JPS6365313B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(産業上の利用分野)
本発明はα−アミラーゼ活性測定法および測定
用試薬に関するものである。 (従来の技術) 最近、ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基
質として、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えば
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースなどが使用される様になりつつあ
る。これらのうち代表例としてマルトペンタオー
スを基質として使用する場合をとりあげて説明す
ると、測定様式は次の様に表わすことができる。 (1) マルトペンタオースアミラーゼ ―――――→
マルトース+マルトトリオース。 (2) マルトース+マルトトリオース
α−グルコシダーゼ ―――――――――――→グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例
えばグルコースオキシダーゼ/パーオキシダー
ゼ/色素系、もしくはヘキソキナーゼ/ホスフオ
グルコムターゼ/グルコース−6−ホスフエート
デヒドログナーゼ/NADH系等で測定される。 ところがこの測定系は、グルコースを中間体と
するため、体液中の内因性グルコースの影響を受
けるという欠点があり、精度の高いα−アミラー
ゼ活性値が得られない。 他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフエニル
基、ナフチル基或はそれらの類似体を結合した基
質が合成され、次の様なものを基質とするアミラ
ーゼ測定試薬が提案されている。 p−ニトロフエニルマルトペンタオサイド (特公昭57−53079号公報) p−ニトロフエニルマルトヘキサオサイド (特公昭57−53079号公報) p−ニトロフエニルマルトヘプタオサイド (特開昭54−51892号公報) これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活
性の測定様式を例示すると、次の様になる。 p−ニトロフエニル−α−マルトペンタサイドの
場合 (1) p−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イドα−アミラーゼ ――――――――→p−ニトロフエニル−α−
マルトサイド+マルトトリオース (2) p−ニトロフエニル−α−マルトサイド+マ
ルトトリオースα−グルコシダーゼ ―――――――――――→p−ニト
ロフエノール+グルコース ここに遊離したp−ニトロフエノールの変化量
α−アミラーゼ活性は測定される。この系は内因
性のグルコースの影響は受けないが、遊離基であ
るp−ニトロフエノールが若干のPH変化、温度変
化で分子吸光係数が大きく変化したり、α−アミ
ラーゼの活性測定或(α−アミラーゼの至適PHは
6.6〜7.5に存在する)で十分な測定感度が得られ
ないという欠点があつた。また基質のグルコース
鎖に関しては、マルトテトラオース以下の低分子
オリゴ糖であるとα−アミラーゼの作用性が悪
く、また追随酵素であるα−グルコシダーゼの作
用を受けブランク値が上昇する。マルトヘキサオ
ース以上の高分子オリゴ糖であるとα−アミラー
ゼの切断部位が増加したり、一次水解生成物に再
度α−アミラーゼが作用し二次水解生成物を生じ
たりして、α−アミラーゼの活性を正確に測定で
きない等の問題点があつた。 そこで本発明者等は、基質としてα−および/
またはβ−o−クロル−p−ニトロフエニルマル
トペンタオサイドを使用することによりこれらの
問題点を解決し既に提案した(特願昭58−111296
号)。遊離基のo−クロル−p−ニトロフエノー
ルはPH変化、温度変化に非常に安定であり、分子
吸光係数の変化が著しく小さく、PH6.6からPH7.5
で十分な測定感度が得られる。また糖鎖をマルト
ペンタオースにすることによりα−アミラーゼの
切断部位が限定され、一次水解生成物へのα−ア
ミラーゼの作用もなく、正確なα−アミラーゼ活
性を得ることに成功した。 これらの特徴を有するα−および/またはβ−
o−クロル−p−ニトロフエニルマルトペンタオ
サイドを基質として、α−アミラーゼ活性の至適
条件、PH6.6からPH7.5で測定する場合、遊離基で
あるo−クロル−p−ニトロフエノールが高感度
化合物(分子吸光係数が大きい)のため、測定の
精度が向上し、試料の少量化も可能になつた。 (発明が解決しようとする問題点) 試料の少量化により、試料中の他成分が測定系
に与える影響は小さくなつたが、試料の測定液中
での濃度が薄くなり、α−アミラーゼが測定液中
で失活して正確な測定値が得られないという新た
な問題点が生じた。 (問題点を解決するための手段) そこで本発明者等はこれらの問題点を解決する
ため種々研究した結果、ハロゲン化−p−ニトロ
フエニルマルトサイドを基質として含んだ測定液
を使用して、試料中のα−アミラーゼを測定する
場合、無機酸または有機酸のカルシウム塩およ
び/またはナトリウム塩を共存させることによ
り、測定液中のα−アミラーゼが賦活化され、試
料の測定液中での濃度が薄くてもα−アミラーゼ
活性の正確な測定値を得ることに成功した。 すなわち本発明はハロゲン化−p−ニトロフエ
ノールが還元性末端にα−結合またはβ−結合し
たマルトオリゴ糖に、試料およびα−グリコシダ
ーゼまたはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコ
シダーゼを無機酸のカルシウム塩および/又はナ
トリウム塩および/または有機酸のカルシウム塩
および/又はナトリウム塩の存在下で作用させ、
生成するハロゲン化−p−ニトロフエノールを測
定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性
測定法である。 また本発明はハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルが還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼ、および無機
酸のカルシウム塩および/又はナトリウム塩およ
び/または有機酸のカルシウム塩および/又はナ
トリウム塩を含有することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬である。 本発明において使用するハロゲン化−p−ニト
ロフエノールが還元性末端にα−結合またはβ−
結合したマルトオリゴ糖とは、繰返し単位数が4
〜10であるマルトオリゴ糖の還元性末端ヒドロキ
シ基に対して、ハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルがグリコシド結合したものであり、グリコシド
結合はα−結合またはβ−結合のいずれでもよ
い。 マルトオリゴ糖としては、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース等がある。またハロゲン化−
p−ニトロフエノールとしては、2−クロル−4
−ニトロフエノール、3−クロル−4−ニトロフ
エノール、2−ブロム−4−ニトロフエノール、
3−ブロム−4−ニトロフエノール、2−ヨード
−4−ニトロフエノール、3−ヨード−4−ニト
ロフエノール、2−フルオロ−4−ニトロフエノ
ール、3−フルオロ−4−ニトロフエノールなど
のモノハロゲン化−p−ニトロフエノール、2,
3−ジクロル−4−ニトロフエノール、2,6−
ジクロル−4−ニトロフエノール、2,3−ジブ
ロム−4−ニトロフエノール、2,6−ジクロル
−4−ニトロフエノール、2,3−ジブロム−4
−ニトロフエノール、2,6−ヨード−4−ニト
ロフエノール、2,6−ヨード−4−ニトロフエ
ノール、2,3−ジフルオロ−4−ニトロフエノ
ール、2,6−ジフルオロ−4−ニトロフエノー
ル、2−クロル−3−ブロム−4−ニトロフエノ
ールなどのジハロゲン化−p−ニトロフエノール
などがある。またトリハロゲン化−p−ニトロフ
エノール、テトラハロゲン化−p−ニトロフエノ
ールを用いてもよい。さらにアルキル基、アルコ
キシ基等が置換されたハロゲン化−p−ニトロフ
エノールであつてもよい。特に好ましくは、2−
クロル−4−ニトロフエノールである。 マルトオリゴ糖とハロゲン化−p−ニトロフエ
ノールとを反応させる方法は通常の方法に従う。
化学的にはマルトオリゴ糖をアセチル化し、この
アセチル化マルトオリゴ糖とハロゲン化−p−ニ
トロフエノールを結合させた後、脱アセチル化す
ることにより合成できる(実験化学講座第24巻第
304頁、1958年参照)。 本発明に使用するα−グルコシダーゼは如何な
る起源のものを使用してもよく、例えばサツカロ
マイセスカルロスベルゲンシス、酵母などから得
られたものがある。 またβ−グルコシダーゼも如何なる起源のもの
を使用してもよく、例えばアーモンドから得られ
たものがある。 本発明に使用する無機酸または有機酸αカルシ
ウム塩としては、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、シユウ酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カ
ルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素
カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のナトリ
ウム塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウ
ム、アスコルビン酸ナトリウム、アジ化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、亜硫
酸水素ナトリウム、酒石酸水素ナトリウム、ホウ
酸ナトリウム、n−酪酸ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、プロピオン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウ
ム、グルコン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のカルシ
ウム塩の濃度は0.01mM〜10mMであり、無機酸
または有機酸のナトリウム塩の濃度は0.001M〜
1Mである。 本発明に用いる緩衝液はPH6.6からPH7.5の間で
緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツ
ド緩衝剤等を含有することが好ましい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、ハ
ロゲン化−p−ニトロフエノールが還元性末端に
α−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼ、無機酸のカルシウム塩お
よび/またはナトリウム塩、および/または無機
酸のカルシウム塩および/またはナトリウム塩お
よび緩衝液からなり、必要によりその他の成分を
含有していてもよい。例えば抗性物質、化学療法
剤、エチレンジアミン四酢酸塩やチツ化ナトリウ
ム等のキレート剤、そして界面活性剤等も添加し
てよい。 本発明に用いる試料としては、血清、尿、膵
液、唾液等がある。 本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、ハロゲ
ン化−p−ニトロフエノールが還元性末端にα−
結合したマルトオリゴ糖を基質とする場合、該マ
ルトオリゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼを
前記カルシウム塩および/またはナトリウム塩の
存在下で作用させ、生成するハロゲン化−p−ニ
トロフエノールを測定する。またハロゲン化−p
−ニトロフエノールが還元性末端にβ−結合した
マルトオリゴ糖を基質とする場合、該マルトオリ
ゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼを前記カルシウム塩および/また
はナトリウム塩の存在下で作用させ、生成するハ
ロゲン化−p−ニトロフエノールを測定する。α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼは上記マルトオリゴ糖と試
料との反応と同時に、あるいは反応前後に添加し
てもよい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定は好ましくは
PH6.6〜7.5の緩衝液中で、上記マルトオリゴ糖と
α−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼと試料とを好ましくは約
2〜30分間反応させる。反応により生成したハロ
ゲン化−p−ニトロフエノールの測定は、ハロゲ
ン化−p−ニトロフエノールが有する吸光度、例
えば2−クロル−4−ニトロフエノールの場合、
400nmの吸光度変化を肉眼判定や分光光度計を
用いて測定する。 (発明の効果) 本発明では、ハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルを還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖を基質として、無機酸または有機酸
のカルシウムおよび/またはナトリウム塩の共存
下、好ましくはPH6.6からPH7.5までの緩衝液中で
試料を作用させ、生成するハロゲン化−p−ニト
ロフエノールを測定して試料中のα−アミラーゼ
活性を測定することにより、従来法で問題であつ
た、内因性のグルコースの影響、PH変化の影響、
温度変化の影響を受けず、高感度で測定が可能と
なる。また少量の試料でα−アミラーゼを失活さ
せることなく正確に測定できる。 (実施例) 以下本発明を実施例により説明する。 実施例 1 下記の試薬を用い、下記方法により試料中のα
−アミラーゼ活性を測定した。 1 試薬 試薬A: 50mM PIPES〔ピペラジン−N,N′−ビス
(2−エタンスルホン酸)〕 PH7.0 β−o−クロル−p−ニトロフエニルペンタオ
サイド 5mM α−グルコシダーゼ 80u/ml β−グルコシダーゼ 10u/ml CaCl2 1mM NaCl 1mM 試薬B: 50mM PIPES PH7.0 マルトペンタオース 5mM α−グルコシダーゼ 80u/ml ヘキソキナーゼ 2u/ml グルコース−6−リン酸デヒドロキナーゼ
10u/ml アデノシン三リン酸(ATP) 2mM ニコチンアミドジタクレオチド(NAD)
4mM 2 サンプル: 血清a:水=9:1 血清a:グルコース水溶液(2g/dl)=9:
1 尿a:水=9:1 尿a:グルコース水溶液(2g/dl)=9:1
3 測定法 各サンプル20μに、37℃で5分間加温した
試薬またはを3ml加えて反応させ、試薬ブ
ランクを対照にして、4分から8分までの直線
部を試薬は400nmで、試薬は340nmで測
定した。1分間の吸光度変化を第1表に示す。
用試薬に関するものである。 (従来の技術) 最近、ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基
質として、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えば
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースなどが使用される様になりつつあ
る。これらのうち代表例としてマルトペンタオー
スを基質として使用する場合をとりあげて説明す
ると、測定様式は次の様に表わすことができる。 (1) マルトペンタオースアミラーゼ ―――――→
マルトース+マルトトリオース。 (2) マルトース+マルトトリオース
α−グルコシダーゼ ―――――――――――→グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例
えばグルコースオキシダーゼ/パーオキシダー
ゼ/色素系、もしくはヘキソキナーゼ/ホスフオ
グルコムターゼ/グルコース−6−ホスフエート
デヒドログナーゼ/NADH系等で測定される。 ところがこの測定系は、グルコースを中間体と
するため、体液中の内因性グルコースの影響を受
けるという欠点があり、精度の高いα−アミラー
ゼ活性値が得られない。 他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフエニル
基、ナフチル基或はそれらの類似体を結合した基
質が合成され、次の様なものを基質とするアミラ
ーゼ測定試薬が提案されている。 p−ニトロフエニルマルトペンタオサイド (特公昭57−53079号公報) p−ニトロフエニルマルトヘキサオサイド (特公昭57−53079号公報) p−ニトロフエニルマルトヘプタオサイド (特開昭54−51892号公報) これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活
性の測定様式を例示すると、次の様になる。 p−ニトロフエニル−α−マルトペンタサイドの
場合 (1) p−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イドα−アミラーゼ ――――――――→p−ニトロフエニル−α−
マルトサイド+マルトトリオース (2) p−ニトロフエニル−α−マルトサイド+マ
ルトトリオースα−グルコシダーゼ ―――――――――――→p−ニト
ロフエノール+グルコース ここに遊離したp−ニトロフエノールの変化量
α−アミラーゼ活性は測定される。この系は内因
性のグルコースの影響は受けないが、遊離基であ
るp−ニトロフエノールが若干のPH変化、温度変
化で分子吸光係数が大きく変化したり、α−アミ
ラーゼの活性測定或(α−アミラーゼの至適PHは
6.6〜7.5に存在する)で十分な測定感度が得られ
ないという欠点があつた。また基質のグルコース
鎖に関しては、マルトテトラオース以下の低分子
オリゴ糖であるとα−アミラーゼの作用性が悪
く、また追随酵素であるα−グルコシダーゼの作
用を受けブランク値が上昇する。マルトヘキサオ
ース以上の高分子オリゴ糖であるとα−アミラー
ゼの切断部位が増加したり、一次水解生成物に再
度α−アミラーゼが作用し二次水解生成物を生じ
たりして、α−アミラーゼの活性を正確に測定で
きない等の問題点があつた。 そこで本発明者等は、基質としてα−および/
またはβ−o−クロル−p−ニトロフエニルマル
トペンタオサイドを使用することによりこれらの
問題点を解決し既に提案した(特願昭58−111296
号)。遊離基のo−クロル−p−ニトロフエノー
ルはPH変化、温度変化に非常に安定であり、分子
吸光係数の変化が著しく小さく、PH6.6からPH7.5
で十分な測定感度が得られる。また糖鎖をマルト
ペンタオースにすることによりα−アミラーゼの
切断部位が限定され、一次水解生成物へのα−ア
ミラーゼの作用もなく、正確なα−アミラーゼ活
性を得ることに成功した。 これらの特徴を有するα−および/またはβ−
o−クロル−p−ニトロフエニルマルトペンタオ
サイドを基質として、α−アミラーゼ活性の至適
条件、PH6.6からPH7.5で測定する場合、遊離基で
あるo−クロル−p−ニトロフエノールが高感度
化合物(分子吸光係数が大きい)のため、測定の
精度が向上し、試料の少量化も可能になつた。 (発明が解決しようとする問題点) 試料の少量化により、試料中の他成分が測定系
に与える影響は小さくなつたが、試料の測定液中
での濃度が薄くなり、α−アミラーゼが測定液中
で失活して正確な測定値が得られないという新た
な問題点が生じた。 (問題点を解決するための手段) そこで本発明者等はこれらの問題点を解決する
ため種々研究した結果、ハロゲン化−p−ニトロ
フエニルマルトサイドを基質として含んだ測定液
を使用して、試料中のα−アミラーゼを測定する
場合、無機酸または有機酸のカルシウム塩およ
び/またはナトリウム塩を共存させることによ
り、測定液中のα−アミラーゼが賦活化され、試
料の測定液中での濃度が薄くてもα−アミラーゼ
活性の正確な測定値を得ることに成功した。 すなわち本発明はハロゲン化−p−ニトロフエ
ノールが還元性末端にα−結合またはβ−結合し
たマルトオリゴ糖に、試料およびα−グリコシダ
ーゼまたはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコ
シダーゼを無機酸のカルシウム塩および/又はナ
トリウム塩および/または有機酸のカルシウム塩
および/又はナトリウム塩の存在下で作用させ、
生成するハロゲン化−p−ニトロフエノールを測
定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性
測定法である。 また本発明はハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルが還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼ、および無機
酸のカルシウム塩および/又はナトリウム塩およ
び/または有機酸のカルシウム塩および/又はナ
トリウム塩を含有することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬である。 本発明において使用するハロゲン化−p−ニト
ロフエノールが還元性末端にα−結合またはβ−
結合したマルトオリゴ糖とは、繰返し単位数が4
〜10であるマルトオリゴ糖の還元性末端ヒドロキ
シ基に対して、ハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルがグリコシド結合したものであり、グリコシド
結合はα−結合またはβ−結合のいずれでもよ
い。 マルトオリゴ糖としては、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース等がある。またハロゲン化−
p−ニトロフエノールとしては、2−クロル−4
−ニトロフエノール、3−クロル−4−ニトロフ
エノール、2−ブロム−4−ニトロフエノール、
3−ブロム−4−ニトロフエノール、2−ヨード
−4−ニトロフエノール、3−ヨード−4−ニト
ロフエノール、2−フルオロ−4−ニトロフエノ
ール、3−フルオロ−4−ニトロフエノールなど
のモノハロゲン化−p−ニトロフエノール、2,
3−ジクロル−4−ニトロフエノール、2,6−
ジクロル−4−ニトロフエノール、2,3−ジブ
ロム−4−ニトロフエノール、2,6−ジクロル
−4−ニトロフエノール、2,3−ジブロム−4
−ニトロフエノール、2,6−ヨード−4−ニト
ロフエノール、2,6−ヨード−4−ニトロフエ
ノール、2,3−ジフルオロ−4−ニトロフエノ
ール、2,6−ジフルオロ−4−ニトロフエノー
ル、2−クロル−3−ブロム−4−ニトロフエノ
ールなどのジハロゲン化−p−ニトロフエノール
などがある。またトリハロゲン化−p−ニトロフ
エノール、テトラハロゲン化−p−ニトロフエノ
ールを用いてもよい。さらにアルキル基、アルコ
キシ基等が置換されたハロゲン化−p−ニトロフ
エノールであつてもよい。特に好ましくは、2−
クロル−4−ニトロフエノールである。 マルトオリゴ糖とハロゲン化−p−ニトロフエ
ノールとを反応させる方法は通常の方法に従う。
化学的にはマルトオリゴ糖をアセチル化し、この
アセチル化マルトオリゴ糖とハロゲン化−p−ニ
トロフエノールを結合させた後、脱アセチル化す
ることにより合成できる(実験化学講座第24巻第
304頁、1958年参照)。 本発明に使用するα−グルコシダーゼは如何な
る起源のものを使用してもよく、例えばサツカロ
マイセスカルロスベルゲンシス、酵母などから得
られたものがある。 またβ−グルコシダーゼも如何なる起源のもの
を使用してもよく、例えばアーモンドから得られ
たものがある。 本発明に使用する無機酸または有機酸αカルシ
ウム塩としては、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、シユウ酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カ
ルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素
カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のナトリ
ウム塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウ
ム、アスコルビン酸ナトリウム、アジ化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、亜硫
酸水素ナトリウム、酒石酸水素ナトリウム、ホウ
酸ナトリウム、n−酪酸ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、プロピオン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウ
ム、グルコン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のカルシ
ウム塩の濃度は0.01mM〜10mMであり、無機酸
または有機酸のナトリウム塩の濃度は0.001M〜
1Mである。 本発明に用いる緩衝液はPH6.6からPH7.5の間で
緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツ
ド緩衝剤等を含有することが好ましい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、ハ
ロゲン化−p−ニトロフエノールが還元性末端に
α−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼ、無機酸のカルシウム塩お
よび/またはナトリウム塩、および/または無機
酸のカルシウム塩および/またはナトリウム塩お
よび緩衝液からなり、必要によりその他の成分を
含有していてもよい。例えば抗性物質、化学療法
剤、エチレンジアミン四酢酸塩やチツ化ナトリウ
ム等のキレート剤、そして界面活性剤等も添加し
てよい。 本発明に用いる試料としては、血清、尿、膵
液、唾液等がある。 本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、ハロゲ
ン化−p−ニトロフエノールが還元性末端にα−
結合したマルトオリゴ糖を基質とする場合、該マ
ルトオリゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼを
前記カルシウム塩および/またはナトリウム塩の
存在下で作用させ、生成するハロゲン化−p−ニ
トロフエノールを測定する。またハロゲン化−p
−ニトロフエノールが還元性末端にβ−結合した
マルトオリゴ糖を基質とする場合、該マルトオリ
ゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼを前記カルシウム塩および/また
はナトリウム塩の存在下で作用させ、生成するハ
ロゲン化−p−ニトロフエノールを測定する。α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼは上記マルトオリゴ糖と試
料との反応と同時に、あるいは反応前後に添加し
てもよい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定は好ましくは
PH6.6〜7.5の緩衝液中で、上記マルトオリゴ糖と
α−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼと試料とを好ましくは約
2〜30分間反応させる。反応により生成したハロ
ゲン化−p−ニトロフエノールの測定は、ハロゲ
ン化−p−ニトロフエノールが有する吸光度、例
えば2−クロル−4−ニトロフエノールの場合、
400nmの吸光度変化を肉眼判定や分光光度計を
用いて測定する。 (発明の効果) 本発明では、ハロゲン化−p−ニトロフエノー
ルを還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖を基質として、無機酸または有機酸
のカルシウムおよび/またはナトリウム塩の共存
下、好ましくはPH6.6からPH7.5までの緩衝液中で
試料を作用させ、生成するハロゲン化−p−ニト
ロフエノールを測定して試料中のα−アミラーゼ
活性を測定することにより、従来法で問題であつ
た、内因性のグルコースの影響、PH変化の影響、
温度変化の影響を受けず、高感度で測定が可能と
なる。また少量の試料でα−アミラーゼを失活さ
せることなく正確に測定できる。 (実施例) 以下本発明を実施例により説明する。 実施例 1 下記の試薬を用い、下記方法により試料中のα
−アミラーゼ活性を測定した。 1 試薬 試薬A: 50mM PIPES〔ピペラジン−N,N′−ビス
(2−エタンスルホン酸)〕 PH7.0 β−o−クロル−p−ニトロフエニルペンタオ
サイド 5mM α−グルコシダーゼ 80u/ml β−グルコシダーゼ 10u/ml CaCl2 1mM NaCl 1mM 試薬B: 50mM PIPES PH7.0 マルトペンタオース 5mM α−グルコシダーゼ 80u/ml ヘキソキナーゼ 2u/ml グルコース−6−リン酸デヒドロキナーゼ
10u/ml アデノシン三リン酸(ATP) 2mM ニコチンアミドジタクレオチド(NAD)
4mM 2 サンプル: 血清a:水=9:1 血清a:グルコース水溶液(2g/dl)=9:
1 尿a:水=9:1 尿a:グルコース水溶液(2g/dl)=9:1
3 測定法 各サンプル20μに、37℃で5分間加温した
試薬またはを3ml加えて反応させ、試薬ブ
ランクを対照にして、4分から8分までの直線
部を試薬は400nmで、試薬は340nmで測
定した。1分間の吸光度変化を第1表に示す。
【表】
第1表から明らかなように、試薬Bではグル
コース含有試料に対して1分間の吸光度変化が
大きい。 参考例 1 p−ニトロフエノールとo−クロル−p−ニト
ロフエノールのPH変化の影響を下記方法により測
定した。 1 試薬 PH5.0からPH7.0までのMES〔2−(N−モルホ
リノ)エタンスルホン酸〕バツフアーを調整し
た。またPH7.7からPH9.0まではトリスバツフア
ーを調整した。 2 測定法 上記試薬中にp−ニトロフエノール、o−ク
ロル−p−ニトロフエノールを各0.066mM濃
度で溶解し、ブランクを対照にして400nmで
吸光度を測定した(温度20℃)。その結果を第
1図に示す。 本発明のo−クロル−p−ニトロフエノール
(CNP)はPH6.6からPH7.5の間での吸光度変化が
非常に小さいのに比べ、p−ニトロフエノール
(PNP)は吸光度変化が大きい。 参考例 2 p−ニトロフエノールとo−クロル−p−ニト
ロフエノールの温度変化の影響を下記方法により
測定した。 1 試薬 PH7.0のMESバツフアーを調整した。 2 測定法 上記試薬中にp−ニトロフエノールを0.072
mM、またはo−クロル−p−ニトロフエノー
ルを0.033mM濃度で溶解し、試薬の温度を15
℃から45℃まで変化させて、試薬フランクを対
照にして、400nmで吸光度を測定した。その
結果を第2図に示す。 p−ニトロフエノール(PNP)は温度変化
に伴い、吸光度変化が大きいが、本発明のo−
クロル−p−ニトロフエノール(PNP)は温
度変化の影響を受けない。 実施例 2 (1) 試薬 下記試薬に第2表の化合物を添加剤とする
試薬A〜Kおよび試薬を調製した。 試薬: 50mM MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u/ml α−o−クロル−p−ニトロフエニルマルトペ
ンタオサイド 5mM 試薬: 50mM MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u/ml α−p−ニトロフエニルペンタオサイド 5mM
コース含有試料に対して1分間の吸光度変化が
大きい。 参考例 1 p−ニトロフエノールとo−クロル−p−ニト
ロフエノールのPH変化の影響を下記方法により測
定した。 1 試薬 PH5.0からPH7.0までのMES〔2−(N−モルホ
リノ)エタンスルホン酸〕バツフアーを調整し
た。またPH7.7からPH9.0まではトリスバツフア
ーを調整した。 2 測定法 上記試薬中にp−ニトロフエノール、o−ク
ロル−p−ニトロフエノールを各0.066mM濃
度で溶解し、ブランクを対照にして400nmで
吸光度を測定した(温度20℃)。その結果を第
1図に示す。 本発明のo−クロル−p−ニトロフエノール
(CNP)はPH6.6からPH7.5の間での吸光度変化が
非常に小さいのに比べ、p−ニトロフエノール
(PNP)は吸光度変化が大きい。 参考例 2 p−ニトロフエノールとo−クロル−p−ニト
ロフエノールの温度変化の影響を下記方法により
測定した。 1 試薬 PH7.0のMESバツフアーを調整した。 2 測定法 上記試薬中にp−ニトロフエノールを0.072
mM、またはo−クロル−p−ニトロフエノー
ルを0.033mM濃度で溶解し、試薬の温度を15
℃から45℃まで変化させて、試薬フランクを対
照にして、400nmで吸光度を測定した。その
結果を第2図に示す。 p−ニトロフエノール(PNP)は温度変化
に伴い、吸光度変化が大きいが、本発明のo−
クロル−p−ニトロフエノール(PNP)は温
度変化の影響を受けない。 実施例 2 (1) 試薬 下記試薬に第2表の化合物を添加剤とする
試薬A〜Kおよび試薬を調製した。 試薬: 50mM MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u/ml α−o−クロル−p−ニトロフエニルマルトペ
ンタオサイド 5mM 試薬: 50mM MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u/ml α−p−ニトロフエニルペンタオサイド 5mM
【表】
(2) サンプル
血清b
尿 b
(3) 測定法
各サンプルを、試薬A〜Kに対しては20μ
、試薬に対しては50μ分取し、37℃で5
分間加温した試薬A〜K、試薬を各3ml添加
し、試薬ブランクを対照にして、4分から8分
までの直線部を400nmで測定した。その結果
を第3表に示す。
、試薬に対しては50μ分取し、37℃で5
分間加温した試薬A〜K、試薬を各3ml添加
し、試薬ブランクを対照にして、4分から8分
までの直線部を400nmで測定した。その結果
を第3表に示す。
【表】
【表】
試薬Kでは測定液中でα−アミラーゼの失活
がおこり、サンプル中のα−アミラーゼの正確
な測定値を得ることができなかつたが、本発明
の試薬A〜Jでは測定液中でα−アミラーゼが
賦活化されて測定することができる。 参考例 3 (1) 試薬 下記の試薬をPH6.0、6.5、6.75、7.0、7.5、
8.0に調製し、下記の方法によりα−アミラー
ゼ活性値を測定した。 試薬: 50mM PIPES β−o−クロル−p−ニトロフエニルペンタオ
サイド 5mM α−グルコシダーゼ 150u/ml β−グルコシダーゼ 20u/ml CaCl2 1mM NaCl 1mM (2) サンプル 膵液由来α−アミラーゼ 唾液由来α−アミラーゼ (3) 測定法 各サンプル20μに、37℃で5分間加温した
PH6.0〜8.0の試薬3mlを添加して反応させ、
試薬ブランクを対照にして4分から8分までの
直線部を400nmで、1分間の吸光度変化を測
定し、最大吸光度変化100%とし、各試薬PH値
における相対活性を測定した。その結果を第3
図に示す。 なお膵液由来、唾液由来のα−アミラーゼ共
に、PH6.6からPH7.5の間に至適PHをもつ。
がおこり、サンプル中のα−アミラーゼの正確
な測定値を得ることができなかつたが、本発明
の試薬A〜Jでは測定液中でα−アミラーゼが
賦活化されて測定することができる。 参考例 3 (1) 試薬 下記の試薬をPH6.0、6.5、6.75、7.0、7.5、
8.0に調製し、下記の方法によりα−アミラー
ゼ活性値を測定した。 試薬: 50mM PIPES β−o−クロル−p−ニトロフエニルペンタオ
サイド 5mM α−グルコシダーゼ 150u/ml β−グルコシダーゼ 20u/ml CaCl2 1mM NaCl 1mM (2) サンプル 膵液由来α−アミラーゼ 唾液由来α−アミラーゼ (3) 測定法 各サンプル20μに、37℃で5分間加温した
PH6.0〜8.0の試薬3mlを添加して反応させ、
試薬ブランクを対照にして4分から8分までの
直線部を400nmで、1分間の吸光度変化を測
定し、最大吸光度変化100%とし、各試薬PH値
における相対活性を測定した。その結果を第3
図に示す。 なお膵液由来、唾液由来のα−アミラーゼ共
に、PH6.6からPH7.5の間に至適PHをもつ。
第1図はCNPとPNPの吸光度に与えるPH値の
影響を示す。●印はCNP、〇印はPNP、−は
MESバツフアー、−−−はトリスバツフアーを示
す。第2図はCNPとPNPの吸光度に与える温度
の影響を示す。●印はCNP、〇印はPNPを示す。
第3図は膵液、唾液由来のα−アミラーゼのPH変
化に対する活性値変化を示す。●印は膵液由来α
−アミラーゼ、〇印は唾液由来のα−アミラーゼ
を示す。
影響を示す。●印はCNP、〇印はPNP、−は
MESバツフアー、−−−はトリスバツフアーを示
す。第2図はCNPとPNPの吸光度に与える温度
の影響を示す。●印はCNP、〇印はPNPを示す。
第3図は膵液、唾液由来のα−アミラーゼのPH変
化に対する活性値変化を示す。●印は膵液由来α
−アミラーゼ、〇印は唾液由来のα−アミラーゼ
を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ハロゲン化−p−ニトロフエノールが還元性
末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
糖に、試料およびα−グリコシダーゼまたはα−
グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを無機
酸のカルシウム塩および/又はナトリウム塩およ
び/又は有機酸のカルシウム塩および/又はナト
リウム塩の存在下で作用させ、生成するハロゲン
化−p−ニトロフエノールを測定することによ
り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定すること
を特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。 2 PH6.6からPH7.5までの緩衝液中で作用させる
ことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載のα
−アミラーゼ活性測定法。 3 ハロゲン化−p−ニトロフエノールが還元性
末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
糖、α−グルコシダーゼまたはα−グルコシダー
ゼおよびβ−グルコシタダーゼ、および無機酸の
カルシウム塩および/又はナトリウム塩および/
または有機酸のカルシウム塩および/又はナトリ
ウム塩を含有することを特徴とするα−アミラー
ゼ活性測定用試薬。 4 PH6.6からPH7.5までの緩衝液を含有すること
を特徴とする特許請求の範囲第3項記載のα−ア
ミラーゼ活性測定用試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15081284A JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15081284A JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6128400A JPS6128400A (ja) | 1986-02-08 |
JPS6365313B2 true JPS6365313B2 (ja) | 1988-12-15 |
Family
ID=15504954
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15081284A Granted JPS6128400A (ja) | 1984-07-19 | 1984-07-19 | α−アミラ−ゼ活性測定法および測定用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6128400A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0653076B2 (ja) * | 1986-05-28 | 1994-07-20 | 東洋紡績株式会社 | グリコシル化合物加水分解酵素活性測定試薬 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
JPS5939300A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-03 | Wako Pure Chem Ind Ltd | α−アミラ−ゼ活性の測定方法 |
JPS6062999A (ja) * | 1983-06-28 | 1985-04-11 | メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬 |
-
1984
- 1984-07-19 JP JP15081284A patent/JPS6128400A/ja active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5753079A (en) * | 1980-09-17 | 1982-03-29 | Toshiba Electric Equip | Table tap |
JPS5939300A (ja) * | 1982-08-27 | 1984-03-03 | Wako Pure Chem Ind Ltd | α−アミラ−ゼ活性の測定方法 |
JPS6062999A (ja) * | 1983-06-28 | 1985-04-11 | メルク・パテント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6128400A (ja) | 1986-02-08 |
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