JPH0452279B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なオリゴ糖誘導体、並びにこれ
を基質として用しるα−アミラーゼアイソザイム
の分別測定法に関する。 更に詳しくは、新規なオリゴ糖誘導体を基質と
して用い、α−アミラーゼの各アイソザイム即ち
膵由来α−アミラーゼ及び唾液腺由来α−アミラ
ーゼによる加水分解反応で生じる生成物量の差を
検知することを特徴とするα−アミラーゼアイソ
ザイムの分別測定法に関する。 生体試料など被検試料、特にヒトの唾液、膵
液、血液、尿中のα−アミラーゼ活性の測定は医
学上の診断において重要である。例えば、膵炎、
膵臓癌、耳下腺炎においては、血液や尿中のα−
アミラーゼ活性は通常の値に比べて著しい上昇を
示す。 更に、例えば血中α−アミラーゼ活性アイソザ
イムに分離して測定することは高アミラーゼ血症
の解析や病態の解明に重要であり、日常臨床検査
にも応用されている。 α−アミラーゼアイソザイムの分離法は現在ま
で多岐にわたつており、(1)荷電の差による分離、
(2)ゲル濾過法、(3)アフイニテイクロマトグラフイ
ーによる方法、(4)免疫学的方法、(5)α−アミラー
ゼインヒビターによる方法、などがある。 これらの内、現在のところ臨床検査に応用し得
るものとしては、公知文献（臨床病理、臨時増刊
第43号、Isoenzymeの分析とその意義、17頁
（1981））にも記載があるように、(1)の荷電の差に
よる分離を電気泳動法によつて行うものと、最近
多く実施されるようになつてきている(5)のアミラ
ーゼインヒビターによる方法がある。 電気泳動法に於て、臨床検査として適している
のはセルロースアセテート膜、薄層ポリアクリル
アミドゲルを用いる電気泳動法などがあるが、い
ずれも測定操作が煩雑で、しかも測定に長時間を
要する欠点がある。 一方、α−アミラーゼインヒビターを用いる方
法は、小麦由来のアミラーゼインヒビターが膵由
来α−アミラーゼよりも唾液腺由来α−アミラー
ゼをより強く阻害することを利用して両者の割合
を算出するものであるが、現在のところ、膵ある
いは唾液腺由来のα−アミラーゼのいずれかを特
異的に完全に阻害するインヒビターが見出されて
いない為、検体中の膵及び唾液腺由来のα−アミ
ラーゼの活性比率を既知の酵素標準液を用いて作
成した検量線から読みとる方法がとられている
が、比較的操作も簡便な為、最近多く使用される
ようになつてきている。 しかしながら、この方法で脾由来α−アミラー
ゼと唾液腺由来α−アミラーゼの活性比率を求め
るには、阻害剤を入れた場合と入れない場合の２
回の測定が必要であり、操作が煩雑である。 本発明者らは、先に、α−アミラーゼアイソザ
イムの新規な分別測定法として、下記構造式Ａ及
びＢで示される２種のオリゴ糖誘導体を組合せて
用い、該基質にα−アミラーゼが作用して起こる
糖転位反応により生成したオリゴ糖誘導体が、更
にα−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
加水分解物を測定するか、又は下記構造式Ｃで示
されるオリゴ糖誘導体を用い、α−アミラーゼの
加水分解作用を受けて生じる分解生成物を測定す
ることによつてヒト膵由来α−アミラーゼとヒト
唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定を行う方法
に関して特許出願している（特願昭58−138344
号）。 〔式中R₁，R₂は２−ピリジルアミノ基、３−
ピリジルアミノ基の如く螢光性を有する置換基、
若しくはアニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロ
キシアニリノ基、カルボキシフエニルアミノ基の
如くUV吸収を有する置換基を表わす。〕 即ち、先の出願は、本発明者らが鋭意研究の結
果、オリゴ糖誘導体の反応性がα−アミラーゼア
イソザイムによつて異なり、従つて生成物の比率
がアイソザイムによつて異なることを見出し、こ
れを利用したα−アミラーゼアイソザイムの分別
測定法について更に研究を重ね、ある種の修飾基
即ち螢光性を有する修飾基或いはUV吸収を有す
る修飾基を基質に導入することにより、生成物が
高速液体クロマトグラフイーによつて容易に分別
測定することができることを見出し完成した発明
である。 今回、本発明者らは、これを更に発展させ、前
記構造式〔Ｃ〕で示されるオリゴ糖誘導体よりも
合成し易く、より実用的なオリゴ糖誘導体につい
て鋭意研究を行なつた結果、製造工程が短かく、
合成が容易な下記構造式〔〕で示される新規な
オリゴ糖誘導体を見出し、これを基質として用い
ることにより、前記構造式〔Ｃ〕で示されるオリ
ゴ糖誘導体を用いた場合よりも、更に高精度にヒ
ト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼの分別測定が可能となることを見出し、
本発明を完成するに到つた。 〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリ
ジルアミノ基及び

【式】な る基の如く螢光性を有する置換基、若しくは、ア
ニリノ基、メチルアニリノ基，ヒドロキシアニリ
ノ基、カルボキシフエニルアミノ基の如くUV吸
収を有する置換基を表わす。〕 本発明の目的は、α−アミラーゼアイソザイ
ム、特にヒト膵由来のα−アミラーゼとヒト唾液
腺由来α−アミラーゼを分別測定せんとするもの
であり、本発明の方法によれば、極めて微量の検
体を用いて高感度の測定が可能となる。又、本発
明の方法では、１回の測定で検体中の膵及び唾液
腺由来のα−アミラーゼの活性比率を求めること
ができる。 本発明の方法は、α−アミラーゼの加水分解反
応を利用するものであり、その要旨は次の如くで
ある。 即ち、ヒトα−アミラーゼアイソザイムの分別
測定に際し、グルコースが６個からなる直鎖状オ
リゴ糖の非還元末端グルコースの６位の１級アル
コール（−CH₂OH）が一般式−CH₂Ｒで表わさ
れる基で置換され、更に、還元末端グルコースが
グリシトールに還元された下記構造式〔〕を有
するオリゴ糖誘導体を基質として、α−アミラー
ゼを作用させると、主として１と２の位置で加水
分解が起こり、非還元末端に置換基を有する、グ
ルコースが３個のオリゴ糖（構造式〔〕）と非
還元末端に置換基を有する、グルコースが４個の
オリゴ糖（構造式〔〕）が得られてくる。 構造式〔〕 〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリ
ジルアミノ基及び

〔FG6F〕

本発明の基質はFG6Fに比べ、製造工程が短
く、製造が容易であり、且つ２つのα−アミラー
ゼアイソザイムによる基質に対する反応性の差が
更に大きいという利点を有するものであるから、
α−アミラーゼアイソザイムの分別測定に於て、
更に有用な化合物である。 また、本基質を用いる方法では、基質を全て加
水分解する必要がないため、反応時間が短い等の
利点を有する。 以下、本発明について例を挙げて詳細に説明す
る。 先ず本発明に使用するオリゴ糖誘導体は、次の
ように合成したが、合成方法は特にこれに限定さ
れるものではない。 〔合成例１〕 まずＯ−６デオシキ−６−〔（２−ピリジル）ア
ミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グル
コピラノースは公知文献〔ジヤーナル オブ ザ
バイオケミストリー、93巻、1055頁（1983年）〕
に記載のオリゴ糖誘導体の合成法に準じて合成し
た。 即ち、デキストリンのグルコース残基の６位の
１級アルコールをジメチルスルホキシドとＮ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドで部分酸
化後、２−アミノピリジンを作用させシツフの塩
基とし、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元し
て、２−ピリジルアミノ基が導入されたデキスト
リンを得る。次いで、これにバチルス属由来液化
型アミラーゼとグルコアミラーゼを作用させ、酵
素的加水分解を行ない、非還元末端グルコースに
２−ピリジルアミノ基が導入されたオリゴ糖を得
る。ゲル濾過後、本画分を凍結乾燥して得た。こ
のオリゴ糖誘導体５mgを蒸留水１mlで溶解した溶
液に、2.5mg／mlの水素化ホウ素ナトリウム水溶
液を２ml加え、４℃で18時間反応させ、還元末端
グルコースをグリシトールに還元した後、酢酸
100μを加え過剰の水素化ホウ素ナトリウムを
分解する。この溶液のゲル濾過を行ない目的とす
るＯ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミ
ノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グリシトール
（FG6R）の画分を凍結乾燥して得る。必要によ
り高速液体クロマトグラフイーにより精製する。 本発明に用いる上記の基質のα−アミラーゼア
イソザイム分別測定時に於ける濃度は、特に限定
されないが、30〜500μmo／が好ましい。 反応の液性は、PH４〜８の範囲であれば、通常
問題はないが、中でもPH５〜７の範囲が好ましく
用いられる。 基質に導入する修飾基はピリジルアミノ基、

〔測定試液〕

グルコースが６個からなる直鎖状オリゴ糖の非
還元末端グルコースの６位の１級アルコールが２
−ピリジルアミノ基で置換され、さらに還元末端
グルコースをグリシトールに還元したオリゴ糖誘
導体（FG6、以下構造式）2.5mgを、10mM塩
化ナトリウムと5mM酢酸カルシウムを含む
0.10M33，３−ジメチルグルタール酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液（PH5.9）20mlで溶解する。 構造式 (ロ) 標準液の調製 ヒト唾液から精製した唾液腺由来α−アミラー
ゼ100Uを1mM塩化カルシユム水溶液100mlで溶
解した液を調製する。ヒト膵液から精製した膵由
来α−アミラーゼ100Uを1mM塩化カルシウム水
溶液100mlで溶解した液を調製する。試験管を３
本用意し、各々にNo.１，２，３を付け、下記の様
に唾液腺由来と膵由来のα−アミラーゼを混合す
る。

【表】 (ハ) 測定操作法 (1) α−アミラーゼ反応 調製した各標準液又は血清15μに測定試液
30μを試験管にとり、よく混合後37℃で６分間
反応させる。反応後0.10M酢酸0.3mlを加え、100
℃で10分間加熱しα−アミラーゼ反応を停止させ
る。 (2) 高速液体クロマトグラフイー 上記反応液10μをとり、高速液体クロマトグ
ラフイーにかけ、非還元末端グルコースに２−ピ
リジルアミノ基が導入されたマルトトリオース誘
導体（FG3、下記構造式）及び還元末端グルコ
ースに２−ピリジルアミノ基が導入されたマルト
テトラオース誘導体（FG4、下記構造式）の生
成量をピーク面積から求める。高速液体クロマト
グラフイーの測定条件は下記の通りである。 カラム及び充填剤：オクタデシルシランを結合
させた逆相型ゲル（商品名Cosmosil ₅C₁₈、
Nakarai Chem.Ltd）を充填したカラム（４×
150mm） 溶出液：0.05％１−ブタノールを含む0.10M酢
酸 流速：2.0ml／分 検出：螢光検出器 励起波長 320nm、螢光波長 400nm (ニ) 計算 高速液体クロマトグラフイーによつて求められ
たFG3とFG4の生成量の比を計算する。膵由来α
−アミラーゼの比率と、FG3とFG4の生成量比の
関係から第１図に示すような検量線が得られ、標
準と同様に操作した血清のFG3とFG4の生成量比
から、この検量線を用いて膵由来α−アミラーゼ
の比率を求める。 血清中の膵由来α−アミラーゼの比率が求まる
と、通常用いられているα−アミラーゼ活性測定
法による総アミラーゼ活性測定値より、膵由来及
び唾液腺由来α−アミラーゼ活性値を算出するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於いて、各標準液につい
て高速液体クロマトグラフイーにより求めたFG3
とFG4との生成量比（縦軸）とこれに対する膵由
来α−アミラーゼ活性の百分率（横軸）との関係
をプロツトしたものである。第２図、第３図は、
それぞれＯ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジ
ル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）
−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルシ
トール（実施例１に於いて得られた化合物）の赤
外線吸収スペクトルとD₂Ｏ中の¹³Ｃ−NMRスペ
クトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコースが６個からなる直鎖状オリゴ糖の
   非還元末端グルコースの６位の１級アルコール
   （−CH₂OH）が一般式−CH₂Ｒで表わされる基
   で置換され、更に還元末端グルコースがグリシト
   ールに還元された、下記構造式〔〕を有するオ
   リゴ糖誘導体。 構造式〔〕 〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリ
   ジルアミノ基及び【式】な る基の如く螢光性を有する置換基、若しくは、ア
   ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリ
   ノ基、カルボキシフエニルアミノ基の如くUV吸
   収を有する置換基を表わす。〕 ２ 基質に下記構造式〔〕で示されるオリゴ糖
   誘導体を用い、α−アミラーゼの加水分解作用を
   受けて生じる分解生成物を測定することによつ
   て、ヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来
   α−アミラーゼの分別測定を行うことを特徴とす
   る、α−アミラーゼアイソザイムの分別測定法。 〔式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリ
   ジルアミノ基及び【式】な る基の如く螢光性を有する置換基、若しくは、ア
   ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリ
   ノ基、カルボキシフエニルアミノ基の如くUV吸
   収を有する置換基を表わす。〕 ３ α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ
   る分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラ
   フイーを用いる特許請求の範囲第２項に記載のα
   −アミラーゼアイソザイムの分別測定法。 ４ α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ
   る分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラ
   フイーを用い、基質に導入したピリジルアミノ基
   又は【式】なる基の螢光性 を利用して検出を行う特許請求の範囲第２項又は
   第３項に記載のα−アミラーゼアイソザイムの分
   別測定法。 ５ α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ
   る分解生成物の分別測定に高速液体クロマトグラ
   フイーを用い、基質に導入したアニリノ基、メチ
   ルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボキ
   シフエニルアミノ基等のUV吸収を利用して検出
   を行う特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の
   α−アミラーゼアイソザイムの分別測定法。