JPH064662B2 - 修飾オリゴサッカライドの分別精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は修飾されたオリゴサッカライドの新規な分別精
製方法に関する。詳しくは、α−アミラーゼ活性の測定
及びヒトのα−アミラーゼの各アイソザイム即ち膵由来
α−アミラーゼと唾液腺由来α−アミラーゼ活性を分別
測定する際に、基質として使用する修飾オリゴサッカラ
イドの分別精製方法に関する。

生体試料など被検試料、特にヒトの唾液、膵液、血液、
尿中のα−アミラーゼ活性は医学上の診断において重要
である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎においては、
血液や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比べて著
しい上昇を示す。

更に、例えば血中α−アミラーゼ活性をアイソザイムに
分離して測定することが高アミラーゼ血症の解析や病態
の解明に重要であり、日常臨床検査にも応用されてい
る。

α−アミラーゼ活性の測定方法については、これまで種
々の方法が発表されているが、使用する基質によって、
でんぷん、アミロース、アミロペクチン等の長鎖の天然
物及びその修飾物を使用する方法と、グルコース残基数
が４〜７個のオリゴサッカライド及びその誘導体を使用
する方法の２種に大別できる。

本発明者らは、これまで数種の新規な修飾オリゴサッカ
ライドを合成し、これを用いるα−アミラーゼ活性の測
定方法をいくつか発表している。

例えば、α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グルコ
ースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサッカライドの非
還元末端グルコースの６位の一級アルコール（−ＣH₂Ｏ
Ｈ）が一般式−ＣH₂Ｒで表わされる基で置換された下記
構造式(I)を有するオリゴサッカライド誘導体を、基質
として使用することを特徴とするα−アミラーゼ活性の
測定方法がある。（特開昭５９−５１８００号） （式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｎは２〜５
の整数であり、Ｒは、例えばピリジルアミノ基を表わ
す。） 更に、α−アミラーゼアイソザイムの新規な分別測定方
法として、下記構造式(II)及び(III)で示される２種の
オリゴ糖誘導体を組合わせて用い、この基質にα−アミ
ラーゼが作用して起こる糖転位反応により生成した下記
構造式(IV)で示されるオリゴ糖誘導体が更にα−アミラ
ーゼの加水分解作用を受けて生じる加水分解生成物を測
定するか又は下記構造式(IV)で示されるオリゴ糖誘導体
を用い、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる
分解生成物を測定することによってヒト膵由来α−アミ
ラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラーゼの分別測定を行
なう方法に関して特許出願している。（特願昭５８−１
３８３４４号）。

（式中R₁，R₂は２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルア
ミノ基の如く蛍光性を有する置換基、若しくはアニリノ
基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カルボ
キシフェニルアミノ基の如くＵＶ吸収を有する置換基を
表わす。） さらに、この方法を発展させて下記構造式(V)で示され
るオリゴサッカライド誘導体を用いてα−アミラーゼア
イソザイム、特にヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液
腺由来α−アミラーゼを分別測定する方法に関しても特
許出願している。

（特願昭５８−２０８０７０号） （式中、Ｒは２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミ
ノ基及び なる基の如く蛍光性を有する置換基、若しくは、アニリ
ノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基、カル
ボキシフェニルアミノ基の如くＵＶ吸収を有する置換基
を表わす。） これらのオリゴサッカライド誘導体は極めて有用ではあ
るが、製造方法においてグルコース鎖長の均一なオリゴ
サッカライド誘導体を得る必要があり、このためには分
別法としてゲル過法が最善の方法と考えられていた。
ゲル過法は、分子量の違いに基づく分別に通常用いら
れる方法であり、この種のオリゴサッカライド誘導体の
分別法として、従来から広く用いられている。しかしな
がら、この方法は分別時間が長く、手法に専門的な技術
が必要等の問題があり工業的規模での大量製造法には向
かなかった。特に、オリゴサッカライドの分別に於い
て、分子量が近接したものでは分離精度が悪く、カラム
の層長を長くしたり、あるいは２回以上カラムを通す必
要があり、操作が煩雑で、且つ精製効果も充分なもので
はなかった。

本発明者らは、オリゴサッカライドの分別精製方法に関
して鋭意研究を行ない、通常分子量の違いに基づく分別
方法でしか分別できないと考えられていたグルコース鎖
長の異なるオリゴサッカライド誘導体が、イオン交換ク
ロマトグラフィーで分別できることを見出し、本発明を
完成するに到った。

即ち、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーによっ
て分別することを特徴とする、(i)非還元末端グルコー
ス残基の６位の水酸基が２−ピリジルアミノ基、３−ピ
リジルアミノ基及び なる基から選ばれた蛍光性を有する置換基、若しくはア
ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基及
びカルボキシフェニルアミノ基から選ばれたＵＶ吸収を
有する置換基で置換され、且つ還元末端グルコース残基
の１位の水酸基がニトロフェニル基で置換されていても
よい、構成糖の鎖長が４〜７個の修飾マルトオリゴサッ
カライド又は(ii)１位の水酸基が２−ピリジルアミノ
基、３−ピリジルアミノ基及び なる基から選ばれた蛍光性を有する置換基、若しくはア
ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基及
びカルボキシフェニルアミノ基から選ばれたＵＶ吸収を
有する置換基で置換されたグリシトールが還元末端に結
合した、構成糖の鎖長が４〜７個の修飾マルトオリゴサ
ッカライドの分別精製方法、の発明である。

本発明に係るイオン交換クロマトグラフィーによる分別
精製方法は、分別時間が短く、操作が簡単等の利点を有
し、工業的規模での製造に適しており、しかも、純度の
極めて高い修飾オリゴサッカライドを効率よく得ること
ができる。

以下に、具体例を挙げて、本発明の実施態様を示す。

合成例1. 非還元末端グルコースの６位の一級アルコールが２−ピ
リジルアミノ基で置換されたオリゴサッカライド誘導体
を公知文献〔ジャーナル オブザ バイオケミストリー
９３巻 １０５５頁（１９３８年）〕に従い合成す
る。

即ち、デキストリンのグルコース残基の６位の一級アル
コールをジメチルスルホキシドとＮ，Ｎ′−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドで部分酸化後、２−アミノピリジ
ンとシッフの塩基を形成させ、シアノボロハイドライド
で還元し、２−アミノピリジル基が導入されたデキスト
リンを得る。これにバチルス属由来液化型アミラーゼと
グルコースアミラーゼを作用させ、非還元末端グルコー
スに２−ピリジルアミノ基が導入されたオリゴサッカラ
イド誘導体の混合液を得る。１００℃、１０分の加熱処
理で、添加したアミラーゼとグルコアミラーゼを変性さ
せた後、過して不溶物を除く。次いで、この液を本
発明の方法、即ち、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーにより分別精製する。

合成例2. 非還元末端グルコースの６位の一級アルコールが２−ピ
リジルアミノ基で置換され、さらに還元末端グルコース
がグリシトールに還元されたオリゴサッカライドの誘導
体を公知文献〔ジャーナル オブ ザ バイオケミスト
リー ９３巻、１０５５頁（１９３８年）〕に記載のオ
リゴ糖誘導体の合成法に準じて合成する。

即ち、デキストリンのグルコース残基の６位の一級アル
コールをジメチルスルホキシドと、Ｎ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドで部分酸化後、２−アミノピリ
ジンを作用させシッフ塩基とし、シアノ水素化ホウ素ナ
トリウムで還元して、２−ピリジルアミノ基が導入され
たデキストリンを得る。次いで、これにバチルス属由来
液化型アミラーゼとグルコアミラーゼを作用させ、酵素
的加水分解を行い、凍結乾燥により非還元末端グルコー
スに２−ピリジルアミノ基が導入されたオリゴ糖を得
る。このオリゴ糖誘導体５mgを水１mlで溶解した溶液
に、2.5mg／mlの水素化ホウ素ナトリウム水溶液を２ml
加え、４℃で１８時間反応させ、還元末端グルコースを
グリシトールに還元した後、酢酸１００μｌを加え過剰
の水素化ホウ素ナトリウムを分解し、目的としたオリゴ
サッカライドの誘導体の混合物を得る。次いで、これを
本発明の方法、即ち、イオン交換クロマトグラフィーに
より分別精製する。

合成例1.及び合成例2.に於けるイオン交換クロマトグラ
フィーの条件の一例を示せば、イオン交換樹脂として、
例えばスチレン−ジビニルベンゼンスルホン酸型強酸性
陽イオン交換樹脂を用いる。溶離液としては0.01Ｍピリ
ジン−酢酸緩衝液pH4.0〜7.0のものが分離可能に優れて
いるが、特にこれらに限定されるものではない。

検出は通常ＵＶ法、あるいは蛍光法で行われる。例え
ば、上記合成例１，２において検出に利用するために置
換基として導入した２−ピリジルアミノ基は、ＵＶ法と
しては３１０nmに最大吸収波長、あるいは蛍光法として
は励起波長、蛍光波長をそれぞれ３２０nm、４００nmに
有しているのでこれらの波長を用いて測定する。

本発明は、本発明者らが独自の知見に基づき完成した修
飾されたオリゴサッカライドの分別精製方法に関するも
のであり、α−アミラーゼ活性の測定及びヒトα−アミ
ラーゼの各アイソザイム活性の分別測定の際に有用な基
質を簡単な操作で、且つ効率よく分別精製する方法を提
供するものであり、工業的規模によるこれらオリゴサッ
カライド誘導体の製造を可能とした点に於いて、斯業に
貢献するところ甚だ大なるものがある。

以下に実施例を示し本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例1. ジメチルスルホキシド３８mlにアミロース２ｇとＮ，
Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド３ｇを溶解し、
これにジクロル酢酸0.4mlとジメチルスルホキシド４ml
の混合液を加え、よく混合し２０〜２５℃で５０分間反
応させる。メタノール５mlのシュウ酸（２水塩）1.2gを
溶解した液を加え、反応を停止する。この反応混合液に
２−アミノピリジン溶液（２−アミノピリジン8.5g、水
１２ml、酢酸３mlそしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム
3.2gを混合した液）を加え９０℃で３０分間加熱する。
加熱反応後、水３００mlを加え、沈澱を生じさせ別す
る。この液を６規定塩酸でpH1.0とし、過剰のシアノ
水素化ホウ素ナトリウムを分解後、１規定水酸化ナトリ
ウムでpH7.0に調整し、真空で濃縮する。この濃縮物を
水に溶解し、ゲル過する。カラムは１０ｍＭ重炭酸ア
ンモニウムで平衡化したBiogel Ｐ−２（Bio Rad社
製）を充填した直径4.5cm、高さ９０cmのものを使用
し、高分子画分を集め凍結乾燥した。

ここでの収量は約1.6gであり、0.1Ｍ酢酸中での３１０n
mの吸光度から修飾はグルコース単位で7.4％であった。

この修飾アミラロース1.5gを水１６０mlに溶解し、１規
定塩酸でpHを4.8とする。これにRhiZopus niveus由来
のグルコアミラーゼ１０mgを加え、４０℃、５時間イン
キュベートする。反応後、１規定水酸化ナトリウムでpH
6.0とし、Bacillus subtilis由来の液化型α−アミラ
ーゼを0.013％含む0.1Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（pH6.
0）を１６ml加える。４０℃、１時間インキュベートす
る。その後、１００℃で１０分間加熱し酵素を不活性化
し、１規定塩酸でpHを4.8とする。この液に５mgのRhizo
pus niveus 由来のグルコアミラーゼを加え、４０
℃、５時間インキュベートする。その後、６００mgの水
素化ホウ素ナトリウムを加え、２０〜２５℃で３時間反
応させる。２００mlの１規定塩酸を加えて過剰の水素化
ホウ素ナトリウムを分解した後、１規定水酸化ナトリウ
ムでpH4.0とする。水で７５０mlにする。この２５０ml
を0.1Ｍピリジン一酢酸緩衝液pH5.6で平衡化した強酸性
陽イオン交換樹脂Dowex 50W×2（Dow Chemical社製）
を充填したカラムを用いイオン交換クロマトグラフィー
を行なう。カラムは直径1.5cm、高さ１２４cmのものを
使用した。溶出は0.1Ｍピリジン−酢酸緩衝液pH5.6と0.
3Ｍピリジン−酢酸緩衝液PH5.6との直線的濃度勾配で行
なった。検出は３１０nmのＵＶ吸収で行なった。この検
出結果を第１図に示す。

第１図に於て、ＦＧ４Ｒは、Ｏ−６−デオキシ−６−
〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｄ−グリシトールの画分を、ＦＧ５Ｒは、Ｏ−６−デオ
キシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グリシトールの画分を、ＦＧ６Ｒは、Ｏ−６
−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ
−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｄ−グリシトールの画分をそれぞれ示す。

また、これらの収量は、ＦＧ４Ｒは約３mg、ＦＧ５Ｒは
約６０mg、ＦＧ６Ｒは約２０mgである。

尚、精製前後のＦＧ４Ｒ、ＦＧ５Ｒ及びＦＧ６Ｒの各純
度は以下の通りである。

これらの結果から明らかな如く、本発明により、ＦＧ４
Ｒ，ＦＧ５Ｒ及びＦＧ６Ｒを効率よく精製し得ることが
判る。

実施例2. メチルスルホキシド３８mlにアミロース２ｇとＮ，Ｎ′
−ジシクロヘキシルカルボジイミド３ｇを溶解し、これ
にジクロル酢酸0.4mlとジメチルスルホキシド４mlの混
合液を加え、よく混合し、２０〜２５℃で５０分間反応
させる。メタノール５mlにシュウ酸（２水塩）1.2ｇを
溶解した液を加え、反応を停止する。この反応混合液に
２−アミノピリジン溶液（２−アミノピリジン8.5ｇ、
水１２ml、酢酸３mlそしてシアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム3.2ｇを混合した液）を加え、９０℃で３０分間加熱
する。加熱反応後、水３００mlを加え、沈澱を生じさ
せ、別する。この液を６規定塩酸でpH1.0とし、過
剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを分解後、１規定水
酸化ナトリウムでpH7.0に調整し、真空で濃縮する。こ
の濃縮物を水に溶解し、ゲル過する。カラムは１０ｍ
Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡化したBiogel Ｐ−２（Bi
o Rad社製）を充填した直径4.5cm、高さ９０cmのものを
使用し、高分子画分を集め凍結乾燥した。

ここでの収量は約1.6ｇであり、0.1Ｍ酢酸中での３１０
nmの吸光度から修飾はグルコース単位で7.4％であっ
た。

この修飾アミロース1.5ｇを水１６０mlに溶解し、１規
定塩酸でpHを4.8とする。これにPhizopus niveus 由来
のグルコアミラーゼ１０mgを加え４０℃、５時間インキ
ュベートする。反応後、１規定水酸化ナトリウムでpH6.
0としBacillus subtilis由来の液化型α−アミラーゼを
0.013％含む0.1Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（pH6.0）を１
６ml加える。４０℃、１時間インキュベートする。その
後、１００℃で１０分間加熱し酵素を不活性化し、１規
定塩酸でpHを4.8とする。この液に５mgのRhizopus nive
us由来のグルコアミラーゼを加え４０℃、５時間インキ
ュベートする。この液を水で７５０mlにする。この２５
０mlを0.1Ｍピリジン−酢酸緩衝液pH5.6で平衡化した強
酸性陽イオン交換樹脂Dowx５０Ｗ×２（Dow Chemicai社
製）を充填したカラムを用いイオン交換クロマトグラフ
ィーを行う。カラムは直径1.5cm、高さ１２４cmのもの
を使用した。溶出は0.1Ｍピリジン−酢酸緩衝液pH5.6と
0.35Ｍピリジン−酢酸緩衝液pH5.6との直線的濃度勾配
で行なった。検出は３１０nmのＵＶ吸収で行なった。こ
の検出結果を第２図に示す。

第２図に於て、ＦＧ４ＲはＯ−６−デオキシ−６−
〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｄ−グルコピラノースの画分を、ＦＧ５Ｒは、Ｏ−６−
デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコピラノースの画分を、ＦＧ６は、Ｏ−
６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｄ−グルコピラノースの画分をそれぞれ示す。

また、これらの収量は、ＦＧ４は約４mg、ＦＧ５は約６
５mg、ＦＧ６は約２５mgである。

尚、精製前後のＦＧ４，ＦＧ５及びＦＧ６の各純度は以
下の通りである。

これらの結果から明らかな如く、本発明により、ＦＧ
４，ＦＧ５及びＦＧ６を効率よく精製し得ることが判
る。

実施例3. メチルスルホキシド76mlにアミロース４ｇとＮ，Ｎ−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド６ｇを溶解し、これにジ
クロル酢酸0.8mlとジメチルスルホキシド８mlの混合液
を加え、よく混合し、20〜25℃で５０分間反応させる。
メタノール１０mlにシュウ酸（２水塩）2.4ｇを溶解し
た液を加え、反応を停止する。この反応混合液に２−ア
ミノピリジン溶液（２−アミノピリジン17g、水24ml、
酢酸３mlそしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム6.4ｇを
混合した液）を加え、90℃で30分間加熱する。加熱反応
後、水600mlを加え沈澱を生じさせ、瀘別する。この瀘
液を６規定塩酸でpH1.0とし、過剰のシアノ水素化ホウ
素ナトリウムを分解後、１規定水酸化ナトリウムでpH7.
0に調整し、真空で濃縮する。この濃縮物を水に溶解
し、ゲル濾過する。カラムは10mM重炭酸アンモニウムで
平衡化したBiogel Ｐ−２（Bio Rad社製）を充填した
直径4.5cm、高さ90cmのものを使用し、高分子画分を集
め凍結乾燥した。

ここでの収量は約3.0ｇであり、0.1Ｍ酢酸中での310nm
の吸光度から修飾はグルコース単位で7.6％であった。

この修飾アミロース2.4gをイオン交換水70mlに溶解し、
pHを塩酸で4.8とする。これにグルコアミラーゼを20mg
添加し、37℃で20時間反応させる。次いでこれに、148m
gの水素化ホウ素ナトリウムを３mlの0.5Ｍ水酸化ナトリ
ウム溶液に溶解した溶液を添加し、室温で20分間放置し
反応液中のグルコースをグリシトールに還元する。12Ｍ
の塩酸を加え反応液を酸性として過剰の水素化ホウ素ナ
トリウムを分解後、４水酸化ナトリウム溶液でpHを5.5
とする。この溶液に1.2ｇのｐ−ニトロフェニル α−
グルコピラノシドを溶解後、4.3単位のシクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴase）を添加
し、37℃で３時間反応させる。反応後12Ｍの塩酸を加
え、pHを3.0としＣＧＴase反応を停止させる。この溶液
を水で1000mlとし、その330mlを以下の方法により精製
した。

即ち、0.01Ｍピリジン−酢酸緩衝液（pH5.5）で平衡化
した強酸性陽イオン交換樹脂SP−セファデックスC-25
（ファルマシア社製）を充填したカラムを用い、上記反
応液330mlのイオン交換クロマトグラフィーを行う。カ
ラムは、直径1.8cm、高さ124cmのものを使用した。溶出
は、0.01Ｍピリジン−酢酸緩衝液（pH5.5）と0.3Ｍピリ
ジン−酢酸緩衝液（pH5.5）との直線的濃度勾配で行っ
た。この検出結果を第３図に示す。

第３図に於て、ＦＧ４Ｐは、ｐ−ニトロフェニル−Ｏ−
６−デオシキ−６−［（２−ピリジル）アミノ］−α−
Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの画
分を、ＦＧ５Ｐは、ｐ−ニトロフェニルＯ−６−デオシ
キ−６−［（２−ピリジル）アミノ］−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの画分をそれぞれ示す。

また、これらの収量は、ＦＧ４Ｐは約８mg、ＦＧ５Ｐは
約18mgである。

尚、精製前後のＦＧ４Ｐ及びＦＧ５Ｐの各純度は以下の
通りである。

これらの結果から明らかな如く、ＦＧ４Ｐは、精製によ
り11.5倍（15/1.3倍）純度が高くなり、また、ＦＧ５Ｐ
は、精製により7.6倍（23/2倍）純度が高くなっている
ので、本発明の精製法は、ＦＧ４ＰやＦＧ５Ｐについて
もＦＧ４Ｒ（又はＦＧ４）やＦＧ５Ｒ（又はＦＧ５）と
同程度若しくはそれ以上に有効であることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例1.に於けるクロマトグラム（曲線
(a)）、及びその際の溶出液中のピリジン濃度直線（直
線(b)）を示すものであり、ＦＧ４Ｒは、Ｏ−６−デオ
キシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グル
コピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グリシトールの画分を、ＦＧ５Ｒは、
Ｏ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−Ｄ−グリシトールの画分を、ＦＧ６Ｒ
は、Ｏ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミ
ノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グリシトールの画分をそれぞれ示す。 また、横軸はフラクションナンバー（９ml/tube）を示
し、縦軸は曲線(a)に於ける３１０nmの吸光度（Ｏ
Ｄ）、及び直線(b)に於けるピリジン濃度（mol/）を
示す。 第２図は、実施例2.に於けるクロマトグラム（曲線
(c)）、及びその際の溶出液中のピリジン濃度直線（直
線(d)）を示すものであり、ＦＧ４はＯ−６−デオキシ
−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコピラノースの画分を、ＦＧ５Ｒは、Ｏ
−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミノ〕−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グルコピラノースの画分を、ＦＧ６Ｒ
は、Ｏ−６−デオキシ−６−〔（２−ピリジル）アミ
ノ〕−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｄ−グルコピラノースの画分をそれぞれ示
す。 また、横軸はフラクションナンバー（９ml/tube）を示
し、縦軸は曲線(c)に於ける３１０nmの吸光度（ＯＤ）
及び直線(d)に於けるピリジン濃度（mol/）を示す。 第３図は、実施例3.に於けるクロマトグラム（曲線
(e)）及びその際の溶出液中のピリジン濃度直線（直線
(f)）を示すものであり、ＦＧ４Ｐは、ｐ−ニトロフェ
ニル Ｏ−６−デオシキ−６−［（２−ピリジル）アミ
ノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシドの画分を、ＦＧ５Ｐは、ｐ−ニトロフェニル Ｏ
−６−デオシキ−６−［（２−ピリジル）アミノ］−α
−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−
（１→４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシドの画分をそ
れぞれ示す。 また、横軸はフラクションナンバー（9.2ml/tube）を示
し、縦軸は曲線(e)に於ける320nmの吸光度（ＯＤ）及び
直線(f)に於けるピリジン濃度（mol/）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/40 6807−4Ｂ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】イオン交換クロマトグラフィーによって分
   別することを特徴とする、(i)非還元末端グルコース残
   基の６位の水酸基が２−ピリジルアミノ基３−ピリジル
   アミノ基及び なる基から選ばれた蛍光性を有する置換基、若しくはア
   ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基及
   びカルボキシフェニルアミノ基から選ばれたＵＶ吸収を
   有する置換基で置換され、且つ還元末端グルコース残基
   の１位の水酸基がニトロフェニル基で置換されていても
   よい、構成糖の鎖長が４〜７個の修飾マルトオリゴサッ
   カライド、又は(ii)１位の水酸基が２−ピリジルアミノ
   基、３−ピリジルアミノ基及び なる基から選ばれた蛍光性を有する置換基、若しくはア
   ニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキシアニリノ基及
   びカルボキシフェニルアミノ基から選ばれたＵＶ吸収を
   有する置換基で置換されたグリシトールが還元末端に結
   合した、構成糖の鎖長が４〜７個の修飾マルトオリゴサ
   ッカライドの分別精製方法。
2. 【請求項２】イオン交換クロマトグラフィーに用いるイ
   オン交換樹脂が強酸性陽イオン交換樹脂である、特許請
   求の範囲第１項に記載の分別精製方法。
3. 【請求項３】イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶
   出液のpHが4.0〜7.0である、特許請求の範囲第１項又は
   第２項に記載の分別精製方法。