CN110787281A - 治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及制备方法 - Google Patents

治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及其制备方法，按重量份计，其包括：没食子酸20‑25、次氯酸钠0.2‑0.5份、羟苯已酯5‑10份、苦参提取物10‑15份、芦苇提取物15‑20份、抗菌肽3‑5份、银离子水5‑8份、黄连提取物8‑10份、金银花提取物10‑12份、大青叶提取物5‑10份、天然凝胶剂85‑100份。其具有多种天然植物抑菌成分，可有效杀菌、抑菌，治疗因糖尿病等引起的皮肤组织溃疡，避免长期使用抗生素导致细菌产生耐药性。

Description

治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及制备方法
技术领域
本发明涉及抗菌药品领域。更具体地说，本发明涉及一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及制备方法。
背景技术
糖尿病是一种严重威胁人类健康的代谢性疾病，而糖尿病皮肤溃疡是糖尿病最常见的并发症之一。罹患糖尿病皮肤溃疡的患者，其溃疡创面反复发作、经久不愈，严重者可出现肢端坏疽、脓毒血症，甚至截肢、死亡。目前糖尿病皮肤溃疡的治疗主要依赖抗生素类药物，抗生素能够治疗溃疡处的感染，却无法促进溃疡的愈合，其次，长期使用抗生素会导致细菌产生耐药性，会导致杀菌、抑菌效果逐渐较弱，进一步增加因糖尿病引起的皮肤组织溃疡治疗的难度。
因此，如何提供一种能治疗因糖尿病引起的皮肤组织溃疡，杀菌、抑菌效果好，能促进伤口愈合，且能摆脱对抗生素使用依赖的药物显得尤为重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶及其制备方法，其具有多种天然植物抑菌成分，可有效杀菌、抑菌，治疗因糖尿病等引起的皮肤组织溃疡，避免长期使用抗生素导致细菌产生耐药性。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶，按重量份计，其包括：没食子酸20-25、次氯酸钠0.2-0.5份、羟苯已酯5-10份、苦参提取物10-15份、芦苇提取物15-20份、抗菌肽3-5份、银离子水5-8份、黄连提取物8-10份、金银花提取物10-12份、大青叶提取物5-10份、天然凝胶剂85-100份。
优选的，所述没食子酸的制备方法包括如下步骤：
S11、将黑曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再放入霉菌培养箱中，于28-35℃条件下活化72h，以获得黑曲霉菌种；采用配制好的液体培养基培养黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液；再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃，pH3.5-4.5，转速500-800rpm搅拌，培养时间为7d，以获得黑曲霉孢子悬浮液；
S12、按重量份计，在反应釜中加入经过粉碎的含单宁生物质40-50份、去离子水300-400份、黑曲霉孢子悬浮液25-30份、第二发酵培养基30-35份，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0，调节溶氧量至3.5-5.0mg/L；
对所述发酵体系进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，所述第一光照处理为：采用光强为30-35μmol.m-2.s-1的红光以及光强为25-30μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为45-60min；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.4-0.8mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为45-60min；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，所述第二光照处理为：采用光强为24-28μmol.m-2.s-1的红光以及光强为20-24μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为30-45min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.65mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为30-45min；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，所述第三光照处理为：采用光强为12-24μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-12μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为20-30min；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.25-0.55mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S13、将经步骤S12中发酵处理的发酵体系置于微波加热器中，并加入发酵体系重量1-3％强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，所述微波加热器的压强为0.1-0.3个大气压，微波功率为800-850w，加热40-45min；
以及S14、将经步骤S13处理得到的溶液进行加压浓缩，使其体积缩小至原来体积的10-15％后降温至20-25℃，过滤分离得到水相和固相；固相用去离子水溶解，再经活性炭脱色、重结晶、真空干燥后得到所述没食子酸。
优选的，所述步骤S11中，按重量比计，用于培养黑曲霉菌种的液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO3 0.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO30.1％、MnSO4.H2O 0.2％、去离子水86.95％。
优选的，所述步骤S11中，按重量比计，所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO40.05％、KNO3 0.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％。
优选的，所述步骤S11中，扩大培养过程中，每天对接种有液态黑曲霉种子液的第一发酵培养基进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz，处理时间为30min。
优选的，所述步骤S12中，所述含单宁生物质包括五倍子和/或塔拉。
优选的，所述步骤S12中，按重量比计，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精3％、豆粕粉4.5％、木糖5％、酵母膏1％、La(NO3)3.6H2O 0.05％、纤维素酶0.15％、果胶酶0.15％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.1％、NH4NO3 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水85.75％。
优选的，所述抗菌肽为昆虫抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、鱼类抗菌肽、软体动物抗菌肽、甲壳类动物抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽中的一种或几种。
优选的，所述天然凝胶剂为明胶、褐藻酸钠、琼脂、魔芋胶中的一种或多种。
还提供一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
S100、分别制备苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物以及大青叶提取物；且五种提取物的制备方法相同，包括：
(1)称取原料，冲洗2-3遍后干燥粉碎，并过100目筛，获得原料粉末；
(2)取原料粉末、缓冲液以及去离子水进行混合，按重量比计，原料粉末：缓冲液＝1:(4-5)：(20-25)进行混合，以获得混合体系，记录混合体系总体积数值，以及将pH值调节为6.8-7；再对混合液进行温度处理，以获得浸提体系；
所述温度处理过程包括：
升温至50-60℃，保温60-75min，再降温至25-30℃，保温25-30min，并记录此时混合体系的第一体积数值；按照(总体积-第一体积)*50％补入含有去离子水和缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1；补入第一混合液后，升温至65-70℃，保温80-90min，再降温至45-55℃，保温30-35min，并记录此时混合体系的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1；补入第二混合液后，升温至75-85℃，保温70-85min，再降温至55-65℃，保温30-45min；
(3)对所述浸提体系进行酶解，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提体系的pH值调节至8.0-9.0，按离心液重量的5％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-35min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.0-4.0，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃，保温30-35min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.5-5.0，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温20-30min后得到第三酶解体系；
(4)在第三酶解体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min后离心，去沉渣后的液相再经硅藻土过滤，得到清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa；再在所述清液中按其重量加入4-5％的活性炭，静置45-50min，然后离心，去沉渣，以获得粗提液；
(5)将粗提液经过微滤陶瓷膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃，以获得微滤膜透过液；再将微滤膜透过液经过卷式超滤膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃，以获得超滤膜透过液；再将超滤膜截留液经过卷式高压反渗透膜进行浓缩，控制操作温度为35-40℃，得到浓缩液；所述浓缩液即为苦参提取物/芦苇提取物/黄连提取物/金银花提取物/大青叶提取物；
S200、称取如权利要求1中所述重量份的天然凝胶剂，混合后然后加入去离子水溶解，去离子水的量为天然凝胶剂重量的10-15倍，待形成均匀胶状液体时，在转速500-800rpm条件下加入如权利要求1中所述重量份的苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物、大青叶提取物、没食子酸、次氯酸钠、羟苯已酯、抗菌肽以及银离子水，得到胶液；
S300、对胶液进行交联固化处理，以获得所述治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过反复酶解结合光照处理、交变磁场处理以及多重过滤的提取工艺，可大幅提高含单宁生物质将单宁转化为没食子酸的效率和产品纯度，使其发挥更佳的杀菌功能，进一步的，没食子酸与其他具有抗菌作用的组分(如次氯酸钠、羟苯已酯、苦参提取物、芦苇提取物、抗菌肽、银离子水、黄连提取物、金银花提取物、大青叶提取物)复配使用后，可有效杀菌、抑菌，促进皮肤溃疡创口愈合，有效治疗因糖尿病等引起的皮肤组织溃疡，避免长期使用抗生素导致细菌产生耐药性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
按重量份计，本实施例中的治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶包括：没食子酸20、次氯酸钠0.2份、羟苯已酯5份、苦参提取物12份、芦苇提取物15份、抗菌肽3份、银离子水5份、黄连提取物8份、金银花提取物12份、大青叶提取物5份、天然凝胶剂85份。其中，所述抗菌肽为昆虫抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、鱼类抗菌肽、软体动物抗菌肽、甲壳类动物抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽中的一种或几种；所述天然凝胶剂为明胶、褐藻酸钠、琼脂、魔芋胶中的一种或多种；
进一步的，没食子酸体外对金黄色葡萄球菌、八叠球菌、α-型键球菌、奈瑟氏球菌、绿脓杆菌、弗氏痢疾杆菌、伤寒杆菌Hd、副伤寒杆菌A等菌有抑制作用，因此其属于重要的抗菌成分。为此，本实施例还提供了一种没食子酸的制备方法，其包括如下步骤：
S11、将黑曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再放入霉菌培养箱中，于28-35℃(优选32℃)条件下活化72h，以获得黑曲霉菌种；采用配制好的液体培养基培养黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液；再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃(优选32℃)，pH3.5-4.5，转速500-800rpm搅拌，培养时间为7d，以获得黑曲霉孢子悬浮液，优选的，为提高扩大培养效率，扩大培养过程中，每天对接种有液态黑曲霉种子液的第一发酵培养基进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz，处理时间为30min；其中，按重量比计，用于培养黑曲霉菌种的液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO3 0.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、ZnSO4.7H2O0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.2％、去离子水86.95％；所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％；
S12、按重量份计，在反应釜中加入经过粉碎的含单宁生物质(所述含单宁生物质包括五倍子和/或塔拉)40-50份(优选45份)、去离子水300-400份(优选350份)、黑曲霉孢子悬浮液25-30份(优选28份)、第二发酵培养基30-35份(优选32份)，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0，调节溶氧量至3.5-5.0mg/L(优选4.5mg/L)；其中，按重量比计，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精3％、豆粕粉4.5％、木糖5％、酵母膏1％、La(NO3)3.6H2O 0.05％、纤维素酶0.15％、果胶酶0.15％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.1％、NH4NO30.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水85.75％；
对所述发酵体系进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃(优选37℃)，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，所述第一光照处理为：采用光强为30-35μmol.m-2.s-1(优选32μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为25-30μmol.m-2.s-1(优选28μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射时间为45-60min(优选50min)；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.4-0.8mT(优选为0.5mT)的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为45-60min(优选50min)；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃(优选37℃)，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，所述第二光照处理为：采用光强为24-28μmol.m-2.s-1(优选25μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为20-24μmol.m-2.s-1(优选22μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射时间为30-45min(优选40min)；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.65mT(优选为0.4mT)的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为30-45min(优选40min)；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃(优选37℃)，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，所述第三光照处理为：采用光强为12-24μmol.m-2.s-1(优选15μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为10-12μmol.m-2.s-1(优选11μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射时间为20-30min(优选25min)；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.25-0.55mT(优选为0.3mT)的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min(优选25min)；
黑曲霉菌种可通过产生单宁酶将单宁转化为没食子酸。因此本步骤中采用黑曲霉菌种作为发酵菌种，分别用特定的培养基活化、扩大培养后，再在含有La(NO3)3.6H2O的培养基中对含单宁生物质进行酶解发酵，以获得没食子酸，其中La3+对黑曲霉的生长代谢起到促进作用，提高其生长效率，并提高单宁酶的产量和酶活力，由此可充分发挥其抗菌作用。进一步的，三阶段发酵处理中，红光以及蓝光也能通过调节细胞质膜的通透性来促进其同化作用，并提高酶活，交变磁场则通过细胞膜上钙离子的释放来促进黑曲霉的生长，进一步提高酶的产量。同时，为避免红光、蓝光以及交变磁场长期在恒定数值而对黑曲霉的生长产生不良影响，本步骤中采用三阶段发酵处理，且每一阶段红光、蓝光的光强、交变磁场的强度均逐步递减，由此保证黑曲霉始终处于较强的生长活力中，以此持续高效产生高活力单宁酶，进一步将单宁转化为没食子酸；
S13、将经步骤S12中发酵处理的发酵体系置于微波加热器中，并加入发酵体系重量1-3％(优选2％)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，所述微波加热器的压强为0.1-0.3个大气压，微波功率为800-850W，加热40-45min；
以及S14、将经步骤S13处理得到的溶液进行加压浓缩，使其体积缩小至原来体积的10-15％后降温至20-25℃，过滤分离得到水相和固相；固相用去离子水溶解，再经活性炭脱色、重结晶、真空干燥后得到所述没食子酸。
<实施例2>
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，按重量份计，本实施例中的治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶由以下组分组成：没食子酸25份、次氯酸钠0.5份、羟苯已酯10份、苦参提取物15份、芦苇提取物20份、抗菌肽5份、银离子水8份、黄连提取物9份、金银花提取物11份、大青叶提取物10份、天然凝胶剂100份、水400份。
<实施例3>
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，按重量份计，本实施例中的治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶由以下组分组成：没食子酸22份、次氯酸钠0.4份、羟苯已酯8份、苦参提取物12份、芦苇提取物18份、抗菌肽4份、银离子水7份、黄连提取物7份、金银花提取物11份、大青叶提取物8份、天然凝胶剂90份、水380份。
<没食子酸制备过程中单宁酶产量、酶活力检测结果>
先将黑曲霉B1401转接到察氏斜面活化培养基上，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养72h备用；将经活化的试管斜面加入10ml的生理盐水，充分震荡、稀释后制得108CFU/mL左右的孢子悬浮液备用；配置培养基，且所述培养基包括：6％单宁酸(w/v)，2.5％葡萄糖(w/v)，1％(NH4)2SO4(w/v)，0.1％MgSO4·7H2O(w/v)，0.1％NaNO3(w/v)，0.1％K2HPO4·3H2O(w/v)，pH值5.0；所述培养基中按2％(v/v)的比例接入孢子悬浮液，在转速160r/min、温度35℃的条件下进行产酶培养72h；在完成产酶培养的培养基中添加总质量20％的单宁酸，转速150r/min、反应温度35℃、pH维持在4.0-5.0条件下发酵反应48h；进行菌体与发酵液分离后即获得没食子酸，上述没食子酸制备方法为对比例1。检测所述对比例1发酵反应与本发明步骤S12中单宁酶的产量和酶活力，其结果如表1所示；
表1单宁酶产量及酶活测定
Figure BDA0002247093840000081
Figure BDA0002247093840000091
从表1中可以看出，通过本发明步骤S13的三发酵阶段处理，通过黑曲霉产生的单宁酶总量平均可达到52mg/g，单宁酶酶活力最高值可达到57.32U/mL，虽然随着酶解反应的进行，由于培养基消耗、发酵条件(温度、pH等)的改变，单宁酶产量、酶活力均呈现不同程度的降低，但到达第三发酵阶段时，三者整体上仍然保持有较高的水平，由此可见，本发明步骤S13的三发酵阶段处理可对黑曲霉的生长代谢起到促进作用，提高其生长效率，并提高单宁酶酶活力和产量，进一步可有效将单宁转化为没食子酸。
<没食子酸检测结果>
将通过上述对比例1制备获得的没食子酸作为对比例2，将其与通过本发明实施例1-3制备获得的没食子酸进行检测，以获得没食子酸产率、外观以及纯度结果，具体如表2所示。
表2没食子酸产率、外观以及纯度
Figure BDA0002247093840000092
从表2中可以看出，通过本发明获得的没食子酸，其产率较对比例2提高40％，纯度提高27％，其外观好，无明显杂质。
<实施例4>
本实施例还提供了一种如实施例1-3任一项所述治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S100、分别制备苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物以及大青叶提取物；且五种提取物的制备方法相同，包括：
(1)称取原料(即苦参或芦苇或黄连或金银花或大青叶)，冲洗2-3遍后干燥粉碎，并过100目筛，获得原料粉末；
(2)取原料粉末、缓冲液以及去离子水进行混合，按重量比计，原料粉末：缓冲液＝1:(4-5)：(20-25)(优选1:4.5:22)进行混合，以获得混合体系，记录混合体系总体积数值，以及将pH值调节为6.8-7；再对混合液进行温度处理，以获得浸提体系；
所述温度处理过程包括：
升温至50-60℃(优选55℃)，保温60-75min(优选70min)，再降温至25-30℃，保温25-30min，并记录此时混合体系的第一体积数值；按照(总体积-第一体积)*50％补入含有去离子水和缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1；补入第一混合液后，升温至65-70℃(优选68℃)，保温80-90min(优选85min)，再降温至45-55℃(优选50℃)，保温30-35min，并记录此时混合体系的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1；补入第二混合液后，升温至75-85℃(优选80℃)，保温70-85min，再降温至55-65℃(优选60℃)，保温30-45min；
(3)对所述浸提体系进行酶解，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提体系的pH值调节至8.0-9.0(优选8.5)，按离心液重量的5％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃(优选58℃)，保温30-35min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.0-4.0(优选3.5)，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃(优选50℃)，保温30-35min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.5-5.0(优选4.8)，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃(优选58℃)，保温20-30min后得到第三酶解体系；
(4)在第三酶解体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min(优选80min)后离心，去沉渣后的液相再经硅藻土过滤，得到清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa；再在所述清液中按其重量加入4-5％的活性炭，静置45-50min，然后离心，去沉渣，以获得粗提液；
(5)将粗提液经过微滤陶瓷膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃(优选60℃)，以获得微滤膜透过液；再将微滤膜透过液经过卷式超滤膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃(优选60℃)，以获得超滤膜透过液；再将超滤膜截留液经过卷式高压反渗透膜进行浓缩，控制操作温度为35-40℃，得到浓缩液；所述浓缩液即为苦参提取物/芦苇提取物/黄连提取物/金银花提取物/大青叶提取物；
S22、称取实施例1-3之一所述重量份的天然凝胶剂，混合后然后加入去离子水溶解，去离子水的量为天然凝胶剂重量的10-15倍(优选12倍)，待形成均匀胶状液体时，在转速500-800rpm条件下加入如权利要求1中所述重量份的苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物、大青叶提取物、没食子酸、次氯酸钠、羟苯已酯、抗菌肽以及银离子水，得到胶液；
S23、对胶液进行交联固化处理，以获得所述治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶。
由此，可通过多阶段酶解使得苦参或芦苇或黄连或金银花或大青叶的细胞结构(如细胞壁等)组成在不同的温度变化环境下被反复冲击、破坏，使其内部富含的杀菌、促进伤口愈合等成分更为充分的游离至细胞外，以此达到杀菌、促进皮肤溃疡伤口愈合的效果。
<抑菌消炎功效评价试验>
(1)抑菌
取新鲜菌株斜面培养物，用无菌生理盐水制成浓度为1×106-1×107CFU/ml的菌悬液，无菌吸取菌悬液100μL接种于相应培养基表面，涂布均匀。准确吸取受试皮肤抑菌剂20L滴于无菌圆纸片(φ5mm×4mm)上，37℃下烘干后贴放于培养基表面；空白对照纸片上滴加无菌蒸馏水20μL。每组3个平皿，每个平皿表面放置4张试验样品纸片和1张阴性对照纸片，37℃下培养16-18h。测量抑菌圈直径，大于7mm表示有抑菌作用，测量结果如表3所示。
受试皮肤抑菌剂：以本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶(以下均为“复方植物药凝胶”)为主要原料制成的溶液，pH为6.2；试验菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、白色假丝酵母(ATCC10231)；菌悬液浓度：3×106CFU/ml。
表3复方植物药凝胶对抑菌圈平均直径影响
Figure BDA0002247093840000121
从表3中可知，相对于空白对照组而言，本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶对2种试验菌的生长抑制效果均很明显，其中对真菌(白色假丝酵母)的抑菌效果最好，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果次之，此外，中、高剂量组相对于阳性对照组而言，其对2种试验菌的生长同样具有显著的抑制效果，总体来说，本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶具有优异的抑菌效果。
(2)消炎
选取雄性小鼠240只,体重18～21g,随机分成12组，每组20只，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。将30L二甲苯涂于模型对照组和抗菌肽组小鼠左耳前后两面致炎，右耳为对照。致炎后模型对照组擦拭等量地塞米松，正常对照组擦拭等量生理盐水，抗菌肽组以20mg/kg给药，每日1次，连续5d。末次给药后1h，处死小鼠，用直径8mm的打孔器打下左右耳片，称重，以左右耳片重量差作为肿胀度，计算肿胀率(计算结果如表4所示)，观察消炎效果。
表4复方植物药凝胶对肿胀率影响
Figure BDA0002247093840000131
由表4结果可知，本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶能显著降低二甲苯致小鼠耳廓的肿胀程度，肿胀度最多可下降51％，说明本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶具有良好的消炎效果。
<对糖尿病溃疡的疗效评价试验>
综合治疗：DM饮食，控制体重；口服降糖药控制血糖；取溃疡面分泌物做细菌培养及药敏试验，选用有效的抗生素控制感染；给予改善循环及扩张血管治疗；进行合理的足部护理，防止进一步外部损伤。
分组：
对照组:每组30人，采用常规换药，每天1次，观察2周；
实验组:每组30人，外敷本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶，每天1次，观察2周，检测治疗前后的溃疡面积，其结果如表5所示。
表5治疗前后溃疡面积比较表(x±s)
Figure BDA0002247093840000132
Figure BDA0002247093840000141
从表5可以看出，对照组中，治疗2周后溃疡面积下降51％，而通过本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶治疗后，溃疡面积平均下降66％，其相对于对照组具有更好的促进溃疡愈合、减小溃疡面的效果。
<创面闭合功效评价试验>
研究选取2015年12月－2016年12月的糖尿病足患者120例为研究对象，其中男性61例，女性59例，随机分为研究组和对照组，每组30例。对照组患者给予凡士林敷料，研究组患者给予ETT.HPV抗菌肽敷料，当患者的溃疡面出现红、肿、热、痛等临床症状或愈合不良、渗出液污染敷料及溃疡面出现感染时，及时对溃疡面进行换药。相关症状改善后，间隔72-96h进行换药，并对两组患者给予不同敷料治疗后的创面闭合指数进行观察和比较，结果如表6所示。
表6治疗前后创面闭合指数比较表
组别 人数 14d 28d
对照组 30 46.53±6.53 84.32.±3.21
实施例1 30 59.42±5.32 96.02±5.43
实施例2 30 54.52±5.64 91.59±1.83
实施例3 30 53.62±2.57 93.55±0.13
从表6这种可以直接看出，14d时，实施例1-3中的患者创面闭合指数最多相较对照组提高27.7％，28d时，实施例1-3中的患者创面闭合指数最多相较对照组提高13.9％，表明本发明中的抗菌肽复方植物药凝胶能有效缓解糖尿病患者足部问题，促进创面愈合。
需要说明的是，上述实施例1至4中的技术方案可进行任意组合，且组合后获得的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明通过反复酶解结合光照处理、交变磁场处理以及多重过滤的提取工艺，可大幅提高含单宁生物质将单宁转化为没食子酸的效率和产品纯度，使其发挥更佳的杀菌功能，进一步的，没食子酸与其他具有抗菌作用的组分(如次氯酸钠、羟苯已酯、苦参提取物、芦苇提取物、抗菌肽、银离子水、黄连提取物、金银花提取物、大青叶提取物)复配使用后，可有效杀菌、抑菌，促进皮肤溃疡创口愈合，有效治疗因糖尿病等引起的皮肤组织溃疡，避免长期使用抗生素导致细菌产生耐药性。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，按重量份计，其包括：没食子酸20-25、次氯酸钠0.2-0.5份、羟苯已酯5-10份、苦参提取物10-15份、芦苇提取物15-20份、抗菌肽3-5份、银离子水5-8份、黄连提取物8-10份、金银花提取物10-12份、大青叶提取物5-10份、天然凝胶剂85-100份。
2.如权利要求1所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述没食子酸的制备方法包括如下步骤：
S11、将黑曲霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再放入霉菌培养箱中，于28-35℃条件下活化72h，以获得黑曲霉菌种；采用配制好的液体培养基培养黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液；再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃，pH3.5-4.5，转速500-800rpm搅拌，培养时间为7d，以获得黑曲霉孢子悬浮液；
S12、按重量份计，在反应釜中加入经过粉碎的含单宁生物质40-50份、去离子水300-400份、黑曲霉孢子悬浮液25-30份、第二发酵培养基30-35份，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0，调节溶氧量至3.5-5.0mg/L；
对所述发酵体系进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，所述第一光照处理为：采用光强为30-35μmol.m-2.s-1的红光以及光强为25-30μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为45-60min；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.4-0.8mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为45-60min；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，所述第二光照处理为：采用光强为24-28μmol.m-2.s-1的红光以及光强为20-24μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为30-45min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.65mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为30-45min；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为30-45℃，并在转速500-800rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，所述第三光照处理为：采用光强为12-24μmol.m-2.s-1的红光以及光强为10-12μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射时间为20-30min；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.25-0.55mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为20-30min；
S13、将经步骤S12中发酵处理的发酵体系置于微波加热器中，并加入发酵体系重量1-3％强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，所述微波加热器的压强为0.1-0.3个大气压，微波功率为800-850w，加热40-45min；
以及S14、将经步骤S13处理得到的溶液进行加压浓缩，使其体积缩小至原来体积的10-15％后降温至20-25℃，过滤分离得到水相和固相；固相用去离子水溶解，再经活性炭脱色、重结晶、真空干燥后得到所述没食子酸。
3.如权利要求2所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述步骤S11中，按重量比计，用于培养黑曲霉菌种的液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO3 0.25％、Na2MoO4.2H2O0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.2％、去离子水86.95％。
4.如权利要求2所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述步骤S11中，按重量比计，所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％。
5.如权利要求2所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述步骤S11中，扩大培养过程中，每天对接种有液态黑曲霉种子液的第一发酵培养基进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz，处理时间为30min。
6.如权利要求2所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述步骤S12中，所述含单宁生物质包括五倍子和/或塔拉。
7.如权利要求2所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述步骤S12中，按重量比计，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精3％、豆粕粉4.5％、木糖5％、酵母膏1％、La(NO3)3.6H2O 0.05％、纤维素酶0.15％、果胶酶0.15％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.1％、NH4NO30.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水85.75％。
8.如权利要求1所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述抗菌肽为昆虫抗菌肽、哺乳动物抗菌肽、两栖动物抗菌肽、鱼类抗菌肽、软体动物抗菌肽、甲壳类动物抗菌肽、植物抗菌肽、细菌抗菌肽中的一种或几种。
9.如权利要求1所述的抗菌肽复方植物药凝胶，其特征在于，所述天然凝胶剂为明胶、褐藻酸钠、琼脂、魔芋胶中的一种或多种。
10.一种治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S100、分别制备苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物以及大青叶提取物；且五种提取物的制备方法相同，包括：
(1)称取原料，冲洗2-3遍后干燥粉碎，并过100目筛，获得原料粉末；
(2)取原料粉末、缓冲液以及去离子水进行混合，按重量比计，原料粉末：缓冲液＝1:(4-5)：(20-25)进行混合，以获得混合体系，记录混合体系总体积数值，以及将pH值调节为6.8-7；再对混合液进行温度处理，以获得浸提体系；
所述温度处理过程包括：
升温至50-60℃，保温60-75min，再降温至25-30℃，保温25-30min，并记录此时混合体系的第一体积数值；按照(总体积-第一体积)*50％补入含有去离子水和缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1；补入第一混合液后，升温至65-70℃，保温80-90min，再降温至45-55℃，保温30-35min，并记录此时混合体系的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1；补入第二混合液后，升温至75-85℃，保温70-85min，再降温至55-65℃，保温30-45min；
(3)对所述浸提体系进行酶解，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提体系的pH值调节至8.0-9.0，按离心液重量的5％加入胰蛋白酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-35min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.0-4.0，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃，保温30-35min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.5-5.0，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温20-30min后得到第三酶解体系；
(4)在第三酶解体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min后离心，去沉渣后的液相再经硅藻土过滤，得到清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa；再在所述清液中按其重量加入4-5％的活性炭，静置45-50min，然后离心，去沉渣，以获得粗提液；
(5)将粗提液经过微滤陶瓷膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃，以获得微滤膜透过液；再将微滤膜透过液经过卷式超滤膜进行过滤，操作温度控制在55-65℃，以获得超滤膜透过液；再将超滤膜截留液经过卷式高压反渗透膜进行浓缩，控制操作温度为35-40℃，得到浓缩液；所述浓缩液即为苦参提取物/芦苇提取物/黄连提取物/金银花提取物/大青叶提取物；
S200、称取如权利要求1中所述重量份的天然凝胶剂，混合后然后加入去离子水溶解，去离子水的量为天然凝胶剂重量的10-15倍，待形成均匀胶状液体时，在转速500-800rpm条件下加入如权利要求1中所述重量份的苦参提取物、芦苇提取物、黄连提取物、金银花提取物、大青叶提取物、没食子酸、次氯酸钠、羟苯已酯、抗菌肽以及银离子水，得到胶液；
S300、对胶液进行交联固化处理，以获得所述治疗皮肤组织溃疡感染的抗菌肽复方植物药凝胶。
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