JPH0687798B2 - 体液中のカルシウム測定方法 - Google Patents
体液中のカルシウム測定方法Info
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- JPH0687798B2 JPH0687798B2 JP2001379A JP137990A JPH0687798B2 JP H0687798 B2 JPH0687798 B2 JP H0687798B2 JP 2001379 A JP2001379 A JP 2001379A JP 137990 A JP137990 A JP 137990A JP H0687798 B2 JPH0687798 B2 JP H0687798B2
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- reducing terminal
- chromogenic
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のカルシウム測定方法に関する。さらに
詳しくは、α−アミラーゼがカルシウムによって活性化
されることを利用した体液中のカルシウム量の測定方法
に関する。
詳しくは、α−アミラーゼがカルシウムによって活性化
されることを利用した体液中のカルシウム量の測定方法
に関する。
発明の背景 現在、病院の検査室において、種々の体液（血清、尿
等）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いら
れている。
等）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いら
れている。
カルシウムは生体内での細胞機能や、血液の凝固機能に
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。
例えば、低カルシウム血症としては、低タンパク血症、
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副
甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症
としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能
亢進症、腎不全等の疾患の可能性があり、これらの診断
に用いることができる。
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副
甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症
としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能
亢進症、腎不全等の疾患の可能性があり、これらの診断
に用いることができる。
しかしながら、従来の方法では正確かつ簡便にカルシウ
ム量を測定することができなかった。
ム量を測定することができなかった。
従来の技術およびその問題点 体液中のカルシウム測定法としては、以下の方法が知ら
れている。
れている。
（１）滴定法 （２）比色法 （３）原子吸光法 （４）炎光分析法 （５）電極法 （６）酵素法 （１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレートを用いて、化
学的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者
により測定値に差異が出るという欠点を有する。
学的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者
により測定値に差異が出るという欠点を有する。
（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−CPC（オルトーク
レゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法は、
８−ヒドロキシキノリンを添加し、Mg2+イオンの影響を
排除するもので、現在、病院検査室で最も汎用されてい
る。
レゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法は、
８−ヒドロキシキノリンを添加し、Mg2+イオンの影響を
排除するもので、現在、病院検査室で最も汎用されてい
る。
しかしながら、 1.8−ヒドロキシキノリンを加えてもなお数％程度のMg
2+イオンの影響があること、 2.温度、時間により吸光度が変化すること、 3.発色に至適pH範囲があること、 4.低濃度（カルシウム）で、測定値がマイナスになる領
域があること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。
2+イオンの影響があること、 2.温度、時間により吸光度が変化すること、 3.発色に至適pH範囲があること、 4.低濃度（カルシウム）で、測定値がマイナスになる領
域があること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。
（３）の原子吸光法は、機器が高価であり、熟練を要す
るとともに、検体を希釈する必要がある。
るとともに、検体を希釈する必要がある。
（４）の炎色分析法も、検体の希釈が必要であるととも
に、特異性、再現性にも問題がある。
に、特異性、再現性にも問題がある。
（５）の電極法は、機器が高価であるとともに、pHの影
響を受け、また機器の保守が煩雑である。
響を受け、また機器の保守が煩雑である。
（６）の酵素法には、ｉ）カルモジュリンを利用する方
法［特開昭62-36199号参照］、ii）ホスホリパーゼＤ、
コリンオキシダーゼを利用する方法がある［特開昭62-1
95297号参照］。
法［特開昭62-36199号参照］、ii）ホスホリパーゼＤ、
コリンオキシダーゼを利用する方法がある［特開昭62-1
95297号参照］。
ｉ）カルモジュリンを用いる方法は、特異性にはすぐれ
ているが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（100〜100
0倍）が必要となる。
ているが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（100〜100
0倍）が必要となる。
ii）ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼを用いる方
法は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要である
が、反応に時間がかかるため、連続して測定できないと
いう欠点を有している。
法は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要である
が、反応に時間がかかるため、連続して測定できないと
いう欠点を有している。
以上のように、いずれの測定法も欠点を有しており、満
足のいく測定法というものはなかった。
足のいく測定法というものはなかった。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、正確かつ簡便に測定できる、酵素を用い
るカルシウムの定量法を見い出すべく鋭意検討を重ねた
結果、α−アミラーゼの活性がカルシウムの量に比例し
て高められることを見い出した。
るカルシウムの定量法を見い出すべく鋭意検討を重ねた
結果、α−アミラーゼの活性がカルシウムの量に比例し
て高められることを見い出した。
種々の起源のα−アミラーゼはカルシウムと結合した活
性型として存在することが知られている（酵素ハンドブ
ック、田宮及び丸尾監修、朝倉書店、493頁）。しかし
ながら、その活性強度とカルシウムの濃度の間に直線的
な相関関係があることは全く知られておらず、これを利
用して体液中のカルシウムが測定できるということは、
今回本発明者らによって初めて見い出されたことであ
る。
性型として存在することが知られている（酵素ハンドブ
ック、田宮及び丸尾監修、朝倉書店、493頁）。しかし
ながら、その活性強度とカルシウムの濃度の間に直線的
な相関関係があることは全く知られておらず、これを利
用して体液中のカルシウムが測定できるということは、
今回本発明者らによって初めて見い出されたことであ
る。
しかしながら、検討を重ねるうちに、用いる基質の種類
によっては直線的な相関関係が得られなかったり、測定
範囲が狭かったりして実用に供せられない場合もあるこ
とが判明した。
によっては直線的な相関関係が得られなかったり、測定
範囲が狭かったりして実用に供せられない場合もあるこ
とが判明した。
そこで、本発明者らはさらに検討を加え、 （１）カルシウムに、より特異的なキレート剤の存在下
に酵素反応を行なうこと、および／または （２）基質として、その還元末端グルコースに発色源基
を有さないマルトオリゴ糖類と、発色源基を有するマル
トオリゴ糖類を組合せて用いて酵素反応を行なうことに
より、これらの欠点が解決されることを見い出し、本発
明を完成した。
に酵素反応を行なうこと、および／または （２）基質として、その還元末端グルコースに発色源基
を有さないマルトオリゴ糖類と、発色源基を有するマル
トオリゴ糖類を組合せて用いて酵素反応を行なうことに
より、これらの欠点が解決されることを見い出し、本発
明を完成した。
キレート剤存在下でα−アミラーゼは酵素自身が有する
カルシウムの大部分を放出し、不活性型のα−アミラー
ゼに変化することは以前から知られている［Eur.J.Bioc
hem.,41,171（1974）参照のこと］が、キレート剤存在
下で初めてカルシウムを定量的に測定することができる
ようになったり、また測定範囲が広がるという事実は、
今回初めて見い出されたことであり、また先の公知事実
からはまったく予測されないことである。
カルシウムの大部分を放出し、不活性型のα−アミラー
ゼに変化することは以前から知られている［Eur.J.Bioc
hem.,41,171（1974）参照のこと］が、キレート剤存在
下で初めてカルシウムを定量的に測定することができる
ようになったり、また測定範囲が広がるという事実は、
今回初めて見い出されたことであり、また先の公知事実
からはまったく予測されないことである。
さらに、（２）で示した２種類の基質を用いることによ
っても同様の効果が得られるという事実も今回初めて見
い出されたことであり、従来技術からは予測されないこ
とである。
っても同様の効果が得られるという事実も今回初めて見
い出されたことであり、従来技術からは予測されないこ
とである。
発明の構成 従って、本発明は検体に、α−アミラーゼと、α−アミ
ラーゼの基質として （１）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖、または （２）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つ非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリ
ゴ糖、または （３）（ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコ
ースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれ
る基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに発色源基
が結合し、かつ非還元末端グルコースに置換基が結合し
たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合わせて用い、
グリコールエーテルジアミン四酢酸、1,2−ビス（ｏ−
アミノフェノキシ）エタン四酢酸、エチレンジアミン四
酢酸およびトランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン四
酢酸より選ばれるキレート剤を、単独あるいはそれらの
混合物として、最終濃度0.1〜10mmol/lの存在下で作用
させることを特徴とする体液中のカルシウム測定方法に
関する。
ラーゼの基質として （１）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖、または （２）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つ非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリ
ゴ糖、または （３）（ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコ
ースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれ
る基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに発色源基
が結合し、かつ非還元末端グルコースに置換基が結合し
たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合わせて用い、
グリコールエーテルジアミン四酢酸、1,2−ビス（ｏ−
アミノフェノキシ）エタン四酢酸、エチレンジアミン四
酢酸およびトランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン四
酢酸より選ばれるキレート剤を、単独あるいはそれらの
混合物として、最終濃度0.1〜10mmol/lの存在下で作用
させることを特徴とする体液中のカルシウム測定方法に
関する。
本発明に用いるα−アミラーゼは、微生物、植物または
動物のうちのいずれを起源とするものでもよいが、好ま
しくは動物起源のものであり、例えば市販のブタ膵由来
のα−アミラーゼが用いられる。α−アミラーゼは1000
〜1000000U/l、より好ましくは5000〜500000U/lの濃度
で用いられる。
動物のうちのいずれを起源とするものでもよいが、好ま
しくは動物起源のものであり、例えば市販のブタ膵由来
のα−アミラーゼが用いられる。α−アミラーゼは1000
〜1000000U/l、より好ましくは5000〜500000U/lの濃度
で用いられる。
本発明に用いるα−アミラーゼの基質としては、デンプ
ンおよびグリコーゲン等の多糖類およびマルトオリゴ糖
類が挙げられるが、測定の簡素化、測定時間の短縮化な
どの点からマルトオリゴ糖類が有利である。
ンおよびグリコーゲン等の多糖類およびマルトオリゴ糖
類が挙げられるが、測定の簡素化、測定時間の短縮化な
どの点からマルトオリゴ糖類が有利である。
そのようなマルトオリゴ糖類としては、（１）マルトオ
リゴ糖、例えばマルトペンタオーズ、マルトヘプタオー
ズ、（２）その還元末端グルコースに非発色源基が結合
したマルトオリゴ糖、例えば2,4−ジクロロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシド、2,4−ジクロロフェニル−
（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、2,4−ジク
ロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド、（３）その還元末端グルコースに発色源基が結合し
たマルトオリゴ糖、例えば４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル−（αまたは
β）−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル−
（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２
−クロロ−４−ニトロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−
マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル
−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、および
（４）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つその非還元末端グルコースに置換基が結合したマルト
オリゴ糖、例えば３−ケトブチリデン−２−クロロ−４
−ニトロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタ
オシド、エチリデン−４−ニトロフェニル−（αまたは
β）−Ｄ−マルトヘプタオシド、ベンジル−４−ニトロ
フェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、
ベンジリデン−４−ニトロフェニル−（αまたはβ）−
Ｄ−マルトペンタオシド等が挙げられる。
リゴ糖、例えばマルトペンタオーズ、マルトヘプタオー
ズ、（２）その還元末端グルコースに非発色源基が結合
したマルトオリゴ糖、例えば2,4−ジクロロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシド、2,4−ジクロロフェニル−
（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、2,4−ジク
ロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド、（３）その還元末端グルコースに発色源基が結合し
たマルトオリゴ糖、例えば４−ニトロフェニル−α−Ｄ
−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル−（αまたは
β）−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル−
（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２
−クロロ−４−ニトロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−
マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル
−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、および
（４）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つその非還元末端グルコースに置換基が結合したマルト
オリゴ糖、例えば３−ケトブチリデン−２−クロロ−４
−ニトロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタ
オシド、エチリデン−４−ニトロフェニル−（αまたは
β）−Ｄ−マルトヘプタオシド、ベンジル−４−ニトロ
フェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、
ベンジリデン−４−ニトロフェニル−（αまたはβ）−
Ｄ−マルトペンタオシド等が挙げられる。
さらに、（５）（ａ）前記したマルトオリゴ糖およびそ
の還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルゴオ
リゴ糖から選ばれる基質と、（ｂ）前記した、その還元
末端グルコースに発色源基が結合したマルゴオリゴ糖お
よびその還元末端グルコースに発色源基が結合し、かつ
非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリゴ
糖から選ばれる基質を組合せて用いることができる。
の還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルゴオ
リゴ糖から選ばれる基質と、（ｂ）前記した、その還元
末端グルコースに発色源基が結合したマルゴオリゴ糖お
よびその還元末端グルコースに発色源基が結合し、かつ
非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリゴ
糖から選ばれる基質を組合せて用いることができる。
上記の（１）〜（４）で示される基質を単独で用いる場
合の好ましい濃度は、0.1〜50mmole/lの範囲である。ま
た（５）で示されるように組合せて用いる場合には、発
色源基を有さないマルトオリゴ糖と発色源基を有するマ
ルトオリゴ糖は、それぞれ0.1〜50mmole/lの濃度で、10
0:1〜1:1の比で加えるのが好ましい。
合の好ましい濃度は、0.1〜50mmole/lの範囲である。ま
た（５）で示されるように組合せて用いる場合には、発
色源基を有さないマルトオリゴ糖と発色源基を有するマ
ルトオリゴ糖は、それぞれ0.1〜50mmole/lの濃度で、10
0:1〜1:1の比で加えるのが好ましい。
組合わせて使用することにより、基質に対する競合性の
ため、検体中にカルシウムが存在しない場合の反応（も
ともと酵素自身がカルシウムを有するので、基質さえあ
れば検体中にカルシウムが存在しなくても酵素は活性化
され反応は進む。これをブランク反応という。）が抑制
され、測定が可能となったり、測定範囲が広くなるもの
と考えられる。
ため、検体中にカルシウムが存在しない場合の反応（も
ともと酵素自身がカルシウムを有するので、基質さえあ
れば検体中にカルシウムが存在しなくても酵素は活性化
され反応は進む。これをブランク反応という。）が抑制
され、測定が可能となったり、測定範囲が広くなるもの
と考えられる。
より好ましいα−アミラーゼの基質としては、前記
（３）、（４）または（５）で示される基質群であり、
より具体的には４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
マルトペンタオシド、３−ケトブチリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、
またはマルトペンタオーズと２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの組合せ、または
2,4−ジクロロフエニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド
と２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシドの組合せが挙げられる。一般に、前記（４）
で示される基質群はブランク値の経時的変化が小さい。
（３）、（４）または（５）で示される基質群であり、
より具体的には４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
マルトペンタオシド、３−ケトブチリデン−２−クロロ
−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、
またはマルトペンタオーズと２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの組合せ、または
2,4−ジクロロフエニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド
と２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシドの組合せが挙げられる。一般に、前記（４）
で示される基質群はブランク値の経時的変化が小さい。
カルシウムに、より特異的なキレート剤としては、グル
コールエーテルジアミン四酢酸、1,2−ビス（ｏ−アミ
ノフェノキシ）エタン四酢酸、エチレンジアミン四酢
酸、トランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン四酢酸
（以下、それぞれGEDTA、BAPTA、EDTAおよびCyDTAと略
記される。）等が挙げられる。これらのキレート剤は単
独で、あるいは数種類を混合して用いることができる。
キレート剤は0.05〜20mmol/l（最終濃度で0.1〜10mmol/
l）の濃度で加えるのが好ましい。
コールエーテルジアミン四酢酸、1,2−ビス（ｏ−アミ
ノフェノキシ）エタン四酢酸、エチレンジアミン四酢
酸、トランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン四酢酸
（以下、それぞれGEDTA、BAPTA、EDTAおよびCyDTAと略
記される。）等が挙げられる。これらのキレート剤は単
独で、あるいは数種類を混合して用いることができる。
キレート剤は0.05〜20mmol/l（最終濃度で0.1〜10mmol/
l）の濃度で加えるのが好ましい。
キレート剤存在下では、酵素活性を増大させるカルシウ
ム（α−アミラーゼ中および検体中に存在する。）がキ
レート剤によって食われてしまうため、検体中のカルシ
ウム濃度が実際には高い場合であっても、酵素活性は低
く抑えられ、測定が可能となり、また測定範囲が広くな
ると考えられる。
ム（α−アミラーゼ中および検体中に存在する。）がキ
レート剤によって食われてしまうため、検体中のカルシ
ウム濃度が実際には高い場合であっても、酵素活性は低
く抑えられ、測定が可能となり、また測定範囲が広くな
ると考えられる。
キレート剤と結合するカルシウムと結合しないカルシウ
ムの間には平衡関係が成立しており、検体中のカルシウ
ム濃度に応じて酵素活性が低下し、両者の間は直接関係
となる。さらに好都合なことには、カルシウムに、より
特異的なキレート剤を用いるので検体中に存在する他の
金属イオン、とりわけマグネシウムの影響を受けずに測
定ができる点である。
ムの間には平衡関係が成立しており、検体中のカルシウ
ム濃度に応じて酵素活性が低下し、両者の間は直接関係
となる。さらに好都合なことには、カルシウムに、より
特異的なキレート剤を用いるので検体中に存在する他の
金属イオン、とりわけマグネシウムの影響を受けずに測
定ができる点である。
なお、（５）で示されるように２種類の基質群を組合せ
た場合には、キレート剤の存在下あるいは不存在下のい
ずれでも十分に広い測定範囲を得ることが可能である。
た場合には、キレート剤の存在下あるいは不存在下のい
ずれでも十分に広い測定範囲を得ることが可能である。
本発明における検出系は、通常のα−アミラーゼ活性測
定法のそれが用いられる。例えば、α−アミラーゼの基
質として多糖類の一種であるデンプンを用いた場合に
は、生成した還元糖量を公知の方法、例えばソモジー
（Somogyi）法を用いて検量するか、またはブルスター
チを用いて生成される色素によって検量することができ
る。
定法のそれが用いられる。例えば、α−アミラーゼの基
質として多糖類の一種であるデンプンを用いた場合に
は、生成した還元糖量を公知の方法、例えばソモジー
（Somogyi）法を用いて検量するか、またはブルスター
チを用いて生成される色素によって検量することができ
る。
基質として前記のマルトオリゴ糖類のうち（１）を用い
た場合には、α−グルコシダーゼを共役させ、生成した
グルコースをグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系あるいはヘキソキナーゼ／ホスフォグルコム
ターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ/NADH系へ導くことにより検出することができる。ま
た基質として上記のマルトオリゴ糖類のうち（２）を用
いた場合には、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−
グルコシダーゼを共役させるか、または該酵素を共役さ
せることなく反応させ、生じた非発色源を発色系へ導く
ことにより検量することができる。更に基質として上記
のマルトオリゴ糖類のうち（３）または（４）を用いた
場合には、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼお
よびグルコアミラーゼを適宜組み合わせて共役させる
か、または該酵素を共役させることなく反応させ、生じ
た発色源、例えば４−ニトロフェノールまたは２−クロ
ロ−４−ニトロフェノールを直接比色することにより検
量することができる。（１）〜（４）のいずれの場合も
基質として三炭糖を用いた場合には共役酵素は不要であ
り、四炭糖から七炭糖を用いた場合には該酵素が必要と
なる。
た場合には、α−グルコシダーゼを共役させ、生成した
グルコースをグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系あるいはヘキソキナーゼ／ホスフォグルコム
ターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ/NADH系へ導くことにより検出することができる。ま
た基質として上記のマルトオリゴ糖類のうち（２）を用
いた場合には、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−
グルコシダーゼを共役させるか、または該酵素を共役さ
せることなく反応させ、生じた非発色源を発色系へ導く
ことにより検量することができる。更に基質として上記
のマルトオリゴ糖類のうち（３）または（４）を用いた
場合には、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼお
よびグルコアミラーゼを適宜組み合わせて共役させる
か、または該酵素を共役させることなく反応させ、生じ
た発色源、例えば４−ニトロフェノールまたは２−クロ
ロ−４−ニトロフェノールを直接比色することにより検
量することができる。（１）〜（４）のいずれの場合も
基質として三炭糖を用いた場合には共役酵素は不要であ
り、四炭糖から七炭糖を用いた場合には該酵素が必要と
なる。
前記のマルトオリゴ糖類のうち、（５）で示されるよう
に２種類の基質を組合せて用いた場合には、α−グルコ
シダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼを共役させ
るか、または該酵素を共役させることなく反応させ、
（ｂ）群の基質より生じた発色源を直接比色することに
より検量することができる。
に２種類の基質を組合せて用いた場合には、α−グルコ
シダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼを共役させ
るか、または該酵素を共役させることなく反応させ、
（ｂ）群の基質より生じた発色源を直接比色することに
より検量することができる。
本発明による測定は、pH5〜８を維持できるような緩衝
液中で行なわれる。そのような緩衝液はよく知られてお
り、例えばグッド緩衝液［例えば、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（以
下、HEPESと略記する。）、ピペラジン−N,N′−ビス
（２−エタンスルホン酸）（以下、PIPESと略記す
る。）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（以下、HEPP
SOと略記する。）等］、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液等が挙げられる。緩衝液は10〜500mmole/lの濃度で加
えるのが好ましい。
液中で行なわれる。そのような緩衝液はよく知られてお
り、例えばグッド緩衝液［例えば、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（以
下、HEPESと略記する。）、ピペラジン−N,N′−ビス
（２−エタンスルホン酸）（以下、PIPESと略記す
る。）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（以下、HEPP
SOと略記する。）等］、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液等が挙げられる。緩衝液は10〜500mmole/lの濃度で加
えるのが好ましい。
さらに本発明の測定系には、アルカリ金属のハロゲン化
物、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリ
ウム、ヨウ化ナトリウムを１〜400mmole/lの濃度で加え
ることが好ましい。
物、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリ
ウム、ヨウ化ナトリウムを１〜400mmole/lの濃度で加え
ることが好ましい。
本発明の方法による測定は用手法はもちろんのこと、通
常の生化学検査用自動分析器によっても行なうことがで
きる。
常の生化学検査用自動分析器によっても行なうことがで
きる。
実施例 以下の実施例および参考例により本発明を詳述するが、
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
参考例：［基質として発色源基を有するマルトオリゴ糖
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
たα−アミラーゼによるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
たα−アミラーゼによるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
ブタ膵α−アミラーゼ 8000U/l×100μｌ α−グルコシダーゼ 250000U/l×100μｌ β−グルコシダーゼ 20000U/l×100μｌ 2,4−ジクロロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド 20mmole/l×100μｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペン
タオシド 2mmole/l×100μｌ PIPES緩衝液（pH6.8） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液に、カルシウム濃度０〜10mg/d
l相当の酢酸カルシウム水溶液を20μｌ添加し、37℃で
反応させた後、400nm（37℃）での吸光度増加を経時的
に測定し、各々の反応速度を出した。得られた検量線を
第１図に示す。
タオシド 2mmole/l×100μｌ PIPES緩衝液（pH6.8） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液に、カルシウム濃度０〜10mg/d
l相当の酢酸カルシウム水溶液を20μｌ添加し、37℃で
反応させた後、400nm（37℃）での吸光度増加を経時的
に測定し、各々の反応速度を出した。得られた検量線を
第１図に示す。
図から分るように、検量線はカルシウム濃度7.5mg/dlま
で直線性を示した。
で直線性を示した。
実施例1:［基質として発色源基を有するマルトオリゴ糖
を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼに
よるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼに
よるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
ブタ膵α−アミラーゼ 8000U/l×100μｌ α−グルコシダーゼ 250000U/l×100μｌ β−グルコシダーゼ 20000U/l×100μｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペン
タオシド 20mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
測定を行なった。得られた検量線を第２図に示す。
タオシド 20mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
測定を行なった。得られた検量線を第２図に示す。
図から分るように、検量線はカルシウム濃度10mg/dlま
で直線性を示した。
で直線性を示した。
実施例2:［基質として発色源基を有するマルトオリゴ糖
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
た、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼによるカ
ルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
た、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼによるカ
ルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
ブタ膵α−アミラーゼ 8000U/l×100μｌ α−グルコシダーゼ 250000U/l×100μｌ β−グルコシダーゼ 20000U/l×100μｌ マルトペンタオーズ 20mmole/l×100μｌ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペン
タオシド 2mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 180μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
（ただし、カルシウム濃度０〜30mg/dl相当の酢酸カル
シウム水溶液を用いた。）測定を行なった。得られた検
量線を第３図に示す。
タオシド 2mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 180μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
（ただし、カルシウム濃度０〜30mg/dl相当の酢酸カル
シウム水溶液を用いた。）測定を行なった。得られた検
量線を第３図に示す。
図から分るように、検量線はカルシウム濃度30mg/dlま
でほぼ直線性を示した。
でほぼ直線性を示した。
実施例3:［基質として発色源基を有するマルトオリゴ糖
を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼに
よるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼに
よるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
ブタ膵α−アミラーゼ 200000U/l×100μｌ ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド 5mmole/l×100μｌ BAPTA 1mmole/l×100μｌ GEDTA 1.75mmole/l×100μｌ HEPPSO緩衝液（pH8.0） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 390μｌ 計 990μｌ 上記で得られた試薬溶液に、カルシウム濃度０〜50mg/d
l相当の酢酸カルシウム水溶液を10μｌ添加し、37℃で
反応させた後、400nm（37℃）での吸光度増加を経時的
に測定し、各々の反応速度を出した。得られた検量線を
第４図に示す。
l相当の酢酸カルシウム水溶液を10μｌ添加し、37℃で
反応させた後、400nm（37℃）での吸光度増加を経時的
に測定し、各々の反応速度を出した。得られた検量線を
第４図に示す。
図から分るように、検量線はカルシウム濃度50mg/dlま
で直線性を示した。
で直線性を示した。
実施例6:［基質として、その還元末端グルコースに発色
源基が結合し、かつその非還元末端グルコースに置換基
が結合したマルトオリゴ糖を用いた、キレート剤存在下
におけるα−アミラーゼによるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
源基が結合し、かつその非還元末端グルコースに置換基
が結合したマルトオリゴ糖を用いた、キレート剤存在下
におけるα−アミラーゼによるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。
ブタ膵α−アミラーゼ 8000U/l×100μｌ α−グルコシダーゼ 250000U/l×100μｌ β−グルコシダーゼ 20000U/l×100μｌ ３−ケトブチリデン−２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β−Ｄ−マルトペンタオシド 20mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
（ただし、カルシウム濃度０〜100mg/dl相当の酢酸カル
シウム水溶液を用いた。）測定を行なった。得られた検
量線を第５図に示す。
−β−Ｄ−マルトペンタオシド 20mmole/l×100μｌ BAPTA 20mmole/l×100μｌ リン酸緩衝液（pH6.5） 500mmole/l×100μｌ 塩化ナトリウム 500mmole/l×100μｌ 精製水 280μｌ 計 980μｌ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
（ただし、カルシウム濃度０〜100mg/dl相当の酢酸カル
シウム水溶液を用いた。）測定を行なった。得られた検
量線を第５図に示す。
図から分るように、検量線はカルシウム濃度100mg/dlま
で直線性を示した。
で直線性を示した。
比較例1:［本発明方法とｏ−CPC法（従来法）における
マグネシウムの影響］ 検体として、血清900μｌとマグネシウム濃度０〜100mg
/dlに相当する酢酸マグネシウム溶液100μｌの混合液を
用いて、実施例３に記載の方法によりカルシウムの測定
を行なった。
マグネシウムの影響］ 検体として、血清900μｌとマグネシウム濃度０〜100mg
/dlに相当する酢酸マグネシウム溶液100μｌの混合液を
用いて、実施例３に記載の方法によりカルシウムの測定
を行なった。
一方、ｏ−CPC法の測定キット［CalciumII-HA Test Wak
o（和光純薬社製）］を用いて自動分析器（日立705型）
で同一の検体のカルシウムを測定した。ふたつの測定方
法におけるマグネシウムの影響を第６図に示す。
o（和光純薬社製）］を用いて自動分析器（日立705型）
で同一の検体のカルシウムを測定した。ふたつの測定方
法におけるマグネシウムの影響を第６図に示す。
図から分るように、本発明方法では検体中のマグネシウ
ムの影響をほとんど受けずに測定できているが、ｏ−CP
C法ではマグネシウムの影響を抑える工夫がしてあるに
もかかわらず、かなりの影響を受けている。
ムの影響をほとんど受けずに測定できているが、ｏ−CP
C法ではマグネシウムの影響を抑える工夫がしてあるに
もかかわらず、かなりの影響を受けている。
比較例2:［本発明方法による測定値とｏ−CPC法（従来
法）による測定値との相関関係］ 血清検体25例につき、実施例３に記載の方法とｏ−CPC
法（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によっ
てカルシウム量を測定した。両者の相関関係を第７図に
示す。
法）による測定値との相関関係］ 血清検体25例につき、実施例３に記載の方法とｏ−CPC
法（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によっ
てカルシウム量を測定した。両者の相関関係を第７図に
示す。
図から分るように、相関の回帰直線はｎ＝25、ｒ＝0.94
4、ｙ＝0.985 x＋1.552となり、両者は良好な相関を示
した。このことから、本発明方法は日常検査用として十
分利用できることが分る。
4、ｙ＝0.985 x＋1.552となり、両者は良好な相関を示
した。このことから、本発明方法は日常検査用として十
分利用できることが分る。
比較例3:［本発明方法による測定値とｏ−CPC法（従来
法）による測定値との相関関係］ 血清検体36例につき、実施例４に記載の方法とｏ−CPC
法（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によっ
てカルシウム量を測定した。両者の相関関係を第８図に
示す。
法）による測定値との相関関係］ 血清検体36例につき、実施例４に記載の方法とｏ−CPC
法（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によっ
てカルシウム量を測定した。両者の相関関係を第８図に
示す。
図から分るように、相関の回帰直線はｎ＝36、ｒ＝0.92
3、ｙ＝1.017 x＋0.102となり、両者は良好な相関を示
した。このことから、本発明方法は日常検査用として十
分利用できることが分る。
3、ｙ＝1.017 x＋0.102となり、両者は良好な相関を示
した。このことから、本発明方法は日常検査用として十
分利用できることが分る。
比較例4:［本発明方法による測定値とｏ−CPC法（従来
法）による測定値との相関関係］ 尿検体40例につき、実施例４に記載の方法とｏ−CPC法
（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によって
カルシウム量を測定した。両者の相関関係を第９図に示
す。
法）による測定値との相関関係］ 尿検体40例につき、実施例４に記載の方法とｏ−CPC法
（比較例１に記載の測定用キットを用いた。）によって
カルシウム量を測定した。両者の相関関係を第９図に示
す。
図から分るように、相関の回帰直線はｎ＝40、ｒ＝0.99
4、ｙ＝0.845 x＋0.32となり、両者は良好な相関を示し
た。このことから、本発明方法は日常検査用として十分
利用できることが分る。
4、ｙ＝0.845 x＋0.32となり、両者は良好な相関を示し
た。このことから、本発明方法は日常検査用として十分
利用できることが分る。
発明の効果 本発明は、酵素を用いた方法であるため、他の方法に比
し特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて
長い反応時間を必要としない、正確かつ簡便なカルシウ
ムの測定方法である。
し特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて
長い反応時間を必要としない、正確かつ簡便なカルシウ
ムの測定方法である。
第１図は、基質として発色源基を有するマルトオリゴ糖
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
たα−アミラーゼによるカルシウム測定の検量線を示
し、第２図、第３図、第４図および第５図は本発明方法
によるカルシウム想定の検量線を示し、第６図は本発明
方法とｏ−CPC法（従来法）における検体中のマグネシ
ウムの影響を比較したグラフであり、第７図、第８図お
よび第９図は本発明方法による測定値とｏ−CPC法（従
来法）による測定値との相関関係を示すグラフである。
と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて用い
たα−アミラーゼによるカルシウム測定の検量線を示
し、第２図、第３図、第４図および第５図は本発明方法
によるカルシウム想定の検量線を示し、第６図は本発明
方法とｏ−CPC法（従来法）における検体中のマグネシ
ウムの影響を比較したグラフであり、第７図、第８図お
よび第９図は本発明方法による測定値とｏ−CPC法（従
来法）による測定値との相関関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−126497（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】検体に、α−アミラーゼと、α−アミラー
ゼの基質として （１）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖、または （２）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つ非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリ
ゴ糖、または （３）（ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコ
ースに非発色源基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれ
る基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに発色源基
が結合し、かつ非還元末端グルコースに置換基が結合し
たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合わせて用い、
グリコールエーテルジアミン四酢酸、1,2−ビス（ｏ−
アミノフェノキシ）エタン四酢酸、エチレンジアミン四
酢酸およびトランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン四
酢酸より選ばれるキレート剤を、単独あるいはそれらの
混合物として、最終濃度0.1〜10mmol/lの存在下で作用
させることを特徴とする体液中のカルシウム測定方法。 - 【請求項２】α−アミラーゼの基質が、 （１）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖、または （２）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つ非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリ
ゴ糖であることを特徴とする請求項第１項記載の測定方
法。 - 【請求項３】α−アミラーゼの基質として （ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに
非発色源基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれる基質
と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに発色源基
が結合し、かつ非還元末端グルコースに置換基が結合し
たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合わせて加える
ことを特徴とする請求項第１項記載の測定方法。 - 【請求項４】キレート剤がグリコールエーテルジアミン
四酢酸または1,2−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタ
ン四酢酸またはそれらの混合物であることを特徴とする
請求項第２項または第３項記載の測定方法。 - 【請求項５】α−アミラーゼの基質として、 （１）４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、 （２）２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マル
トペンタオシド、 （３）３−ケトブチリデン−２−クロロ−４−ニトロフ
ニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、または （４）マルトペンタオーズと２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドを組合せて用いる
ことを特徴とする請求項第１項記載の測定方法。 - 【請求項６】還元末端グルコースに発色源基が結合した
マルトオリゴ糖が、２−クロロ−４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシドであることを特徴とする請求
項第４項記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001379A JPH0687798B2 (ja) | 1989-01-09 | 1990-01-08 | 体液中のカルシウム測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-2571 | 1989-01-09 | ||
| JP257189 | 1989-01-09 | ||
| JP2001379A JPH0687798B2 (ja) | 1989-01-09 | 1990-01-08 | 体液中のカルシウム測定方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6119574A Division JP2699147B2 (ja) | 1989-01-09 | 1994-05-09 | 体液中のカルシウム測定方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3087891B2 (ja) * | 1998-03-31 | 2000-09-11 | 東洋紡績株式会社 | 電解質測定用試薬組成物 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0612999B2 (ja) * | 1986-11-17 | 1994-02-23 | 関東化学株式会社 | 塩素イオン定量用試薬 |
-
1990
- 1990-01-08 JP JP2001379A patent/JPH0687798B2/ja not_active Expired - Fee Related
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