JPH0542276B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な基質、即ちオリゴサツカライ
ド誘導体を基質として使用することを特徴とする
α−アミラーゼ活性測定法に関する。 ［従来の技術］ α−アミラーゼは澱粉、及びグルコースの比較
的低分子の重合体、及びオリゴマー中のグルコー
ス単位間のα−１，４−結合を加水分解する酵素
である。この酵素は人体中では主として膵臓、及
び唾液腺中で産生され、又古くから各種の疾患と
の関連が研究された酵素である。最近、各種の合
成基質による酵素活性の測定も注目されており、
各種の測定法が数多く発表され、又各種の測定用
キツトも多数発売されている。 従来よりα−アミラーゼ活性測定方法について
は各種の方法論が知られている。例えば、ヨー
ド澱粉反応を利用し、有色の減退を測定するヨー
ド澱粉法は、キヤラウエイの方法に代表される
が、共存蛋白が澱粉とヨウ素の呈色を阻害するこ
と、或いは反応時間が短いため再現性が悪いこ
と、更にこの方法は自動分析機で行なわせること
が困難である等の問題点を有している。色素を
結合させた澱粉を基質とし、加水分解により遊離
した色素を測定する色素法は、いわゆるブルース
ターチ法に代表されるが、この方法は測定操作で
遠心操作を要するため煩雑であり、分析の自動化
には困難性を有している。澱粉溶液の還元性の
増加を測定する糖化法は、ソモジーの方法に代表
されるが、この方法は試料中のグルコースにより
正の誤差を生じ、又操作が煩雑である等の問題点
を有している。〔生物試料分析、Vol.7、No.２、25
〜44（1984）〕。 一方、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス等の一連のマルトオリゴ糖の基質として利用す
る方法〔特開昭50−56998号公報〕では、生成す
る糖は主としてマルトース、グルコース等であ
り、予め試料中の糖質を完全に消去しておかねば
ならないこと、又酵素反応で生成するグルコース
をグルコースオキシターゼ（GOD）、ペルオキシ
ダーゼ（POD）、クロモゲン系を用いて測定する
場合に、試料中のグルコースの影響を補正する必
要があると共に、多量のGODを必要とする。更
に、試料中に存在するアスコルビン酸やビリルビ
ン等の還元物質の影響をまぬがれない等々の問題
点を有している。 更に、修飾マルトオリゴ糖を用いた方法も各種
発表されている。例えば、ｐ−ニトロフエノール
の結合したマルトペンタオース、或いはマルトヘ
キサオースをα−アミラーゼの基質とし、α−ア
ミラーゼの作用によつて生成したｐ−ニトロフエ
ノールの結合したマルトオース、マルトトリオー
ス、グルコース等にα−グルコシダーゼを作用さ
せて生成するｐ−ニトロフエノールを測定する方
法〔特開昭57−53079号公報〕がある。この方法
は、ｐ−ニトロフエノールを410nｍの吸光度で
測定してその量を産出するのであるが、ｐ−ニト
ロフエノールの発色度は測定PHや測定温度の影響
を受け易いことと、410nｍ付近に吸収を示す試
料中のビリルビンの影響を受け易い。又、ハロゲ
ン化フエニル基が結合したマルトペンタオースを
α−アミラーゼの基質とし、α−アミラーゼを含
む試料を作用させた後、α−グルコシダーゼ、及
びβ−グルコシターゼを作用させて遊離するハロ
ゲン化フエノールを測定する方法〔特開昭56−
35998号公報〕がある。この方法は、遊離するハ
ロゲン化フエノールを例えば、４−アミノアンチ
ピリンと酸化縮合させ、生成する色素の呈色強度
を500nｍで測定するため、この波長域に光学的
な吸収を有する溶血血清中のヘモグロビンの影響
を受け易く、更に、この方法で尿を試料として尿
中のα−アミラーゼの測定を行なうと、尿中にし
ばしば認められるフエノール類似物質が呈色試薬
により発色するため、正誤差を与えるという問題
点を有している。 ［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者は、上記従来のα−アミラーゼ活性測
定法の問題点を解消すべく鋭意研究を重ねた結
果、ｐ−アミノフエノール基が還元性末端に結合
したマルトオリゴ糖を基質とて使用すれば、これ
らの問題点が克服されることを見出し、本発明を
完成するに到つた。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、α−アミラーゼを測定するに際し、
ｐ−アミノフエノール基が還元性末端に結合した
マルトオリゴ糖を基質とし、α−アミラーゼを含
有する試料を作用させた後、遊離するｐ−アミノ
フエノールを測定することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定法である。 本発明におけるマルトオリゴ糖とは、α−１，
４−グルコシド結合でグルコースが２〜10個程度
結合した糖類をいうが、特にマルトテトラオース
（G₄）、マルトペンタオース（G₅）、マルトヘキサ
オース（G₆）、マルトヘプタオース（G₇）がα−
アミラーゼ活性測定の基質として好ましい。 本発明において遊離するｐ−アミノフエノール
は公知の方法で測定する。例えば、ｐ−アミノフ
エノールはカプラーとしてフエノール系、ナフト
ール系化合物の中からフエノール、サリチル酸、
ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、２，３−キシ
レノール、２，５−キシレノール、１−ナフトー
ル、１−ナフトール−８−スルホン酸、１−ナフ
トール−４−スルホン酸、１−ナフトール−２−
スルホン酸、２−ナフトール−６−スルホン酸、
２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸等から選
択した化合物と酸化剤の存在下で、カツプリング
させ生成するインドフエノール色素を比色測定す
ることにより、α−アミラーゼ活性を求める。酸
化剤としては、、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、過
ヨウ素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、過硫
酸アンモニウム、フエリシアン化カリウム、過酸
化水素等を用いることができる。緩衝剤として
は、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチル
グルタル酸塩、及びトリス−（ヒドロキシメチル）
−アミノメタン等のグツド緩衝剤が用いられる。 本発明に用いるｐ−アミノフエニル基が還元性
末端に結合したマルトオリゴ糖は、市販のｐ−ニ
トロフエニル−α−マルトオリゴ糖を原料として
常法に従つて合成する。例えば、白金黒、又はラ
ネーニツケル等を触媒に用い、水素化還元を行な
い、ニトロ基をアミノ基に変換させることにより
合成できる〔ハウス最新有機合成反応、第二版、
p1〜37、1983年、廣川書店参照〕。 本発明方法では通常、測定用共役酵素としてα
−グルコシダーゼを作用させてｐ−アミノフエノ
ールを遊離させる。このα−グルコシダーゼは試
料中のα−アミラーゼと同時に作用させること
も、或いは基質のマルトオリゴ糖と試料中のα−
アミラーゼとの反応後、作用させることも可能で
ある。しかし、グルコースが２〜４個程度結合し
た基質を用いるときには、α−グルコシダーゼは
特に用いなくてもよい。 ［作用］ 本発明方法によれば、ｐ−アミノフエニル基が
還元性末端に結合したマルトオリゴ糖をα−アミ
ラーゼ活性測定法の基質として用いているため、
基質の構造、及び水解生成物の構造が明確であ
り、標準的測定法〔生物試料分析、Vol.7、No.２、
25〜44（1984）〕の基質の選択条件に適している。
又、アミラーゼの作用により基質から遊離するｐ
−アミノフエノールを測定することにより、試料
中の還元糖、還元物質等の影響がなく、従つて、
試料中にグルコースが多量に存在していても、グ
ルコースを除く前処理の必要がない。更に、尿を
試料とした測定のときしばしば問題となるフエノ
ール類似物質による妨害もまつたくないα−アミ
ラーゼ活性の測定法が可能になる。 以下、実施例により本発明を説明する。 参考例 ｐ−アミノフエニル−α−マルトオリゴ糖の合
成法 市販のｐ−ニトロフエノール−α−マルトオリ
ゴ糖200mgを100％メタノール20mlとアンモニア水
0.2mlに溶解し、２％白金黒40mgを加えて常圧室
温にて５時間水素化還元を行なう。反応終了後、
触媒を瀘過して瀘液を減圧濃縮して、エタノール
を加えて再び減圧濃縮することにより白色結晶
（粉末）のｐ−アミノフエニル−α−マルトオリ
ゴ糖を得る。収率はマルトテトラオース約60％、
マルトペンタオース約60％、マルトヘキサオース
約50％、マルトヘプタオース約50％である。これ
らの合成物は、薄層クロマトグラフイーにて単一
のスポツトを示した。 試験例 本発明法と従来法（４−アミノアンチピリンと
酸化縮合）の発色系における検体ブランクの比
較。 本発明法の試液の調整 試液−１ 50ｍＭリン酸一カリウム−水酸
化ナトリウム緩衝液（PH6.9） 試液−２ 0.2N水酸化カリウムに1.9ｍＭ
過ヨウ素酸カリウム、及び10ｍＭ ｐ−キシ
レノールを含有する溶液。 ｍＭ ｐ−キシレノールを含有する溶液。 従来法の試液の調整 試液−１ 3.5ｍM4−アミノアンチピリン
を含む50ｍＭパイプス（PIPES）緩衝液
（PH6.9） 試液−２ 10ｍＭ過ヨウ素酸カリウムを含
む133ｍＭホウ酸−水酸化カリウム緩衝液
（PH8.5） 操作法 10種類の尿試料を各々20μ分注し、前記
、及びの試液−１を各々１ml添加し、室温
で10分間放置後、前記、及びの試液−２を
各々２ml加えて撹拌し、発色させ、本発明法で
は600nｍにて、従来法では490nｍにて吸光度
を測定した。 結果

【表】 以上の結果より、本発明による方法を用いた
場合は、従来法に比べて検体ブランクの影響が
極めて少ない。この結果、本発明法では検体ブ
ランクをとる必要がなくなることが明らかにな
つた。 実施例 １ 測定試験 試液−１ 50ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、2.5ｍＭ ｐ−アミノフエ
ニル−α−マルトテトラオース、及び50×
10³U／α−グルコシターゼを含む50ｍＭ
リン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5） 試液−２ 100ｍＭ水酸化カリウムに1.9ｍ
Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム、及び10ｍＭ ｐ−
キシレノールを含有する溶液。 操作法 試液−１を１mlとり、これに血清試料0.02ml
を加え、37℃で15分間加温する。次いで試液−
２を２ml加えて撹拌し、室温５分間放置後、
600nｍにおける吸光度を測定する。この時の
試料の希釈度と吸光度変化の関係を第１図に示
す。 実施例 ２ 測定試液 試液−１ 50ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、２ｍＭ ｐ−アミノフエニ
ル−α−マルトペンタオース、及び50×
10³U／α−グルコシダーゼを含む50ｍＭ
リン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5） 試液−２ 実施例１の測定試液の試液−２
と同様。 操作法 実施例１の操作法と同様に行なう。この時の
試料の希釈度と吸光度変化を関係を第２図に示
す。 実施例 ３ 測定試液 試液−１ 実施例２の測定試液の試液−１
と同様。 試液−２ 実施例１の測定試液の試液−２
と同様。 操作法 760ソモジー単位／dlの尿を試料（健常者尿
10mlと唾液0.5mlを混合して調製）とし、実施
例１の操作法と同様に行なう。この時の試料の
希釈度と吸光度変化の関係を第３図に示す。 実施例 ４ 測定試液 試液−１ 50ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、２ｍＭ ｐ−アミノフエニ
ル−α−マルトヘキサオース、及び50×
10³U／α−グルコシターゼを含む50ｍＭ
リン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5） 試液−２ 実施例１の測定試液の試液−２
と同様。 操作法 実施例１の操作法と同様に行なう。この時の
試料の希釈度と吸光度変化を関係を第４図に示
す。 実施例 ５ 測定試液 試液−１ 50ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
塩化カルシウム、2.5ｍMp−アミノフエニル
−α−マルトヘプタオース、及び50×
10³U／α−グルコシダーゼを含む50ｍＭ
リン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5） 操作法 実施例１の操作法と同様に行なう。この時の
試料の希釈度と吸光度変化の関係を第５図に示
す。

【図面の簡単な説明】

第１図、及び第２図は、実施例１、及び２にお
ける血清試料の希釈度と吸光度変化との関係を示
す。第３図は、実施例３における尿試料の希釈度
と吸光度変化との関係を示す。第４図、及び第５
図は、実施例４、及び５における血清試料の希釈
度と吸光度との関係を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ｐ−アミノフエニル基が還元性末端に結合し
   たマルトオリゴ糖を基質とし、α−アミラーゼを
   含有する試料を作用させた後、遊離するｐ−アミ
   ノフエノールを測定すること特徴とするα−アミ
   ラーゼ活性測定法。