０ 試薬１ ： ５０ｍＭ ＭｇＳ ｐＨ
７，０α−グルコシダーゼ ｓｏｕ、”＊α−
ｏ−クロルーｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイド
５ｍＭ試薬ｎ ： ５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ ｐＨ７，０α−グルコシダーゼ
８０ｕ／＊α−ｐ−ニトロフェニルペンタオサ
イドｍＭ −第 ２ 我 （２）サンプル 血清ｂ ■ 尿 ｂ ■ （３）測定法 各サンプルを、試薬Ａ−Ｋに対しては２０μ１１試薬■
に対しては５０μ１分取し、３７℃で５分間加温した試
薬Ａ−に、試薬ｎｋ各３ｄ添加し、試薬ブランクを対照
にして、４分から８分までの直線部を４００ｎｍ″Ｔ：
測定した。その結果を第３衣に試薬にでは測定液中でα
−アミラーゼの失活がおこシ、サンプル中のα−アミラ
ーゼの正確な測定値を得ることができなかったが、本発
明の試薬Ａ−Ｊでは測定液中でα−アミラーゼが賦活化
されて測定することができる。
および試薬■ｔ−調製しｔ０ 試薬１ ： ５０ｍＭ ＭｇＳ ｐＨ
７，０α−グルコシダーゼ ｓｏｕ、”＊α−
ｏ−クロルーｐ−ニトロフェニルマルトペンタオサイド
５ｍＭ試薬ｎ ： ５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ ｐＨ７，０α−グルコシダーゼ
８０ｕ／＊α−ｐ−ニトロフェニルペンタオサ
イドｍＭ −第 ２ 我 （２）サンプル 血清ｂ ■ 尿 ｂ ■ （３）測定法 各サンプルを、試薬Ａ−Ｋに対しては２０μ１１試薬■
に対しては５０μ１分取し、３７℃で５分間加温した試
薬Ａ−に、試薬ｎｋ各３ｄ添加し、試薬ブランクを対照
にして、４分から８分までの直線部を４００ｎｍ″Ｔ：
測定した。その結果を第３衣に試薬にでは測定液中でα
−アミラーゼの失活がおこシ、サンプル中のα−アミラ
ーゼの正確な測定値を得ることができなかったが、本発
明の試薬Ａ−Ｊでは測定液中でα−アミラーゼが賦活化
されて測定することができる。
参、前例３
−（１）試 薬
下記の試薬ＩをｐＨ６，０、６，５、６，７５、７，０
’。
’。
７．５．８．０に調製し、下記の方法によりα−アミラ
ーゼ活性値を損１］定した。
ーゼ活性値を損１］定した。
試薬１ ： ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ
β−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフェニルペンタオサイド
５ｍＭα−グルコシダーゼ
１５０ ｕ ／ ｍｌβ−グルコシダーゼ
２ｏｕ／ｄＣａＣ１１１ｍＭ ＮａＣＡ＊ １ｍＭ（２）
サンプル 膵液由来α−アミラーゼ ■ 唾液由来α−アミラーゼ ■ （３）測定法 各サンプル２０μｌに、３７℃で５分間加温したｐＨ６
，０〜８．０の試薬■３ｗｔを添加して反応させ、試薬
ブランクを対照にして４分から８分までの直線部全４０
０ｎｍで、１９分間の吸光度変化を測定し、最大吸光度
変化１００％とし、各試薬ｐＨ値に４．おける相対活性
を測定しｔｏその結果１に第３図に示す。
５ｍＭα−グルコシダーゼ
１５０ ｕ ／ ｍｌβ−グルコシダーゼ
２ｏｕ／ｄＣａＣ１１１ｍＭ ＮａＣＡ＊ １ｍＭ（２）
サンプル 膵液由来α−アミラーゼ ■ 唾液由来α−アミラーゼ ■ （３）測定法 各サンプル２０μｌに、３７℃で５分間加温したｐＨ６
，０〜８．０の試薬■３ｗｔを添加して反応させ、試薬
ブランクを対照にして４分から８分までの直線部全４０
０ｎｍで、１９分間の吸光度変化を測定し、最大吸光度
変化１００％とし、各試薬ｐＨ値に４．おける相対活性
を測定しｔｏその結果１に第３図に示す。
なお膵液白米、唾液由来のα−アミラーゼ共に、ｐＨ６
，６からｐＨ７，５の間に至適ＰＨをもつ。
，６からｐＨ７，５の間に至適ＰＨをもつ。
第１図はＣＮＰとＰＮＰの吸光度に与えるｐＨ値の影響
を示す。・印はＧＮＰ、○印はＰＮＰ、−はＭＥＳバッ
ファー、−一−ｒａトｖスバッファーを示す。 第２図はＧＮＰとＰＮＰの吸光度に与える温度の影響金
示す。・印はＣＮＰ％Ｏ印はＰＮＰ’に示す。 第３図は膵液、唾液由来のα−アミラーゼのｐＨ変化に
対する活性値変化を示す。・印は膵液白米α−アミラー
ゼ、○印は唾液由来のα−アミラーゼを示す。 第１図 ・ ；○−７０ルーｐ−ニトロフＬ１−ルＯ＋ｐ−ニト
ロフ田ノール ：ＹＥＳ Ｉくツ７アー 一−−；ｌ−リス バ・・１７７− 第２１！ｌ ト ：○−７０ル−ｐ−ニトロｈ１−ノし・ｏ−：ｐ−
ニトロ７ｒ：Ｉ−１し 第３ＩＩｌ 太目 Ｏヴ虻−，＃か氷メーアミラー゛ビ゛ 手 続 補 正 書（自発） 昭和５９年９月１８日 昭和５９年特許願第１５０８１２号 ２ 発明の名称 α−アミラーゼ活性測定法および測定用試薬 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人
を示す。・印はＧＮＰ、○印はＰＮＰ、−はＭＥＳバッ
ファー、−一−ｒａトｖスバッファーを示す。 第２図はＧＮＰとＰＮＰの吸光度に与える温度の影響金
示す。・印はＣＮＰ％Ｏ印はＰＮＰ’に示す。 第３図は膵液、唾液由来のα−アミラーゼのｐＨ変化に
対する活性値変化を示す。・印は膵液白米α−アミラー
ゼ、○印は唾液由来のα−アミラーゼを示す。 第１図 ・ ；○−７０ルーｐ−ニトロフＬ１−ルＯ＋ｐ−ニト
ロフ田ノール ：ＹＥＳ Ｉくツ７アー 一−−；ｌ−リス バ・・１７７− 第２１！ｌ ト ：○−７０ル−ｐ−ニトロｈ１−ノし・ｏ−：ｐ−
ニトロ７ｒ：Ｉ−１し 第３ＩＩｌ 太目 Ｏヴ虻−，＃か氷メーアミラー゛ビ゛ 手 続 補 正 書（自発） 昭和５９年９月１８日 昭和５９年特許願第１５０８１２号 ２ 発明の名称 α−アミラーゼ活性測定法および測定用試薬 ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人
Claims (4)
- （１）ハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端
にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖に、試料
およびα−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼを無機酸のカルシウム塩および
／又はナトリウム塩および／または有機酸のカルシウム
塩および／又はナトリウム塩の存在下で作用させ、生成
するハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールを測定すること
により、試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを
特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。 - （２）ｐＨ６．６からｐＨ７．５までの緩衝液中で作用
させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のα
−アミラーゼ活性測定法。 - （３）ハロゲン化−ｐ−ニトロフェノールが還元性末端
にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、α−グ
ルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよびβ−グル
コシダーゼ、および無機酸のカルシウム塩および／又は
ナトリウム塩および／または有機酸のカルシウム塩およ
び／又はナトリウム塩を含有することを特徴とするα−
アミラーゼ活性測定用試薬。 - （４）ｐＨ６．６からｐＨ７．５までの緩衝液を含有す
ることを特徴とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15081284A JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15081284A JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6128400A true JPS6128400A (ja) | 1986-02-08 |
| JPS6365313B2 JPS6365313B2 (ja) | 1988-12-15 |
Family
ID=15504954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15081284A Granted JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6128400A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62278998A (ja) * | 1986-05-28 | 1987-12-03 | Toyobo Co Ltd | グリコシル化合物加水分解酵素活性測定試薬 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
| JPS5939300A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-03 | Wako Pure Chem Ind Ltd | α−アミラ−ゼ活性の測定方法 |
| JPS6062999A (ja) * | 1983-06-28 | 1985-04-11 | メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬 |
-
1984
- 1984-07-19 JP JP15081284A patent/JPS6128400A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
| JPS5939300A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-03 | Wako Pure Chem Ind Ltd | α−アミラ−ゼ活性の測定方法 |
| JPS6062999A (ja) * | 1983-06-28 | 1985-04-11 | メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62278998A (ja) * | 1986-05-28 | 1987-12-03 | Toyobo Co Ltd | グリコシル化合物加水分解酵素活性測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6365313B2 (ja) | 1988-12-15 |
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