CN116212091B - 一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法 - Google Patents

一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法，所述的复合抗菌剂由VA‑23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐合成得到。本发明所述的复合抗菌剂将Nax[EuW10O36]•yH2O与多肽VA‑23复合后，对金黄色葡萄球菌具有高效的消毒杀菌性能，二元组装的EuGdW10/VA‑23相比于EuW10/VA‑23、VA‑23的消毒效果分别提高了4.6和37.6倍。

Description

一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法
技术领域
本发明属于医用敷料领域，尤其是涉及一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法。
背景技术
慢性伤口由于愈合过程严重受损，炎症和感染不平衡或持续，无法愈合并恢复解剖和功能的完整性。其患病率高达总人口的1-2%，与心力衰竭的发病率相似，这代表着巨大的经济成本。随着发病率和死亡率的增加，慢性伤口越来越被认为是严重的危及生命的疾病。目前慢性伤口的治疗包括清创、传统伤口医用敷料(如纱布、棉垫和绷带)、使用卸荷装置和负压伤口疗法。对于更严重的伤口，先进的疗法，如生物工程皮肤替代品或生长因子，最终也使用自体皮肤移植。尽管有这些治疗，慢性伤口的结果仍然令人不满意。随着时间的推移，人们设计了各种生物材料来促进慢性伤口愈合。如海绵、泡沫、水凝胶、薄膜、纤维等。尽管做出了相当大的努力，但治疗慢性伤口的疗效仍然有限，这主要是由于愈合过程的复杂性，以及我们对皮肤再生的干预仍然非常有限，包括生化、免疫和生理修复过程。
为了克服这些问题，纳米材料在更广泛的领域创造了一个新的领域。国际标准化组织（International Organization for Standardization）将纳米材料定义为任何外部尺寸在1至100 nm之间的材料；由于其显著的性质，它们也处于多重领域中。通过优化其物理化学性质，各种纳米材料已被用作有效的消毒材料。因此，许多研究人员正在探索生成多功能纳米材料作为有效的消毒材料。纳米材料具有广泛的用途，如水消毒剂、医院的消毒液、食品防腐剂、敷料和医疗器械等。多金属含氧酸盐（POM）是由氧化物阴离子和过渡金属阳离子组成的带负电的无机物质簇。这些无机化合物具有多种潜在应用，其中一些已被用作抗病毒材料。因此将POM用于医用抗菌敷料中可以有效的遏制细菌感染的风险，提高伤口的愈合速度。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种复合抗菌剂、人体友好型医用抗菌敷料及其制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种复合抗菌剂，所述的抗菌剂由VA-23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐合成得到。
进一步，所述的VA-23与Gd3+掺杂的多金属含氧酸盐的摩尔浓度比为1：1-3。
优选的，所述的VA-23与Gd3+掺杂的多金属含氧酸盐的摩尔浓度比为1：1。
进一步，所述的Gd3+掺杂的多金属含氧酸盐为Na9[EuxGdyW10O36]•yH2O，其中的x为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，y为0.6、0.5、0.4、0.3或0.2。
进一步，所述的x为0.7，y为0.3。所述的Na9[EuxGdyW10O36]•yH2O由摩尔比为7：3的Eu(NO3) 3•6H2O与Gd(NO3) 3•6H2O制成。
进一步，所述的复合抗菌剂由VA-23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐经混合、孵育后得到；所述的孵育步骤的时间为5-16分钟。在pH值为6-7的MES-NaOH 缓冲液中将VA-23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐进行混合。所述的复合抗菌剂为EuGdW10/VA-23二元组装体。
一种人体友好型医用抗菌敷料，该敷料由包括如下重量百分比的组分制成：所述的复合抗菌剂5%，重组胶原蛋白 0.1-1%，甘油3-6%，丁二醇0.5-2%，三乙醇胺2-7%，苯氧乙醇0.3-1%，余量为水。
所述的人体友好型医用抗菌敷料的制备方法，包括如下步骤：将各组分进行混合、搅拌，然后保存、备用即成。
进一步，所述的搅拌步骤的时间为15-30分钟，温度为35-45℃；所述的保存步骤的温度为30-45℃。
由于Gd3+离子具有生物活性强、f-f发射低、价格相对低廉的优点，将Gd3+离子掺杂到EuW10中制备EuGdW10，EuGdW10的发射中心仍为Eu3+。Gd3+的最低激发态过高，导致POMs无法将能量传递给Gd3+。因此Gd3+主要作为基体稀释Eu3+，降低浓度猝灭效应。随着EuGdW10物质中Gd3+相对含量的增加，Eu3+ (发光中心离子)减少，发光强度单调降低。结果表明，Eu3+的相对含量对EuGdW10的发光强度起决定性作用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的复合抗菌剂将Nax[EuW10O36]•yH2O与多肽VA-23复合后，对金黄色葡萄球菌具有高效的消毒杀菌性能，二元组装的EuGdW10/VA-23相比于EuW10/VA-23、VA-23的消毒效果分别提高了4.6和37.6倍。
本发明所述的复合抗菌剂采用HPV16富含精氨酸的肽段(VA-23)与无机含稀土金属的POM (EuW10)进行二元组装，具有极好的消毒杀菌效果，并且保持了长时间的抑菌性能。
本发明所述的医用抗菌敷料为含稀土的多金属含氧酸盐复合材料，解决了传统敷料对人体危害和菌类产生抗体的问题，构建了生物多肽和无害纳米金属复合材料的概念，为研制新型高效医用抗菌敷料提供了很好的思路。
附图说明
图1为本发明实施例2所述的荧光光谱图；
图2为本发明实施例7所述的琼脂平板抗菌试验图：2-A为空白对照，2-B为VA-23 ，2-C为EuW10/VA-23，2-D为三元组装体；
图3为本发明实施例7所述的细菌存活率统计图；
图4为本发明实施例8所述的敷料抑菌时间测试图：4-A为VA-23敷料，4-B为EuW10/VA-23敷料，4-C为三元组装体敷料。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
VA-23为人乳头瘤病毒16型（HPV16型）L2蛋白的N末端氨基酸105-123的序列；HPV16型L2蛋白获得自UniProt网站（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P03107/entry），ID号为4263560。
Na9[EuW10O36]•32H2O，以下简称EuW10，Na9[Eu0.7Gd0.3W10O36]•32H2O，以下简称EuGdW10。
2-(N-Morpholino)乙磺酸(MES)和氢氧化钠(NaOH)购自北京化工厂(北京，中国)，氯化钠、蛋白胨以及酵母提取物购自阿拉丁试剂有限公司，所有的化学物质都未经进一步处理使用，蒸馏水(ρ=18.2 MΩ•cm，25℃)来自Millipore milli-Q净水系统。此外，以10.0mM的MES和NaOH为原料，用蒸馏水制备了10.0 mM、pH = 6.0的MES-NaOH缓冲液。在2.0 mM的水溶液中制备EuGdW10原液，并置于黑暗条件下(4℃)储存，然后根据不同的实验要求稀释到所需浓度。革兰氏阴性菌E.coli和金黄色葡萄球菌S.aureus来自北京四环生物制药有限公司。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 Na9[EuW10O36]•32H2O (EuW10)的制备与纯化
将26.8 mmol Na2WO4•2H2O溶解在20 mL 蒸馏水中，用乙酸(CH3COOH)调节pH至7.0-7.5。将包含2.4 mmol Eu(NO3)3•6H2O的2 mL的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80-90℃搅拌，冷却至室温，得到结晶的Na9[EuW10O36]•32H2O，过滤后，在空气中干燥得到Na9[EuW10O36]•32H2O。
实施例2 Na9[Eu0.7Gd0.3W10O36]•32H2O(EuGdW10)的制备与纯化
将26.8 mmol Na2WO4•2H2O溶解在20 mL 蒸馏水中，用乙酸(CH3COOH)调节pH至7.0-7.5。将包含1.68 mmol Eu(NO3)3•6H2O的2mL水溶液和0.72 mmol Gd(NO3)3•6H2O的 2mL的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80-90℃搅拌，冷却至室温，得到结晶的Na9[Eu0.7Gd0.3W10O36]•32H2O，过滤后，在空气中干燥得到Na9[Eu0.7Gd0.3W10O36]•32H2O。
如图1所示，当引入Gd3+之后，多金属含氧酸EuW10的荧光强度明显增强，证明了Gd3+为EuW10的荧光发射提供了新的途径，降低了EuW10的荧光猝灭。多以相比于单一的EuW10，EuGdW10具有更强的荧光发射效应。
实施例3 构建EuW10/VA-23二元组装体
将12.5 μL VA-23 (2.0 mM)与EuW10 (50 μM)在MES-NaOH (10.0 mM，pH=6.5) 缓冲液中混合均匀，使得终体积为1.0 mL，室温孵育10 min后，构建得到EuW10/VA-23二元组装体。
实施例4 构建EuGdW10/VA-23二元组装体
将12.5 μL VA-23 (2.0 mM)与EuGdW10 (50 μM)在MES-NaOH (10.0 mM，pH=6.5)缓冲液中混合均匀，使得终体积为1.0 mL，室温孵育10 min后，构建得到EuGdW10/VA-23二元组装体。
实施例5 制备高效医用抗菌敷料
将以下组分按照一定比例混合，然后进行混合均匀后，在40℃下搅拌25 min，然后保存在40℃的环境中备用，即为高效医用抗菌敷料。
各组分的比例如下：
复合抗菌剂（VA-23、EuW10/VA-23、EuGdW10/VA-23） 5%，重组胶原蛋白 0.5%，甘油5%，丁二醇 1%，三乙醇胺 5%，苯氧乙醇 1.0%，余量为水。
实施例6 革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌S.aureus的培养
将10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和170.9 mmol氯化钠加入1 L水中，搅拌均匀后，放入高温灭菌锅中消毒杀菌，静置冷却至室温，然后用封口膜封住外围的开口，将其放入4℃的保温冰箱中备用，制得Luria-Bertani (LB)琼脂培养基。
将MRSA单菌落接种到Luria-Bertani (LB)琼脂培养基中，在37℃、180 rpm条件下培养14-16 h，得到不同类型菌的悬液，光密度在600 nm (OD600)的紫外吸收值用来评估S.aureus的生长情况，该发明中控制OD600=0.4-0.6。
实施例7 琼脂平板消毒试验
将原料EuGdW10 (5 μM)、EuGdW10 (7.5 μM)、EuGdW10 (10 μM)、EuGdW10 (12.5 μM)和EuGdW10 (15 μM)分别与S.aureus悬液(OD600= 0.2)混合，37℃孵育3 h后，将0.2 mL稀释的菌悬液平铺于LB琼脂上，在37℃孵育18 h，用标准平板计数法测定细菌的存活率，EuGdW10 (12.5 μM)的消毒效果最佳。
将原料EuW10 (12.5 μM)和 VA-23 (6.25 μM)或者 EuGdW10 (12.5 μM)和 VA-23(6.25 μM)在磷酸盐缓冲溶液(PBS，阴性对照)中组装成二元(EuW10/VA-23)和二元(EuGdW10/VA-23)，将VA-23(6.25 μM)与制得的EuW10/VA-23、EuGdW10/VA-23分别与S.aureus悬液(OD600= 0.2)混合。37℃孵育3 h后，将0.2 mL稀释的菌悬液平铺于LB琼脂上，在37℃孵育18 h，用标准平板计数法测定细菌的存活率，结果如图2-3所示。
从图中明显地观察到：分别加入了VA-23和二元组装体EuW10/VA-23，金黄色葡萄球菌的存活率分别为：37.6%和4.6%。与空白相比较，VA-23和二元组装体EuW10/VA-23对于S.aureus的生长有着不同的抑制作用，而当VA-23与EuGdW10组合构建成二元组装体之后，消毒效果有着明显的提升，此时的金黄色葡萄球菌的存活率达到了0%。
实施例8 敷料抑菌时间测试
取0.2 mL S.aureus悬液(OD600= 0.2)稀释的菌悬液平铺于LB琼脂上，并将制备的敷料涂抹在培养皿中心位置，在37℃孵育18 h，观察培养皿中心位置是否还存在菌落。并且每间隔一小时记录观察。
如图4-A所示，单一的VA-23敷料在培养皿中心位置会长满菌落，证明了单一组分的VA-23敷料没有抗菌性能。图4-B可以看出，二元组分EuW10/VA-23是具有一部分的抗菌性能的，而且形成了小的抑菌圈，抑菌圈的直径约为5 mm。从图4-C中可以发现，三元组装体制备的敷料在培养皿中心位置并没有发现任何菌落，但是没有涂抹敷料的地方长满菌落，而且抑菌圈的直径约为20 mm。因此说明了高效医用抗菌敷料具有很好的杀菌性能。并且维持了52 h。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种复合抗菌剂，其特征在于：所述的抗菌剂由VA-23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐合成得到；所述的VA-23为HPV16型L2蛋白的N末端氨基酸105-123的序列；
所述的Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐为Na9[EuxGdyW10O36]•32H2O，其中的x为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，y为0.6、0.5、0.4、0.3或0.2。
2.根据权利要求1所述的复合抗菌剂，其特征在于：所述的VA-23与Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐的摩尔浓度比为1：1-3。
3.根据权利要求2所述的复合抗菌剂，其特征在于：所述的VA-23与Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐的摩尔浓度比为1：1。
4.根据权利要求1所述的复合抗菌剂，其特征在于：所述的x为0.7，y为0.3。
5.根据权利要求1所述的复合抗菌剂，其特征在于：所述的复合抗菌剂由VA-23和Gd3+掺杂的Eu多金属含氧酸盐经混合、孵育后得到；所述的孵育步骤的时间为5-16分钟。
6.一种人体友好型医用抗菌敷料，其特征在于：该敷料由包括如下重量百分比的组分制成：权利要求1-5中任一项所述的复合抗菌剂5%，重组胶原蛋白 0.1-1%，甘油3-6%，丁二醇0.5-2%，三乙醇胺2-7%，苯氧乙醇0.3-1%，余量为水。
7.权利要求6所述的人体友好型医用抗菌敷料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将各组分进行混合、搅拌，然后保存、备用即成。
8.根据权利要求7所述的人体友好型医用抗菌敷料的制备方法，其特征在于：所述的搅拌步骤的时间为15-30分钟，温度为35-45℃；所述的保存步骤的温度为30-45℃。
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