CN115141850B - 一种自发捕捉与释放dna的载体制备方法及应用 - Google Patents
一种自发捕捉与释放dna的载体制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种自发捕捉与释放DNA的载体制备方法及应用。本发明首先采用C12DMAO和EuW10按一定摩尔比且通过调节pH制备C12DMAO‑EuW10载体溶液,最后向其中加入脲酶,得到DNA捕捉液,尿素和醋酸作为能量诱发被捕捉DNA的自发释放过程。本发明制备的C12DMAO‑EuW10载体是具有pH响应的球形载体,C12DMAO具有pH响应性的质子化行为,而其中铕杂多酸盐EuW10具有刚性的框架结构、良好的水溶性、生物相容性以及较强的自组装能力。本发明通过添加尿素/脲酶,不仅实现了DNA的自发捕捉和释放,还提高了DNA的捕捉量。为基因治疗治疗提供了一种高效的工具/方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子技术领域,具体涉及一种自发捕捉与释放DNA的载体制备方法及应用。
背景技术
基因治疗是指将外源功能性DNA片段转移到靶细胞修补有缺陷的基因达到治疗疾病的目的。但由于DNA分子上磷酸基团的斥力以及生物内各种酶的存在,DNA很难跨越细胞膜进入细胞并在细胞内存活和发挥作用。为解决该问题,将DNA从长链结构组装成类球形结构,达到缩减DNA尺寸和削弱DNA与细胞膜之间静电斥力的目的,是基因治疗中十分重要的一步。由于表面活性剂可以组装形成多种类型的组装体包含胶束、囊泡、液晶等,表面活性剂成为组装DNA的有力材料。响应基团的引入进一步增强了对DNA组装与解组装的控制能力,光响应的偶氮苯、磁响应的反离子、pH响应的氧化胺等基团成为表面活性剂分子中的响应开关。其中,氧化胺类型表面活性剂是典型的代表。它最大特征在于它既能给出质子又能接受质子,即通过调控溶液的pH值,实现阴、阳离子表面活性剂性质切换。pH作为响应开关控制DNA的捕捉与释放:当溶液pH值小于两性表面活性剂等电点时,表面活性剂呈正电性能够结合DNA分子;当溶液pH值大于两性表面活性剂等电点时,表面活性剂不带电荷,结合的DNA分子又重新释放到溶液中。
但是从构筑载体的角度来说,载体的形貌、尺寸和稳定性至关重要,表面活性剂作为最常见的两亲分子可以与其它组装单元通过静电、氢键、疏水等非共价作用力参与到载体的共组装过程中。其中,稀土杂多酸盐具有刚性的框架结构、良好的水溶性、生物相容性以及较强的自组装能力。其中,稀土杂多酸盐因其优异的光物理性质和力学性能而备受关注。基于杂多酸的多阴离子和富含氧原子的特点,利用静电或氢键相互作用力,生物分子、聚合物或表面活性剂等均可与其共组装形成多种形态的超分子组装体。但是氧化胺表面活性剂参与构筑载体的响应性质需要人为控制溶液的pH值的变化,需要引入外源酸或引入外源碱。如何让氧化胺表面活性剂载体在设定时间内完成酸/碱的自发变化,也就是说让载体在设定时间内自发完成对DNA的捕捉过程和自发释放行为,这个自发过程的时间可以编程控制。目前耗散自组装引起人们的广泛关注,即体系必须依靠外界能量的持续输入才能形成瞬变组装体,一旦失去能量供给或能量消耗,组装体立即表现出解组装行为。如何设计能量耗散机制,将这种能量驱动的耗散自组装过程引入到DNA的捕捉过程对于自发完成DNA捕捉和释放具有重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种自发捕捉与释放DNA的载体制备方法及应用。本发明制备得到具有pH响应的C12DMAO-EuW10球形载体,通过添加尿素/脲酶,不仅实现了DNA的自发捕捉和释放,还大大提高了DNA的捕捉量;为基因治疗治疗提供了一种高效的工具/方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种两性离子载体溶液,其特征在于,所述两性离子载体溶液中含有C12DMAO-EuW10载体,所述C12DMAO-EuW10载体的平均粒径为108nm、多分散系数为0.058。
优选的,所述两性离子载体溶液由以下方法制备:
(1)将C12DMAO和EuW10分别溶于水中,配制成C12DMAO水溶液和EuW10水溶液;
(2)将C12DMAO水溶液和EuW10水溶液混合得到混合液,调节混合液的pH值为4-5,室温下静置过夜,得到两性离子载体溶液。
优选的,步骤(1)中,所述C12DMAO水溶液的浓度为10mM;所述EuW10水溶液的浓度为0.05mM。
优选的,步骤(2)中,所述混合液中,C12DMAO与EuW10的摩尔比为(20-36):1;采用醋酸溶液调节混合液的pH值。
优选的,所述C12DMAO与EuW10的摩尔比为36:1,调节混合液的pH值为4;优选的,所述醋酸溶液由醋酸与水按5:1的体积比混合得到。
本发明的第二方面,提供两性离子载体溶液在捕捉/释放DNA或制备DNA捕捉液中的应用。
本发明的第三方面,提供一种自发捕捉和释放DNA的溶液,其制备方法为:向两性离子载体溶液中添加脲酶,使脲酶的浓度为0.45-0.90g/L,先得到DNA捕捉液,然后同时加入尿素和醋酸,进一步得到能够自发捕捉和释放DNA的溶液。
优选的,所述的自发捕捉和释放DNA的溶液中,尿素的浓度为60mM;加入醋酸后,DNA捕捉/释放液的pH值为4。
本发明的第四方面,提供上述溶液在自发捕捉/释放DNA或提高DNA捕捉量中的应用。
优选的,将DNA加入自发捕捉和释放DNA的溶液后,使DNA的浓度为0.01mM。
本发明的有益效果:
1.本发明制备了一种具有pH响应的C12DMAO-EuW10球形组装体,既充分结合了表面活性剂得失质子的响应性质,又借助杂多酸的刚性框架结构、良好的水溶性、生物相容性以及较强的自组装能力,这种组装体制备条件绿色温和,无需严苛的条件。
2.如果DNA不进行自发捕捉和释放,需要在两性离子或者两性离子载体中加入醋酸进行pH值的调节,然后再加入强碱进行DNA的捕捉和释放。但强碱会破坏细胞环境,影响DNA的捕捉和释放,不适于生物学方面的利用。本发明通过向C12DMAO-EuW10载体溶液中添加尿素/脲酶制备能够自发捕捉和释放DNA的溶液,不仅可以控制C12DMAO-EuW10球形载体与DNA结合能力,实现了对DNA分子捕捉和释放的自发控制和时间调节;还大大提高了DNA的捕捉量,为基因编辑提供了高效的工具。
附图说明
图1是EuW10固体粉末的红外光谱图,证明EuW10的成功制备。
图2是对C12DMAO-EuW10载体形成条件的探究,固定pH为4,探究C12DMAO和EuW10的配比,其中C12DMAO母液10mM;EuW10:0.025mM在不同配比下的粒径表征图(a)与Zeta电势图(b)。
图3是在最适配比为36:1,pH为4条件下形成的C12DMAO-EuW10载体的TEM图。
图4是对C12DMAO-EuW10载体形成pH的探究,固定C12DMAO和EuW10配比为36:1(C12DMAO:0.9mM;EuW10:0.025mM),二者溶液在不同pH下的粒径表征图(a)与Zeta电势图(b)。
图5是最适配位为36的C12DMAO-EuW10组装体,在pH为5,6,7,8下的TEM图。
图6是实施例3的DNA捕捉液和对比例1~2捕捉DNA效果对比图,紫外谱图中260nm处吸收峰越低,证明DNA捕捉效率越高。其中实施例3是含有最终浓度0.30g/L脲酶的C12DMAO-EuW10(二者摩尔比是36:1)捕捉液,对比例1是C12DMAO捕捉液,对比例2是C12DMAO-EuW10(二者摩尔比是36:1)捕捉液,三组实验中C12DMAO的量相同。
图7是实施例3加入能量尿素和醋酸后,DNA捕捉液能够自发捕捉和释放DNA的分光光度图,且时间随着脲酶浓度的增大而缩短,其中尿素的最终浓度为60mM且溶液pH为4。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,均可通过商业渠道购买得到。
实施例1:杂多酸EuW10合成
8.3g钨酸钠溶于20mL三次水中,并用醋酸调pH至7.45,然后水浴加热至85℃,磁子不断搅拌。将1.1g硝酸铕溶于2mL三次水中,加热至50℃-60℃,完全溶解。将硝酸铕溶液通过注射器逐滴加入钨酸钠溶液中,反应1.5h。
将反应液旋蒸至内壁出现大量白色粉末,加入20mL热水(85℃左右),溶解白色粉末,进行第二次旋蒸,直至溶液剩余1/2。
旋蒸剩余液趁热转移,防止因冷却造成损失。转移后,放冰箱冷藏,低温静置。直到溶液稳定,上层澄清,下层呈现白色。
进行过滤,将滤纸上的白色粉末先过夜风干,然后50℃烘干。得到EuW10,密封保存,并放入干燥器保存。如图1所示,根据EuW10的红外吸收峰,可知成功制备EuW10。
实施例2:C12DMAO-EuW10载体溶液的制备
将0.0229g C12DMAO常温完全溶解于10mL三次水中,配置10mM的C12DMAO母液。将0.0017g EuW10常温完全溶解于10mL三次水中,配置0.05mM的EuW10母液。
(1)固定EuW10体积为1.5mL,配置C12DMAO体积分别为0.03mL,0.09mL,0.15mL,0.21mL,0.27mL的五份溶液。得到C12DMAO与EuW10摩尔比分别为4:1、12:1、20:1、28:1、36:1的混合液。混合溶液总体积为3mL,差值部分由三次水补齐。醋酸溶液(醋酸与水的体积比为5:1)调节pH为4。图2是粒径与Zeta电势图,可以看出C12DMAO与EuW10最适摩尔比为36:1,此时得到的载体尺寸为108nm,表面带正电荷且Zeta电势值为26.9mV。图3也证明了C12DMAO-EuW10载体为形貌均匀且是110nm左右的球形结构。
(2)固定C12DMAO与EuW10最适摩尔比为36:1,即固定EuW10体积为1.5mL,C12DMAO体积为0.27mL,用醋酸和1mM NaOH调节pH分别为4,5,6,7,8的五份溶液。图4分别是粒径与Zeta电势图,可以看出,C12DMAO-EuW10载体溶液能够形成的pH为4-5而且最适pH为4。图3和图5进一步证明pH在4,5时可以形成球形载体,但是pH等于4时形成载体尺寸更均匀,增大pH至6,7,8时则不能形成球形载体。
实施例3:自发捕捉和释放DNA的溶液制备
(1)DNA捕捉液的制备
取实施例2制备的C12DMAO与EuW10摩尔比为36:1,溶液pH为4的C12DMAO-EuW10载体溶液。向其中加入脲酶,脲酶的最终浓度为0.90g/L,得到DNA捕捉液。
对比例1:DNA捕捉液的制备
将C12DMAO完全溶解于三次水中,加入醋酸调pH为4得到混合液,混合溶液总体积为4.0mL,差值部分由三次水补齐。混合液中,C12DMAO的浓度为0.9mM,制备得到DNA捕捉液。
对比例2:DNA捕捉液的制备
取实施例2制备的C12DMAO与EuW10摩尔比为36:1、C12DMAO-EuW10载体溶液pH为4的C12DMAO-EuW10载体溶液,得到DNA捕捉液。
实验例
(1)DNA捕捉量
称取0.0067g鲑鱼精DNA(购自Sigma-Aldrich公司)完全溶解于20mL三次水中,配置1mM的DNA母液。分别取实施例3和对比例1~2制备的DNA捕捉液1.333mL,分别加入0.04mL的DNA母液,共4mL,差值由三次水补齐,分别得到实施例3试验液、对比例1试验液,对比例2试验液。
孵育4小时后8000转,5分钟离心后取上清液,紫外谱图中260nm为DNA特征吸收峰,可以代表DNA的剩余量,260nm处吸光度值越低证明DNA捕捉液的效率越高,如图6所示,实验例中DNA在260nm处吸光度值远远低于对比例1和对比例2,证明设计的DNA捕捉液的高效率性。
(2)DNA捕捉液自发捕捉和释放DNA的应用
对比例1和对比例2能够进行DNA捕捉过程但捕捉效率远不如实施例3,而且不能完成DNA的自发释放应用,需要人为调节pH,这个过程需引入强碱NaOH,不利于生物学方面的应用。向体积为4mL的实验例中(DNA捕捉液1.333mL,加入0.04mL的DNA母液,共4mL,差值由三次水补齐)同时加入尿素和醋酸,使溶液中尿素浓度为60mM且pH为4。迅速摇晃后,迅速将溶液倒入干燥洁净的常量比色皿中,迅速放入紫外分光光度计进行测试。如图7所示,引入尿素脲酶的C12DMAO-EuW10组装体可以自发的对DNA进行捕捉与释放,且随着脲酶的浓度为0.15,0.18,0.225,0.30g/L,DNA自发释放的时间为3.0,5.5,10.5,13.0分钟。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种两性离子载体溶液,其特征在于,所述两性离子载体溶液中含有C12DMAO-EuW10载体,所述C12DMAO-EuW10载体的平均粒径为108 nm、多分散系数为0.058;
所述两性离子载体溶液由以下方法制备:
(1)将C12DMAO和EuW10分别溶于水中,配制成C12DMAO水溶液和EuW10水溶液;所述C12DMAO水溶液的浓度为10 mM;所述EuW10水溶液的浓度为0.05 mM;
(2)将C12DMAO水溶液和EuW10水溶液混合得到混合液,调节混合液的pH值为4,室温下静置过夜,得到两性离子载体溶液;所述混合液中,C12DMAO与EuW10的摩尔比为36:1;采用醋酸溶液调节混合液的pH值;所述醋酸溶液由醋酸与水按5:1的体积比混合得到。
2.权利要求1所述的两性离子载体溶液在捕捉/释放DNA或制备DNA捕捉液中的应用。
3.一种自发捕捉和释放DNA的溶液,其特征在于,其制备方法为:向权利要求1所述的两性离子载体溶液中添加脲酶,使脲酶的浓度为0.45-0.90 g/L,得到DNA捕捉液,然后依次加入尿素和醋酸,得到能够自发捕捉和释放DNA的溶液。
4.根据权利要求3所述的自发捕捉和释放DNA溶液,其特征在于,所述溶液中,尿素的浓度为60 mM;加入醋酸后,DNA捕捉/释放液的pH值为4。
5.权利要求3或4所述的溶液在自发捕捉/释放DNA和/或提高DNA捕捉量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将DNA加入权利要求3或4所述的溶液后,使DNA的浓度为0.01 mM。
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