CN102325790A

CN102325790A - 应用酚可溶性调控蛋白研制疫苗

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Publication number: CN102325790A
Application number: CN2009801560811A
Authority: CN
Inventors: 弗朗西斯科·博拉斯·奎斯塔; 伊纳斯·诺莉娅·卡萨雷斯·拉加尔; 马里亚德尔卡门·杜兰特斯·德尔加多; 胡安·何塞·拉萨尔特·萨加斯蒂韦尔萨; 克劳德·勒克莱尔; 赫苏斯·玛丽亚·普列托·巴尔图埃彻; 巴勃罗·萨罗韦·乌加里萨
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2012-01-18
Also published as: WO2010063865A1; US20110268757A1; MX2011005915A; AU2009323996A1; CA2745603A1; BRPI0923249A2; JP2012510284A; EP2374813A1

Abstract

本发明涉及通过将抗原肽共价连接到调控蛋白衍生肽（PSM、酚可溶性调控蛋白）来提高抗原肽的免疫原性的方法。特别是，PSMα、PSMγ和PSMδ肽与抗原（来自病原体或肿瘤相关蛋白）结合提高了抗原在体内激活免疫应答的能力。因此，PSMα、PSMγ和PSMδ肽结合到这些抗原上可用于研制预防或治疗传染病或癌症的疫苗。

Description

应用酚可溶性调控蛋白研制疫苗

技术领域

本发明通常涉及免疫领域，特别涉及通过将抗原肽共价结合到调控蛋白衍生肽(PSM，酚可溶性调控蛋白)上从而提高抗原肽的免疫原性的方法。特别地，PSMα、PSMγ和PSMδ肽与抗原(来自病原体或与肿瘤相关的蛋白质)的结合提高了抗原在体内激活免疫应答的能力。因此，结合到这些抗原上的PSMα、PSMγ和PSMδ肽能够用于研制预防或治疗传染病或癌症的疫苗。

技术背景

病原体和癌症仍然是全世界死亡的主要原因。研制疫苗来预防没有接种疫苗的疾病(如AIDS或疟疾)，或是治疗慢性疾病或癌症，以及提高现有疫苗的效力和安全性，仍然是优先的。在多数情况下，这类疫苗的研制需要能够特异性刺激CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的策略。

CTL通过呈递给MHC I类分子的关联小肽的T细胞受体(TCRs)来激活。这些肽-MHC I类复合物呈现在抗原-呈递细胞(APCs)的表面，所述细胞同样能够对CTL的最优的激活提供刺激信号。

树突细胞(DCs)是最有效的抗原呈递细胞，并且具有独特的与非活化的T淋巴细胞(初始型T淋巴细胞)相互作用，并启动初次免疫应答，激活CD4+辅助性T淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的能力。

不存在炎症和免疫应答时，树突细胞通过血液、周缘组织、淋巴和二级淋巴器官移动。在周缘组织中，树突细胞捕获自身和外来抗原。捕获的抗原用蛋白水解肽处理，传递给MHC I类和II类分子(分别用于激活CD8+或CD4+T淋巴细胞。抗原捕获、降解和装载的过程被称为抗原呈递。但是，不存在刺激时，外周树突细胞无效率地呈递抗原。病原体的外源性信号或内源性的信号诱导树突细胞，使其启动被称为成熟作用的发展过程，该过程使树突细胞转变为APC和T淋巴细胞激活剂。

细菌和病毒产品，以及炎症细胞因子和其它自身分子，通过与固有树突细胞的表面受体直接相互作用来诱导树突细胞的成熟。T淋巴细胞，通过依赖CD40或不依赖CD40的途径，内皮细胞通过引导细胞到细胞接触并且通过细胞因子的分泌作用来促使树突细胞的最终成熟。危险信号出现后很短的时间，抗原捕获的效率，胞内运输和降解，以及MHC分子的胞内运输都会被调整。提升了肽装载，以及MHC分子的半衰期和向细胞表面的转移。同样提高了T细胞共刺激分子表面上的表达。这样，树突细胞转变成最有效的APC，并且只有一些能够激活非活化的T淋巴细胞和启动免疫应答。加上它们抗原呈递能力的调整，成熟也诱导了周缘组织中的树突细胞的大量迁移。趋化因子受体和粘附分子中的表达的调整，以及在细胞骨架组织中的重要的变化，促使树突细胞通过淋巴液转移至二级淋巴器官。

树突细胞响应两种信号：抗原的直接识别(通过受体以特异性识别的模式)，以及感染的间接识别(通过炎症细胞因子、内在细胞化合物以及特异的免疫应答)。应答这些信号，树突细胞被激活，并启动其成熟过程，该过程将树突细胞转变为有效的T细胞刺激物。DC成熟的最有效的信号之一是通过toll样受体TLR(TLR1-9)与其各自的配体的相互作用介导的(Kaisho和Akira综述，Biochimica et Biophysica Acta，2002：1589：1-13)。

将抗原肽靶向到MHC I类和/或MHC II类分子的一种最初的途径基于合成肽疫苗，其包含能够直接结合APC细胞表面分子的选择性表位。在一些情况下，这些肽达到了在鼠模型中保护肿瘤或消除病毒的作用，然而在另一些情况下，它们具有诱导耐受性。对人类不同类型的肽的研究已经达到了对癌症病人极小的临床反应。这种弱免疫原性能力可以归咎于这些肽一般不会激活树突细胞的成熟，从而导致在非免疫原性环境中发生抗原呈递，对抗原的无应答(无反应性)是更有利的。

可选地，已经描述了一些途径，其中通过使用组合物使肽靶向到APC细胞上，在所述组合物中，抗原肽具有对于APC表面受体有亲和性的第二化合物。从这个意义上讲，过去已经描述了利用TLR配体将免疫原性肽靶向到APC。

TLR在巨噬细胞和树突细胞中，以及在其它的例如B淋巴细胞等细胞中表达。一些TLR的配体已经经过了鉴定。这些配体多数来自病原体，但是在宿主上没有发现，这表明TLR对于检测侵入的微生物是必要的。通过TLR识别配体引起了先天免疫的快速激活，诱导促炎性细胞因子的产生并过调节共刺激分子。激活的先天免疫引起了有效的获得性免疫。

已经使用了不同的TLR配体来提高抗原的有效性，例如包括EDA(Lasarte等，J Immunol，2007，西班牙专利申请ES20050141)、鞭毛蛋白(Cuadros C等，Infect Immun.2004 May；72：2810-6)或CpGs(Tighe，H.等，2000.Eur J Immunol.30：1939)。

WO2005025614描述了佐剂组合物，其包括编码TLR激动剂的核酸和编码GM-CSF的核酸，尽管在该文献中没有提到可能提供GM-CSF作为TLR激动剂的融合蛋白。

WO2004060319描述了佐剂组合物，其包括TLR激动剂和TNF受体激动剂的组合，以提高对抗原的免疫应答，但是其中两个组分并没有共价连接。

WO07042583描述了抗丙型肝炎病毒的免疫刺激组合物，其包括TLR3激动剂(聚肌胞)，CD40激动剂和NS3多肽。其并未启示在该组合物的任意组分间形成的共价复合物。

WO06134190描述了免疫刺激化合物，其包括与TLR4有亲和力的纤连蛋白片段。该文献提到了将连接纤连蛋白片段和抗原共价偶联的可能性。但是，该文献没有提到使用TLR2激动剂或PSM的类似化合物。

WO2007103322描述了融合蛋白，其包括免疫原性多肽以及TLR5激动剂(Flagelin)或TLR2/6激动剂(Pam3Cys脂肽)之一，以及其诱导抗体应答免疫原性肽的用途。

WO2006083706描述了鉴定TLR2配体和分离一系列新的TLR2配体的筛选方法，以及共价缀合物，其包括这些配体和能够用于产生保护性免疫的抗原。

但是，还需要进一步的免疫原性组合物，其能够(i)运输抗原衍生的T淋巴细胞表位到APC(或DC)从而其能够在MHC I类和/或MHC II类分子上装载，(ii)传输合适的信号给DC来诱导其活化，因为在不存在成熟信号的条件下从抗原到达DC细胞，将导致耐受性而不会激活辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞，(iii)导致有效的免疫原性而不用考虑载体自身的在先的免疫性。

发明简述

一方面，本发明涉及一种缀合物包括：

(i)酚可溶性调控蛋白(PSM)或其功能等价变体，以及

(ii)一个或多个抗原肽。

其中组分(i)和(ii)共价连接，并且其中缀合物促进了对抗原肽的细胞毒性应答。

在另一些方面，本发明涉及多核苷酸或基因构建体，其包含编码本发明的缀合物的核酸序列，还涉及包含本发明的多核苷酸或基因构建体的载体，以及包含本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的宿主细胞。

另一方面，本发明涉及组合物，其包括，共同或单独的，

(a)本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体或宿主细胞，以及

(b)选自如下组中的第二组分

(i)一种或多种TLR激动剂，

(ii)一种或多种共刺激分子的激动剂抗体，

(iii)一种或多种细胞因子以及

(iv)(i)到(iii)提到的化合物的任意组合。

另一方面，本发明涉及获得抗原致敏的抗原呈递细胞的方法，其包括以下步骤：

(i)使抗原呈递细胞与本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或组合物接触，并且

(ii)分离抗原致敏的抗原呈递细胞。

另一方面，本发明涉及用本发明的方法获得的抗原致敏的抗原呈递细胞。

另一方面，本发明涉及药物组合物或疫苗，其包含缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞、组合物或抗原致敏的抗原呈递细胞。

另一方面，本发明涉及本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞、组合物、药物组合物、疫苗或抗原呈递细胞的医药用途。

另一方面，本发明涉及本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞、组合物、药物组合物，疫苗或抗原呈递细胞，其在诱导对于传染病、过敏性疾病或肿瘤疾病的细胞毒性应答的方法中的用途。

另一方面，本发明涉及本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞、组合物、药物组合物、疫苗或抗原呈递细胞，其用于体外方法中以促进通过抗原呈递细胞呈递抗原肽或促进抗原呈递细胞的成熟。

另一方面，本发明涉及缀合物，其包括：

(i)酚可溶性调控蛋白(PSM)或其功能等价变体，以及

(ii)生物活性化合物；

其中组分(i)和(ii)共价连接。

在另一些方面，本发明涉及包含编码本发明的非免疫原性缀合物的核酸序列的多核苷酸或基因构建体，包含本发明的多核苷酸或基因构建体的载体，包含本发明的多核苷酸或基因构建体的宿主细胞。

另一方面，本发明涉及包含本发明的非免疫原性缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体或宿主细胞以及药学上可接受的载体的药物制剂。

还一方面，本发明涉及本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或药物组合物的医药用途。

还一方面，本发明涉及本发明的非免疫原性的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或药物组合物，其用于治疗疾病的用途，所述疾病的特征在于细胞有不希望的增殖或不希望的活性，所述细胞选自CD4-、CD8-、CD19-、CD11c-、F4/8-或CD117-阳性细胞或其组合。

附图说明

图1.PSM肽结合到小鼠脾细胞。小鼠脾细胞(A、B、D和E)或来自骨髓的树突细胞(C和F)用戊二醛固定，并且随后用CFSEαMod-SIINFEKL肽(A、B和C)或用CFSEγMod-SIINFEKL肽(D、E和F)进行培养，包括PSMα或PSMγ肽共价连接到SIINFEKL肽并且在氨基末端用CFSE标记。作为对照，细胞同样用标记的对照肽CFSE-OVA(235-264)(A、C、D和F)进行着色。为了研究结合的特异性，在存在或不存在αMod-SIINFEKL(B)时培养CFSE标记的肽，或在存在或不存在用CFSE标记的γMod-SIINFEKL(D)肽作为竞争者时培养CFSE标记的肽。4℃下30分钟后，用PBS清洗两次，用流式细胞仪分析细胞。(G)用CFSEγMod-SIINFEKL肽和用藻红蛋白染色标记的抗CD4、CD8、CD11c、CD19、F480或GR1抗体对全部脾细胞的双重染色。图G的底部分布图表明这些表面标记物的阳性细胞的百分比，其用CFSEγMod-SIINFEKL肽进行了染色。

图2.PSM肽诱导源自骨髓的树突细胞的成熟并促进抗原呈递。编码IL-12蛋白质(p40)(A)或TNF-α(B)的信使RNA的表达。源自骨髓的树突细胞与50μM浓度的指示肽一起培养。培养14小时后，纯化细胞的RNA，进行反转录。用实时定量PCR进行IL12-p40和TNFα的mRNA的表达。(C)树突细胞的表面成熟标记物的表达。源自骨髓的树突细胞在存在指示肽的情况下按照(A)描述的进行培养。培养48小时后，使用特异性抗体，通过流式细胞仪分析指示标记物。(RFU：相对荧光单位)(D)体外检测抗原呈递。在存在或不存在10μM指示肽的条件下培养源自骨髓的树突细胞。40小时后，清洗细胞，以不同的浓度分配到96孔板中，并在存在获自转基因OT-1小鼠(其表达卵白蛋白的SIINFEKL肽的特异性的T受体)的10⁵T细胞/孔的条件下培养。72小时后，在培养物中加入氚标记胸腺嘧啶核苷，6小时后，收获细胞，用闪烁计数器(Topcount Packard)来分析掺入的胸苷。

图3.体内细胞特异性应答SIINFEKL肽的激活。C57BL/6用5nmol的指示肽加上50μg的聚肌胞进行免疫。接种后7天(A和B)或60天(C和D)，处死小鼠，进行ELISPOT测定(A和C)来定量每一组免疫小鼠中应答SIINFEKL肽或对应调控蛋白肽的产生IFNγ的细胞的数量。(B和D)测量用不同的肽免疫后诱导7天(B)或60天(D)抗SIINFEKL肽的特异性的细胞毒活性。通过对小鼠静脉内注射0.25μM CFSE或2.5μM CFSE以及SIINFEKL肽(10μg/ml)标记的脾细胞来实行体内裂解(体内杀死)试验。16小时后，处死小鼠，通过流式细胞仪分析脾细胞来定量SIINFEKL肽脉冲的细胞的裂解。

图4.体内细胞应答激活作用中的调控蛋白与不同TLR配体的协同作用。C57BL/6小鼠用5nmol的指示肽和结合50μg的指示TLR配体：PGN(肽多糖)、PIC(聚肌胞)、LPS(脂多糖)、EDA(纤连蛋白的额外结构域A)或CpG进行免疫。7天后，测定用不同的肽免疫后诱导产生的抗SIINFRKL肽的特异性细胞毒活性。通过对小鼠静脉内注射0.25μM CFSE或2.5μM CFSE以及SIINFEKL肽(10μg/ml)标记的脾细胞来实行体内裂解(体内杀死)试验。16小时后，处死小鼠，通过流式细胞仪分析脾细胞来定量SIINFEKL肽脉冲的细胞的裂解。

图5.防止肿瘤发展。(A)C57BL/6小鼠用使用5nmol的SIINFEKL肽、αMod加SIINFEKL(非共价连接)、αMod-SIINFEKL或SIINFEKL-αMod，所有的这些都联合50g的聚肌胞使用，进行皮下静脉免疫。一组小鼠仅接受聚肌胞，而另一组小鼠用PBS注射(作为肿瘤生长对照)。(B)C57BL/6小鼠用5nmol的SIINFEKL肽或用γMod-SIINFEKL结合聚肌胞进行皮下静脉免疫。一组小鼠仅接受聚肌胞，而另一组小鼠用PBS注射(作为肿瘤生长对照)。接种后7天，皮下注射5x10⁵(A)或7x10⁵(B)EG7OVA肿瘤细胞。用量尺来计量随后的肿瘤生长。绘制每种处理的小鼠生存Kaplan-Meier曲线。显示了αMod-SIINFEKL(A)和γMod-SIINFEKL(B)防止肿瘤攻击的结果。

图6A.用αMod-SIINFEKL肽加聚肌胞治疗证实患有EG7OVA肿瘤的小鼠。C57BL/6小鼠皮下注射5x10⁵EG7OVA肿瘤细胞。当肿瘤直径达到5mm时，用PBS进行处理或用指示肽+聚肌胞处理。随后的肿瘤生长用量尺来计量。绘制每种处理的小鼠生存Kaplan-Meier曲线。

图6B.用αMod-E7(49-57)肽结合聚肌胞进行免疫诱导了抗E7(49-57)肽的特异性细胞毒性应答并能够治疗携带TC1皮下肿瘤的小鼠。(A)C57B/6用5nmol的指示肽结合50μg的聚肌胞进行免疫。免疫后7天，用ELISPOT来测定抗细胞毒性肽E7(49-57)的诱导应答，以定量产生IFN-γ的细胞的数量。(B)、(C)和(D)C57B/6小鼠皮下注射5x10⁵TC-1肿瘤细胞(表达HPV-16E7蛋白)。25天后，当肿瘤直径为8mm时，小鼠用PBS(B)、E7(49-57)肽+50μg/ml聚肌胞(C)或αMod-E7(49-57)肽+50μg/ml聚肌胞(D)来进行静脉注射处理。7天后，小鼠再次用相同的免疫原进行二次免疫。定期测量肿瘤尺寸，用垂直的两条直径的平均值表示。每次处理包含了每组相对于总的小鼠的数量的无肿瘤的小鼠数量。

图7.使用α、γ或δ-衍生的调控蛋白肽结合p1073来体内诱导抗丙型肝炎NS3肽p1073的T细胞应答。

C57BL/6用5nmol的指示肽结合50μg的聚肌胞进行接种。7天后，处死小鼠，进行ELISPOT试验(A)来测量对来自丙型肝炎NS3蛋白质的肽p1073(1073)特异性的产生IFNγ的细胞的存在。使用用0.25μM CFSE或用2.5μMCFSE和肽p1073(10μg/ml)标记的脾细胞进行体内杀死试验(B)。

图8.TLR2KO小鼠中调控蛋白衍生肽诱导的细胞应答的激活。C57BL/6野生型小鼠或TLR2KO小鼠用5nmol的指示肽结合50μg的聚肌胞进行免疫。免疫后7天，处死动物，进行ELISPOT来定量应答SIINFEKL肽的产生IFNγ的细胞的数量。(B)测量用不同种类的肽免疫后诱导的抗SIINFEKL肽的特异性细胞毒性活性。通过对小鼠静脉内注射0.25μMCFSE或2.5μMCFSE以及SIINFEKL肽(10μg/ml)标记的脾细胞来实行体内裂解(体内杀死)试验。16小时后，处死小鼠，通过流式细胞仪分析脾细胞来定量SIINFEKL肽脉冲的细胞的裂解。

图9.PSM肽结合到来自TLR2敲除小鼠的脾细胞。来自TLR2KO小鼠的小鼠脾细胞用戊二醛固定，随后与CFSE αMod-SIINFEKL肽或与CFSEγMod-SIINFEKL肽一起进行培养。作为对照，细胞同样用标记的对照肽CFSE-OVA(235-264)进行染色或不处理(灰色虚线框)。4℃下培养30分钟后，用PBS清洗两次，用流式细胞仪分析细胞。

发明详述

本发明的作者已经展示了PSM肽能够运载抗原到抗原呈递细胞，激活其成熟，提高抗原呈递能力并因此促进免疫细胞对抗原应答的激活作用。该策略已经被证明对于诱导细胞毒性应答和抑制C57BL/6小鼠的肿瘤发展非常有效。但是，已经观察到，衍生自调控蛋白的肽的激活作用机理不依赖于TLR2。事实上，使用肽(所述肽包含结合到抗原的α或γ调控蛋白)对小鼠的免疫，即使在TLR2受体敲除的小鼠中也诱导了强的细胞应答。

1.本发明的缀合物

本发明的作者已经展示了包含酚可溶性调控蛋白和抗原肽的共价缀合物，其能够促进树突细胞的成熟以及共价连接到所述PSM上的肽的树突细胞对肽的呈递。

如本发明实施例2中所示，与仅用抗原性肽相比，包含PSM和肽的融合蛋白能够更高程度地促进树突细胞的成熟和抗原呈递。此外，本发明的实施例3显示了施用缀合物导致了强的和长期的细胞毒性应答，这种应答在施用包含非共价连接混合的PSM和抗原性肽的组合物时是观察不到的。

因此，第一方面，本发明涉及一种缀合物，其包括

(i)酚可溶性调控蛋白(PSM)或其功能等价变体，以及

(ii)一个或多个抗原肽。

其中组分(i)和(ii)共价连接，并且其中缀合物促进对于抗原肽的细胞毒性应答。

A.酚可溶性调控蛋白

本发明的缀合物的第一种组分对应于酚可溶性调控蛋白或其功能等价变体。此处用到术语“酚可溶性调控蛋白”和“PSM”不是特定的，其涉及不同的葡萄球菌属菌株(特别是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)分泌的细胞毒性肽家族的任一成员，其特征在于当使用热苯酚萃取时其能够分离进入有机相中。

PSM最初是由Mehlin等人(J.Exp.Med.，1999，189：907-917)鉴定为一种具有从表皮葡萄球菌细菌获得的炎症活性的多肽复合物，后来又确定其能够激活TLR2信号转导途径(Hajjar AM等，2001，J Immunol，166：15-19)。虽然表皮葡萄球菌细菌没有其它的葡萄球菌严重，但是感染该细菌还是可能导致败血症。该细菌释放不同的多肽，由于其在苯酚中的溶解性，通常被称为酚可溶性调控蛋白(PSM)。PSM具有至少4种组分，PSMα、PSMβ、PSMδ和PSMγ，它们都是具有22到54个氨基酸的小蛋白。已经描述了表皮葡萄球菌PSM诱导TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的生成，并激活巨噬细胞内的NF-κβ转录因子(Liles WC等，J.Leukoc.Biol.70：96-102)。

用于本发明的缀合物的优选的调控蛋白如表1所示

生物	名称	登录号	SEQ ID	序列
					表皮葡萄球菌RP62A	PSMα	YP_187680	1	MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK
表皮葡萄球菌RP62A	PSMβ1	YP_188322	2	MSKLAEAIANTVKAAQDQDWTKLGTSIVDIVESGVSVLGKIFGF
					表皮葡萄球菌RP62A	PSMβ1	YP_188320	3	MEQLFDAIRSVVDAGINQDWSQLASGIAGIVENGISVISKLLGQ
表皮葡萄球菌RP62A	PSMβ1	YP_188319	4	MELLTHLGVLIMKLFNAFKDILEAAITNDGTQLGASIVNIIESSVDMVNRFLGN
					表皮葡萄球菌RP62A	PSMβ1	YP_189947	5	MEHVSKLAEAIANTVSAAQAEDGAELAKSIVNIVANAGGIIQDIAHAFGY
表皮葡萄球菌RP62A	PSMβ1	YP_189944	6	MEHVSKLGEAIVDTVTAAQAEDGAELAKSIVNIVANAGGIIQDIAHAFGY
					金黄色葡萄球菌金黄亚种COL	抗蛋白	YP_186050	7	MTGLAEAIANTVQAAQQHDSVKLGTSIVDIVANGVGLLGKLFGF
金黄色葡萄球菌金黄亚种COL	抗蛋白	YP_186049	8	MEGLFNAIKDTVTAAINNDGAKLGTSIVSIVENGVGLLGKLFGF
					金黄色葡萄球菌金黄亚种MSSA476	PSMα4	PSMA4_STAAS	9	MAIVGTIIKIIKAIIDIFAK
金黄色葡萄球菌金黄亚种MSSA476	PSMα3	PSMA3_STAAS	10	MEFVAKLFKFFKDLLGKFLGNN
					金黄色葡萄球菌金黄亚种MSSA476	PSMα2	PSMA2_STAAS	11	MGIIAGIIKFIKGLIEKFTGK
金黄色葡萄球菌金黄亚种MSSA476	PSMα1	PSMA1_STAAS	12	MGIIAGIIKVIKSLIEQFTGK
					表皮葡萄球菌	PSMγ		13	MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKK
金黄色葡萄球菌	PSMδ		14	MSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK

表I酚可溶性调控蛋白

更优选的，用于本发明的缀合物中的PSM包括α-、γ-和δ-调控蛋白，分别对应SEQ ID NO：1、13和14。

表述PSM的“功能等价变体”指的是显示了与PSM基本相同生物活性的化合物。确定待测化合物是否是PSM的功能等价变体的合适的功能性试验为，例如，基于在THP-1细胞中PSM激活HIV-1LTR的能力以及PSM促进THP-1细胞分泌TNF-α的能力的试验，Mehlin等(J.Exp.Med.，1999，189：907-917)对这两种都进行了描述，基于在表达TLR2的细胞中能够促进NF-κB的活化(细胞短暂地被TLR2转染或细胞持续地表达TLR2)，Hajjar等(Journal of Immunology，2001，166：15-19)对此进行了描述。

适宜用作本发明的缀合物中的组分(i)的相关分子还包括那些与上述PSM基本上同源的序列。此处用到的表述“基本上同源”，指的是上述任一核酸序列当其具有与本发明的核酸序列至少60％，更有利地至少70％，优选至少85％，更优选至少95％序列同一性的核酸序列。与本发明的核酸序列基本上同源的核酸序列通常能够基于包含在所述核酸序列中的信息从产生本发明的多肽的生物体中分离获得，或者基于如SEQ ID NO：1-14所示的DNA序列构建获得，例如通过引入保守或非保守的取代。可能的修饰的其它例子包括在序列中插入一个或多个核苷酸，在序列的任一末端添加一个或多个核苷酸，或在序列的任一末端或内部缺失一个或多个核苷酸。使用计算机算法和本领域技术人员已经熟知的方法来确定两条多核苷酸之间的序列同一性。优选使用BLASTN算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)]。

具有对应的基本上同源的序列的合适的肽如表2所示。应用于本发明的优选的PSM同系物包括从金黄色葡萄球菌中分离得到的δ-细胞溶解素和δ-溶血素。

在一优选的具体实施方式中，本发明的缀合物的组分(i)是选自SEQ IDNO：1-26中所示的PSM。

生物	名称	登录号	SEQ ID	序列
					金黄色葡萄球菌	δ-溶血素	AAF43204	15	MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTK
金黄色葡萄球菌	δ-溶血素	AAG03054	16	MAQDIISTISDLVKWIIDTVNKFTK
					中间葡萄球菌	δ-溶血素	CAA11542	17	MAGDIVGTIGEFVKLIIETVQKF
溶血葡萄球菌	抗淋球菌蛋白1	P11697	18	MQKLAEAIAAAVQAGQDKDWGKMGTSIVGIVENGISVLGKIFGF
					溶血葡萄球菌	抗淋球菌蛋白2	P11698	19	MEKIANAVKSAIEAGQNQDWTKLGTSILDIVSNGVTELSKIFGF
溶血葡萄球菌	抗淋球菌蛋白3	P11699	20	MSKLVQAISDAVQAQQNQDWAKLGTSIVGIVENGVGILGKLFGF
					里昂葡萄球菌	SLUSHA	AAB49286	21	MSGIVDAITKAVQAGLDKDWATMATSIADAIAKGVDFIAGFFN
里昂葡萄球菌	SLUSHB	AAB49287	22	MSGIIEAITKAVQAGLDKDWATMGTSIAEALAKGIDAISGLFG
					里昂葡萄球菌	SLUSHC	AAB49288	23	MDGIFEAISKAVQAGLQKDWATMGTSIAEALAKGVDFIIGLGH
华纳葡萄球菌	δ-细胞溶解素	CAA11542	24	MAGDIVGTIGEFVKLIIETVQKF
					华纳葡萄球菌	δ-细胞溶解素I	CAA11543	25	MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK
华纳葡萄球菌	δ-细胞溶解素II	CAA11544	26	MTADIISTIGDFVKWILDTVKKFTK

表II.示出了与PSM高度序列相似度的细胞毒性肽

B.抗原肽

本发明的缀合物的组分(ii)是一种或多种抗原肽。此处所用的表述“抗原肽”应理解为刺激具有肿瘤或传染病的哺乳动物的免疫系统去攻击肿瘤并抑制其生长或破坏导致疾病的病原体的一种肽。因此，本发明使用的抗原是与治疗的动物上发现的特异性疾病相匹配的。

一般来说，肽抗原与PSM是异源的；也就是说，其不是PSM蛋白质本身或其片段，虽然在特定的情况下可能需要使用包含同一PSM的两个拷贝的融合蛋白，例如，为了诱导对PSM蛋白质本身的应答。抗原可从与PSM的相同生物体中分离获得。当抗原来自生产PSM的物种时，可能想要利用来自该物种的PSM，因为产生的抗PSM本身的任意免疫应答可能促进抗该生物体的保护机制。例如，当抗原来自金黄色葡萄球菌，PSM(如，α调控蛋白)优选也来自金黄色葡萄球菌。

应当理解的是抗原可以是完整的蛋白质、蛋白质的单独结构域、蛋白质的肽片段或包含多个表位(例如，从5到100个不同表位)的多表位融合蛋白。非必要的，多肽可能包括附加区段，例如，其能够包括至少4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90或甚至100或更多的片段，每一个都是病原体的自然存在的蛋白和/或天然发生的肿瘤抗原的一部分，其可能与其它的片段来源的蛋白质是相同的或者不同的。这些片段中的每一个长度至少为8个氨基酸，并且每个包含至少一个(优选2个或更多个)与其它区段的表位不同的表位。杂交多肽中的片段中的至少一个(优选至少两个或三个)可能包含，例如，3、4、5、6、7或甚至10或者更多表位，特别是I类或II类MHC结合表位。片段中的两个、三个或更多个在杂交多肽中可以是连续的，即，它们是首尾相连接的，在它们中间没有间隔子。可选的，可以用间隔氨基酸或间隔多肽来连接任意两个临近的片段。

抗原可以是，例如，但不限于，病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、分化抗原、肿瘤抗原、胚胎抗原、致癌基因或突变的肿瘤抑制基因抗原、由染色体易位导致的独特的肿瘤抗原和/或其衍生物。

病毒抗原

能够引起对抗病毒的免疫应答的病毒抗原包括HIV-1抗原，(例如tat、nef、gp120或gp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev)，人疱疹病毒，(例如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其衍生物，或即刻早期蛋白例如来自于HSV1或HSV2的ICP27、ICP47、ICP4、ICP36，巨细胞病毒，特别是人类的，(例如gB或其衍生物)，爱泼斯坦-巴尔病毒(例如gp350或其衍生物)，水痘带状疱疹病毒(例如gp1、II、I11和IE63)，或来自肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或肝炎核心抗原)，丙型肝炎病毒(例如核心、E1、NS3或NS5抗原)，来自副粘病毒例如呼吸道合胞体病毒(例如F和G蛋白质或其衍生物)，来自副流感病毒，来自风疹病毒(例如E1和E2蛋白质)，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18，如LI、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7)，黄病毒(例如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒细胞，例如HA、NP、NA、或M蛋白质，或其组合)，轮状病毒抗原(例如VP7sc以及其它轮状病毒元件)，等等(更多的病毒抗原的例子参见Fundamental Virology，Second Edition，eds.Fields，B.N.和Knipe，D.M.(Raven Press，New York，1991)。

在一优选的具体实施方式中，抗原肽来自丙型肝炎，在一更优选的具体实施方式中，肽来自丙型肝炎NS3蛋白质。在一更优选的具体实施方式中，抗原肽对应于HLA-A2-限制性NS3肽的1073-1081位氨基酸，其序列为CVNGVCWTV(SEQ ID NO：50)。

在一优选的具体实施方式中，抗原肽来自人乳头瘤病毒，在一更优选的具体实施方式中，来自人乳头瘤病毒16，在一更优选的具体实施方式中，肽来自人乳头瘤病毒E7蛋白质，在一个更优选的具体实施方式中，所述肽包括序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO：55)。

细菌抗原

本发明考虑使用的细菌抗原例如来自奈瑟菌属，包括淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌(转铁结合蛋白、乳铁结合蛋白、PiIC和粘附素)；来自酿脓链球菌(例如M蛋白或其片段以及C5A蛋白酶)；来自无乳链球菌、变形链球菌、杜克雷嗜血杆菌；莫拉菌属，包括卡他莫拉菌，还被称为粘膜炎布兰汉球菌(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵染素)；来自博德特菌属，包括百日咳杆菌(例如副百日咳和支气管炎博德特菌(例如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物、纤维状红细胞凝集素、腺苷酸环化酶，菌毛)；来自分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌、牛分支杆菌、麻风分枝杆菌、鸟分支杆菌、副结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌；军团菌属，包括嗜肺军团杆菌(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C、MPT 44、MPT59、MPT45、HSPIO，HSP65、HSP70、HSP 75、HSP90、PPD 19kDa[Rv3763]、PPD 38kDa[Rv0934])；来自埃希氏杆菌属，包括肠毒性大肠杆菌(例如定居因子，不耐热毒素或其衍生物，耐热毒素或其衍生物)，来自肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌的抗原(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)，来自弧菌属，包括霍乱弧菌(例如霍乱毒素或其衍生物)；来自志贺菌属，包括宋内志贺菌、痢疾志贺菌、弗氏志贺菌；来自耶尔森菌属，包括结肠炎耶尔森菌(例如Yop蛋白)；来自鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌的抗原；弯曲菌属，包括空肠弯曲菌(例如毒素、粘附素和侵染素)；来自沙门氏菌属，包括伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌；利斯特菌属，包括单增利斯特菌；螺旋菌属，包括幽门螺旋杆菌(如尿素酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；来自假单胞杆菌属，包括铜绿假单胞菌；葡萄球菌属，包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌；肠球菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌；梭状芽孢杆菌属，包括破伤风梭菌(如破伤风毒素和其衍生物)；来自肉毒梭菌(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)；来自艰难梭菌(例如肉毒毒素A或B及其衍生物)；来自芽孢杆菌属，包括炭疽杆菌(例如炭疽毒素及其衍生物)；棒状杆菌属，包括白喉棒杆菌(例如白喉毒素及其衍生物)；来自疏螺旋体属，包括伯氏疏螺旋体菌(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)；来自B garinii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，B.afzelii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，来自B andersonfi(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)，来自赫姆丝疏螺旋体；埃立克体属，包括马埃立克体和人类粒细胞埃立克体病的因子；立克次氏体属，包括立氏立克次氏体；衣原体属，包括沙眼衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)；来自肺炎衣原体(例如MOMP，肝素结合蛋白)，来自鹦鹉热衣原体；来自钩端螺旋体菌属，包括问号钩端螺旋体；密螺旋体属，包括苍白球螺旋体(例如罕见的外膜蛋白)，来自齿垢密螺旋体，猪痢疾密螺旋体的抗原；来自疟原虫属，包括恶性疟原虫的抗原；弓形虫原虫和刚地弓形虫(例如SAG2、SAGS、Tg34)；来自阿米巴属，包括痢疾阿米巴；巴贝斯虫属，包括田鼠巴贝斯虫；锥虫，包括克氏锥虫；梨形鞭毛虫属，包括肠兰伯式鞭毛虫；利什曼原虫属，包括硕大利什曼原虫；肺囊虫属，包括卡氏肺囊虫；毛滴虫属，包括阴道滴虫；血吸虫菌属，包括曼氏血吸虫，或源自酵母菌如念珠菌属，包括白色念珠菌；隐球菌属，包括新型隐球菌；来自结核分枝杆菌(如Rv2557、Rv2558、RPFs：Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA(Rv0467)、PstS1、(Rv0932)、SodA(Rv3846)、Rv2031c 16kDal.、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1)；来自衣原体(如高分子量蛋白质(HWMP)，ORF3(EP 366 412)，和公认的膜蛋白(Pmps)；来自链球菌属，包括肺炎链球菌(PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白、蛋白抗原肺炎球菌溶血素，其突变的去毒衍生物)；来自嗜血杆菌属，包括B型流感嗜血菌(例如PRP和其缀合物)；非典型流感嗜血杆菌(如OMP26，高分子量粘附素，P5，P6，蛋白D和脂蛋白D和丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽，或多个拷贝变体或其融合蛋白)，衍生自恶性疟原虫的抗原(如RTS.S、TRAP、MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其在疟原虫中的类似物)。

真菌抗原

本发明的缀合物和方法用的真菌抗原包括，但不限于，例如，念珠菌真菌抗原组分，组织胞浆菌真菌抗原如热休克蛋白60(HSP60)和其它组织胞浆菌真菌抗原组分；隐球菌真菌抗原如荚膜多糖和其它隐球菌真菌抗原组分；球孢子菌真菌抗原例如内孢囊抗原和其它球孢子菌真菌抗原组分；以及癣类真菌抗原如发癣菌素和其它球孢子菌真菌抗原组分。

原生动物及其它寄生物的抗原

原生动物抗原包括，但是不限于，恶性疟原虫抗原例如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子母细胞/配子表面抗原、血-阶段(blood-stage)抗原pf，55/RESA及其它疟原虫的抗原组分；弓形体抗原例如SAG-I、p30及其它弓形属抗原组分；血吸虫抗原例如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白、及其它血吸虫抗原组分；硕大利什曼原虫及其它利什曼原虫抗原例如gp63、脂磷酸聚糖与其关联蛋白质及其它利什曼原虫的抗原组分；和克氏锥虫抗原例如75-77kDa抗原、56kDa抗原及其它锥虫的抗原组分。

变应原与环境抗原

抗原可以是变应原或者环境抗原，例如，但不限于，来源于自然发生的变应原例如花粉变应原(树-、香草、杂草-、与草花粉变应原)的抗原，昆虫变应原(吸入剂、唾液与毒液变应原)，动物毛皮与头皮屑变应原和食物变应原。来自树、草与药草的重要的花粉变应原来源于分类学上的山毛榉目、木犀目、Pinoles与悬铃木科包括桦树(桦木属)、桤木(赤杨皮)、榛子(榛属)、角树(鹅耳枥属)与橄榄树(油橄榄)、雪松(杉桧属)、悬铃树(法国梧桐)、禾本目包括即黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草、虉草、黑麦属和高粱的草，菊目与荨麻目包括豚草属，艾属，与墙草属的草本植物。其它的可能使用的变应原抗原包括来自室内尘埃嗜皮螨属和嗜霉螨属的尘螨，仓库螨例如嗜磷螨属、食甜螨属和食酪螨属，来自蟑螂、摇蚊和跳蚤的，例如小蠊属、大蠊属、摇蚊属和栉头蚤属，来自哺乳动物例如猫、狗、马、鸟，毒液变应原包括来源于螫刺或者叮咬类昆虫例如来自分类学的膜翅目的那些，包括蜜蜂(蜜蜂科总科)，黄蜂和蚂蚁(蚁总科)。可能使用的其它的变应原还包括来自真菌例如链格孢属和分支孢子菌属的吸入变应原。

肿瘤抗原

肿瘤抗原的范例包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环素b、结肠关联抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)和其抗原的表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异抗原(PSA)与其抗原的表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺-特异膜抗原(PSMA)、T-细胞受体/CD3-ζ链、MAGE-家族肿瘤抗原(例如，MMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGEA4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3，、MAGE-C4、MAGEC5)、GAGE-家族肿瘤抗原(例如、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p2lras、RCAS1、α-胎儿球蛋白、上皮钙粘素、α-连环蛋白、13-连环蛋白、γ-连环蛋白、pl2Octn、gp100^Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性息肉病杆菌蛋白质(APC)、胞影蛋白、连接蛋白37、免疫球蛋白独特型、p15、gp75、GM2与GD2神经节苷脂、病毒产物例如人乳头状瘤病毒蛋白质、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV-编码核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL_40)、SSX-3、SSX-4、SSX 5、SCP-1与CT-7与c-erbB-2、急性淋巴母细胞性白血病(etv6、amll、亲环素b)、B细胞淋巴瘤(免疫球蛋白独特型)、神经胶质瘤(上皮钙粘素、a-连环蛋白、13-连环蛋白、7连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p2lras)、胆管癌(p2lras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53p2lras)、结肠癌(p2lras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结肠直肠癌(结肠直肠的关联抗原(CRC)-0017-1A/GA733、APC)绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环素b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌、霍吉金氏淋巴瘤(lmp lmp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞-派生白血病(亲环素b)、黑素瘤(p15蛋白质、gp75、癌胚抗原、GM2与GD2神经节苷脂、MelanA/MART-1、cdc27、MAGE 3、p2lras、gp100^Pme1117)、骨髓瘤(MUC家族、p2lras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(lmp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌(前列腺特异抗原(PSA)与其抗原表位PSA-1、PSA-2与PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、颈与食道的鳞状细胞癌(病毒产物例如人乳头状瘤病毒蛋白质)、睾丸癌(NY-ES0-1)与T细胞白血病(HTLV-1表位)。

连接组分(i)与(ii)的连接子

本发明缀合物可能包括连接第一与第二组分的连接子。根据本发明，所述非天然的中间物氨基酸序列扮演了在结构域之间的绞链区的角色，从而使它们互相独立地移动，同时维持个体结构域的三维形状。从这个该意义上讲，优选的根据本发明的非天然的中间物氨基酸序列可以是以允许此运动的结构延展性为特征的绞链区。可用于连接本发明的组分(i)与(ii)的非限制的示例性的连接子包括非天然的易弯曲的连接子。在一优选的具体实施方式中，所述易弯曲的连接子是以长度为20个氨基酸或更少氨基酸组成的易弯曲的连接肽。在一更优选的具体实施方式中，该连接肽包括选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸与苏氨酸中的两个或以上的氨基酸。在本发明的一更优选的具体实施方式中，所述易弯曲的连接子是聚甘氨酸连接子。可能的连接子/间隔子的例子包括SGGTSGSTSGTGST(SEQ ID NO：27)、AGSSTGSSTGPGSTT(SEQID NO：28)或GGSGGAP(SEQ ID NO：29)。这些序列已经被用于使设计的缠绕的螺旋结合到其它的蛋白质(Muller，K.M.，Arndt K.M.与Alber，T，MethEnzymology，2000，328：261-281)。所述连接子优选包括或由氨基酸序列GGGVEGGG组成(SEQ ID NO：30)。

连接子区域的作用是在组分(i)与组分(ii)之间提供间隔以便组分(i)的二级结构不会受到组分(ii)存在的影响，反之亦然。间隔子优选有肽的性质。连接肽优选包括至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或大约100个氨基酸。

连接子可以通过共价键连接结合到本发明的缀合物的两个组分的侧面的组分上，并且优选间隔子实质上是非免疫原性的和/或不包括任何半胱氨酸残基。一种类似的方式中，间隔子的三维结构优选是线性的或实质上是线性的。

间隔子或连接肽的优选例子包括那些已经被用来结合蛋白质，但大体上不破坏该结合蛋白质的功能或至少大体上不会破坏该结合蛋白质之一的功能。更优选的，间隔子或连接子用于结合包含具有盘绕螺旋的结构的蛋白质。

连接子可以包括组成了四连接素的β片层的四连接素的53-56位残基，以及组成了四连接素中的转的57-5位残基(Nielsen，B.B.等，FEBS Lett.412：388-396，1997)。该片段的序列是GTKVHMK(SEQ ID NO：31)。该连接子的优点在于当其存在于天然四连接素上时，其结合了三聚结构域与CRD结构域，因此一般来说其适于连接三聚结构域到另一个结构域上。此外，产生的构建体预计比没有连接子的构建体不会有更多的免疫原性。

可选的，从来自人纤连蛋白的连接链3的子序列可以选择用作连接子，对应于氨基酸1992-2102(SWISSPROT编号，登录号P02751)。优选的子序列PGTSGQQPSVGQQ(SEQ ID NO：32)对应于2037-2049位氨基酸，并且更优选的是内部的子序列片段GTSGQ(SEQ ID NO：33)对应于于2038-2042位氨基酸。该构建体的优点在于其并不容易蛋白水解裂解，并且不具有很强的免疫原性，因为在血浆中纤连蛋白以高浓度存在。

可选的，合适的肽连接子可以基于鼠IgG3的上铰链区的10个氨基酸残基序列。该肽(PKPSTPPGSS，SEQ ID NO 34)已被用于制备通过盘绕螺旋(Pack P.与Pluckthun，A.，1992，Biochemistry 31：1579-1584)二聚形成的抗体，并可以用作根据本发明的间隔子肽。人IgG3的上铰链区的对应序列是更优选的。人IgG3序列在人体中预计不具有免疫原性。

在一优选的具体实施方式中，连接肽选自序列APAETKAEPMT(SEQ IDNO：35)的肽和序列的GAP肽。

可选的，本发明的缀合物的两个组分可以由包含蛋白酶的切割靶位点的序列的肽连接起来，从而允许组分(i)和组分(ii)分离。适于掺入本发明的多肽的蛋白酶切割位点包括肠激酶(切割位点DDDDK，SEQ ID NO：36)、Xa因子(切割位点IEDGR，SEQ ID NO：37)、凝血酶(切割位点LVPRGS，SEQID NO：38)、TEV蛋白酶(切割位点ENLYFQG，SEQ ID NO：39)、PreScission蛋白酶(切割位点LEVLFQGP，SEQ ID NO：40)、内含肽等。在一更优选的具体实施方式中，切割位点是是在肿瘤组织，发炎组织或肝脏中表达的蛋白酶切割位点，从而使得一旦缀合物到达肝脏，Apo A和组分(ii)可以发生分离。在一优选的具体实施方式中，连接子包含基质金属蛋白酶-9识别位点(切割位点LFPTS，SEQ ID NO：41)。

本发明还仔细考虑了缀合物，其中组分(ii)包含多于一个抗原或表位。在该情况下，抗原或表位可以是相同的或不同的。在抗原肽连接到PSM时，不同的肽可连接到PSM的不同的位点上。可选的，抗原肽可能形成单独的多肽链连接到PSM的单个位点上。

在一优选的具体实施方式中，本发明的缀合物可能通过单独的多肽链形成，其中组分(ii)的C末端是单独的抗原肽，其与组分(i)形成了单独的多肽链。在一更优选的具体实施方式中，根据本发明的缀合物是一个单独的多肽链，其中组分(ii)的C末端连接到组分(i)的N末端，或其中组分(ii)的N末端连接到组分(i)的C末端上。

在一更优选的具体实施方式中，本发明的缀合物不是选自：LMSCLILRIFILIKEGVISMAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK(SEQ ID NO42)与MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKKKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：43)的肽。

C.本发明的缀合物的细胞毒效应

本发明的缀合物能够诱导对于表面表达与有主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白相关联的肽抗原的细胞的特异性细胞溶解T细胞(CTL)应答。CTL诱导并促进胞内微生物的破坏，或裂解感染所述微生物或在其表面表达肿瘤抗原的细胞。

为了确定在根据本发明治疗的动物中是否获得CTL应答，测量了存在于血或淋巴器官例如脾或淋巴结中CD8+细胞的水平(即CTL)。通过首先在使用本发明的方法之前测量CD8+细胞水平，以及测量在治疗过程中的水平，例如第7、10、20、40天等来完成该确定过程。可以在体内或体外评估CD8+(CTL)应答的水平或强度。

人体中，迄今为止存在的唯一的测量CD8+T细胞应答的体内检测为皮肤试验。在皮肤试验中，皮下注射HLA I类结合肽。如果存在CTL应答，这些细胞将识别和攻击肽-脉冲的真皮细胞，通过释放细胞因子或细胞毒性机制引起局部炎症反应。该炎症反应可以通过测量局部皮疹的直径和/或通过测量渗透物的直径来定量(即肿胀反应)。作为注射溶解性的自由肽的替代，还可以一种结合的形式皮下注射HLAI类结合肽，例如，结合到体外来源的树突细胞。在其他哺乳动物中，另外的，尽管是实验性的，存在用体内实验来测定CD8+T细胞应答。例如，在鼠模型中，CD8+T细胞应答可以通过用于免疫的表达肽的疫苗重组病毒的攻击性感染来测量。再感染的免疫性的水平可以量化为在攻击感染之后来自鼠器官的牛痘病毒滴定度的减小系数。

通过估计对待测的抗原肽特异的CD8+T细胞的数量，还可以在体外定量CD8+T细胞应答的水平。在幼小的哺乳动物中，所谓的“频率”，即特异性CD8+T细胞数目除以非特异性白细胞数量是小于10^-6。在成功免疫后，频率由于特异性T细胞的增殖而提高。在急性的病毒感染期间，例如，特异性CD8+T细胞的频率可能提高到10^-2，然后，在消除病毒之后，特异性CD8+T细胞频率通常下降到“记忆”水平，大约为10^-4。因此，CD8+T细胞应答可以由测量特异性的CD8+T细胞的频率来定量。频率越高，应答越强烈。用于测量特异性CD8+T细胞频率的典型实验基于有限稀释细胞培养技术，Kundig，T.M.等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1996，93：9716-9723)等对该技术进行了详述。估计特异性CD8+T细胞频率的新方法是构建可溶解的I类MHC(用于鼠中)或HLA分子(用于人类中)，其具有结合到其沟槽中的肽，使得特异性T细胞受体将结合到该复合物上。这些复合物可以标记用于检测，例如，用荧光物质，使得通过流式细胞仪检测。另一体内定量CTL活性水平的方法是体内杀死实验，其已经在本发明的图3、4和9中进行了描述。

II.获得本发明的缀合物的方法

可以用本领域技术人员已知的任意方法获得本发明的缀合物。因此可能通过任何标准方法来获得PSM多肽或所述蛋白质的变体。例如，可以用苯酚提取固定的表皮葡萄球菌的上清液来纯化PSM蛋白质，如Mehlin等(J.Exp.Med.，1999，189：907)所述。可选的，可以通过在异源生物体中表达cDNA的方法获得PSM蛋白质，例如，利用本领域已知的方法在大肠杆菌、啤酒酵母、毕赤酵母、昆虫细胞中表达，如Otto，M.等(J Infect Dis.2004，190：748-55)所述。

一旦有充分数量的纯化PSM蛋白质，其必须共轭连接到目的抗原化合物上。可以用不同的方法进行治疗活性组分(ii)到PSM的共轭连接。一种可能的方法在不干扰所述组分的活性位点上将官能团直接与治疗活性组分结合。本发明中可以理解的，官能团涉及分子中的一群特定的原子，其负责所述分子的特征化学反应。官能团的例子，包括但不限于羟基、醛、烷基、烯基、炔基、酰胺、羧酰胺、伯铵、仲铵、叔铵、季铵、氨氧基、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、苄基、碳酸盐、酯、乙醚、乙醛酰、卤代烷基、卤代甲酰基、亚胺、酰亚胺、酮、顺丁烯二酰亚胺、异氰化物、异氰酸酯、羰基、硝酸盐、亚硝酸盐、硝基、亚硝基、过氧化物、苯基、苯基、磷化氢、磷酸盐、膦酰基、吡啶基、硫化物、磺酰基、亚硫酰基、硫酯、巯基与氧化3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)基。所述基团的例子为顺丁烯二酰亚胺或乙醛酰基，其与PSM分子的巯基特异性反应，以及氧化3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)基，其与PSM分子的伯胺基团反应。

另一种可能性是通过利用同型或异型双功能基团，将治疗活性组分(ii)共轭连接到PSM分子上。双功能基团可以首先共轭连接到治疗活性化合物上，然后，共轭连接到PSM肽上或，可选的，将双功能基团共轭连接到PSM上然后将其共轭链接到组分(ii)上。这样的缀合物的说明性的例子包括被称为酮-肟(US20050255042中所述)的缀合物，其中缀合物的第一组分包括氨氧基，其结合到异型双功能基团中存在的酮基上，所述异型双功能基团反过来结合缀合物的第二组分的氨基。

在另一具体实施方式中，用于共轭连接本发明的缀合物的组分(i)与(ii)的试剂可以是光解地、化学地、用热地或酶加工的。特别是使用能够被存在于靶细胞中的酶水解的交联剂，以便于仅在细胞里释放治疗活性物质。可以胞内加工的交联剂的类型的例子已经在WO04054622、WO06107617、WO07046893和WO07112193中进行了详述。

在一优选的具体实施方式中，本发明的缀合物的组分(ii)是具有肽性质的化合物，所述肽包括寡肽和肽。化学法上修饰多肽链的方法是本领域技术人员广泛已知的，包括基于通过存在于半胱氨酸部分的巯基的共轭连接方法，基于通过存在于赖氨酸部分的伯胺基团的共轭连接方法(US6809186)，基于通过N与C末端部分的共轭连接方法。适于修饰多肽使得它们结合到其它的化合物的试剂包括：戊二醛(允许化合物结合到多肽的N末端)，碳化二亚胺(允许化合物结合到多肽的C末端)，琥珀酰亚胺酯(例如MBS、SMCC)其激活N末端与半胱氨酸部分，联苯胺(BDB)，其激活络氨酸基团，高碘酸盐，其激活糖基化蛋白质的碳水化合物部分。

在特殊的情况下，其中组分PSM和抗原肽形成了单独的肽链，可使用本发明的编码所述缀合物的基因构建体一步表达缀合物，其中所述构建体被引入载体中，所述载体适合与转录以及非必要的翻译控制元件一起在异源有机体中表达、。存在于本发明的表达框的转录，以及非必要的翻译控制元件包括启动子，其引导核酸序列转录，到其操作性连接的核酸以及其它必要的或适于转录以及在适宜的时间和位置的进行合适的调控的序列，例如，起始与终止信号、切割位点、多聚腺苷酸化信号、复制起点、转录增强子、转录沉默子等。一般根据使用的宿主细胞来选择所述元件，以及用于构建本发明的表达框和重组载体的载体。

III.本发明的多核苷酸、基因构建体、载体与宿主细胞

另一方面，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可以理解本发明的多核苷酸将只编码缀合物，其中组分(ii)具有肽性质并且其与组分(i)形成了单独的肽链，而不考虑相对方位，也不考虑两个组分是直接连接还是由间隔子分开。

另一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的基因构建体。所述构建体优选包括位于调控本发明的多核苷酸表达的操作性控制序列下游的本发明的多核苷酸。本领域技术人员将可以理解本发明的多核苷酸必须进入靶组织的核，并且转录和翻译来产生具有生物学活性的融合蛋白。

原则上，任何启动子可以用于本发明的基因构建体，只要其适合表达多核甘酸的细胞。因此，适于本发明的具体实施方式的启动子包括，但不必须限于，组成型的启动子，例如来自真核生物的病毒基因组的衍生物，所述病毒为例如多形瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、乙型肝炎病毒、金属硫因基因启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因启动子、反向病毒LTR区、免疫球蛋白基因启动子、肌动蛋白基因启动子、EF-1α基因启动子，以及诱导型启动子，其中蛋白质的表达依赖添加分子或外源信号，例如四环素系统、NFκB/UV光系统、Cre Lox系统与热激基因启动子、WO/2006/135436中所述的RNA聚合酶II调控启动子以及组织特异性启动子。在一优选的具体实施方式中，本发明的基因构建体包含存在于主要肝脏的表达基因的启动子区中的表达-增强区，例如人血清白蛋白基因、凝血酶原基因、α-1-微球蛋白基因或醛缩酶基因，在几个拷贝形式中的单一拷贝中或在隔离型中或与其它的肝脏特异性表达元件结合例如巨细胞病毒，α-1-抗胰蛋白酶或白蛋白启动子协同。优选的，用来表达本发明的多核苷酸的启动子是树突细胞中的功能性启动子，例如，Bros等(J.Immunol.，2003，171：1825-1834)所描述的fascin基因启动子，Morita等(Gene Ther.，2001，8：1729-37)所描述的DC-CK1、DC-STAMP与DC SIGN基因启动子，Dectin-2启动子，(Masood，R.等2001.Int J Mol Med 8：335-343与Somia，N.V.等1995.Proc Acad Sci USA 92：7570-7574)所描述的CD11c基因启动子。

其它的组织特异性启动子的例子包括白蛋白基因启动子(Miyatake等，1997，J.Virol 71：5124-32)，肝炎病毒核心启动子(Sandig等，1996，Gene Ther.，3：1002-9)，α-胎蛋白基因启动子(Arbuthnot等，1996，Hum.GeneTher.，7：1503-14)，以及结合到甲状腺素的球蛋白-结合蛋白启动子(Wang，L.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：11563-11566)。

本发明的多核苷酸或形成它们的基因构建体可以组成载体的一部分。因此，另一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸或基因构建体的载体。本领域技术人员应当理解可以使用的载体的类型是不受限制的，因为所述载体可以是适于增殖与获得多核苷酸或合适的基因构建体的克隆载体，或在不同的适合纯化缀合物的异源有机体中的表达载体。因此，根据本发明的合适的载体包括原核生物表达载体例如pUC18、pUC19、Bluescript与其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌体与穿梭载体例如pSA3与pAT28，酵母表达载体例如2微米质粒载体、整合质粒、YEP载体、着丝粒质粒等，昆虫细胞表达载体例如pAC系列与pVL系列载体，植物表达载体例如植物中的表达载体，例如pIBI、pEarleyGate、pAVApCAMBIA、pGSA pGWB、pMDC、pMY、pORE系列载体等，以及在高等真核细胞中基于病毒载体(腺病毒、腺病毒关联病毒以及逆转录病毒与慢病毒)的表达载体，以及非病毒载体例如pSilencer 4.1-CMV(Ambion)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL与pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。

本发明的载体可用于转化、转染或感染可以被所述载体转化、转染或感染的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。举例来说，引入所述DNA序列的载体可以是质粒或载体，其被引入到宿主细胞时，整合到所述细胞的基因组中，随着其整合的染色体的复制而复制。可以用本领域技术人员已知的惯用方法获得所述的载体(Sambrok等，2001，上述的)。

因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸、基因构建体或载体的细胞，所述细胞能够被本发明提供的构建体或载体转化、转染或感染。能够通过本领域技术人员已知的惯用方法获得转化、转染或感染的细胞(Sambrok等，2001，如上所述)。在一特别的具体实施方式中，宿主细胞是被合适的载体转染或感染的动物细胞。

适于表达本发明的缀合物的宿主细胞包括，但不限于，哺乳动物、植物、昆虫、真菌的与细菌细胞。细菌细胞包括，但不限于格兰氏阳性细菌细胞例如杆菌属、链霉菌属与葡萄球菌属与革兰氏阴性细菌细胞例如埃希氏杆菌属与假单胞菌属细胞。真菌细胞优选包括酵母细胞例如酵母属、巴斯德毕赤氏酵母属与汉逊酵母属。昆虫细胞包括，但不限于，果蝇细胞与Sf9细胞。植物细胞包括，尤其是，作物植物细胞例如禾谷类作物、药用植物、观赏植物或鳞茎状的植物的细胞。本发明中的合适的哺乳动物细胞包括上皮细胞系(猪的，等)、骨肉瘤细胞系(人，等)、成神经细胞瘤细胞系(人，等)、上皮癌(人，等)、神经胶质细胞(鼠科动物，等)、肝细胞系(来自猴子，等)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、COS细胞、BHK细胞、HeLa细胞、911、AT1080、A549、293或PER.C6、NTERA-2人ECC细胞、mESC系的D3细胞、人胚胎干细胞例如HS293与BGV01、SHEF1、SHEF2与HS181、NIH3T3细胞、293T、REH与MCF-7与hMSC细胞。

IV.本发明的药物制剂

本发明的作者已经注意到本发明的缀合物能够引起对组成缀合物的一部分的抗原的CTL应答，因此，允许利用所述缀合物治疗对要求的抗原的免疫应答的疾病。因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的缀合物、本发明的多核苷酸和基因构建体、本发明的的载体或本发明的宿主细胞和药学上可接受的载体的药物制剂或疫苗。

术语“药学上可接受的载体”指的是在施用其的对象中不会引起变态反应或其它副作用的载体。合适的药学上可接受的载体包括，例如，水、盐溶液、磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等的一种或多种或其组合。另外，如果需要，疫苗可以包含较少的数量的辅助的物质例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂和/或提高疫苗效果的佐剂。有效的佐剂的例子可包括，但不限于：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰D-异谷氨酰胺、MTP-PE和RIBI(其包含从细菌中提取的三种组分)、单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，溶于2％角鲨烯/Tween 80乳剂中。其他佐剂的例子包括DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)、弗氏完全佐剂和不完全佐剂和QuilA。另外，免疫调节物质例如淋巴因子(例如，IFN-γ、IL-2和IL-12)或合成的IFN-γ诱导物例如聚肌胞可用于与此处描述的佐剂联合使用。

在本发明的另一方面，本发明涉及本发明的缀合物、本发明的多核苷酸和基因构建体、本发明的的载体、本发明的宿主细胞或药用组合物或疫苗的医药用途。

缀合物可能单独使用或可能与另外的抗原或与其它的化合物，例如已知的提高CTL应答的免疫刺激的细胞因子联合递送，例如GM-CSF、IL-12、IL-2、TNF、IFN、IL-18、IL-3、IL-4、IL-8、IL-9、IL-13、IL-10、IL-14、IL-15、G-SCF、IFNα、IFNβ、IFNγ、TGFα、TGFβ等等。细胞因子在本领域中是已知的，并且很容易从文献或商业中获得。

另一方面，本发明涉及本发明的缀合物、本发明的多核苷酸或基因构建体、本发明的载体、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物或疫苗，其用于引起对抗原肽的细胞毒性应答的方法。另外，本发明涉及在需要所述应答的受试者中引起免疫应答的方法，包括对受试者施用本发明的缀合物、本发明的多核苷酸或基因构建体、本发明的载体、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物或疫苗。

可以理解本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞和药物组合物能够被用于治疗已经鉴定出能够引起CTL应答的抗原肽所引起的任意疾病。因此，本发明的化合物适合治疗病毒病例如源于腺病毒、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-II CMV或VZV)、痘病毒(例如正痘病毒属例如天花或牛痘或触染性软疣)、细小核糖核酸病毒(例如鼻病毒或肠道病毒)、正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸性合胞病毒)、冠状病毒(例如SARS)、乳头多瘤空泡病毒(papovirus)(例如引起生殖器疣、普通疣或种植者疣的乳头状瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、黄热病病毒(例如丙型肝炎病毒或登革热病毒)或逆转录病毒(例如慢病毒属例如HIV-1)感染引起的疾病。

在一优选的具体实施方式中，本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或药物制剂可用来治疗由丙型肝炎病毒引起的传染病。这些疾病包括，但不限于，慢性和急性丙型肝炎。

细菌病例如由埃希氏杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌、葡萄球菌、志贺氏菌属、李司特菌属、气杆菌属、螺旋杆菌、克雷伯氏杆菌属、变形杆菌、假单胞菌属、链球菌、衣原体属、支原体菌属、肺炎球菌属、奈瑟氏球菌属、梭状芽孢杆菌、杆菌、棒状杆菌属、分枝杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌、沙雷氏菌属、普罗非登菌属、色杆菌属、布鲁氏菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌或博德特氏菌的细菌感染引起的。

其它的传染性疾病例如真菌病包括但不限于，念珠菌病、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌脑膜炎或寄生虫病包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子虫病、肺炎、利什曼病、隐孢子虫病、弓形体病和锥虫属传染引起的疾病。

本发明的缀合物也适用于治疗超增生疾病，例如，但不限于，位于结肠、腹部、骨、乳房、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头和颈、神经的(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖道的瘤。

类似的，也可以用本发明的化合物治疗或检测其它增生异常疾病，包括，但不限于，急性的幼年淋巴细胞性白血病、急性小儿淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性的骨髓性白血病、成人何杰金氏病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、艾滋病相关淋巴瘤、艾滋病相关恶性肿瘤、直肠癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、幼年(原发性)肝细胞癌、幼年(原发性)肝癌、幼年急性淋巴母细胞性白血病、幼年急性骨髓性白血病、幼年脑干神经胶质瘤、幼年小脑星形细胞瘤、幼年大脑星形细胞瘤、幼年颅外的生殖细胞瘤、幼年淋巴肉芽肿病、幼年何杰金氏淋巴瘤、幼年下丘脑和视路神经胶质瘤、幼年淋巴细胞性白血病、幼年成神经管细胞瘤、幼年非何杰金氏淋巴瘤、幼年松果体和幕上原始神经外胚层瘤、幼年原发性肝癌、幼年横纹肌肉瘤、幼年软组织肉瘤、幼年视路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、结肠癌、皮肤的T细胞淋巴瘤、内分泌的胰腺胰岛细胞癌、子宫内膜癌，室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌的胰腺癌、颅外的生殖细胞瘤、性腺外的生殖细胞瘤、肝外的胆管癌、眼癌、女性乳房癌、葡糖脑苷脂酶缺乏症、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠的瘤、生殖细胞瘤、妊娠期的滋养叶瘤、毛细胞白血病、头和颈癌、肝细胞癌、淋巴肉芽肿病、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内的黑素瘤、小岛细胞癌、小岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增生的异常、巨球蛋白血症、男性乳房癌、恶性间皮瘤、恶性的胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性的隐藏原发性的鳞状颈癌、转移性的原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、粒细胞性白血病、骨髓性白血病、脊髓增生病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、在妊娠期间的非何杰金氏淋巴瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞癌颈部癌、口咽癌、Osteo-ZMalignant纤维性的肉瘤、OsteosarcomaWMalignant纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢的上皮癌、卵巢的生殖细胞瘤、卵巢的浅的恶性的位瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤、塞扎莱综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状的颈癌、胃癌、幕上的原始的神经外胚层和松果状瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管转移细胞癌、转移性肾盂和输尿管癌、滋养叶瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦氏巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤、和其它的位于上述器官系统上的除了肿瘤的超增生疾病。

另外，本发明的缀合物可能还适合预防和/或治疗恶化情况并防止恶化形成肿瘤或恶性病症，包括但不限于上述疾病。这些情况是指在已知的条件或在涉嫌恶化成肿瘤或癌症中，特别是在非肿瘤细胞生长的地方包括增生，化生，或更特别的，发生了发育异常。

增生是控制的细胞增殖的一种形式，包括组织或器官中的细胞数量的增加，但在结构或功能上没有重大的改变。可以用本发明的化合物预防和治疗的异常增生包括，但不限于，血管滤泡的纵隔的淋巴结增生、具有嗜曙红细胞增多的血管淋巴结样增生症、非典型的黑素细胞增生、基底细胞增生、良性的巨大淋巴结增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生症、先天皮脂腺增生、囊性增生、乳房囊性增生、义齿性增生、管增生、子宫内膜增生、纤维肌性的增生、局灶性上皮增殖、牙龈增生、炎症性的纤维性的增生、炎症性的乳头状增生、血管内的乳头状内皮增生、前列腺结节性增生症、结节再生性增生、假性上皮瘤增生、老年皮脂腺增生症和疣状增生。

化生是可控制的细胞生长的一种形式，其中一种成熟的或完全分化的细胞代替了另一种成熟的细胞。可以用本发明的化合物预防和/或治疗的化生异常包括，但不限于，病因不明的骨髓组织异生、顶浆分泌腺化生、非典型的化生、自体实质化生、结缔组织化生、上皮化生、肠上皮化生、化生性贫血、化生性骨化、化生性息肉、骨髓组织异生、原发性骨髓组织异生、继发性骨髓组织异生、鳞状上皮化生、羊膜鳞状上皮化生与症状性骨髓组织异生。

发育异常经常是癌症的预兆，并且主要在上皮发现，其主要是有非肿瘤细胞的无序生长构成，包括丧失个体细胞的一致性以及细胞在结构上的定向性。发育异常的细胞常有异常大的，深着色的核，并显示多型现象。发育异常特征性地发生在有慢性刺激或炎症的地方。可以用本发明的化合物预防和/或治疗的发育异常障碍包括，但不限于，无汗性外胚层发育不良、异侧发育异常、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育异常、支气管肺发育异常、大脑的发育异常、子宫颈非典型增生、软骨外胚层发育异常、锁骨颅骨发育不全、先天性外胚叶发育不良、颅骨骨干发育异常、颅腕跖骨发育不全、颅骨干骺端发育异常、牙质发育异常、骨干发育异常、外胚层器官发育异常、珐琅质发育异常、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育异常、点状骨骺发育异常、上皮异常增生、面-指(趾)-生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱襞性粘膜发育异常、纤维肌性的发育异常、骨纤维组织发育异常，旺盛骨性发育异常，遗传的肾脏-视网膜发育异常、出汗性外胚层发育异常、少汗性外胚层层发育异常、淋巴细胞减少性胸腺发育异常、乳腺发育异常、下颌面(骨)发育异常、干骺端发育异常、Mondini发育异常，单骨性纤维性结构发育异常、肌上皮的发育异常、多重骺的发育异常、眼-耳-脊椎发育异常、眼齿指发育异常、眼-脊椎发育异常、牙源性的发育异常、眼下颌支发育异常、根尖周牙骨质异常增生、多骨性纤维性结构发育不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜的发育异常、中隔-眼发育异常、脊椎骨骺发育异常和ventriculoradial发育异常。

其它的可以用本发明的化合物预防和/或治疗的癌前异常包括，但不限于，良性的不良增生异常(例如、良性肿瘤、纤维囊性病症、组织肥大、肠息肉、结肠息肉与食道发育异常)、黏膜白斑病、角化病、博文氏病、慢性光化性皮炎、日光性唇炎和日光性角化病。

在一优选的具体实施方式中，本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞与药物制剂用来治疗由人乳头瘤病毒引起的不希望的细胞增殖，包括疣以及肿瘤。可以用本发明的组合物处理的疣类型包括寻常疣、足底疣、生殖器疣、指甲下的或甲周疣与扁平疣。可以用本发明的组合物治疗的瘤包括子宫颈癌、外阴、女性的阴道和肛门以及男性的阴茎和肛门的瘤。

V.本发明的组合物

本发明的作者已经鉴定当了本发明的缀合物与其它的免疫刺激化合物一起施用时，其免疫原性效果以一种协同的方式增加。本申请的实施例3描述了由PSM缀合物和TLR2配体(PGN)、TLR3配体(pIC)、TLR4配体(LPS或纤连蛋白EDA结构域)或TLR9配体(CpG)的组合物促进连接到PSM的肽的细胞毒性应答能力比所述应答在不存在另外的TLR配体时肽与PSM的缀合物一起施用时获得的应答能力更强。

因而，另一方面，本发明涉及组合物，包括共同或单独地，

(a)根据本发明的缀合物，根据本发明的多核苷酸或基因构建体，根据本发明的载体或根据本发明的宿主细胞，以及

(b)第二组分，选自如下

(i)一或多个toll样受体激动剂；

(ii)共刺激分子的一或多个激动剂抗体，

(iii)一或多个细胞因子，以及

(iv)如(i)和(iiI)中定义的一或多种化合物。

此处用到的术语“TLR激动剂”，指的是能够通过TLR信号转导途径引起信号应答的组分，其直接作为配体或间接地通过内源或外源配体的产生来实现(Sabroe等，JI2003 p1630-5)。

在本发明的一具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-1引起信号应答。TLR-1激动剂的非限制性例子包括三酰化脂肽(LPs)；酚可溶性调控蛋白；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-二(棕榈酰氧基)-(2-RS)-丙基)N-棕榈酰-(R)半胱氨酸-(S)-丝氨酸-(S)-赖氨酸(4)-OH，模仿细菌的脂蛋白的乙酰化物氨基末端的三盐酸化物(Pam₃Cys)LP，和来自伯氏疏螺旋体的OspALP。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-2引起信号应答，非限制性的TLR-2激动剂的例子包括，但不限于，酚可溶性调控蛋白(PSM)(如在表1和表2中定义)及其变体，一个或多个细菌脂肽，来自结核分枝杆菌、伯氏疏螺旋体、苍白螺旋体；来自包括金黄色酿脓葡萄球菌的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏球菌属膜孔蛋白、细菌纤毛、耶尔森毒力因子、CMV病毒粒子、麻疹血细胞凝集素和来自酵母的酵母多糖。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-3引起信号应答，例如双链RNA或聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚肌胞)。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-4引起信号应答，例如一个或多个纤连蛋白的EDA结构域，来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)或其片段；热休克蛋白(HSP)10、60、70、75或90；表面活性蛋白A、透明质酸寡糖、乙酰肝素硫酸酯片段、纤连蛋白片段、纤维蛋白原肽和b-防卫素2。在一具体实施方式中，TLR激动剂是HSP 60、70或90。在一可选的具体实施方式中，能够通过TLR-4引起信号应答的TLR激动剂是无毒的LPS的衍生物，例如单磷酰脂质A(MPL)，Ribi等(1986Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins Plenum Publ.CorpN)进行了描述，并具有结构：

另一种MPL的去毒类型来源于移去来自二糖主链位置3的酰基链，并被称为3-0-脱酰(基)单磷酰脂质A(3D-MPL)。

LPS或细菌脂多糖的无毒衍生物，在本发明中可用作TLR激动剂，其可从细菌来源中纯化或加工获得，或可选的，它们可以是合成的。例如，Ribi等1986(上述)对纯化的单磷酰脂质A进行了描述，以及GB 2220211和US 4912094对来源于沙门氏菌属的3-0-脱酰(基)单磷酰或二磷酰脂质A进行了描述。其它纯化和合成的脂多糖已经在US 6,005,099和EP 0 729473B1；Hilgers等，1986，IntArch.Allergy.Immunol.，79(4)：392-6；Hilgers等，1987，Immunology，60：1416和EP 0 549 074B1进行了描述。在US 6,005,099和EP 0 729 473B1中对细菌脂多糖佐剂可以是3D-MPL和f3(1-6)葡糖胺二糖进行了描述。因此，其它的在本发明中可用作TLR激动剂的LPS衍生物是结构上与LPS或MPL或3D-MPL相似的免疫刺激剂。在本发明的另一方面，LPS衍生物可是酰化单糖，其是上述的MPL结构的的一个亚单位。二糖激动剂可以是具有以下化学式的纯化或合成脂质A：

其中R²可是H或PO₃H₂；R3可是酰基链或8-羟基十四酰基或3-酰基羧酸残基，具有以下结构式：

I

C＝O

I

CH₂

I

CH-O-R⁴

I

(CH₂)γ

I

CH₃

其中R⁴为

X和Y具有0至20的值。

另一个LPS的无毒衍生物，其与LPS几乎没有结构同源性，并且是纯合成的，其在WO 00/00462中进行了描述，它的全部内容通过引用纳入本文。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-5引起信号应答，例如细菌鞭毛蛋白。

在一可选的具体实施方案中，TLR激动剂可以通过TLR-6引起信号应答，例如分支杆菌脂蛋白、二酰化LP和酚可溶性调控蛋白。在W02003043572中描述了其它的TLR6激动剂。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-7引起信号应答，例如洛索立宾、在位置N7和C8的鸟嘌呤核苷类似物、或咪唑并喹啉化合物或其衍生物。在一具体实施方式中，TLR激动剂为咪喹莫特。在W002085905中描述了其它的TLR7激动剂。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-8引起信号应答，例如抗病毒活性的咪唑并喹啉分子，例如瑞喹莫德(R848)；瑞喹莫德也可以被TLR-7识别。在W02004071459中描述了其它可能使用的TLR-8激动剂。

在一可选的具体实施方式中，TLR激动剂能够通过TLR-9引起信号应答，例如包含未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特别是被称为CpG基序的序列背景。包含CpG的寡聚核苷酸诱导主要的Th1应答。这样的寡核苷酸是熟知的，并在例如WO 9602555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中进行了描述。在一具体实施方式中，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。

在一可选的具体实施方式中，组分(i)是能够通过TLR-10引起信号应答的TLR激动剂。可选的，TLR激动剂能够通过组合两个或多个所述的TLR来引起信号应答。

此处所用的术语共刺激分子的“竞争型抗体”，是指具有高亲和力的能够结合到T细胞表面蛋白的化合物，并且其具有激动剂效果，即，它们能够通过受体激活信号，引起同结合配体相同的效果。优选的可以靶向竞争型抗体的共刺激分子为在T细胞增殖上具有共刺激活性的分子，其包括但不限于，CD4和CD137。因此，优选的适合用于本发明的组合物中的竞争型抗体包括抗CD4和抗CD137特异性抗体。根据本发明，术语“抗体”包括能够结合CD137或CD4的完整的抗体分子及其片段，并因此在CD137或CD4功能上施加了竞争性影响。T淋巴细胞的CD137共刺激增殖的活化(Goodwin等，1993；Pollock等，1993；Schwarz等1996)，以及由B淋巴细胞表达的CD137配体与B7协同刺激T细胞增殖(DeBenedette等，1995)。

用于本发明的抗体可以是直接对抗CD137或CD4。术语“抗体”包括多克隆以及单克隆抗体、嵌合的抗体、人源化抗体，其可以结合或溶解的形式存在。而且，根据本发明的“抗体”可能是来自上述种类的片段或衍生物。这样的抗体或抗体片段可以重组体分子的形式存在，例如，与其它(蛋白质的)组分一起的融合蛋白。抗体片段一般通过酶消化、蛋白质合成或由重组体技术而制备，这些都是本领域技术人员熟知的。因此，用于本发明的抗体可以是多克隆，单克隆，人或人源化或重组抗体或其片段，以及单链抗体，例如scFv-构建体，或合成抗体。

多克隆抗体是抗体分子的异质混合物，通过已经用抗原免疫的动物的血清产生。本发明的主题也包括多克隆的单特异性抗体，其是通过纯化抗体混合物获得的(例如通过载有特异性抗原决定簇的肽的柱子的色谱法)。单克隆抗体表现为特异性抗原单一抗原决定簇的同质群体的抗体。

单克隆抗体可以按照在现有技术中描述的方法来制备(例如Kohler undMilstein，Nature 256，495-397，(1975)；美国专利4,376110；Harlow und Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring，Harbor Laboratory(1988)；Ausubel等，(eds)1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyamp；Sons，New York)。

用于本发明的基因工程的抗体可按照前文提到的参考文献中的方法制备。

本发明使用的抗体可以属于免疫球蛋白的以下任一类型：IgG、IgM、IgE、IgA、GILD并且当合适时，使用前述提到的类型的亚型，例如IgG型的亚型。IgG和其亚型，例如优选IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgGM。更优选IgG亚类IgG1/k或IgG2b/k。制造用于本发明的单克隆抗体的杂交瘤克隆可以是体外培养的，或在体内原位的。高滴度的单克隆抗体优选在体内或原位制备。

嵌合抗体包含不同起源组分(例如，包含源于鼠科动物单克隆抗体的可变区，和来源于人免疫球蛋白的恒定区的抗体)。嵌合抗体用于当施用于病人时减少对病人的免疫原性，以及改善产品得率。例如，与杂交瘤细胞系相比，鼠科动物单克隆抗体提供了较高的得率。然而，它们在患者体内引起了较高的免疫原性。因此，嵌合人/鼠科动物抗体是优选使用的。更优选使用的是一种单克隆抗体，其中高变的互补决定区(CDR)来自鼠科动物单克隆抗体，与人抗体的另外的抗体区结合。这样的抗体被称为人源化抗体。嵌合抗体及其生产方法在现有技术中进行了描述(Cabilly等，Proc.Natl.Sci.USA81：3273-3277(1984)；Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：6851-6855(1984)；Boulianne等Nature 312 643-646(1984)；Cabilly等，EP-A-125023；Neuberger等，Nature 314：268-270(1985)；Taniguchi等，EP-A-171496；Morrion等，EP-A-173494；Neuberger等，WO 86/01533；Kudo等，EP-A-184187；Sahagan等，J.immunol.137：1066-1074(1986)；Robinson等，WO 87/02671；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：3439-3443(1987)；Sun等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：214218(1987)；Better等，Science 240：1041-1043(1988)und Harlow und Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，上述)。

抗体片段包含任意删去或衍生的抗体部分，删去或衍生的抗体部分具有一个或两个抗原的结合位点，即一个或多个CD137或CD137配体的抗原决定基。

这些抗体片段的具体的例子为Fv、Fab或F(ab′)2片段或单链片段例如scFv。双链的片段例如Fv、Fab或F(ab′)2是优选的。Fab和F(ab′)2片段没有包含在完整的抗体中的Fc片段。作为有益的结果，这样的片段在循环系统中运输更快并与完整的抗体类型相比显示了较少的非特异性组织结合。这样的片段可能是由完整的抗体经过用蛋白酶类例如木瓜蛋白酶(用于生产Fab片段)或胃蛋白酶(用于生产F(ab′)2片段)蛋白酶解或化学的氧化法来生产的。

优选的，抗体片段或抗体构建体是通过遗传操作对应的抗体基因来制备的。重组抗体构建体一般包括单链Fv分子(scFvs，30kDa大小)，其中VH和VL结构域通过多肽连接子连接以改善表达和折叠效率。为了增加功能性的亲合力(抗体亲抗原性)和增加大小从而降低血液清除率，单体的scFv片段可以使用黏附蛋白质结构域或肽连接子复合成二聚物、三聚物或更大的聚集物。这样的二价的scFv二聚物的构建体例子是60kDa双特异抗体，其中短的，例如，在各个scFv的VH和V结构域间有5个残基的连接子，防止V结构域排布变成单个的Fv模块并代替地导致两个scFv分子联合。双特异抗体具有两个功能性抗原-结合位点。连接子可以简化为小于3个氨基酸残基，预防形成双特异抗体，并且代替地引起三个scFv分子联合变成三聚物(90kDa三聚体)，其具有三个功能性抗原-结合位点。联合4个scFvs变成四价的四聚体同样是可能的。本发明中使用的更优选的抗体构建体为scFv-CH3融合蛋白的二聚物(80kDa；被称为“微型抗体”)。本发明使用的抗体优选指向由包含有根据GenBank Acc.No.L12964 8的核苷酸序列(参见图8A)的核酸或与根据GenBank Acc.No.L12964的核苷酸序列有至少90％，优选至少95％，特别优选至少97％的同源性的核酸所编码的肽或蛋白质。

此处使用的术语“免疫刺激细胞因子”，可以理解为促进免疫系统的任一组分活力增加的任何化合物，包括组分组成部分或参与细胞介导免疫反应，体液介导免疫反应和补体系统中的组分。优选的免疫刺激细胞因子选自IL-12、IL-2、IL-15、IL-18、IL-24、GM-CSF、TNFα、CD40配体、IFNα、IFNβ、IFNγ和其功能等价变体。

在一优选的具体实施方式中，本发明的组合物中的组分(b)包括TLR激动剂。在一更优选的具体实施方式中，激动剂选自TLR3配体、TLR4配体和TLR9配体。在一更优选的具体实施方式中，TLR3配体是聚肌胞，TLR4配体是LPS或纤连蛋白EDA结构域和/或TLR9配体是CpG。

VI本发明的组合物的医药用途

本发明的组合物适于促进对组成缀合物一部分的抗原肽的免疫应答。因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物制剂和疫苗。另一方面，本发明涉及本发明的组合物或或包含本发明的组合物的药物制剂或疫苗用于医药的用途。

本发明的组合物可能用于和本发明的缀合物相同的目的。因此，另一方面，本发明涉及本发明的组合物，其可用于医药用途。

本发明的组合物可能用于体内作为诱导对抗原肽的细胞毒性应答的疫苗。因此，另一方面，本发明涉及诱导对抗原肽的细胞毒性应答的方法，其包括对需要该应答的受试者施用本发明的组合物。另一方面，本发明涉及本发明的组合物和药用组合物，其用于诱导对对抗原肽的细胞毒性应答的方法。在一优选的具体实施方式中，本发明涉及诱导对传染病，过敏性或肿瘤疾病的细胞毒素应答的方法。

因此，另一方面，本发明涉及本发明的组合物在治疗传染病，过敏性疾病或肿瘤中的用途。另一方面，本发明涉及治疗传染病，过敏性疾病或肿瘤的方法，其中包括对所需病人施用本发明的组合物。

VII本发明的缀合物和组合物的体外用途

如本发明的实施例2所示，本发明的缀合物能够促进树突细胞的成熟和抗原的呈递。因此，本发明的缀合物还可能用于体外促进树突细胞的成熟。因此，另一方面，本发明涉及通过利用本发明的缀合物、本发明的多核苷酸或基因构建体、本发明的载体、本发明的宿主细胞或本发明的组合物，促进通过抗原呈递细胞来对抗原肽的呈递或促进抗原呈递细胞的成熟。在一优选的具体实施方式中，抗原呈递细胞为树突细胞。

涉及到促进树突细胞的成熟和抗原呈递的方法的不同实施例在VIII中详细描述。

VIII制备抗原致敏的抗原呈递细胞的方法以及由所述方法获得的抗原呈递细胞

本发明的作者已经观察到本发明的缀合物能够促进树突细胞的成熟并由所述细胞呈递抗原，从而获得抗原致敏的树突细胞。因此，另一方面，本发明涉及获得抗原致敏的树突细胞的方法，其包括以下步骤：

(i)将抗原呈递细胞(APC)与本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或药用组合物或制剂接触，并且

(ii)分离装载抗原的APC。

在第一个步骤中，获得抗原致敏的APC包括将APC与本发明的缀合物接触。

此处所用的术语“抗原呈递细胞(APC)”，指的是能够以能被免疫系统的特异性效应细胞识别的肽-MHC复合物的形式呈递一种或多种抗原，从而诱导对呈递的抗原的有效的细胞免疫应答的细胞群体。适合用于本发明的合适的APC包括专职的APC细胞例如树突细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞以及非专职的APC细胞，例如成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞和血管内皮细胞。在一优选的具体实施方式中，APC为树突细胞。优选的，本发明的方法中用到的APC为树突细胞，因为只有树突细胞是具有以一种有效量的形式呈递抗原以激活初始T细胞用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

术语“树突细胞(DC)”指的是在许多种淋巴和非淋巴组织中发现的形态学类似的细胞种类的不同群体，Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9：271-296。树突细胞组成机体内最有效的和优选的APC。当树突细胞从单核细胞中分化时，其具有不同的表型。例如，特殊的分化标记，CD14抗原，在树突细胞中找不到但是单核细胞具有该抗原。同时，成熟的树突细胞不是吞噬细胞，而单核细胞是强的吞噬细胞。还显示了成熟的DC能够提供T细胞活化和增殖必须的信号。

树突细胞可以通过使用本领域已知的任意方法，从血液或骨髓或受试者的二级淋巴器官，例如但不限于脾、淋巴结、扁桃体、肠淋巴集结以及骨髓中分离或得到。优选的，本发明的方法中使用的DC为(或末端分化型)树突细胞。树突细胞的来源优选为人类血液单核细胞。

从这些来源中获得的免疫细胞一般包括主要的处于不同的分化和成熟阶段的再循环淋巴细胞和巨噬细胞。树突细胞制备可以用标准方法来浓缩(参见，例如Current Protocols in Immunology，7.32.1-7.32.16，John Wiley andSons，Inc.，1997)，例如耗尽T细胞和粘附细胞，随后密度梯度离心。非必要的，DC可用荧光标记细胞分类或使用抗CD83MAb磁珠来进一步纯化。可选的，高产率的相对同源的DC能够通过对存在于血液样品或骨髓中的DC祖细胞用细胞因子处理而获得，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)。在这些情况下，单核细胞分化为树突细胞而不会进行细胞增殖。用试剂如TNFα的进一步处理刺激树突细胞的终末分化。

举例但不做限制说明，树突细胞可以从血液单核细胞中按下文获得：用标准方法获得外周血单核细胞(参见Sallusto等，1994，J.Exp.Med.179：1109-1118)。用Ficoll-Paque密度梯度离心和塑料粘附来通过白细胞采集物容器或血沉棕黄层制剂来收集来自健康捐血者的白细胞。如果想获得成熟的DC，可以用以下步骤培养DC。细胞在37摄氏度下粘附到塑料盘4小时。移除未粘附的细胞，附着的细胞在包含0.1μg/ml粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.05μg/ml白介素-4(IL-4)的培养基中培养7天。为了制备成熟的树突细胞，在第5天加入肿瘤坏死因子-α，在第7天收集细胞。

使未成熟的树突细胞成熟的方法是本领域已知的。例如，完全的和不可逆成熟的稳定DC通过在添加自体同源的或非自体同源的单核细胞条件培养基，PBMC条件培养基或SAC中培养未成熟的树突细胞而获得，参见Romani等(Immunol.Methods，1996，196：137)和Bender等(J.Immunol.Methods，1996，196：121)。Jonuleit等(Eur.J.Immunol.，199712：3135-3142)公开了用包含GM-CSF和IL-4，加上包含TNF-I±、IL-1 I²、IL-6和PGE2的“细胞因子鸡尾酒”的培养基中过夜培养未成熟的树突细胞来使其成熟。欧洲专利公开号EP-A-O 922 758公开了用包含IFN-1的培养基来培养来自单核细胞的非成熟树突细胞来生产成熟的树突细胞。美国专利公开号为2004/0152191的专利文件公开了与RU41740一起培养来使树突细胞成熟。在国际申请号WO2006/042177的申请中描述了DC成熟的“CD40L基础过程”和“后熟电穿孔(PME)CD40L过程”，它的内容通过引用纳入本文。在CD40L基础过程中，未成熟的DC用CD40L mRNA和抗原编码mRNA转染，然后用IFN-I(1000U/ml)或TNF-I±(10ng/ml)或IFN-I³和PGE2(1I¹/₄g/ml)的组合进行处理。细胞因子水平可能提高也可能降低。在“PME-CD40L过程”中，单核细胞来源的未成熟DC通过与TNF-I±(10ng/ml)、IFN-I³(1000U/ml)和PGE2(1I¹/₄g/ml)过夜培养(12-30小时，优选大约18小时)使其成熟(一般在使用GM-CSFB和IL-4的单核细胞开始培养后4-7天)。过夜培养之后，收获DC细胞，用抗原编码RNA和CD40L mRNA电击穿孔，培养于包含800U/ml GM-CSF和500U/ml IL-4的X-VIVO 15培养基中培养4小时或更多小时，随后移除并等分附加裂解物或细胞提取物或病毒粒子。

可选的，抗原呈递细胞(APC)，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞和B细胞，可以从体外来自人外周血或骨髓的干细胞和祖细胞的产品中获得，如Inaba等，(1992)J Exp Med 176 1693-1702所述。

用该方法获得的树突细胞典型地表达细胞表面标记物CD83。另外，这样的细胞特有地表达高水平的MHC II类分子，以及细胞表面标记CD1α、CD40、CD86、CD54和CD80，但是不表达CD14。其它的细胞表面标记物典型地地包括T细胞标记物CD2和CD5，B细胞标记物CD7和骨髓细胞标记物CD13、CD32(FcγRII)、Cd33、CD36和CD63，以及大量的白细胞相关抗原。

非必要的，标准技术，例如形态学观察和免疫化学染色，可以用于证明树突细胞的存在。例如，树突细胞的纯度可以用直接针对上文提到的特有的细胞表面标记，如，CD83、HLA-ABC、HLA-DR、CD1α、CD40和/或CD54的荧光标记抗体的流式细胞仪来进行评估。该技术还可以用于区别不成熟的和成熟的DC。使用直接针对CD14的荧光标记的抗体，其存在于未成熟的树突细胞上，但不存在于成熟的细胞。

DC前体可从健康的受试者或已知患有某种与特定抗原的表达相关的疾病的受试者中获得。这样的DC前体可能是同种异体的或自体同源的。

一旦获得了DC前体，在合适的条件下培养充分的时间来扩充其细胞种群，并维持DC处于优化的抗原摄入、处理和呈递的阶段。在一优选的培养DC前体的过程中，DC从通过在无血清或无蛋白的培养基中离体培养40小时，不存在外源添加的细胞因子的DC前体中获得，详细描述参见USSN60/158,618。

DC分离和培养的优选方面包括施用缺少外源添加细胞因子的培养基和在无血清条件下培养，以一种对产生Ag装载的超活化DC有效的的方式，所述超活性DC是已经处理了Ag并具有呈递Ag到免疫细胞并能快速产生Ag特异性免疫应答的细胞，如，CTL-介导的T细胞对肿瘤抗原的应答。

树突细胞可以在暴露于本发明的缀合物之前或之后进行低温贮藏。

在本发明的获得抗原装载的树突细胞的方法的步骤(i)中，APC通过包含根据本发明的缀合物、多核苷酸、基因构建体、载体、宿主细胞或药用组合物与树突细胞接触。接触步骤的执行取决于DC是与所属缀合物接触还是与编码所述缀合物的核酸接触而不同。

当接触步骤是使用本发明的缀合物进行时，接触步骤包括使DC与缀合物接触/培养充分长的时间。在一具体实施方式中，致敏作用可通过将APC与非共价连接到缀合物上的热休克蛋白(hsp)的接触而提高。已经证明了非共价链接到抗原分子上的hsp能够提高APC的致敏作用。

可选的，APC可以用编码缀合物的载体转染，并用于过继性免疫疗法和/或疫苗疗法。已经使用了将核酸引入到细胞中的体内，离体和体外的一些方法，例如基于脂类或脂质体的基因递送和包含治疗活性多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组一部分的复制缺陷性逆转录病毒载体。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLVeston)、猿猴免疫缺陷病毒(SIVer)、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲病毒或其组合。非必要地，载体可以改造来扩展载体对细胞的宿主范围，所述细胞原本不会被载体对应的逆转录病毒感染。例如，水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)应经用于构建VSV-G-假型HIV载体，其可以感染造血干细胞。基于腺病毒伴随病毒(AAV)的载体也可以用于将靶核酸转化入细胞中，例如，体外生产核酸和肽，以及体内和离体的基因疗法过程。其它合适的病毒载体包括疱疹病毒、慢病毒和牛痘病毒。

除了病毒载体，还可以使用许多非病毒转染方法。这些方法包括，但不限于电穿孔方法、磷酸钙转染、脂质体、阳离子脂质复合物、油水乳状液、聚乙烯亚胺和树枝状聚合物。合适的话，可以共同使用两种或多种类型的载体。例如，质粒载体可能用于与脂质体连接。对于非病毒载体，可以用本领域已知的合适的方法将核酸整合到非病毒载体中。对于质粒来说，其一般包含将构建体插入到合适的限制性位点。对于如脂质体、油水乳状液、聚乙烯亚胺和树枝状聚合物等载体，载体和构建体可以在本领域已知的合适的条件下通过混合联合使用。

还可能用RNA装载APC。通常使用例如电穿孔、被动吸收、脂转染、显微注射、阳离子试剂、病毒转导、CaPO4等操作方法来进行。

DC的活性可以通过将DC与表达对在缀合物上出现的抗原的特异性T细胞受体的T细胞克隆进行接触来检测，并测量T细胞的增殖，通常通过测量掺入的标记核苷酸类似物来检测。

一旦APC被抗原致敏，分离细胞来获得抗原致敏的APC。细胞表面标记物可以用于分离对于实行本发明的方法所必须的细胞。例如，表达MHC分子和共刺激分子的树突细胞(例如，B7-1和B7-2)。表面标记物的表达促进这些细胞的鉴定和纯化。这些鉴定和纯化方法包括FACS、柱层析法等。免疫学和免疫测定的一般步骤，请参见Stites和Terr(eds.)1991 Basic and ClinicalImmunology(7th ed.)和Paul(上文已述)。对于如何制备选定抗原的抗体的方法请参见Harlow和Lane(1989)(上文已述)。可以用任意的配置来进行细胞分离和免疫分析来检测细胞纯化过程中的细胞，例如，在Maggio(ed.)(1980)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FIa.中综述；Tijan(1985)″Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，″Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Harlow和Lane，上文已述；Chan(ed.)(1987)Immunoassay：APractical Guide Academic Press，Orlando，FIa.；Price and Newman(eds.)(1991)Principles and Practice of Immunoassays，Stockton Press，NY；和Ngo(ed.)(1988)Non-isotopic Immunoassays，Plenum Press，NY.Cells can be isolated andcharacterized by flow cytometry methods and FACS analysis。细胞可通过细胞流式方法和FACS分析来分离和表征。许多不同的细胞流式技术方法是已知的。一般的荧光活化的流式细胞技术的综述，参见，例如，Abbas等(1991)Cellular and Molecular immunology W.B.Saunders Company，特别是第3章，和Kuby(1992)Immunology W.H.Freeman and Company，特别是第6章。

可以用于标记细胞抗原的标记试剂包括，但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质或其它聚合物例如亲和基质、碳水化合物或脂类。可以用任意已知的方法进行检测，例如免疫印迹法、western杂交分析、放射性或生物发光标记物的示踪、毛细管电泳法或其它可以基于大小、电荷或亲和性跟踪分子的方法。

因此，另一方面，本发明涉及通过上述提到的方法获得的APC。

使用本发明的方法获得的抗原转载的APC可以用于在体外激活CD8+T细胞和/或CD4+T细胞，或能够直接引入受试者体内激活T细胞。因此，另一方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的可用于医药用途的APC以及涉及包含由本发明的方法获得的APC的疫苗。应当理解的是，用于医药用途的目的，细胞可源于需要治疗的相同个体(自体移植)或来自不同的个体(同种异体移植)。在同种异体移植中，捐赠者和接受者基于HLA抗原的相似度来进行配对，以最小化捐赠者和接受者对彼此的免疫应答。

体外驯化的CD8⁺T细胞可以引入哺乳动物中，在哺乳动物中它们对携带有抗原肽的靶细胞是具有细胞毒性的，该抗原肽对应于T细胞被激活识别MHCI类分子上的那些。这些靶细胞一般是癌症细胞，或在其MHC I类分子表面表达特定抗原肽的病原体感染的细胞。

类似的，CD4⁺辅助T细胞，其识别在MHC II类背景下的抗原肽，也可以用本发明的APC刺激，其包含在MHC I类或II类分子背景下的抗原肽。辅助T细胞也可以刺激对抗靶细胞的免疫应答。像细胞毒性T细胞一样，辅助T细胞也可以在体外或体内被装载抗原的APC刺激。

因此，另一方面，本发明涉及根据本发明的抗原呈递细胞，其用于诱导对抗细胞毒性抗原的细胞毒性细胞应答的方法中。另一方面，本发明涉及根据本发明的抗原呈递细胞，其用于诱导对抗感染、过敏或肿瘤疾病产生细胞毒性细胞应答的方法中。

可通过已知的方法检测根据本发明的方法生产的抗原呈递细胞或驯化的T细胞的免疫原性，包括但不限于如下方法；

-用于CTL功能的⁵¹Cr-释放裂解试验。细胞毒性T细胞能够杀死其特异性识别的呈递特殊肽：MHC I类复合物的细胞。CTL功能一般用测量靶细胞(例如，装载抗原的APC、肿瘤细胞、病原体细胞等)释放的放射性同位素来确定。

-细胞因子释放试验。分析在接触修饰的APC后的T细胞分泌的细胞因子的种类和数量能够测量其功能活性。可以通过ELISA或ELISpot试验测定细胞因子以确定细胞因子产生的速率和总量(Fujihashi等(1993)J.Immunol.Meth.160：181；Tanquay和Killion(1994)Lymphokine Cytokine Res.13：259)。

-体外T细胞驯化。本发明的组合物可以测定引起来自正常捐赠者的T细胞群或来自病人的PBMC反应的能力。在该系统中，引出的T细胞可以用来测定溶解活性、细胞因子释放、聚克隆形成能力和对抗原肽的交叉反应性(Parkhurst等，1996，J.Immunol.1996，157：2539)。

-转基因动物模型。可以在体内进行免疫原性评价，通过用本发明的组合物接种疫苗HLA转基因小鼠，确定诱导免疫应答的性质和等级。可选的，人-PBL-SCID小鼠模型使得通过过继转移人PBL来在小鼠中重构人免疫系统。这些动物可能用组合物接种疫苗并分析免疫应答，按照Shirai等(1995)J.Immunol.154：2733；Mosier等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2443所述的进行。

-增殖试验。应答活性组合物时T细胞将增殖。增殖能够用测量来定量地监测，例如[³H]-胸苷摄取。在优选的方法中，使用羧基荧光素双乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)来测量T细胞增殖。CFSE由包含琥珀酰亚胺酯官能团和两个乙酸盐部分的荧光素分子组成。淋巴细胞最初与可渗透膜培养，被动发散到细胞中的非荧光CFSE和胞内酯酶裂开乙酸盐基团将其转换成荧光的，非渗透膜的染料。冲走过量的染料，静止的细胞用体外促有丝分裂或抗原刺激来诱导其增殖。细胞在培养基中维持6天。细胞分裂的每个周期中，CFSE荧光被分成两半，使得可以确定连续的细胞代。用标准的荧光滤过器来检测CFSE(激发＝492nm，发射＝517nm)。用荧光标记抗体对细胞表面分子染色，例如CD4和CD8，胞内标记物使得可以检查特异性淋巴细胞亚群的增殖以及对增殖细胞使用流式细胞仪来鉴定表型和功能特性。同时使用碘化丙啶有利于对细胞生存进行评价。CFSE流式试剂盒可以通过Renovar，Inc.(Madison，WI)和其它来源获得。

-灵长类动物模型。非人类灵长类动物(黑猩猩)模型系统可以用于监测HLA限制型配体的体内免疫原性。已经证明了黑猩猩与人类MHC分子共享了重叠的MHC特异性配体，因此使得可以检测HLA限制性配体在亲缘的体内免疫原性(Bertoni等，1998，Immunol.161：4447)。

-监测TCR信号转导事件。一些细胞内信号转导事件(例如，磷酸化作用)与通过MHC配体复合物的成功的TCR衔接相关。对这些事件的定性和定量分析与组合物通过TCR衔接激活效应细胞的相对能力相关(Salazar等(2000)Tnt.J.Cancer 85829；lsakov等(1995)J.Exp.Med.181：375)。

APC细胞可以用于治疗依赖于抗原类型的不同疾病，所述抗原类型组成了用于致敏抗原呈递细胞的缀合物的部分。合适的致敏作用抗原在前文中已经进行了描述，因此，这些细胞适合治疗传染病、过敏性疾病或肿瘤疾病。因此，另一方面，本发明涉及本发明的抗原呈递细胞，其用于治疗传染病、过敏性疾病或肿瘤疾病。另一方面，本发明涉及治疗传染病、过敏性疾病或肿瘤疾病的方法，其包括对病人施用本发明的抗原呈递细胞。另一方面，本发明涉及根据本发明的抗原呈递细胞的用途，用于诱导对抗细胞毒性抗原的细胞毒性细胞应答的方法，或用于诱导对抗传染性、过敏性或肿瘤疾病的细胞毒性细胞应答的方法。

优选的，本发明的治疗方法包括被称为过继性免疫疗法的方法。术语“过继性免疫疗法”指的是治疗癌症或传染病的治疗方法，其中免疫细胞施用给宿主的目的在于该细胞直接或间接介导对不希望的细胞的特异性免疫(即，定向对抗免疫应答)。在优选的具体实施方式中，免疫应答导致抑制肿瘤和/或抑制转移的细胞的生长和/或增殖以及更优选地导致肿瘤细胞死亡和/或再吸收。免疫细胞来自不同的器官/宿主(外源免疫细胞)或从受试者的器官中获得(自体免疫细胞)。

免疫细胞通常在体外由特定的抗原激活(该情况下用本发明的缀合物中使用的抗原肽)，使用上述的任意技术手段来在体外激活APC。实行过继性免疫疗法的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，美国专利号5,081,029、5,985,270、5,830,464、5,776,451、5,229,115、690,915等等)。本发明仔细考虑了对过继性免疫疗法的各种形式。在一具体实施方式中，DC(例如，从病人中分离或自体树突细胞)与本发明的缀合物脉冲，并注射回其存在的受试者中以在体内激活免疫细胞。另外，或可选的，DC可以用编码本发明的缀合物的核酸转染，并随后重新引入到病人体内。在另一具体实施方式中，DC与本发明的缀合物脉冲或用编码本发明的缀合物的核酸转染，随后用于刺激外周血淋巴细胞或培养中的TIL，并激活靶向对抗随后注入到病人体内的抗原肽的CTL。类似的，用编码本发明的缀合物的核酸转染成纤维细胞或其它APC或肿瘤细胞，并用于激活肿瘤细胞或离体的PBL来生产定向对抗随后注入到病人体内的抗原肽的CTL。

使用本文提供的教导，可以很容易地开发其它利用本发明的缀合物或编码所述缀合物的核酸的治疗方法。如上所述，在一具体实施方式中，免疫细胞来自外周血淋巴细胞或TIL(例如，来自肿瘤/肿瘤悬液)。用于体外激活的淋巴细胞包括，但不限于T淋巴细胞，各种抗原呈递细胞(例如单核细胞、树突细胞、B细胞等)等等。活化涉及将抗原呈递细胞和本发明的缀合物接触随后呈递抗原(或其片段)，例如，在HLAI类分子和/或HLAII类分子，和/或可以涉及将细胞(例如T淋巴细胞)直接与嵌合分子接触。可以采取很多形式活化免疫细胞，包括但不限于，直接添加缀合物到培养中的外周血淋巴细胞(PBL)或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，在培养基中用嵌合分子装载抗原呈递细胞(例如单核细胞，树突细胞等)，用编码缀合物的核酸转染抗原呈递细胞或PBL等。

优选活化细胞的接种是通过全身给药。细胞可以通过中心静脉导管静脉给药或给药到外周静脉中。其它的给药方法(例如，直接输注到动脉中)也包括在本发明的范围内。

本发明的树突细胞可以适宜对病人给药的制剂的形式提供，例如，静脉注射。适合用于对病人给药的本发明的DC此处指的是“疫苗”或“DC疫苗”。疫苗或DC疫苗可能进一步包括附加的组分来帮助调节免疫应答，或其可能进一步被处理以使得更适于对病人给药。树突细胞静脉给药的方法在本领域中是已知的，本领域技术人员将能够调整静脉给药的参数来最大限度的提高施用DC的治疗效果。

因此，树突细胞可以任意合适的方式来施用给受试者，通常具有至少一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的适应性部分地通过施用的特殊组合物来确定，并且通过用于施药的特殊方法来确定。更典型的，进行质量控制测试(例如，微生物学测定、克隆生成测定、活力测试)，并且细胞重新注回给受试者，一些情况下先施用苯海拉明和氢化可的松。参见，例如Korbling等(1986)Blood 67：529-532和Haas等(1990)Exp.Hematol.18：94-98。

适合用于胃肠外给药的制剂，例如，通过静脉注射，包括无菌含水等渗注射液，其可以包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和引起试剂与预期的接受者的血液等渗的溶质，以及含水或不含水的无菌悬浊剂，其包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。一般地，本发明的DC可以一定的速率施用给受试者，所述速率由有效的剂量，细胞型的毒性(例如，LD-50)以及在不同浓度的细胞型的副作用来确定，本领域技术人员决定的合适的根据病人的体重和整体健康状况确定。可以单剂量或分剂量给药。本发明的树突细胞能够补充到疾病或病症的其它的治疗中，包括例如，常规的放射治疗、细胞毒素剂、核酸类似物和生物反应调节剂。

施用给病人的树突细胞的剂量，在本发明的背景下应当是充分地能引起在病人体内久而久之的有益的治疗反应，或抑制癌症细胞的生长，或抑制感染。因此，细胞施用给病人以引起对病毒或肿瘤抗原的有效的CTL应答和/或减轻、减少、治愈或至少局部缓解症状和/或疾病感染带来的并发症的用量。足以做到这一点的用量被定义为“治疗有效剂量”。该剂量应当由产生的树突细胞的活性和病人的状况来决定，以及根据要治疗的病人的体重或表面积来确定。剂量的大小还应该由在特定的病人中伴随着给药出现的任一相反的副作用的存在、性质和程度来决定。在疾病例如癌症(例如，转移性黑素瘤、前列腺癌等)的治疗和预防中施用的细胞的有效量的确定过程中，医生需要评估循环血浆水平、CTL毒性、疾病的进展，以及对抗任何引进的细胞型的免疫应答的诱导。

输注前，获得血液样品并保存用于分析。一般至少约10⁴至10⁶，并且，典型的，10⁸至10¹⁰的细胞在大约60-120分钟由静脉内或腹膜内注入70kg的病人体内。优选地，每次接种点使用的细胞数量为至少10⁷。注射剂可在2周间隔内重复例如4次，并应当优选的在淋巴结附近通过真皮内或皮下注射来进行。可能在4周的暂停后进行加强注射。密切监测生命体征和通过脉搏血氧测定法测定的氧饱和度。输注后5分钟和1小时获得血液样品并保存用于分析。细胞的再输注大致每月都重复，一年内总计进行10-12次治疗。在初次治疗后，临床医生慎重考虑门诊病人基数来输注。如果门诊病人施行再输注，参与者在治疗后至少应当观察4小时。为了给药，本发明的细胞能够以一种速率施用，所述速率由细胞型的LD-50(或测量其它毒性)，不同浓度的细胞型的副作用，根据病人的体重和总的健康状况来决定。可以单剂量或分剂量进行给药。在一些治疗方案中，病人可非必需的接受额外的合适剂量的生物应答调节剂，包括但不限于细胞因子IFNα、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其它细胞生长因子、反义TGFβ、反义IL-10等等。

当活性细胞用来治疗肿瘤时，细胞可以单独使用或与其它治疗方案联合使用，包括但不限于施用IL-2，其它化学治疗剂(例如，多柔比星、长春花碱、长春新碱等)、放射疗法、外科手术等。如上所述，非必要的，细胞可在培养基中扩增。这种扩增可以通过用本发明的缀合物与或不与IL-2来对T细胞的反复刺激或在单独添加IL-2的培养基中生长来完成。其它的T细胞的培养法(例如与其它淋巴因子、生长因子或其它生物活性分子)也包括在本发明的范围内。

IX.递送治疗活性化合物到表达CD4、CD8、CD19、CD11C、F4/8和/或CD117标记物的细胞的方法

本发明的作者也观察到本发明的PSM缀合物能够有效地结合到大量的B淋巴细胞、巨噬细胞、CD11c树突细胞、CD4和CD8T淋巴细胞和/或粒细胞的表面，特别是，能够结合到表达CD4、CD8、CD19、CD11c、F4/8o或CD117标记物的细胞上。

该发现打开了新的治疗应用的大门，其中目的化合物能够递送到表达一个或多个上述标记物的细胞中。目的化合物包括治疗活性化合物，其能够靶向特异性细胞，以及当存在异常提高数量的细胞或细胞表现了非需要的活性时需要的细胞毒性化合物。

因此，另一方面，本发明涉及缀合物(以下为“非免疫原性缀合物”)，其包括

(i)酚溶解性调控蛋白或其功能等价变体，以及

(ii)生物学活性化合物

适合用于本发明的非免疫原性缀合物的PSM在有关免疫原性缀合物的部分中已经进行了详细描述。

术语“生物学活性化合物”定义为能够防止或消除疾病症状的化合物。本发明最初打算使用任意易于共价连接修饰而基本上不损失其生物学活性的治疗用化合物，从而使其可以共轭连接到PSM或其功能等价变体上。因此，本发明考虑了使用小的有机分子、肽、多肽模拟物、类肽、蛋白质、多肽、糖蛋白、寡糖、核酸等等作为治疗用有效组分。

在一优选的具体实施方式中，生物学活性化合物是肽化合物。在另一更优选的具体实施方式中，生物学活性肽化合物与PSM组成了单独的多肽链。本发明还涉及包含编码非免疫原性缀合物的序列的多核苷酸或基因构建体，包含所述多核苷酸或基因构建体的载体，以及包含多核苷酸、基因构建体或载体的宿主细胞。表达非免疫原性缀合物的合适的载体及宿主细胞大体上和那些用于免疫原性缀合物中使用的相同，因此，在此不再赘述。

另一方面，本发明提供了包含本发明的非免疫原性缀合物，以及编码所述缀合物的多核苷酸，包括所述多核苷酸的载体或基因构建体，包含所述多核苷酸、载体或基因构建体的宿主细胞，联合适用于给药至病人的药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂的药物组合物。此处用到的术语“药学上可接受的载体”指的是药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，例如液体或固体填料、稀释剂、辅料、溶剂或包被材料，涉及运载或运输目的试剂从一个器官或机体的一个部分，到另一个器官或机体的另一部分。每个载体都必须是“可接受的”，在某种意义上来说和制剂的其它组分是兼容的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、solutol和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸缓冲盐溶液；(21)其它应用于制剂配方中的无毒性相容物质，例如DMSO(二甲基亚砜)及其衍生物。

药物组合物可以任意合适的给药途径给药，例如口服、局部、直肠或非肠道途径(包括皮下、腹膜、真皮、肌肉和静脉途径)。

口服给药的合适的药用形式包括任意固体组合物(片剂、锭剂、胶囊、颗粒等)或液体组合物(溶液、悬液、乳状剂、糖浆等)以及可以包括本领域熟知的常规辅料，例如结合剂，举例来说糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，例如乳糖、糖、玉蜀黍淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；制备片剂的润滑剂，例如硬脂酸镁、崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠或微晶纤维素；或药学上可接受的湿润剂例如月桂硫酸钠。

固体口服组合物可以通过混合、填充或制备片剂的常规方法来进行制备。可以用重复的混合操作，通过使用大量的填料在整个组合物中分散活性成分。这些操作在本领域中是常规的。可以例如通过湿润或干燥法制粒制备片剂，并且非必需的可以根据常规药用实践中熟知的方法来进行包被，特别是用肠溶衣进行包被。

药物组合物还可以被改造成肠胃外给药的形式，例如一种合适的单一制药形式的无菌溶液、悬液或冻干样品。合适的辅料例如增量剂、缓冲试剂或表面活性剂都可以使用。提到的制剂可以用常规的方法来进行制备，例如那些在西班牙药典及美国药典和类似的参考文献中描述或涉及到的方法。

本发明中使用的化合物或组合物的给药可以经由任意合适的方法，例如静脉输注，口服制剂以及腹膜和静脉给药实现。然而，优选的给药途径将依赖于病人的状况。由于对病人来说更舒适以及待治疗的慢性疾病的特点，口服给药是优选的。

为了应用于治疗方面，本发明的组合物优选制成药学上可接受的或基本上纯的形式，即，本发明的组合物除去药学上可接受的辅料，具有学上可接受的纯度水平，并且不包含在标准剂量水平被认为是有毒性的材料。

本发明的非免疫原性缀合物的治疗有效剂量一般来讲，除了别的因素以外，依赖于治疗的个体，所述个体所患疾病的严重度，选择的给药形式等等。为此，本发明提到的剂量应当仔细考虑，其对本领域技术人员来说应该是个指导量，并且本领域技术人员根据上述提到的各种不同的情况必须调整剂量。然而，缀合物可以一天施用一次或多次，例如，一天给药1、2、3或4次，典型的日均给药总量包括1至200mg/kg体重/天，优选1至10mg/kg体重/天。胆碱激酶的抑制剂可以用相同的方式一天给药一次或多次，例如一天给药1、2、3或4次，典型的日均给药总量包括1至200mg/kg体重/天，优选1至10mg/kg体重/天。

非免疫原性缀合物可以用于医药，并且因此，本发明还涉及用于医学用途的非免疫原性缀合物，编码所述缀合物的多核苷酸，包含所述多核苷酸或基因构建体的载体，包含多核苷酸、基因构建体或载体的宿主细胞或包含所述缀合物的药物组合物。

本发明的非免疫原性缀合物特别适合递送生物活性化合物到那些缀合物对其显示亲和性的细胞类型。如实施例1所示，缀合物能够结合到表达CD4、CD8、CD11c、CD19、F480或CD117的细胞上。在那些其中化合物是细胞毒性的或能够抑制生长抑制基因的情况下，化合物可以用于治疗疾病，其中发生了上述的一种或多种类型的细胞的不必要的增殖。但是，化合物还可以用于递送适合恢复上述提到的任意细胞类型的功能的化合物。该化合物可供给细胞其失去的活性或抑制对所述细胞的该特性消失负责的基因的表达。

因此，另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，所述疾病特征在于细胞具有不希望的增殖或不希望的活性，所述细胞选自CD4、CD8、CD11c、CD19、F480或CD117阳性细胞或其组合，所述方法包括向病人施用编码所述缀合物的多核苷酸，包含所述核酸或基因构建体的载体，包含多核苷酸，基因构建体或载体的宿主细胞或包含所述缀合物的药物组合物。在一优选的具体实施方式中，非免疫原性的缀合物包括细胞毒性化合物，并能够用于治疗特征在于表达CD4、CD8、CD19、CD11c、F4/8或CD117的细胞具有不希望的活性的疾病。

细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害(例如，杀死细胞)的任意试剂。对这些本领域熟知的药物类别，以及其作用机制的详细描述，参见Goodman等，Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis Of Therapeutics，8th Ed.，Macmillan Publishing Co.，1990。另外的与制备抗体免疫毒素类相关的技术参见例如Vitetta，Immunol.Today 14，252(1993)和US 5,194,594。组成对本发明有用的免疫缀合物的合适的治疗剂包括紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、放线菌素D、1-脱氢-睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，抗代谢药(例如甲氨蝶呤，6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉宾、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)，烷化剂(如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、马法兰、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、达卡巴嗪(DTlC)、甲基苄肼、丝裂霉素C、顺铂和其它铂类衍生物，如卡铂)，抗生素(如放线菌素D(原放线菌素)、博莱霉素、道诺霉素(原柔红霉素)、阿霉素、去甲氧柔红霉素、光神霉素、卡奇霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普利霉素、安曲霉素(AMC))、白喉毒素及相关分子(如白喉A链及其活性片段和杂交分子)、蓖麻毒素(如蓖麻毒素A或糖基化蓖麻毒素A链毒素)、霍乱毒素、志贺样毒素(SLT-I、SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、鲍-伯大豆胰蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、alorin、皂草素、蒴莲根毒素、gelanin、相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、美商陆蛋白质(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素毒素。治疗剂，其可能与本文其它处描述的抗体联合施用，可用做对本发明中用到的抗体的共轭有用的治疗组分的候选者。另外，如果细胞毒素化合物是多肽，其包括，但不限于，酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素γ或生物应答调节剂，例如，淋巴因子、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFB)、粒细胞集落刺激因子(G-CSFB)或其它生长因子以及诱导蛋白质从线粒体中分离的凋亡因子。

想要破坏CD4阳性细胞的疾病为，例如，其中有HIV-1感染和在某些情况下促进CD4表达细胞的生长抑制，其中CD4细胞对抗自体靶标或器官的活性增强，像在自身免疫病中发生的情况类似，所述疾病例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化症、特发性炎性肌病、干燥综合征、系统性血管炎、类肉瘤病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾脏疾病、中央或周围神经系统脱髓鞘病、原发性脱髓鞘性多发性神经病、感染性多发性神经根炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆疾病、感染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性肠病、麸质敏感性肠病、惠普尔病、自身免疫或免疫介导的皮肤疾病、大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎、牛皮癣、过敏性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、食物过敏、荨麻疹、肺免疫疾病、嗜酸性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性肺炎、移植相关的疾病、移植排斥反应或移植物抗宿主病。

以存在CD8阳性细胞的不希望的增殖或不希望的活性为特征的疾病包括由对抗自身抗原的免疫应答或对抗无害的外源抗原(即，非细胞病变病毒或拟态自身抗原病毒的感染)的不适当的应答所引起的免疫介导疾病。

此处使用的术语“自身免疫病”，指的是在受试者身上的一种情况，其特征在于细胞、组织和/或器官伤害是由受试者自己对其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应而造成的。用作说明而不做限制的可以用本发明的细胞群治疗的自身免疫病的例子包括斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、变应性肉芽肿性血管炎、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、盘状红斑狼疮、，特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、突眼性甲状腺肿、格林巴利综合症、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA的神经病变、青少年关节炎、扁平苔藓、美尼尔氏症、混合结缔组织病、多发性硬化症、1型或免疫介导糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、结节病、硬皮病、进行性全身性硬化、干燥综合征、肺出血肾炎综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎，如疱疹性皮炎血管炎、白癜风、眶坏死性肉芽肿等)。

由对抗无害的外源抗原(即非细胞病变病毒或拟态自身抗原病毒的感染)导致的疾病包括HIV-1诱导的神经系统疾病、Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)-介导的多发性硬化、HSV诱导的重症肌无力、轮状病毒诱导的胰岛自身免疫等等。

以存在CD11c阳性细胞的不希望的增殖或不希望的细胞活性为特征的疾病包括任何B谱系恶性肿瘤例如淋巴肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、弥散巨型B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病、T幼淋细胞白血病、外套细胞淋巴瘤、Burkitt′s型白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴性白血病等等。

本发明将通过随后的实施例进行详细描述，所述实施例仅用于说明，而不限制本发明的保护范围。

具体实施例

实施例1调控蛋白肽能够结合到脾细胞的细胞表面。对能够结合调控蛋白衍生肽的亚种群进行分析。

材料和方法

本试验中使用的肽如表3所示。

肽	序列	SEQ ID NO：
			SIINFEKL	SIINFEKL	44
αMod	MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK	1
			αMod-SIINFEKL	MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQKSIINFEKL	45
SIINFEKL-αMod	SIINFEKLMADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK	46
			γMod	MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKK	13
γMod-SIINFEKL	MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKKSIINFEKL	47
			SIINFEKL-γMod	SIINFEKLMAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKK	48
OVA(235-264)	ASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKL	49
			CFSE-γMod-SIINFEKL	CFSE-MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKKSIINFEKL	47
CFSE-OVA(235-264)	CFSE-ASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKL	49
			1073	CVNGVCWTV	50
αMod-1073	MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQKCVNGVCWTV	51
			γMod-1073	MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKKCVNGVCWTV	52
δMod	MSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK	14
			δMod-1073	MSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKKCVNGVCWTV	53
1073-δMod	CVNGVCWTVMSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK	54

使用脾细胞(图1，A、B、D、E和G)或骨髓来源树突细胞(图1，C和F)来进行结合试验。细胞通过与戊二醛溶液在4℃培养15分钟的方法进行固定。存在20μM CFSEαMod-SIINFEKL(图1，A、B和C)或CFSEγMod-SIINFEKL(图1，D、E、F和G)的情况下培养5x10⁵的固定的细胞。在一些试验中，为了研究CFSE标记的肽结合的特异性，在存在或不存在未标记的αMod-SIINFEKL、γMod-SIINFEKL或SIINFEKL(100μM)(B和E)下进行培养。并且，我们用CFSE标记的肽CFSE-OVA(235-264)作为阴性对照(图1，A、C、D和F)进行了结合试验。在4℃培养30分钟后，用PBS清洗两次，用流式细胞仪分析制备好的标记。在一些实验中(图1G)，用藻红蛋白(Pharmingen)标记的抗-CD4、CD8、CD11c、CD19、F480或GR1(CD117)抗体协同CFSE-γMod-SIINFEKL肽来进行双重染色。在这些情况下，在用戊二醛固定细胞之前先进行特异性抗体的标记。如上文所述，在一些情况下，用CFSEγMod-SIINFEKL或CFSEαMod-SIINFEKL肽或CFSE-OVA(235-264)对照肽的标记实验在根据下文获得的骨髓树突细胞上进行(图1C和1F)。

结果和讨论

能够使得免疫原引起有效的免疫应答的一个特征是其能够有效地被抗原呈递细胞捕获。调控蛋白肽具有这种能力，因为已经描述过其能够激活TLR2信号转导途径并且抗原呈递细胞在其表面表达这种分子。但是，没有实验证据表明调控蛋白肽结合到抗原呈递细胞的表面。为此，合成CFSE-γMod-SIINFEKL肽，其包含结合到卵清蛋白的SIINFEKL细胞毒性T决定簇的γ调控蛋白序列以及结合到肽的氨基末端的CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE))荧光染料，从而通过流式细胞仪来分析其结合到细胞表面的能力。

因此，如图1所示，发现CFSE-Mod-SIINFEKL肽结合到了脾细胞上。实际上，与CFSE-Mod-SIINFEKL一起培养的脾细胞和CFSE标记的非相关肽CFSE-OVA(235-264)一起培养的脾细胞相比显示了更高的荧光强度(图1A)。这个正信号明显地被添加无标记肽Mod-SIINFEKL抑制，但没有被SIINFEKL肽抑制(图1B)，表明CFSE Mod-SIINFEKL获得的信号是特异性的并且与α-调控蛋白的存在有关。在使用骨髓树突细胞时同样可以观察到CFSE Mod-SIINFEKL的结合能力(图1C)。当我们使用CFSE-γMod-SIINFEKL肽时可以观察到相似的结果(图1C、D和E)。在该情况下，可以观察到两个荧光峰(一个是低荧光(低)，另一个是高荧光(明亮的)(图1D)。用CFSE标记的非相关肽CFSE-OVA(235-264)获得的荧光和用CFSEγMod-SIINFEKL(图1D)观察到的低荧光峰类似，表明这第二个峰归因于非特异性结合。不包含CFSE并因此与CFSEγMod-SIINFEKL肽竞争结合到其受体上的γMod-SIINFEKL肽一起培养，降低了明亮的荧光(参见图1E的虚线)。但是，与SIINFEKL肽一起培养不能影响信号，表明肽到细胞表面的结合归因于γ-调控蛋白序列的作用。

至于在CFSE Mod-SIINFEKL肽中，CFSEγMod-SIINFEKL肽也能够使来自骨髓的树突细胞着色(图1F)。用藻红蛋白(Pharmingen)标记的抗-CD4、CD8、CD11c、CD19、F480或GR1(CD117)抗体协同CFSE-γMod-SIINFEKL肽来进行双重染色(图1G)时，可以发现大约24.4％的CD4+细胞、17.8％的CD8+细胞、62.1％的CD11c细胞、52.8％的CD19细胞、66.2％的F418细胞和27.3％的GR1+细胞被CFSEγMod-SIINFEKL肽着色，表明γ-调控蛋白结合到了这些细胞上。

该数据显示了α-调控蛋白和γ-调控蛋白特异性地结合到一些细胞亚型上，特别是抗原呈递细胞，在激活对抗原的特异性细胞应答的时候运载抗原到这些细胞的特性是很有用的。

实施例2α-调控蛋白和γ-调控蛋白激活树突细胞的成熟以及抗原呈递材料和方法

从骨髓中产生树突细胞

树突细胞是从骨髓细胞中生长而来的。用ACK溶胞试剂溶解红细胞后，清洗细胞，通过与抗CD4(GK1；ATCC，Manassas，VA)、CD8(53.6.72；ATCC)、Ly-6G/Gr1(BD-Pharmingen；San Diego CA)和CD45R/B220(BD-Pharmingen)的抗体混合物一起培养的方法移除淋巴细胞和粒细胞，随后加入兔源添加物。剩下的细胞在12个培养皿中生长，培养皿中使用完全培养基，每10⁶细胞/ml添加20ng/ml mGM-CSF和20ng/ml mIL-4(均购自Peprotech；London，GB)。每2天用新鲜的含细胞因子的培养基替换。在第7天，收集不贴壁的树突细胞，在存在或不存在50μM调控蛋白肽或1μg/mlLPS(Sigma)的条件下培养，37℃和5％CO₂条件下培养48小时。该阶段过后，分离细胞，并与抗IAb、CD54和CD86抗体(Pharmingen)一起培养。在平行实验中，树突细胞与指示刺激物一起培养16小时，其后，检测IL-12的p40分子和TNF-α的信使RNA表达。

IL-12p40和TNFα的信使RNA的表达分析

用核酸纯化裂解试剂(Applied BioSystems，Foster City，CA)和ABIPRISM 6100核酸提取仪(Applied BioSystems)半自动系统进行提取与不同的上述的指示刺激物共培养16小时的树突细胞的总RNA。如上文所述进行IL-12的p40亚基和TNF-α的DNA酶处理、反转录和实时定量PCR，并使用这些细胞因子的特异引物(Zabala，M.，et to the 2007.J Hepatol 47：807-815.)。使用公式：2^ΔCt来计算信使RNA的值，其中ΔCt指示了对照基因(β激动蛋白)和要研究的基因之间的阈值循环的不同。

成熟标记物的上调

用流式细胞仪来检测DC成熟标记物的表达。收集DC细胞，用鼠抗CD16/32mAb(2.4G2克隆，BD Pharmingen)预培养15分钟，封闭一抗的非特异性结合。初始培养后，细胞用一抗在4℃染色15分钟，清洗并在FACSscan细胞计数器(BD Biosciences，San Diego，CA)上获得细胞，用Cell Quest软件(BD Biosciences)进行分析。使用的抗体是：抗-H-2K^b(AF6-88.5克隆)、抗-CD54(3E2克隆)、抗-CD86(GL1克隆)和抗-CD11c(HL-3克隆)，均来自BD Pharmingen。

抗原呈递试验

来自骨髓的树突细胞在存在或不存在10μM指示肽的条件下培养(图3)。40小时后，清洗细胞，以不同的浓度分布在96孔板中，在存在从OT-1转基因小鼠(其表达卵清蛋白的SIINFEKL肽的特异性T受体)中获得的10⁵T细胞/孔的条件下进行培养。72小时后，在培养物中添加氚标记胸腺嘧啶核苷，6小时后收集细胞，在闪烁计数器上分析(Topcount Packard)掺入的胸苷。

结果和讨论

树突细胞(DC)的成熟是T淋巴细胞应答的最佳刺激的必要条件。当成熟发生时，APC提高表面分子的表达例如MHC I类(该模式中的H2Kb)和MHC II类(该模式中IAb)以及CD40、CD80和CD86分子。因此，可以分析衍生自α-调控蛋白或γ-调控蛋白的EDA-SIINFEKL是否可以诱导来自骨髓的树突细胞的成熟。为此，按照材料和方法中指示的培养树突细胞，并用流式细胞仪分析这些成熟标记物的表达。在图2C中可以观察到加入α-调控蛋白或γ-调控蛋白诱导了这些标记物中的一些的过表达。特别地，α-调控蛋白激活Cd54、CD86和IAb分子的表达，而γ-调控蛋白促进CD54和IAb分子的表达。该数据表明调控蛋白在通过刺激树突细胞的成熟的方法对抗原产生免疫应答反应中具有增强的效果。

当检测IL-12和TNF-α细胞因子的信使RNA的表达时(分别为图2A和2B)，发现到某一程度，α-和γ-调控蛋白能够提高这些mRNA的表达(两种情况下p＜0.05，当我们比较用α-或γ-调控蛋白或用培养基单独培养的DC细胞中mRNA的表达时)，表明它们能够促进这些促炎细胞因子的分泌，其有利于对于抗原的免疫应答的激活。

一旦检测了调控蛋白肽结合到树突细胞表面的能力和激活其成熟，可以研究其是否促进共价连接的SIINFEKL肽的抗原呈递。因此，当树突细胞与10μMαMod-SIINFEKL、γMod-SIINFEKL、OVA(235-264)、αMod、γMod或SIINFEKL肽单独培养，并且这些细胞用作抗原呈递细胞来激活OT-1小鼠(并因此具有SIINFEKL肽的特异性T细胞受体)的T淋巴细胞的增殖，发现在用SIINFEKL单独培养时T淋巴细胞的增殖更好，因为其直接结合到树突细胞的MHC-I类分子上而不需要抗原加工。但是，当我们比较需要抗原加工的肽(更长的肽)时，发现与αMod-SIINFEKL或γMod-SIINFEKL刺激的OT-1T细胞比OVA(235-264)肽(p＜0.05)刺激的细胞的增殖明显更好。因此，可以在图2D中看出，α-调控蛋白或γ-调控蛋白利于通过树突细胞加工和呈递SIINFEKL到SIINFEKL-特异性T淋巴细胞从而促进其增殖。

实施例3A-用结合到细胞毒性SIINFEKL抗原的调控蛋白衍生肽与一些 TLR配体的联合免疫诱导了对于抗原的细胞毒性应答的激活。该细胞毒性应答是长期持续的并且保护小鼠对抗EG7OVAl肿瘤细胞的皮下注射。

材料和方法

体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导和免疫后IFN-γ-产生细胞的计量(ELISPOT)。

C57BL6小鼠用5nmol的指示肽和50μg的TLR3配体聚肌胞联合使用进行静脉内注射免疫。在一些情况下，在存在TLR2(肽多糖)、TLR4(LPS或EDA蛋白质)或TLR9(CpG)配体的情况下用肽免疫。免疫后7天，小鼠静脉注射5x10⁶脾细胞的混合物，一般先前用0.25μM剂量的C对其中一半进行标记，另一半用2.5uM CFSE和SIINFEKL肽(10μg/ml)进行标记。在第二天，处死小鼠，用流式细胞仪分析脾细胞来定量高CFSE标记的细胞相对于低CFSE标记的细胞的数量。因此，能够在被称为体内杀死的实验中计算与细胞毒性SEENFEKL肽共同培养的细胞的细胞溶解的百分比。

为了分析对SIINFEK1特异性的并在体内被免疫诱导的IFNγ-产生细胞，使用BD-pharmingen试剂盒(San Diego，CA)根据操作说明来进行ELISPOT实验。简言之，与抗IFNγ抗体培养过夜的孔板(Multiscreen HTS，Millipore，Bedford，MA)用包含10％马血清的HL-1培养基(Biowhittaker，Verviers，Belgium)封闭2小时。因此，5x10⁵的脾细胞被分为三份培养，在不存在或存在抗原，37℃和5％CO₂的条件下培养。第二天，用PBS清洗孔板，并与生物素化的抗IFNγ抗体培养(2mg/ml)。2小时后，清洗孔板，与1/100稀释的抗生蛋白链霉菌素-过氧化物酶进行培养。1小时后，清洗孔，使用AEC底物(BD-Pharmingen)显影。用蒸馏水终止比色反应。使用ELISPOT自动读数器(CTL，Aalen，Germany)定量斑点的数量。

防止表达OVA蛋白的EG7肿瘤细胞的攻击

C57BL6小鼠用5nmol的指示肽与聚肌胞联合使用进行皮下免疫。免疫后7天，小鼠皮下注射5x10⁵或5x10⁷EG7OVA细胞。在一些实验中，小鼠最初用5x10⁵的细胞进行皮下注射进行第一次激发，并且肿瘤直径达到5mm时，用指示肽进行处理。用量尺计量肿瘤生长。当肿瘤体积大于4cm³时，处死小鼠。绘制每个免疫的小鼠存活的Kaplan-Meier图表。

结果和讨论

如图3所示，用αMod-SIINFEKL或γMod-SIINFEKL肽的C57BL/6小鼠的免疫能够响应SIINFEKL刺激时诱导强烈的细胞毒性应答(图3B)和产生IFNγ(图3A)。但是，游离的SIINFEKL肽不能激活这些应答产生，当SIINFEKL没有共价连接到α-调控蛋白或γ-调控蛋白肽时，联合使用α-调控蛋白或γ-调控蛋白肽和SIINFEKL时也不会激活应答。同样研究了这些免疫原激活长期应答的能力。当研究免疫后60天的诱导应答时，发现结合到SIINFEKL上的α或γ-调控蛋白的衍生肽能够诱导特异性细胞应答(图3C，用ELISPOT测量的IFNγ产生细胞和图3D，用体内杀死实验测量细胞溶解能力)，其不能诱导与聚肌胞佐剂联合使用的SIINFEKL肽。这些结果表明共价连接细胞毒性决定簇到α或γ调控蛋白上使其具有特异性诱导对于细胞毒性抗原的长期细胞毒性细胞应答的特性。该特性，根据上面的图观察到的结果，可以用调控蛋白肽运载抗原向呈递细胞的载量来计量。抗原到呈递细胞的结合可以进一步促进它们的成熟，并以更有效的方式来呈递细胞毒性抗原决定簇，并且，协同佐剂例如聚肌胞、TLR3配体的帮助，能够极大地提高细胞应答的激活。

同样研究了其它TLR配体协同调控蛋白衍生肽在其提高对于SIINFEKL肽的细胞毒性应答的激活的能力的效果。如图4所示，协同使用调控蛋白肽(αMod-SIINFEKL和γMod-SIINFEKL)和TLR3和TLR9配体，以及在较小程度上与TLR4配体具有在激活免疫应答方面的协同作用。该数据表明调控蛋白肽能够与这些配体结合来设计潜在的疫苗。

一旦证明了调控蛋白衍生肽激活对于SIINFEKL抗原的细胞毒性应答的能力，则可以评估这些免疫原保护小鼠免受EG7OVA肿瘤细胞的感染的能力。因此，小鼠用5nmol的肽(示于图5A和5B)协同使用聚肌胞佐剂进行皮下免疫。免疫后7天，皮下注射5x10⁵(A)或7x10⁵(B)EG7OVA细胞。可以观察到用αMod-SIINFEKL(图5A)或γMod-SIINFEKL肽(图5B)的免疫阻止了小鼠的肿瘤生长。所有的小鼠用SIINFEKL或用盐水发育肿瘤免疫。我们同样检测了调控蛋白衍生肽治疗携带皮下肿瘤的小鼠。在这种情况下，携带EG7OVA1肿瘤的小鼠用γMod-SIINFEKL加聚肌胞、γMod+SIINFEKL(非共价连接)加聚肌胞、SIINFEKL加聚肌胞，单独加上聚肌胞或使用盐水进行处理，并评估肿瘤的生长。发现用γMod-SIINFEKL处理的小鼠中约38％能够对抗肿瘤，相比较剩下的处理组为0％(图6，p＜0.05)。这些数据表明α或γ-调控蛋白肽能够用作在对抗病原体或癌症的疫苗的开发中充当载体和佐剂。

接着，调控蛋白衍生肽的免疫刺激能力用另一种不同于SIINFEKL的抗原来检测，以检查该结果是否还能再现。调控蛋白衍生肽连接到来自丙型肝炎病毒的非结构蛋白NS3的细胞毒性T细胞决定簇(HLA-A2-限制型NS3肽1073-1081，序列CVNGVCWTV(SEQ ID NO：50))。因此肽αMod-1073、γMod-1073和δMod-1073以及肽p1073单独进行合成。HHD转基因小鼠(表达人HLA_A2分子)在存在聚肌胞时用5nmol的对应肽进行免疫，免疫后7天，按上文所述的使用肽1073脉冲的靶细胞进行ELISPOT和体内杀死试验。如图7A和7B所示，存在连接到肽1073的α-Mod、γ-Mod以及δ-Mod使得诱导了对于肽的特异性的强的T细胞免疫应答，而在小鼠用肽1073加聚肌胞注射时观察不到。实际上，用δMod-1073、γMod-1073和δMod-1073免疫的那些小鼠具有高数量的对肽1073特异性的IFNγ产生细胞(图7A)，并且具有高水平的CTL活性(图7B)。

总之，该数据表明α-调控蛋白、γ-调控蛋白或δ-调控蛋白肽结合到抗原上有利于运载抗原至抗原呈递细胞，促进它们的成熟和抗原呈递。该特性使得这些免疫原，联合使用TLR3配体，TLR4配体或TLR9配体，来诱导体内对抗原的强的细胞毒性细胞应答，其可能保护小鼠对抗表达所述抗原的肿瘤细胞生长或对抗表达病毒抗原的细胞。

因此，调控蛋白衍生肽能够形成诱导对于目的抗原的细胞应答的合适的载体。基于这些肽的融合蛋白构建体涉及对抗肿瘤疾病或由感染因子导致的疾病的疫苗接种治疗方案中的合适的策略。

实施例3B用αMod-E7(49-57)联合使用聚肌胞的免疫诱导对于肽E7 (49-57)的特异性细胞毒性应答并能够治疗带有TC1皮下肿瘤的小鼠

材料和方法

本部分中用到如下肽

肽	序列	SEQ ID NO：
			E7(49-57)	RAHYNIVTF	55
αMod-E7(49-57)	MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQKRAHYNIVTF	56

测量免疫后IFN-γ的体内诱导(ELISPOT)

C57BL6小鼠用5nmol的指示肽联合50μg的TLR3配体聚肌胞进行静脉注射免疫。为了分析在存在肽E7(49-57)和通过免疫在体内诱导的IFN-γ产生细胞，在接种后7天处死动物，使用BD-pharmingen试剂盒(San Diego，CA)按上文指示的进行ELISPOT实验，并使用E7(49-57)肽作为抗原。

防止表达HPV6(人乳头瘤病毒16)的E7蛋白的TC1肿瘤细胞的攻击

C57B/6小鼠用5x10⁵TC-1肿瘤细胞(表达HPV-16病毒的E7蛋白质)进行皮下注射。25天后，当肿瘤达到直径8mm，小鼠静脉注射PBS(B)，或肽E7(49-57)加50μg/ml聚肌胞(C)，或肽αMod-E7(49-57)加50μg/ml聚肌胞(D)。7天后，小鼠用同样的免疫原进行二次免疫。以两个垂直方向的直径的平均值表示肿瘤大小，使用测量尺定期测量。每组中相对于总的动物数的无肿瘤小鼠的数量也包括在每个处理实验中。

结果与讨论

在前面的实验中证明了调控蛋白衍生肽能够结合到脾细胞的表面，激活抗原呈递细胞的成熟，并可以作为转移抗原的载体，使得用这些调控蛋白衍生肽和细胞毒性T决定簇例如SIINFEKL联合使用TLR的融合肽的免疫能够诱导体内的强烈的细胞毒性T应答，并在表达抗原的EG7OVA肿瘤细胞攻击后保护小鼠。本发明的目的是为了确定是否在EG7OVA肿瘤模型上观察到的疗效可以延伸到其它肿瘤模型上。

子宫颈癌是全世界女性身上的最常见的癌症之一，也是一般来说第五常见的癌症，估计有140万病例。已经有肯定的证据表明由各种类型的人乳头瘤病毒(HPV)引发的慢性产道感染导致了宫颈癌。因此假设HPV作为子宫颈癌变的起因，而恶性转化是由于与其它因素的相互作用。

美国默克实验室对抗子宫癌的现在使用的疫苗，被称为加德西，显示用于预防HPV-16和HPV-17病毒株的感染，其是大约70％的子宫癌病例的起因。已经证实当该疫苗施用于早期年龄的女孩子(11-12岁)时，其对于阻止这种疾病是有效的。但是，该疫苗没有显示能够治疗一旦已经证实了患有子宫癌。

HPV E6和E7的致癌蛋白质的表达对于起始和维持恶化以及对E7的细胞免疫(其与临床和HPV诱导的损伤的细胞学溶解相关)是必要的。为此，使用了TC1肿瘤模型，其表达HPV16E7抗原作为肿瘤抗原。一旦证实患有肿瘤，在用皮下注射后肿瘤细胞达到了8mm直径，则动物用不同的供选物质来进行接种。已经发现这些接受了αMod-E7(49-57)和聚肌胞的免疫的动物完全消除了肿瘤。因此，用该免疫原处理的11只小鼠中的11只被治愈，而当使用肽E7(49-57)处理小鼠时，11只中的仅4只消除了肿瘤。这些数据表明融合肽αMod-E7(49-57)，或基于调控蛋白衍生肽和HPV抗原的融合的类似肽可以被考虑用于研发对抗人类子宫颈癌的可选的疗法。

实施例4调控蛋白衍生肽诱导对抗抗原的细胞应答的能力不依赖TLR2 途径的激活

材料和方法

KO小鼠中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体内诱导(体内杀死)和免疫后对于TLR2的IFNγ产生细胞的测量

C57BL6野生型小鼠和敲除小鼠用TLR2免疫来研究调控蛋白肽对于TLR2依赖性的免疫刺激能力。因此，不同的小鼠用5nmol的指示肽或用PBS联合50μg的TLR3配体聚肌胞注射。免疫后7天，小鼠静脉内注射5x10⁶脾细胞的混合物，其中一半之前用0.25μM剂量的C标记，另一半用2.5μMCFSE和SIINFEKL肽(10μg/ml)进行标记。第二天，处死小鼠，使用和实施例3中相同的方法，用流式细胞仪来分析脾细胞以定量高CFSE标记细胞相对于低DFSE标记的细胞的数量。

为了分析存在SIINFEKL和体内免疫诱导的IFNγ-产生细胞，使用BD-pharmingen试剂盒(San Diego，CA)来进行ELISPOT实验，按照操作说明进行，使用和实施例3中相同的方法。

结合试验

在均质化处理脾脏后从C57BL/6TLR2KO小鼠中纯化鼠脾细胞。细胞用0.4％的戊二醛溶液4℃下培养15分钟的方法来固定。在存在20μM CFSEγMod-SIINFEKL、CFSEαMod-SIINFEKL或CFSE-OVA(235-264)对照肽的条件下培养5x10⁵的固定化脾细胞来显示结合特异性。在4℃培养30分钟后，用PBS清洗两次，使用流式细胞仪来分析完成的标记。

结果与讨论

如期望的，当免疫C57BL/6野生型小鼠时，用αMod-SIINFEKL或用γMod-SIINFEKL肽免疫能够诱导产生对SIINFEKL肽共同培养的靶细胞的细胞毒性T应答。同样的方法，诱导SIINFEKL肽的特异性IFN-γ-产生细胞的激活(分别为图8B和图8A)。但是，该应答还令人惊奇地在缺失TLR2分子的小鼠中免疫后也可以观察到。实际上，发现的应答水平在两种小鼠中是类似的，表明TLR2分子不导致用于引起对于SIINFEKL T抗原决定簇的细胞应答的诱导的调控蛋白衍生肽的能力。

因此，当进行使用CFSE标记的结合试验时，发现CFSEαMod-SIINFEKL和CFSEγMod-SIINFEKL这两种肽都保持了结合到脾细胞表面的能力(图9)，表明该结合和TLR2分子无关。

虽然在文献中没有描述调控蛋白肽激活TLR2途径，可以根据这些实验得出结论，该特性，如果是正确的话，对于其免疫提高能力是非必要的。这些多肽引起对于其结合的抗原的细胞应答的诱导的行为的机制还需要进一步的研究。

Claims

1.缀合物，其包括

酚可溶性调控蛋白（PSM）或其功能等价变体，以及

一个或多个抗原肽；

其中组分（i）和（ii）共价连接，并且其中缀合物提高了对于抗原肽的细胞毒性应答。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中PSM选自SEQ ID NO：1-10或其功能等价变体。

3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中组分（ii）与组分（i）形成了单个多肽链。

4.多核苷酸或基因构建体，其包括编码权利要求3所述的缀合物的核酸序列。

5.载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体。

6.宿主细胞，包括权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体或权利要求5所述的载体。

7.组合物，其包括，协同的或单独的

（a）权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞；以及

（b）选自如下组的第二组分

一种或多种toll样受体激动剂，

一种或多种共刺激分子的激动剂抗体，

一种或多种细胞因子以及

（iv）（i）到（iii）中提到的化合物的任意组合。

8.根据权利要求7的组合物，其中第二toll样受体激动剂选自TLR3配体、TLR4配体和TLR9配体。

9.根据权利要求8的组合物，其中TLR3配体为聚肌胞，TLR4配体为LPS或EDA蛋白和/或TLR9配体是CpG。

10.获得抗原致敏的抗原呈递细胞的方法，其包括以下步骤：

（i）将抗原呈递细胞与权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物进行接触，并且

（ii）分离抗原致敏的抗原呈递细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中抗原呈递细胞是树突细胞。

12.由权利要求10或11所述的方法获得的抗原呈递细胞。

13.药物制剂或疫苗，其包括权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物或权利要求12所述的抗原呈递细胞以及药学上可接受的载体。

14.权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物、权利要求10所述的药物组合物或疫苗或权利要求12所述的抗原呈递细胞的医药用途。

15.权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物、权利要求10所述的药物组合物或权利要求12所述的抗原呈递细胞，其用于诱导对于抗原肽产生细胞毒性应答的方法。

16.权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物、权利要求10所述的药物组合物或权利要求12所述的抗原呈递细胞，其用于诱导对于传染病、过敏性疾病或肿瘤疾病的细胞毒性应答的方法。

17.利用权利要求1-3所述的缀合物、权利要求4所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7-9任一项所述的组合物在通过抗原呈递细胞促进抗原肽的呈递或促进抗原呈递细胞的成熟的体外方法中的用途。

18.缀合物，其包括

（i）酚可溶性调控蛋白（PSM）或其功能等价变体，以及

（ii）生物学活性化合物；

其中组分（i）和（ii）共价连接。

19.根据权利要求18所述的缀合物，其中PSM选自SEQ ID NO：1-10或其功能等价变体。

20.根据权利要求18或19所述的缀合物，其中组分（ii）是与组分（i）形成单独的多肽链的肽化合物。

21.多核苷酸或基因构建体，其包含编码权利要求20所述的缀合物的核酸序列。

22.载体，其包含权利要求21所述的多核苷酸或基因构建体。

23.宿主细胞，其包含权利要求22所述的多核苷酸或基因构建体。

24.药物制剂，包含权利要求18-20所述的缀合物、权利要求21所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求22所述的载体或权利要求23所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体。

25.根据权利要求18-20所述的缀合物、权利要求21所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的宿主细胞或权利要求24所述的药物制剂的医药用途。

26.根据权利要求18-20所述的缀合物、权利要求21所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的宿主细胞或权利要求24所述的药物制剂，其治疗疾病的用途，所述疾病特征在于细胞有不希望的增殖或不希望的活性，所述细胞选自CD4-、CD8-、CD19-、CD11c-、F4/8-或CD117-阳性细胞或其组合。

27.根据权利要求18-20所述的缀合物、权利要求21所述的多核苷酸或基因构建体、权利要求22所述的载体、权利要求23所述的宿主细胞或权利要求24所述的药物制剂，其中疾病特征在于细胞有不希望的增殖或不希望的活性，所述细胞选自CD4-、CD8-、CD19-、CD11c-、F4/8-或CD117-阳性细胞的疾病是自身免疫病，CD4阳性细胞的逆转录病毒感染，由对抗良性的外源试剂诱导的自身抗原的免疫应答引起的疾病和B谱系恶性肿瘤。