JPS6365313B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はα−アミラーゼ活性測定法および測定
用試薬に関するものである。 （従来の技術） 最近、ヒト体液中のアミラーゼ活性の測定用基
質として、構造の明確なマルトオリゴ糖、例えば
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースなどが使用される様になりつつあ
る。これらのうち代表例としてマルトペンタオー
スを基質として使用する場合をとりあげて説明す
ると、測定様式は次の様に表わすことができる。 (1) マルトペンタオースアミラーゼ ―――――→
マルトース＋マルトトリオース。 (2) マルトース＋マルトトリオース
α−グルコシダーゼ ―――――――――――→グルコース ここに生成したグルコースは、公知の方法、例
えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系、もしくはヘキソキナーゼ／ホスフオ
グルコムターゼ／グルコース−６−ホスフエート
デヒドログナーゼ／NADH系等で測定される。 ところがこの測定系は、グルコースを中間体と
するため、体液中の内因性グルコースの影響を受
けるという欠点があり、精度の高いα−アミラー
ゼ活性値が得られない。 他方、マルトオリゴ糖の還元末端にフエニル
基、ナフチル基或はそれらの類似体を結合した基
質が合成され、次の様なものを基質とするアミラ
ーゼ測定試薬が提案されている。 ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオサイド （特公昭57−53079号公報） ｐ−ニトロフエニルマルトヘキサオサイド （特公昭57−53079号公報） ｐ−ニトロフエニルマルトヘプタオサイド （特開昭54−51892号公報） これらの化合物を基質とするα−アミラーゼ活
性の測定様式を例示すると、次の様になる。 ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタサイドの
場合 (1) ｐ−ニトロフエニル−α−マルトペンタオサ
イドα−アミラーゼ ――――――――→ｐ−ニトロフエニル−α−
マルトサイド＋マルトトリオース (2) ｐ−ニトロフエニル−α−マルトサイド＋マ
ルトトリオースα−グルコシダーゼ ―――――――――――→ｐ−ニト
ロフエノール＋グルコース ここに遊離したｐ−ニトロフエノールの変化量
α−アミラーゼ活性は測定される。この系は内因
性のグルコースの影響は受けないが、遊離基であ
るｐ−ニトロフエノールが若干のPH変化、温度変
化で分子吸光係数が大きく変化したり、α−アミ
ラーゼの活性測定或（α−アミラーゼの至適PHは
6.6〜7.5に存在する）で十分な測定感度が得られ
ないという欠点があつた。また基質のグルコース
鎖に関しては、マルトテトラオース以下の低分子
オリゴ糖であるとα−アミラーゼの作用性が悪
く、また追随酵素であるα−グルコシダーゼの作
用を受けブランク値が上昇する。マルトヘキサオ
ース以上の高分子オリゴ糖であるとα−アミラー
ゼの切断部位が増加したり、一次水解生成物に再
度α−アミラーゼが作用し二次水解生成物を生じ
たりして、α−アミラーゼの活性を正確に測定で
きない等の問題点があつた。 そこで本発明者等は、基質としてα−および／
またはβ−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフエニルマル
トペンタオサイドを使用することによりこれらの
問題点を解決し既に提案した（特願昭58−111296
号）。遊離基のｏ−クロル−ｐ−ニトロフエノー
ルはPH変化、温度変化に非常に安定であり、分子
吸光係数の変化が著しく小さく、PH6.6からPH7.5
で十分な測定感度が得られる。また糖鎖をマルト
ペンタオースにすることによりα−アミラーゼの
切断部位が限定され、一次水解生成物へのα−ア
ミラーゼの作用もなく、正確なα−アミラーゼ活
性を得ることに成功した。 これらの特徴を有するα−および／またはβ−
ｏ−クロル−ｐ−ニトロフエニルマルトペンタオ
サイドを基質として、α−アミラーゼ活性の至適
条件、PH6.6からPH7.5で測定する場合、遊離基で
あるｏ−クロル−ｐ−ニトロフエノールが高感度
化合物（分子吸光係数が大きい）のため、測定の
精度が向上し、試料の少量化も可能になつた。 （発明が解決しようとする問題点） 試料の少量化により、試料中の他成分が測定系
に与える影響は小さくなつたが、試料の測定液中
での濃度が薄くなり、α−アミラーゼが測定液中
で失活して正確な測定値が得られないという新た
な問題点が生じた。 （問題点を解決するための手段） そこで本発明者等はこれらの問題点を解決する
ため種々研究した結果、ハロゲン化−ｐ−ニトロ
フエニルマルトサイドを基質として含んだ測定液
を使用して、試料中のα−アミラーゼを測定する
場合、無機酸または有機酸のカルシウム塩およ
び／またはナトリウム塩を共存させることによ
り、測定液中のα−アミラーゼが賦活化され、試
料の測定液中での濃度が薄くてもα−アミラーゼ
活性の正確な測定値を得ることに成功した。 すなわち本発明はハロゲン化−ｐ−ニトロフエ
ノールが還元性末端にα−結合またはβ−結合し
たマルトオリゴ糖に、試料およびα−グリコシダ
ーゼまたはα−グルコシダーゼおよびβ−グルコ
シダーゼを無機酸のカルシウム塩および／又はナ
トリウム塩および／または有機酸のカルシウム塩
および／又はナトリウム塩の存在下で作用させ、
生成するハロゲン化−ｐ−ニトロフエノールを測
定することにより、試料中のα−アミラーゼ活性
を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活性
測定法である。 また本発明はハロゲン化−ｐ−ニトロフエノー
ルが還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖、α−グルコシダーゼ、および無機
酸のカルシウム塩および／又はナトリウム塩およ
び／または有機酸のカルシウム塩および／又はナ
トリウム塩を含有することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬である。 本発明において使用するハロゲン化−ｐ−ニト
ロフエノールが還元性末端にα−結合またはβ−
結合したマルトオリゴ糖とは、繰返し単位数が４
〜10であるマルトオリゴ糖の還元性末端ヒドロキ
シ基に対して、ハロゲン化−ｐ−ニトロフエノー
ルがグリコシド結合したものであり、グリコシド
結合はα−結合またはβ−結合のいずれでもよ
い。 マルトオリゴ糖としては、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース等がある。またハロゲン化−
ｐ−ニトロフエノールとしては、２−クロル−４
−ニトロフエノール、３−クロル−４−ニトロフ
エノール、２−ブロム−４−ニトロフエノール、
３−ブロム−４−ニトロフエノール、２−ヨード
−４−ニトロフエノール、３−ヨード−４−ニト
ロフエノール、２−フルオロ−４−ニトロフエノ
ール、３−フルオロ−４−ニトロフエノールなど
のモノハロゲン化−ｐ−ニトロフエノール、２，
３−ジクロル−４−ニトロフエノール、２，６−
ジクロル−４−ニトロフエノール、２，３−ジブ
ロム−４−ニトロフエノール、２，６−ジクロル
−４−ニトロフエノール、２，３−ジブロム−４
−ニトロフエノール、２，６−ヨード−４−ニト
ロフエノール、２，６−ヨード−４−ニトロフエ
ノール、２，３−ジフルオロ−４−ニトロフエノ
ール、２，６−ジフルオロ−４−ニトロフエノー
ル、２−クロル−３−ブロム−４−ニトロフエノ
ールなどのジハロゲン化−ｐ−ニトロフエノール
などがある。またトリハロゲン化−ｐ−ニトロフ
エノール、テトラハロゲン化−ｐ−ニトロフエノ
ールを用いてもよい。さらにアルキル基、アルコ
キシ基等が置換されたハロゲン化−ｐ−ニトロフ
エノールであつてもよい。特に好ましくは、２−
クロル−４−ニトロフエノールである。 マルトオリゴ糖とハロゲン化−ｐ−ニトロフエ
ノールとを反応させる方法は通常の方法に従う。
化学的にはマルトオリゴ糖をアセチル化し、この
アセチル化マルトオリゴ糖とハロゲン化−ｐ−ニ
トロフエノールを結合させた後、脱アセチル化す
ることにより合成できる（実験化学講座第24巻第
304頁、1958年参照）。 本発明に使用するα−グルコシダーゼは如何な
る起源のものを使用してもよく、例えばサツカロ
マイセスカルロスベルゲンシス、酵母などから得
られたものがある。 またβ−グルコシダーゼも如何なる起源のもの
を使用してもよく、例えばアーモンドから得られ
たものがある。 本発明に使用する無機酸または有機酸αカルシ
ウム塩としては、塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、シユウ酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カ
ルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素
カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のナトリ
ウム塩としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウ
ム、アスコルビン酸ナトリウム、アジ化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、亜硫
酸水素ナトリウム、酒石酸水素ナトリウム、ホウ
酸ナトリウム、ｎ−酪酸ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリ
ウム、プロピオン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウ
ム、グルコン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素ナトリウ
ム等がある。 本発明に使用する無機酸または有機酸のカルシ
ウム塩の濃度は0.01ｍＭ〜10ｍＭであり、無機酸
または有機酸のナトリウム塩の濃度は0.001M〜
1Mである。 本発明に用いる緩衝液はPH6.6からPH7.5の間で
緩衝能を示す緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、グツ
ド緩衝剤等を含有することが好ましい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬は、ハ
ロゲン化−ｐ−ニトロフエノールが還元性末端に
α−結合またはβ−結合したマルトオリゴ糖、α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼ、無機酸のカルシウム塩お
よび／またはナトリウム塩、および／または無機
酸のカルシウム塩および／またはナトリウム塩お
よび緩衝液からなり、必要によりその他の成分を
含有していてもよい。例えば抗性物質、化学療法
剤、エチレンジアミン四酢酸塩やチツ化ナトリウ
ム等のキレート剤、そして界面活性剤等も添加し
てよい。 本発明に用いる試料としては、血清、尿、膵
液、唾液等がある。 本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、ハロゲ
ン化−ｐ−ニトロフエノールが還元性末端にα−
結合したマルトオリゴ糖を基質とする場合、該マ
ルトオリゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼを
前記カルシウム塩および／またはナトリウム塩の
存在下で作用させ、生成するハロゲン化−ｐ−ニ
トロフエノールを測定する。またハロゲン化−ｐ
−ニトロフエノールが還元性末端にβ−結合した
マルトオリゴ糖を基質とする場合、該マルトオリ
ゴ糖に試料およびα−グルコシダーゼおよびβ−
グルコシダーゼを前記カルシウム塩および／また
はナトリウム塩の存在下で作用させ、生成するハ
ロゲン化−ｐ−ニトロフエノールを測定する。α
−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼおよ
びβ−グルコシダーゼは上記マルトオリゴ糖と試
料との反応と同時に、あるいは反応前後に添加し
てもよい。 本発明のα−アミラーゼ活性測定は好ましくは
PH6.6〜7.5の緩衝液中で、上記マルトオリゴ糖と
α−グルコシダーゼまたはα−グルコシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼと試料とを好ましくは約
２〜30分間反応させる。反応により生成したハロ
ゲン化−ｐ−ニトロフエノールの測定は、ハロゲ
ン化−ｐ−ニトロフエノールが有する吸光度、例
えば２−クロル−４−ニトロフエノールの場合、
400nｍの吸光度変化を肉眼判定や分光光度計を
用いて測定する。 （発明の効果） 本発明では、ハロゲン化−ｐ−ニトロフエノー
ルを還元性末端にα−結合またはβ−結合したマ
ルトオリゴ糖を基質として、無機酸または有機酸
のカルシウムおよび／またはナトリウム塩の共存
下、好ましくはPH6.6からPH7.5までの緩衝液中で
試料を作用させ、生成するハロゲン化−ｐ−ニト
ロフエノールを測定して試料中のα−アミラーゼ
活性を測定することにより、従来法で問題であつ
た、内因性のグルコースの影響、PH変化の影響、
温度変化の影響を受けず、高感度で測定が可能と
なる。また少量の試料でα−アミラーゼを失活さ
せることなく正確に測定できる。 （実施例） 以下本発明を実施例により説明する。 実施例 １ 下記の試薬を用い、下記方法により試料中のα
−アミラーゼ活性を測定した。 １ 試薬 試薬Ａ： 50ｍＭ PIPES〔ピペラジン−Ｎ，N′−ビス
（２−エタンスルホン酸）〕 PH7.0 β−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフエニルペンタオ
サイド ５ｍＭ α−グルコシダーゼ 80u／ml β−グルコシダーゼ 10u／ml CaCl₂ １ｍＭ NaCl １ｍＭ 試薬Ｂ： 50ｍＭ PIPES PH7.0 マルトペンタオース ５ｍＭ α−グルコシダーゼ 80u／ml ヘキソキナーゼ 2u／ml グルコース−６−リン酸デヒドロキナーゼ
10u／ml アデノシン三リン酸（ATP） ２ｍＭ ニコチンアミドジタクレオチド（NAD）
４ｍＭ ２ サンプル： 血清ａ：水＝９：１ 血清ａ：グルコース水溶液（２ｇ／dl）＝９：
１ 尿ａ：水＝９：１ 尿ａ：グルコース水溶液（２ｇ／dl）＝９：１
３ 測定法 各サンプル20μに、37℃で５分間加温した
試薬またはを３ml加えて反応させ、試薬ブ
ランクを対照にして、４分から８分までの直線
部を試薬は400nｍで、試薬は340nｍで測
定した。１分間の吸光度変化を第１表に示す。

【表】 第１表から明らかなように、試薬Ｂではグル
コース含有試料に対して１分間の吸光度変化が
大きい。 参考例 １ ｐ−ニトロフエノールとｏ−クロル−ｐ−ニト
ロフエノールのPH変化の影響を下記方法により測
定した。 １ 試薬 PH5.0からPH7.0までのMES〔２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸〕バツフアーを調整し
た。またPH7.7からPH9.0まではトリスバツフア
ーを調整した。 ２ 測定法 上記試薬中にｐ−ニトロフエノール、ｏ−ク
ロル−ｐ−ニトロフエノールを各0.066ｍＭ濃
度で溶解し、ブランクを対照にして400nｍで
吸光度を測定した（温度20℃）。その結果を第
１図に示す。 本発明のｏ−クロル−ｐ−ニトロフエノール
（CNP）はPH6.6からPH7.5の間での吸光度変化が
非常に小さいのに比べ、ｐ−ニトロフエノール
（PNP）は吸光度変化が大きい。 参考例 ２ ｐ−ニトロフエノールとｏ−クロル−ｐ−ニト
ロフエノールの温度変化の影響を下記方法により
測定した。 １ 試薬 PH7.0のMESバツフアーを調整した。 ２ 測定法 上記試薬中にｐ−ニトロフエノールを0.072
ｍＭ、またはｏ−クロル−ｐ−ニトロフエノー
ルを0.033ｍＭ濃度で溶解し、試薬の温度を15
℃から45℃まで変化させて、試薬フランクを対
照にして、400nｍで吸光度を測定した。その
結果を第２図に示す。 ｐ−ニトロフエノール（PNP）は温度変化
に伴い、吸光度変化が大きいが、本発明のｏ−
クロル−ｐ−ニトロフエノール（PNP）は温
度変化の影響を受けない。 実施例 ２ (1) 試薬 下記試薬に第２表の化合物を添加剤とする
試薬Ａ〜Ｋおよび試薬を調製した。 試薬： 50ｍＭ MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u／ml α−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフエニルマルトペ
ンタオサイド ５ｍＭ 試薬： 50ｍＭ MES PH7.0 α−グルコシダーゼ 80u／ml α−ｐ−ニトロフエニルペンタオサイド ５ｍＭ

【表】 (2) サンプル 血清ｂ 尿 ｂ (3) 測定法 各サンプルを、試薬Ａ〜Ｋに対しては20μ
、試薬に対しては50μ分取し、37℃で５
分間加温した試薬Ａ〜Ｋ、試薬を各３ml添加
し、試薬ブランクを対照にして、４分から８分
までの直線部を400nｍで測定した。その結果
を第３表に示す。

【表】

【表】 試薬Ｋでは測定液中でα−アミラーゼの失活
がおこり、サンプル中のα−アミラーゼの正確
な測定値を得ることができなかつたが、本発明
の試薬Ａ〜Ｊでは測定液中でα−アミラーゼが
賦活化されて測定することができる。 参考例 ３ (1) 試薬 下記の試薬をPH6.0、6.5、6.75、7.0、7.5、
8.0に調製し、下記の方法によりα−アミラー
ゼ活性値を測定した。 試薬： 50ｍＭ PIPES β−ｏ−クロル−ｐ−ニトロフエニルペンタオ
サイド ５ｍＭ α−グルコシダーゼ 150u／ml β−グルコシダーゼ 20u／ml CaCl₂ １ｍＭ NaCl １ｍＭ (2) サンプル 膵液由来α−アミラーゼ 唾液由来α−アミラーゼ (3) 測定法 各サンプル20μに、37℃で５分間加温した
PH6.0〜8.0の試薬３mlを添加して反応させ、
試薬ブランクを対照にして４分から８分までの
直線部を400nｍで、１分間の吸光度変化を測
定し、最大吸光度変化100％とし、各試薬PH値
における相対活性を測定した。その結果を第３
図に示す。 なお膵液由来、唾液由来のα−アミラーゼ共
に、PH6.6からPH7.5の間に至適PHをもつ。

【図面の簡単な説明】

第１図はCNPとPNPの吸光度に与えるPH値の
影響を示す。●印はCNP、〇印はPNP、−は
MESバツフアー、−−−はトリスバツフアーを示
す。第２図はCNPとPNPの吸光度に与える温度
の影響を示す。●印はCNP、〇印はPNPを示す。
第３図は膵液、唾液由来のα−アミラーゼのPH変
化に対する活性値変化を示す。●印は膵液由来α
−アミラーゼ、〇印は唾液由来のα−アミラーゼ
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハロゲン化−ｐ−ニトロフエノールが還元性
   末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
   糖に、試料およびα−グリコシダーゼまたはα−
   グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを無機
   酸のカルシウム塩および／又はナトリウム塩およ
   び／又は有機酸のカルシウム塩および／又はナト
   リウム塩の存在下で作用させ、生成するハロゲン
   化−ｐ−ニトロフエノールを測定することによ
   り、試料中のα−アミラーゼ活性を測定すること
   を特徴とするα−アミラーゼ活性測定法。 ２ PH6.6からPH7.5までの緩衝液中で作用させる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のα
   −アミラーゼ活性測定法。 ３ ハロゲン化−ｐ−ニトロフエノールが還元性
   末端にα−結合またはβ−結合したマルトオリゴ
   糖、α−グルコシダーゼまたはα−グルコシダー
   ゼおよびβ−グルコシタダーゼ、および無機酸の
   カルシウム塩および／又はナトリウム塩および／
   または有機酸のカルシウム塩および／又はナトリ
   ウム塩を含有することを特徴とするα−アミラー
   ゼ活性測定用試薬。 ４ PH6.6からPH7.5までの緩衝液を含有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第３項記載のα−ア
   ミラーゼ活性測定用試薬。