WO2024138921A1 - 非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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nanoformulation
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苏苗
张玉喜
林松
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都小姣
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • nucleic acid drugs such as siRNA have many advantages such as high target specificity, and their role and prospects in disease treatment have become increasingly prominent.
  • the use of nucleic acid drugs such as siRNA to regulate targets such as genes and proteins and the tumor microenvironment has received widespread attention in basic research and clinical transformation.
  • ALN-VSP02 and TKM-080301 siRNA drugs targeting vascular endothelial growth and Polo-like kinase 1 genes for the treatment of liver cancer
  • two mRNA vaccines against the new coronavirus have been approved one after another, showing great potential in preventing viral infectious diseases.
  • nucleic acid drugs such as targeting, instability in the body, toxic side effects, etc.
  • Nanocarriers currently under research and clinical application in nucleic acid drugs can be mainly divided into the following categories: 1. Lipid nanocarriers.
  • the siRNA delivery carrier constructed based on lipid materials has achieved the successful clinical transformation of the first siRNA nucleic acid drug Patisiran, and is also the in vivo delivery carrier relied on by two mRNA vaccines against the new coronavirus.
  • Polymer nanocarriers CALLA-01, a water-soluble polycationic nanoparticle-encapsulated siRNA based on cyclodextrin polymer (CDP) developed by Calando Pharmaceuticals in the United States, is the first polymer nanocarrier used in clinical trials for tumor-targeted siRNA delivery. 3.
  • CDP cyclodextrin polymer
  • the LNP system currently approved for clinical use is mainly enriched in the liver after administration, which is suitable for diseases that are administered to the liver and difficult to expand to diseases in other parts; even subcutaneous injection of LNP-based mRNA vaccines will be concentrated in the liver, causing autoimmune hepatitis.
  • nano-drug carrier materials and delivery systems for clinical transformation need to follow the basic principles of drug development of "safety, effectiveness, and quality control".
  • nucleic acid nano-drug delivery system building a large-scale, continuous and intelligent preparation technology platform based on this system, forming a production process that can accurately control the performance of nucleic acid nano-drugs, establishing a quality evaluation system for standardized preparations, and improving the bioavailability and efficacy of clinical nucleic acids will become an urgent need for the development of nucleic acid drugs.
  • polyethylene glycol-polylactic acid and cationic lipids were dissolved in organic phase dichloromethane (250 ⁇ L), and an aqueous solution of siRNA (50 ⁇ L) was added, and the first emulsification was performed through an ultrasonic probe; then the aqueous phase (1.0 mL) was added, and the carrier was emulsified to obtain a nanopreparation encapsulating siRNA.
  • an aqueous solution of nucleic acid is used as the inner aqueous phase
  • polyethylene glycol-polylactic acid or polyethylene glycol-poly (lactic acid glycolic acid) copolymer, cationic lipids, and ionizable lipids are dissolved in an organic solvent as the organic phase
  • DEPC water is used as the outer aqueous phase, and the reaction is carried out in a microchannel reactor to prepare the preparation.
  • the nucleic acid may be siRNA (small interfering RNA) or mRNA (messenger RNA).
  • an ionizable lipid is added as the third component to the two components of polyethylene glycol-polylactic acid and cationic lipid.
  • This three-component composition can significantly improve the transfection effect of nucleic acid drugs and can achieve the same efficacy as Lipofectamine at a concentration of 2 to 50 nM.
  • a method for preparing the above-mentioned nucleic acid nanoparticle preparation comprises the following steps: (1) continuous preparation in a microchannel reactor: in the microchannel reactor, the inner aqueous phase and the organic phase enter the reaction plate 1 through the channel respectively for mixing and reaction to obtain a mixture, and then enter the reaction plate 2; the outer aqueous phase enters the reaction plate 2 through the channel and mixes with the mixture to obtain a nucleic acid nanoparticle preparation solution;
  • step (3) The nanoparticle solution concentrated in step (3) is freeze-dried to obtain a nucleic acid nanoparticle preparation.
  • the nucleic acid nanoparticle preparation of the present invention is prepared by nucleic acid drugs such as siRNA, mRNA, polyethylene glycol-polylactic acid or polyethylene glycol-poly (lactic acid glycolic acid) copolymer, cationic lipid and ionizable lipid material, and has good Stability, high nucleic acid drug encapsulation rate and drug loading capacity, high transfection efficiency, and can protect nucleic acid drugs from degradation.
  • nucleic acid drugs such as siRNA, mRNA, polyethylene glycol-polylactic acid or polyethylene glycol-poly (lactic acid glycolic acid) copolymer, cationic lipid and ionizable lipid material
  • the present invention is the first to build a large-scale, continuous and intelligent preparation technology platform for nano-drugs, forming a production process that can accurately control the performance of nucleic acid nano-drugs, and can quickly, efficiently and batch produce nucleic acid preparations, establish a quality evaluation system for standardized preparations, and thus realize the technology of online preparation of nucleic acid drugs.
  • the present invention is the first to creatively apply microchannel reactors to the continuous and intelligent preparation of nucleic acid nano-preparation drugs, providing a transformable and intelligent preparation technology for the fields of nucleic acid drug preparations such as siRNA and mRNA, and has huge clinical application potential.
  • FIG3 is a schematic diagram showing the stability of nucleic acid nanoformulations in a medium containing 10% serum, wherein A is a graph showing the change in particle size of PCI/siRNA, and B is a graph showing the change in particle size of PCI/mRNA.
  • Figure 4 is a schematic diagram of the effect of siRNA nucleic acid nanoparticles in silencing genes in tumor cells; wherein A is a diagram showing the effect of siRNA nucleic acid nanoparticles in reducing the expression of CD47 mRNA, and B is an electron micrograph of the siRNA nucleic acid nanoparticles.
  • FIG. 6 is a graph showing the efficacy of nanoformulations in delivering siRNA to inhibit tumor growth.
  • FIG. 7 is a graph showing the in vivo expression effect of Luci-mRNA delivered by nanoformulations.
  • FIG8 is a diagram showing the expression effects of Luci-mRNA nanoformulations loaded with different components in the main organs in vivo after intravenous injection.
  • FIG. 11 is the H NMR spectrum of the ionizable lipid BHEM-EAA.
  • BHEM-AEA Dissolve triethylamine (2.25 g, 22.28 mmol) and 2-(azetidin-1-yl)ethylamine (1.23 g, 12.25 mmol) in 10 mL of chloroform, stir for 30 min, then dropwise add cholesterol chloroformate solution (5 g, 11.14 mmol) dissolved in 40 ml of chloroform in a cold bath. Continue stirring at room temperature for 12 h after the dropwise addition. Purify the compound by a flash column chromatography system to obtain a BHEM-AEA lipid compound (3.78 g, 62.7%).
  • the polymer is a polyethylene glycol-modified aliphatic and/or polyester aliphatic polyester.
  • the aliphatic polyester is poly(glycolide-co-lactide), and its LA/GA ratio ranges from 95/5 to 50/50, specifically 95/5, 85/15, 75/25, 50/50 or a range between any two specific ratios.
  • step (3) Adding a lyophilization protective agent with a final concentration of 10 to 20% (w/v) to the concentrated nucleic acid nanoparticle preparation solution of step (3), and performing vacuum low-temperature freeze-drying to obtain a nucleic acid nanoparticle preparation.
  • the siRNA aqueous solution or mRNA aqueous solution in the inner aqueous phase of step (1) is dissolved in DEPC Treated ultrapure water.
  • the concentration of the ionizable lipid is 0.4 mg/mL-0.6 mg/mL.
  • the volume ratio of the inner aqueous phase, the organic phase, and the outer aqueous phase is 1:8-12:46-55.
  • the flow rate of the external organic phase is 5.0 mL/min to 100 mL/min, more preferably 5.0 mL/min to 50 mL/min.
  • the flow rate can be adjusted accordingly as needed, and is usually 1:8-12:46-55 (e.g., 1:10:50) according to the volume used, and can be adjusted accordingly to ensure sufficient and timely reaction.
  • the microchannel reactor described in step (1) mainly includes: a control panel, three pumps (from left to right, pump 1, pump 2, pump 3), three pipelines (pipeline 1, pipeline 2, pipeline 3 corresponding to pump 1, pump 2, pump 3, respectively), two microchannel reaction plates and one output pipeline.
  • the method of concentrating the initial nucleic acid nanoparticle solution in step (3) comprises: kDa envelope, concentrated to the required volume, 10mL or more.
  • Other conventional methods can also be used as long as the nucleic acid nanoparticle solution can be concentrated.
  • the freeze-drying of the nucleic acid nanoformulation in the freeze dryer in step (4) includes adding a freeze-drying protective agent with a final concentration of, for example, 9-11 wt% to the concentrated nucleic acid nanoformulation solution, and freeze-sublimation drying under vacuum conditions to obtain a nucleic acid nanoformulation that can be stored for a long time.
  • the freeze-drying protective agent can be sucrose, but is not limited thereto, and can also be glucose, trehalose, mannitol, etc.
  • Ionizable lipids Dlin-MC3-DMA, SM-102, ALC-0315, Dlin-KC2-DMA, purchased from Avanti Polar Lipids; in addition, the following ionizable lipids were included:
  • Mouse HBsAg ELISA kit catalog number LT-120009, purchased from Huangshi Blueprint Biotechnology Co., Ltd.;
  • the mixed solution can be seen by observing the reaction plate 1; 5 Use pumps 1 and 2 to push the mixed solution in the reaction plate 1 to the reaction plate 2, and turn on pump 3 at the same time.
  • the mixed solution in the reaction plate 1 enters the reaction plate 2 and is mixed with the external aqueous phase for a second time.
  • this experiment firstly fixed the feeding amount of mPEG 2K -PLGA 2K (mPEG block molecular weight is 2000, PLA block molecular weight is 2000,) and changed the feeding amount of DOTAP and Dlin-MC3-DMA respectively to explore the influence of the ratio of DOTAP and Dlin-MC3-DMA on nanoparticles.
  • the ratio of DOTAP significantly affects the loading efficiency of siRNA, and the N/P ratio of DOTAP/siRNA (molar ratio of amino nitrogen of DOTAP to phosphate group of nucleic acid drug) is 2 or above, which can effectively load nucleic acid drug, and the higher the ratio of Dlin-MC3-DMA, the lower the dispersion of particles.
  • Table 1 Effects of the feeding amounts of DOTAP and Dlin-MC3-DMA on the loading efficiency (EE), nucleic acid content (Loading Content), particle size (Diameter), distribution (PDI) and zeta potential (Zeta potential) of the prepared nucleic acid nanocarriers.
  • Table 2 Effect of mPEG 2K -PLGA 2K feed amount on the loading efficiency (EE), nucleic acid content (Loading Content), particle size (Diameter), distribution (PDI) and zeta potential (Zeta potential) of the prepared nucleic acid nanocarriers.
  • the molecular weight of the copolymer was studied to explore the effect of the molecular weight of the copolymer on the nanoparticles. As shown in Tables 3 and 4, the molecular weight of the copolymer has little effect on the properties of the nanoparticles, such as particle size and dispersity.
  • Example 5 Effects of two cationic lipids in PCI/siRNA nanoparticles on target gene knockout efficiency
  • this experiment used siRNA with the knockout target of CD47 as a model to investigate the knockout efficiency of CD47 protein in B16-F10 cells. The knockout situation.
  • the preparation steps of the nucleic acid nanoformulation include: pump 1 is an internal aqueous phase of siRNA aqueous solution, and the nucleic acid concentration is 800 ⁇ g/mL; pump 2 is set to an organic phase acetonitrile containing polymers, cationic lipids and ionizable lipids, wherein the concentration of PEG-PLGA is 10 mg/mL, the concentration of cationic lipid DOTAP is 0.5 mg/mL, and the concentration of ionizable lipid Dlin-MC3-DMA is 0.5 mg/mL; pump 3 is set to an external aqueous phase (DEPC ultrapure water); the flow rates of the three phases are 0.1 mL/min, 1.0 mL/min, and 5.0 mL/min, respectively; the nanoformulation PCI/siRNA DOTAP/MC3 is prepared according to the method in Example 1.
  • Dlin-MC3-DMA was replaced with BHEM-APMP and BHEM-EAA at the same concentration, and the prepared nanoformulations were PCI/siRNA DOTAP/APMP and PCI/siRNA DOTAP/EAA .
  • nanoparticles PC/siRNA DOTAP , PC/siRNA MC3 , PC/siRNA APMP , and PC/siRNA EAA/siRNA assembled with only one cationic lipid were prepared.
  • the prepared nanoparticles PCI/siRNA DOTAP/MC3 , PCI/siRNA DOTAP/APMP , PCI/siRNA DOTAP/EAA , PC/siRNA DOTAP , PC/siRNA MC3 , PC/siRNA APMP , and PC/siRNA EAA were co-incubated with B16F10 cells, and the siRNA transfection concentration in each group was 50 nM. After 6 hours of co-incubation, fresh serum-containing culture medium was replaced and cultured for a further 24 hours. The cells were then collected and the expression of CD47 mRNA was detected by q-PCR.
  • Nanoparticles prepared with only one cationic lipid cannot effectively reduce the expression of CD47 mRNA at a concentration of 50 nM.
  • the cationic lipid and ionizable lipid are jointly assembled into nanoparticles, the expression of CD47 mRNA can be effectively reduced ( FIG. 4A ).
  • the prepared nanoparticles are solid spherical structures ( FIG. 4B ).
  • this experiment used siRNA with GFP as the knockout target as a model to investigate the knockout of GFP protein in B16-F10 cells stably expressing GFP.
  • a total of 24 nanoparticles PCI/siGFP DOTAP/MC3 prepared from PEG-PLGA, cationic lipid DOTAP, and ionizable lipid Dlin-MC3-DMA were prepared. Specifically, 0.45 nmol of siGFP was diluted in 72 ⁇ L of DEPC water to prepare the aqueous phase. The components constituting the oil phase of the particles were mPEG 2K -PLGA 2K (150 mg/mL, dissolved in DMSO), DOTAP (10 mg/mL, dissolved in ethanol), and Dlin-MC3-DMA (10 mg/mL, dissolved in ethanol).
  • the particles prepared above were co-incubated with B16F10 cells stably expressing GFP at a concentration of 2 nM siGFP, and the silencing efficiency of GFP was evaluated by flow cytometry after 24 h.
  • PCI/siNC DOTAP/MC3 and PCI/siPD-L1 DOTAP/MC3 simply replace siRNA with non-functional siRNA (siNC) And siRNA targeting PD-L1 gene (siPD-L1);
  • PCI/siCD47+siPD-L1 DOTAP/MC3 is a mixture of PCI/siCD47 and siPD-L1 DOTAP/MC3 ; the dosage of siRNA is 0.25OD each time, once every two days, and the injection method is tail vein injection.
  • this experiment used mRNA expressing luciferase (Luci-mRNA) as a model to investigate the mRNA delivery and expression efficiency of two administration methods: subcutaneous injection and intramuscular injection.
  • mRNA expressing luciferase Luci-mRNA

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Abstract

一种非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用，该制剂由核酸水溶液、包含聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质材料作为有机相制备而成。该核酸纳米制剂在微通道反应器中进行，然后通过蒸发有机溶剂、浓缩以及冻干干燥后获得。该核酸纳米制剂基于微通道反应器可以实现规模化、连续和智能化制备，具有靶向性且稳定性高的优点。可用于包括肿瘤、病毒感染等多种疾病的治疗。

Description

非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用
本发明要求于2022年12月30日提交中国专利局、申请号为2022117415571，申请名称为“非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本发明中。
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种基于微通道反应器连续制备的非肝靶向核酸纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，核酸药物如siRNA等具有靶点特异性高等诸多优点，在疾病治疗中的作用和前景日益凸显。利用siRNA等核酸药物调控基因、蛋白等靶点及肿瘤微环境，已经受到基础研究和临床转化的广泛关注。例如，用于治疗肝癌的靶向血管内皮生长和Polo样激酶1基因的siRNA药物ALN-VSP02和TKM-080301已经完成Ⅰ期临床试验。此外，2款针对新冠病毒的mRNA疫苗相继获批，在预防病毒传染性疾病方面显示出巨大的潜力。尽管如此，核酸药物在体内的应用仍存在诸多问题，如靶向性、在体内的不稳定性、毒副作用等。
目前在研和临床应用于核酸药物的纳米载体主要可以分为以下几大类：一、脂质类纳米载体。基于脂质类材料构建的siRNA递送载体，实现了第一个siRNA核酸药物Patisiran的成功临床转化，也是两款针对新冠病毒的mRNA疫苗所依赖的体内递送载体。二、高分子纳米载体。由美国Calando制药公司开发的基于环糊精聚合物(CDP)的水溶性聚阳离子纳米颗粒包载的siRNA的CALLA-01，是第一个用于肿瘤靶向siRNA递送临床试验的高分子纳米载体。三、耦联递送载体，是通过材料化学修饰药物分子提高其生物利用度和疗效，例如，将siRNA与聚合物、多肽、抗体等耦联起来应用。Alnylam制药公司利用三个乙酰半乳糖胺修饰siRNA链，基于该递送技术的siRNA药物ALN-TTRsc、ALN-PCS和ALN-AT3均已获批临床应用，分别用于治疗甲状腺蛋白淀粉样变性、高胆固醇血症和血友病等肝脏部位疾病。
大量的基础研究和临床试验结果表明，目前核酸纳米载体制剂在临床应用上仍然面临极大的提升空间。一方面，目前通过临床获批使用的LNP体系，给药后主要富集在肝脏部位，适用于针对肝脏部位给药的疾病类型，难以拓展到其他部位的疾病；而即使皮下注射的基于LNP的mRNA疫苗，也会集中在肝脏部位，引发自身免疫性肝炎。另一方面，面向临床转化的纳米药物载体材料及递送系统，需要遵循“安全，有效，质量可控”的药物开发基本原则。因此，利用临床药用或具有药用前景的辅料，构建非肝靶向的核酸纳米药物递送体系，搭建基于该体系的规模化、连续和智能化制备技术平台，形成能对核酸纳米药物性能精确调控的生产工艺，建立标准化制剂的质量评价体系，提高临床核酸的生物利用度和药效，将成为核酸药物研发的迫切需求。
在前期研究中，发明人利用临床批准使用的药用辅料聚乙二醇-聚乳酸以及阳离子脂质，通过双乳化的方法，制备包载siRNA的纳米载体。具体为：将聚乙二醇-聚乳酸以及阳离子脂质溶解在有机相二氯甲烷中(250μL)，并加入siRNA的水溶液(50μL)，通过超声探头进入初次乳化；随后加入水相(1.0mL)，载体乳化，得到包载siRNA的纳米制剂。该纳米制 剂能够高效包载核酸药物，并实现体内的核酸药物递送。但需要指出的是，该纳米制剂的转染效果欠佳：细胞水平需要在200～300nM条件下，方可实现高效的靶基因沉默，达到商业化转染试剂Lipofectamine相当功效。在本发明中，发展了基于聚乙二醇-聚乳酸、阳离子脂质、可电离脂质的三组份的核酸药物递送体系，这种三组份的组合物能够显著提高核酸药物的转染效果，在2～50nM的浓度即可达到Lipofectamine相当功效。此外，与二组份使用的双乳化方法不同，本发明制备方法主要通过微通道反应器来制备。微通道反应器是以微米级结构部件为核心的反应、混合、分离等设备，其通道尺寸一般在10到1000微米之间，流体能够以特定的物理状态在反应器中进行流动以及组合，具有连续反应等特征，可以实现很高的产量。该技术目前并未用于核酸药物的制备。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种可以基于微通道反应器的规模化、连续和智能化制备非肝靶向的核酸纳米制剂及其制备方法和应用。
本发明的第一方面，是提供非肝靶向的核酸纳米制剂，由核酸的水溶液作为内水相，包含聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质材料作为有机相制备而成；所述阳离子脂质与核酸的N/P比小于12，所述可电离脂质与核酸的N/P比大于1.5。
作为优选的一种方式，由核酸的水溶液作为内水相，聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质溶解于有机溶剂中作为有机相，以DEPC水为外水相，在微通道反应器中反应，制备而成。
所述核酸可为siRNA(小干扰RNA))、mRNA(信使RNA)。
在本发明中，在聚乙二醇-聚乳酸以及阳离子脂质的二组份中，加入可电离脂质作为第三组份，这种三组份的组合物能够显著提高核酸药物的转染效果，在2～50nM的浓度即可达到Lipofectamine相当功效。
本发明的第二方面，是提供一种规模化制备上述核酸纳米制剂的方法，具体内容包括利用微通道反应器等搭建针对核酸纳米药物制剂的规模化生产平台，实现纳米药物的连续制备和在线质量控制，并引入自动化和智能化控制技术，提高纳米药物制剂的生产工艺，形成从研究到生产一整套原创性关键技术储备。
一种上述核酸纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)微通道反应器连续制备：微通道反应器中，将所述内水相、所述有机相分别通过通道进入反应板1中混合反应，得到混合物，然后进入反应板2，所述外水相通过通道进入反应板2，与混合物进行混合，获得核酸纳米制剂溶液；
(2)去除有机溶剂；
(3)浓缩；
(4)将步骤(3)浓缩后纳米颗粒溶液通过冻干技术，得到核酸纳米制剂。
本发明的第三方面，是提供上述的核酸纳米制剂在疾病治疗中的应用。
上述核酸纳米制剂在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
上述核酸纳米制剂在制备预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
本发明所述的核酸纳米制剂是由siRNA、mRNA等核酸药物、聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质以及可电离脂质材料共同制备而成，具有良好的 稳定性，核酸药物包封率和载药量高，转染效率高，能保护核酸药物免于降解。
本发明首次搭建得到纳米药物的规模化、连续和智能化制备技术平台，形成能对核酸纳米药物性能精确调控的生产工艺，可以快速、高效、批量地生产核酸制剂，建立标准化制剂的质量评价体系，从而实现了核酸药物在线制备的技术。本发明首次将微通道反应器创造性地应用于连续智能化制备核酸纳米制剂药物中，为siRNA、mRNA等核酸药物制剂等领域提供了一种可转化、智能化的制备技术，具有巨大的临床应用潜能。
附图说明
图1为核酸纳米制剂制备工艺流程图示意图；其中，A为微通道反应器乳化反应，B为旋转增发有机溶剂，C为切向流浓缩，D为冻干冻干制剂。
图2为核酸纳米制剂示意图以及复溶后纳米制剂表征示意图；其中，A为核酸纳米制剂制备流程图，B为冻干纳米制剂图片，C为PIC/siRNA纳米制剂的粒径分布图，D为PIC/mRNA纳米制剂的粒径分布图。
图3为核酸纳米制剂在含10％血清培养基中稳定性表征示意图，其中，A为PCI/siRNA粒径变化图，B为PCI/mRNA粒径变化图。
图4为siRNA核酸纳米制剂沉默肿瘤细胞中基因的效果示意图；其中，A为siRNA核酸纳米制剂降低CD47mRNA的表达效果图，为B为siRNA核酸纳米制剂的电镜图。
图5为实施例6中多种PCI/siRNA纳米粒对靶基因敲除效率的影响的结果示意图。
图6为纳米制剂递送siRNA抑制肿瘤生长的功效图。
图7为纳米制剂递送Luci-mRNA在体内表达效果图。
图8为组分不同的负载Luci-mRNA纳米制剂通过静脉注射后在体内主要脏器表达效果图。
图9为可电离脂质BHEM-DBA的核磁氢谱。
图10为可电离脂质BHEM-APMP的核磁氢谱。
图11为可电离脂质BHEM-EAA的核磁氢谱。
图12为可电离脂质BHEM-AEA的核磁氢谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技
术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种基于聚乙二醇-聚乳酸、阳离子脂质、可电离脂质的三组份体系，利用微通道反应器，规模化、连续和智能化制备的核酸纳米制剂及其制备方法和应用。与脂质类 纳米载体递送的核酸药物主要在肝部发挥作用不同，本发明制备的纳米体系可以通过组分调控，将核酸药物递送至肝脏、肺、脾脏等不同器官。
本发明的一些实施例中，提供一种基于微通道反应器，可通过微通道反应器泵的连续进样，实现规模化、连续和智能化的核酸纳米制剂的制备技术，具体技术流程包括微通道反应器、旋转蒸发有机溶剂、切向流浓缩以及冻干机冻干核酸纳米制剂，所述微通道反应器为建立在连续流动上的微管道反应器。
本发明一些实施例中涉及一种非肝靶向的核酸纳米制剂，由核酸的水溶液、包含聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质材料作为有机相制备而成，其中，所述阳离子脂质与核酸的N/P(氨基氮与磷酸根基团摩尔比)比小于12，所述可电离脂质与核酸的N/P比大于1.5。
在其中的一些实施例中，所述阳离子脂质与核酸的N/P比小于等于12，或者小于等于10，优选为2～12，所述可电离脂质与核酸的N/P比大于等于1.5，或者大于等于3，优选为3～10.5；更优选地，所述阳离子脂质与核酸的N/P比4～8，所述可电离脂质与核酸的N/P比4.5～9。合适的阳离子脂质和可电离脂质与核酸的N/P使得纳米制剂能有效负载药物，而且敲低效率高，沉默效果好。在其中的一些实施例中，所述核酸纳米制剂由核酸的水溶液作为内水相、聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质溶解于有机溶剂中作为有机相、以DEPC水为外水相，在微通道反应器中混合，制备而成。
在一些实施方式中，所述基于微通道反应器的反应，首先是含核酸药物的内水相与含阳离子脂质、可电离脂质的有机相在第一反应板中混合，并先进行反应，得到混合液。进一步地，所述混合液与聚合物(例如聚乙二醇-聚乳酸)的有机相在第二反应板中混合，并加入到水相中，得到负载核酸的纳米制剂溶液。
或者，含核酸药物的内水相与含阳离子脂质、可电离脂质、聚合物(聚乙二醇-聚乳酸)的有机相在第一反应板中混合制备后，加入到外水相中，得到负载核酸的纳米制剂溶液。
在其中一些实施例中，所述核酸为siRNA或mRNA。
在其中一些实施例中，所述siRNA或mRNA为肿瘤治疗药物或抗病毒感染治疗药物。
在其中一些实施例中，所述阳离子脂质材料可以是三氟乙酸二甲基-2，3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵(DOTMA)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-二油烯氧基丙基铵(DORIE)、溴化二甲基-3-羟丙基-2，3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HP)、溴化二甲基-4-羟丁基-2，3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2，3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HPc)、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-双十六烷氧基丙基铵(DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-双十八烷氧基丙基铵(DSRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、脂质多聚-L-赖氨酸(LPLL)、硬脂胺(SA)中的一种。
进一步优选为，步骤(1)所述的阳离子脂质为DOTMA、DOTAP、DORI、DSRIE、DOGS、DOSC中的一种以上，最优选为DOTAP。
在其中一些实施例中，阳离子脂质与核酸的N/P比2～12，更优选为4～8。
可电离脂质与核酸的的N/P比3～10.5，更优选为4.5～10.5。
在其中一些优选的实施例中，所述阳离子脂质与所述可电离脂质在有机相中的质量比为1：0.5-1.5，更优选为1：0.8-1.2，更优选为1：1。
在其中一些实施例中，所述核酸药物包括至靶向PD-L1和CD47的小干扰RNA(siPD-L1、siCD47)、以及mRNA等。
在其中一些实施例中，所述核酸纳米制剂复溶后的粒径范围为50nm～500nm，优选范围为50nm～200nm。
在其中一些实施例中，可电离脂质是Dlin-MC3-DMA、SM-102、ALC-0315、Dlin-KC2-DMA，此外，还可以是以下可电离脂质：
BHEM-DBA：
BHEM-APMP：
BHEM-EAA：
BHEM-AEA：
这些可电离脂质的合成方法如下。
BHEM-DBA：将三乙胺(2.25g，22.28mmol)和N，N-二丁基乙二胺(2.11g，12.25mmol)溶解于10mL的氯仿中，搅拌30min，然后冷浴滴入溶于40ml氯仿的胆固醇氯甲酸酯溶液中(5g，11.14mmol)。滴完后在室温下继续搅拌12h。通过快速柱层析系统纯化化合物， 得到BHEM-DBA脂质化合物(5.13g，78.7％)。
BHEM-DBA的核磁氢谱的主要数据参见图9。
BHEM-APMP：将三乙胺(2.25g，22.28mmol)和N-(3-氨丙基)吗啉(1.77g，12.25mmol)溶解于10mL的氯仿中，搅拌30min，然后冷浴滴入溶于40ml氯仿的胆固醇氯甲酸酯溶液中(5g，11.14mmol)。滴完后在室温下继续搅拌12h。通过快速柱层析系统纯化化合物，得到BHEM-APMP脂质化合物(4.51g，70.7％)。
BHEM-APMP的核磁氢谱的主要数据参见图10。
BHEM-EAA：将三乙胺(2.25g，22.28mmol)和2，2-正丙基乙二胺(1.76g，12.25mmol)溶解于10mL的氯仿中，搅拌30min，然后冷浴滴入溶于40ml氯仿的胆固醇氯甲酸酯溶液中(5g，11.14mmol)。滴完后在室温下继续搅拌12h。通过快速柱层析系统纯化化合物，得到BHEM-EAA脂质化合物(4.33g，71.9％)。
BHEM-EAA的核磁氢谱的主要数据参见图11。
BHEM-AEA：将三乙胺(2.25g，22.28mmol)和2-(氮杂环丁烷-1基)乙胺(1.23g，12.25mmol)溶解于10mL的氯仿中，搅拌30min，然后冷浴滴入溶于40ml氯仿的胆固醇氯甲酸酯溶液中(5g，11.14mmol)。滴完后在室温下继续搅拌12h。通过快速柱层析系统纯化化合物，得到BHEM-AEA脂质化合物(3.78g，62.7％)。
BHEM-AEA的核磁氢谱的主要数据为参见图12。
在其中一些实施例中，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮等溶液，优选为乙醇、乙腈。
在其中一些实施方式中，所述聚合物为聚乙二醇修饰的脂肪族和/或聚酯脂肪族聚酯。
在其中一些实施方式中，所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯为聚乙二醇修饰的聚丙交酯(PEG-PLA)和聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-PLGA)中的至少一种。
在其中一些实施方式中，所述的脂肪族聚酯的分子量范围为1000～11000道尔顿。
在其中一些实施方式中，所述的聚乙二醇的分子量范围为1000～10000道尔顿。
在其中一些实施方式中，所述的脂肪族聚酯为聚(乙交酯-co-丙交酯)，其LA/GA的比例范围为95/5～50/50，具体可以为95/5、85/15、75/25、50/50或任意两个具体比例之间的范围。
本发明一些实施例中，涉及基于上述微通道反应器的所述核酸纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)微通道反应器中，将所述内水相、所述有机相分别通过通道进入反应板1中混合反应，得到混合物，然后进入反应板2，所述外水相通过通道进入反应板2，与混合物进行混合，获得核酸纳米制剂溶液；
(2)将步骤(1)所述溶液转移至旋转蒸发仪，在37℃左右水浴中，逐步升压，蒸发溶液中的有机溶剂，得到初始核酸纳米制剂溶液。
(3)将步骤(2)所述核酸纳米制剂溶液，通过切向流浓缩，得到浓缩核酸纳米制剂溶液。
(4)将步骤(3)所述浓缩核酸纳米制剂溶液，加入终浓度为10～20％(w/v)冻干保护剂，真空低温冷冻干燥，得到核酸纳米制剂。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述内水相的siRNA水溶液或mRNA水溶液，溶于DEPC 处理后的超纯水。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述有机溶剂为如氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮等。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述外水相为DEPC处理后的超纯水。
在其中一些实施例中，核酸水溶液中，核酸浓度为700μg/mL-900μg/mL。
在其中一些实施例中，在有机相中，所述聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物浓度为8mg/mL-12mg/mL。
在其中一些实施例中，在有机相中，所述阳离子脂质浓度为0.4mg/mL-0.6mg/mL.
在其中一些实施例中，在有机相中，所述可电离脂质浓度为0.4mg/mL-0.6mg/mL。
在其中一些实施例中，所述内水相、有机相、外水相的体积比1:8-12:46-55。
在其中一些实施例中，内水相的流速为0.1mL/min～100mL/min，更优选为0.1mL/min～10mL/min。
在其中一些实施例中，有机相的流速为1.0mL/min～100mL/min，更优选为1.0mL/min～40mL/min。
在其中一些实施例中，外机相的流速为5.0mL/min～100mL/min，更优选为5.0mL/min～50mL/min。
在实际制备过程中，所述流速可以根据需要做相应的调整，根据其使用体积，通常为1:8-12:46-55(例如1:10:50)，做相应调整，使反应充分及时即可。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述微通道反应器主要组成包括：控制面板、三个泵(从左至右分别为泵1、泵2、泵3)、三个管道(分别对应泵1、泵2、泵3的管道1、管道2、管道3)，两个微通道反应板以及1个输出管道。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述通过微通道反应器制备技术的方法步骤包括：①打开微通道开关，恒温面板控制开关；微通道反应器泵连接乙醇溶液，冲洗泵和管道；利用注射器排除3个泵的空气；随后在泵1和泵2连接有机溶剂(氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮)，冲洗泵和管道；泵3连接DEPC水，冲洗泵和管道。②设置泵1流速为0.1～10mL/min，为内水相(siRNA水溶液)；设置泵2流速为1.0～40mL/min，为有机相(阳离子脂质、可电离脂质、聚合物有机溶剂溶液)；设置泵3流速为5.0～100mL/min，为外水相(DEPC超纯水)；三相体积比依据需要通过流动相速度调整。③取下泵1连接的管道1，排出管道内滞留有机溶剂，利用注射器(配专用注射针头)吸取配置的siRNA溶液；将siRNA溶液注射入管道1，在管道1两端留出相应体积空气柱，然后将管道1重新连接到泵1和反应板中间，开启泵1(连接有机溶剂溶液)将siRNA溶液柱推至离反应板入口约3cm处，暂停泵1。④将泵2连接有机相，开启泵2，约80s(利用计时器计时)后同时开启泵1，约1min后可以内水相和有机相开始进入反应板1，开始混合；⑤利用泵1和泵2将反应板1中的混合溶液推至反应板2，同时打开泵3，反应板1中的混合溶液进入反应板2，与外水相进行二次混合，可以在反应板2中看到混合液体，即为核酸纳米制剂溶液。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述旋转蒸发仪包括但不限于平行旋转蒸发仪，除去有机溶剂，得到初始核酸纳米制剂溶液。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述初始核酸纳米制剂溶液浓缩的方法包括：通过300 kDa包膜，浓缩至所需体积，10mL以上体积。也可以用其他常规方法，只要能浓缩核酸纳米制剂溶液即可。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述冻干机冻干核酸纳米制剂包括在浓缩核酸纳米制剂溶液加入终浓度为例如9-11wt％的冻干保护剂，在真空条件下，冷冻升华干燥，得到可长期保存核酸纳米制剂。具体地，所述冻干保护剂可以为蔗糖，但不限于此，还可以为葡萄糖、海藻糖、甘露醇等。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中所用原料来源：
阳离子脂质DOTAP：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵，购于Avanti Polar Lipids公司；
可电离脂质：Dlin-MC3-DMA、SM-102、ALC-0315、Dlin-KC2-DMA，购于Avanti Polar Lipids公司；此外，还包括以下可电离脂质：
BHEM-DBA、BHEM-APMP、BHEM-EAA、BHEM-AEA。
聚(乙交酯-co-丙交酯)聚合物(PLGA)：LA/GA的比例为75/25，购自济南岱罡生物科技有限公司。
聚乙二醇(PEG)的分子量范围为1000～10000道尔顿。
LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent，货号13778075，购于Thermo公司；
RNA Kit，货号ER101-01，购于全式金公司；
PrimeScriptTM RT reagent Kit，货号RR036A，购于TaKaRa公司；
FastStart Essential DNA Green Master，货号06924204001，购于Roche公司；
Mouse HBsAg ELISA kit，货号LT-120009，购于黄石市蓝图生物科技有限公司；
Mouse HBeAg ELISA kit，货号LT-120011，购于黄石市蓝图生物科技有限公司；
siRNA购于苏州贝信生物技术有限公司；mRNA购于合肥阿法纳生物科技有限公司；
有机溶剂溶液，购于国药集团化学试剂有限公司；
未经说明的其它试剂直接使用。
实施例中所用仪器型号及公司：
微通道反应器：康宁Lab反应器系统，美国康宁公司；
旋转蒸发仪：型号为RV10auto control，德国IKA公司；
Minimate切向流超滤系统以及300kDa包膜：型号为OAPMP220，美国PALL公司；
研发型冻干机：型号为LyoStarTM 3，美国SP Scientific公司；
纳米粒度及Zeta电位仪：型号为Nano ZSE，英国Malvern公司；
流式细胞分析仪：型号为BD FACSCelesta，美国BD公司；
qPCR仪：型号Roche Light Cycler 96，美国罗氏公司。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1、核酸纳米制剂的制备工艺流程
如图1A所示微通道反应器主要组成包括：控制面板、三个泵(从左至右分别为泵1、泵2、泵3)、三个进料管道(分别对应泵1、泵2、泵3的管道1、管道2、管道3)，两个微通道反应板(前后分别为反应板1和反应板2)以及1个输出管道。
通过微通道反应器混合的方法步骤包括：①打开微通道开关，恒温面板控制开关；微通 道反应器泵连接乙醇溶液，冲洗泵和管道；利用注射器排除3个泵的空气；随后在泵1和泵2连接有机溶剂，冲洗泵和管道；泵3连接DEPC水，冲洗泵和管道。②设置泵1为内水相(siRNA水溶液或mRNA水溶液，核酸浓度为800μg/mL)；设置泵2为有机相(聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-PLGA)、阳离子脂质、可电离脂质溶解于乙腈，浓度为10.0mg/mL)；设置泵3为外水相(DEPC超纯水)；三相体积比(1:10:50)通过流速(分别为0.1mL/min,1.0mL/min,5.0mL/min)调控。③取下泵1连接的管道1，排出管道内滞留有机溶剂，利用注射器(配专用注射针头)吸取配置的siRNA溶液；将siRNA溶液注射入管道1，在管道1两端留出相应体积空气柱，然后将管道1重新连接到泵1和反应板中间，开启泵1(连接有机溶剂溶液)将siRNA溶液柱推至离反应板入口约3cm处，暂停泵1。④将泵2连接有机相，开启泵2，约80s(利用计时器计时)后同时开启泵1，约1min后可以内水相和有机相开始进入反应板1，开始混合反应，观察反应板1可以看到混合溶液；⑤利用泵1和泵2将反应板1中的混合溶液推至反应板2，同时打开泵3，反应板1中的混合溶液进入反应板2，与外水相进行二次混合。
利用500mL圆底烧瓶收集混合溶液(观察反应板2中混合溶液初始排出时间以及完全排出时间，避免收集前后非混合液体)，如图1B所示，连接旋转蒸发仪，除去有机溶剂，得到初始核酸纳米制剂溶液。
如图1C所示，将初始核酸纳米制剂溶液利用切向流通过300kDa包膜，浓缩至所需体积。进一步，配制浓度为50％的蔗糖溶液，如图1D所示，在浓缩核酸纳米制剂溶液加入终浓度为10％的蔗糖溶液，在真空条件下，冷冻升华干燥，得到可长期保存核酸纳米制剂。制备的负载siRNA、mRNA的纳米体系被分别命名为PCI/siRNA和PCI/mRNA。
实施例2、核酸纳米制剂示意图以及冻干和复溶后核酸纳米制剂表征
如图2A所示，核酸纳米制剂由脂质/聚合物核酸纳米颗粒，制备方法同实施例1。在加入冻干保护剂后，分装至10mL冻干瓶(2mL/瓶)，进行冻干，冻干步骤包括：①检查空气和氮气气瓶气压，确保足够，氮气至少大于3MPa，打开气阀，把分压阀调至0.8MPa以上，净化间内分压阀按照指示，空气调至0.5MPa，氮气0.7Mpa；②打开冻干机，把样品放好在样品盘中，橡胶盖半盖状态。将样品盘推进冻干舱，并抽出托盘，关闭冻干舱门以及下方冷凝室门；③冻干软件自动打开后登入，在freeze dry页面调整冻干程序，开始冻干。观察状态栏，确保气密性良好，以及环境温度低于30℃；④冻干过程中，观察PVG(含湿度的真空度)与设定真空度相差不超过3时，可进入升温步骤(-28℃及之后的步骤)，在freeze dry页面可调整对应时间和步骤；⑤冻干结束后，先在semi auto页面回填氮气(配合打开回填管路)至500，抬高托盘，压盖，然后关闭回填，释放真空，等完全释放后方可打开舱门。迅速取出样品，压盖。如图2B所示，核酸纳米制剂冻干后呈现白色、大小均一、质量均一的粉状。
复溶后核酸纳米制剂表征：在冻干后siRNA纳米制剂(PIC/siRNA)和mRNA纳米制剂(PIC/mRNA)中，加入1mL DEPC处理的超纯水，进行复溶。经动态光散射仪(Dynamic light scattering，DLS)检测纳米制剂粒径，如图2C和图2D所示，siRNA纳米制剂和mRNA纳米制剂复溶后的粒径分别约为136.7nm和166.0nm。
实施例3、核酸纳米制剂在含10％血清培养基中稳定性表征
上述制备得到的核酸纳米制剂，包括PCI/siRNA和PCI/mRNA，超纯水稀释至0.5mg/mL， 分别将其加入10％血清，密闭；37℃恒温摇床中孵育，如图3A和3B所示，分别在0h，1h，2h，4h，6h，12h，24h，48h，72h取出，经动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)检测其粒径，结果表明，在观察时间内，PCI/siRNA和PCI/mRNA粒径没有显著的改变，且粒径分布没有巨大波动，说明本发明的核酸纳米制剂水溶液可以在72小时保持水化半径的稳定。
实施例4、PCI/siRNA纳米粒配方优化研究
为了考察本发明的脂质DOTAP、Dlin-MC3-DMA以及共聚物之间的比例以及共聚物的分子量对于纳米粒包封率、尺度以及电势的影响，本实验首先通过固定mPEG2K-PLGA2K(mPEG嵌段分子量为2000，PLA嵌段分子量为2000，)的投料量，分别改变DOTAP以及Dlin-MC3-DMA的投料量来探究DOTAP和Dlin-MC3-DMA的比例对于纳米粒的影响。如表1所示，DOTAP的比例显著影响siRNA的负载效率，DOTAP/siRNA的N/P比(DOTAP的氨基氮与核酸药物的磷酸根基团摩尔比)在2或以上时，可以有效负载核酸药物，而Dlin-MC3-DMA的比例越高，颗粒的分散度越低。
表1、DOTAP以及Dlin-MC3-DMA的投料量对制备的核酸纳米载体包载效率(E.E.)、核酸量(Loading Content)以及粒径(Diameter)、分布(PDI)以及电势(Zeta potential)的影响。

通过固定DOTAP以及Dlin-MC3-DMA的投料量，改变mPEG2K-PLGA2K的投料量，来探究共聚物的添加量对于纳米粒的性质影响。如表2所示，共聚物的投料量对颗粒包载效率、粒径等性质影响不大。
表2、mPEG2K-PLGA2K投料量对制备的核酸纳米载体包载效率(E.E.)、核酸量(Loading Content)以及粒径(Diameter)、分布(PDI)以及电势(Zeta potential)的影响。
通过DOTAP、Dlin-MC3-DMA以及共聚物的投料量，改变共聚物的分子量，以探究共聚物的分子量对于纳米粒的影响。如表3、表4所示，共聚物的分子量对于纳米粒的粒径和分散度等性质影响不大。
表3、mPEG-PLGA聚合物中mPEG嵌段分子量(PLGA嵌段分子量为3K，保持不变)对制备的核酸纳米载体包载效率(E.E.)、核酸量(Loading Content)以及粒径(Diameter)、分布(PDI)以及电势(Zeta potential)的影响。
表4、mPEG-PLGA聚合物中PLGA嵌段分子量(mPEG嵌段分子量为2K，保持不变)对制备的核酸纳米载体包载效率(E.E.)、核酸量(Loading Content)以及粒径(Diameter)、分布(PDI)以及电势(Zeta potential)的影响。
实施例5、PCI/siRNA纳米粒中两种阳离子脂质对靶基因敲除效率的影响
为了考察本发明的脂质/聚合物杂化纳米颗粒中阳离子脂质与可电离脂质比例对敲除效率的影响，本实验以敲除靶点为CD47的siRNA为模型，考察对B16-F10细胞中CD47蛋白 的敲除情况。
如实施例1中所描述的，核酸纳米制剂的制备步骤包括：泵1为内水相为siRNA水溶液，核酸浓度为800μg/mL；设置泵2为含有聚合物、阳离子脂质以及可电离脂质的有机相乙腈，其中PEG-PLGA浓度为10mg/mL、阳离子脂质浓度DOTAP为0.5mg/mL、可电离脂质Dlin-MC3-DMA浓度0.5mg/mL；设置泵3为外水相(DEPC超纯水)；三相流速分别为0.1mL/min,1.0mL/min,5.0mL/min；依据实施例1中的方法制备，得到纳米制剂PCI/siRNADOTAP/MC3。
根据上述类似的方法，将Dlin-MC3-DMA替换为BHEM-APMP、BHEM-EAA，浓度不变，制备得到的纳米制剂为PCI/siRNADOTAP/APMP、PCI/siRNADOTAP/EAA。
另外在制备过程中，有机相除PEG-PLGA外，只加入一种脂质DOTAP(浓度为0.5mg/mL)、Dlin-MC3-DMA(浓度为0.5mg/mL)、BHEM-APMP(浓度为0.5mg/mL)、BHEM-EAA(浓度为0.5mg/mL)，其他条件保持不变，得到的纳米制剂为PC/siRNADOTAP、PC/siRNAMC3、PC/siRNAAPMP、PC/siRNAEAA。
相应地，制备了仅有一种阳离子脂质组装的纳米粒PC/siRNADOTAP、PC/siRNAMC3、PC/siRNAAPMP、PC/siRNAEAA/siRNA。
利用制备的纳米粒PCI/siRNADOTAP/MC3、PCI/siRNADOTAP/APMP、PCI/siRNADOTAP/EAA、PC/siRNADOTAP、PC/siRNAMC3、PC/siRNAAPMP、PC/siRNAEAA与B16F10细胞共孵育，其中各组的siRNA转染浓度均为50nM；共孵育6h后，更换新鲜含血清培养基继续培养24h，随后收集细胞，利用q-PCR检测方法检测CD47mRNA表达情况。
实验结论：仅有一种阳离子脂质制备纳米粒在50nM浓度下，不能有效地降低CD47mRNA的表达，而当所述阳离子脂质与可电离脂质共同参与组装纳米粒后，能有效降低CD47mRNA的表达(图4A)；此外，所制备的纳米粒为实心球状结构(图4B)。
实施例6、不同配方的PCI/siRNA纳米粒对于其靶基因敲除效率的影响
为了考察本发明的为了考察本发明的脂质/聚合物杂化纳米颗粒中阳离子脂质与可电离脂质比例对敲除效率的影响，本实验以敲除靶点为GFP的siRNA为模型，考察对稳定表达GFP的B16-F10细胞中GFP蛋白的敲除情况。
一共制备了24种由PEG-PLGA以及阳离子脂质DOTAP、可电离脂质Dlin-MC3-DMA制备的纳米粒PCI/siGFPDOTAP/MC3，具体为：将0.45nmol的siGFP稀释于72μL的DEPC水内，从而配置水相。组成颗粒油相的组分分别为mPEG2K-PLGA2K(150mg/mL、溶于DMSO)、DOTAP(10mg/mL、溶于乙醇)以及Dlin-MC3-DMA(10mg/mL、溶于乙醇)。各种颗粒的油相配置情况如下，PCI4-0(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—0μL)、MC3PCI4-1.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—1.82μL)、MC3PCI4-3(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—3.63μL)、MC3PCI4-4.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—5.45μL)、MC3PCI4-6(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—7.26μL)、MC3PCI4-7.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—9.075μL)、MC3PCI4-9(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—5.28μL、Dlin-MC3-DMA—10.89μL)、PCI8-0(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—0μL)、MC3PCI8-1.5 (mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—1.82μL)、MC3PCI8-3(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—3.63μL)、MC3PCI8-4.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—5.45μL)、MC3PCI8-6(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—7.26μL)、MC3PCI8-7.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—9.075μL)、MC3PCI8-9(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—10.89μL)、MC3PCI8-10.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—10.56μL、Dlin-MC3-DMA—12.71μL)、PCI12-0(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—0μL)、MC3PCI12-1.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—1.82μL)、MC3PCI12-3(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—3.63μL)、MC3PCI12-4.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—5.45μL)、MC3PCI12-6(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—7.26μL)、MC3PCI12-7.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—9.075μL)、MC3PCI12-9(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—10.89μL)、MC3PCI12-10.5(mPEG2K-PLGA2K—8μL、DOTAP—15.84μL、Dlin-MC3-DMA—12.71μL)。将上述的水相分别与上述的油相混合后，在Votex上震动20s。室温静置15min。
上述制备的纳米粒中，下标表示DOTAP、Dlin-MC3-DMA与siRNA的N/P比，如MC3PCI4-1.5，表示DOTAP与siRNA的N/P为4、Dlin-MC3-DMA与siRNA的N/P为1.5。此外，PCI4-0、PCI8-0、PCI12-0则表示DOTAP与siRNA的N/P为4、8、12，但不掺入Dlin-MC3-DMA脂质。
将上述制备得到的颗粒与稳定表达GFP的B16F10细胞以2nM siGFP的浓度共孵育，24h后用流式细胞仪评估GFP的沉默效率。
如图5所示，Dlin-MC3-DMA的含量与靶基因的敲低效率成正比：如图5中所示，当Dlin-MC3-DMA脂质与siRNA的N/P比为1.5或者更高时，其沉默效果逐渐增加，当达到4.5或更高时，效果最佳。DOTAP的含量与靶基因的敲低效率成反比：与DOTAP脂质与siRNA的N/P比为4、8纳米粒相比，当DOTAP脂质与siRNA的N/P比为12时，其敲低效率明显降低，当大于12时敲低效率不佳。
实施例7、PCI/siRNA纳米粒抑制肿瘤功效研究
为了考察本发明的脂质/聚合物杂化纳米颗粒递送siRNA治疗疾病的功效，本实验以敲除靶点为CD47、PD-L1的siRNA为模型，考察对B16-F10肿瘤的抑制情况。
一共制备了三种由PEG-PLGA以及阳离子DOTAP、可电离脂质Dlin-MC3-DMA制备的纳米粒PCI/siRNADOTAP/MC3，其中，PCI/siCD47DOTAP/MC3制备方法如实施例4所示，具体为：如实施例1中所描述的，核酸纳米制剂的制备步骤包括：泵1为内水相为针对CD47基因的siRNA(siCD47)水溶液，核酸浓度为800μg/mL；设置泵2为含有聚合物、阳离子脂质以及可电离脂质的有机相乙腈，其中聚合物PEG-PLGA浓度为10mg/mL、阳离子脂质浓度DOTAP为0.5mg/mL、可电离脂质Dlin-MC3-DMA浓度0.5mg/mL；设置泵3为外水相(DEPC超纯水)；三相流速分别为0.1mL/min,1.0mL/min,5.0mL/min；依据实施例1中的方法制备，得到纳米制剂PCI/siCD47DOTAP/MC3。
PCI/siNCDOTAP/MC3、和PCI/siPD-L1DOTAP/MC3仅仅将siRNA替代成无功能的siRNA(siNC) 以及针对PD-L1基因的siRNA(siPD-L1)；PCI/siCD47+siPD-L1DOTAP/MC3是PCI/siCD47和siPD-L1DOTAP/MC3混合物；siRNA的给药剂量为0.25OD每次、每两天给药一次，注射方式为尾静脉注射。
实验结论：通过尾静脉注射单独PCI/siCD47DOTAP/MC3或者siPD-L1DOTAP/MC3可以有效抑制肿瘤生长，当同时注射两种纳米粒PCI/siCD47DOTAP/MC3和siPD-L1DOTAP/MC3时，能够更有效抑制肿瘤生长，显示出该纳米体系在体内具有良好递送siRNA的功效(图6)。
实施例8、荷载mRNA的组合物纳米颗粒体内转染效率验证
为了考察本发明纳米颗粒体内mRNA转运效率，本实验以表达荧光素酶的mRNA(Luci-mRNA)为模型，考察皮下注射和肌肉注射两种给药方式的mRNA递送及表达效率。实验由PEG-PLGA以及阳离子DOTAP、可电离脂质Dlin-MC3-DMA制备的纳米粒PCI/Luci-mRNA；制备方法如实施例1类似：制备步骤包括：泵1为内水相为Luci-mRNA水溶液，核酸浓度为800μg/mL；设置泵2为含有聚合物、阳离子脂质以及可电离脂质的有机相乙腈，其中PEG-PLGA浓度为10mg/mL、阳离子脂质浓度DOTAP为0.5mg/mL、可电离脂质Dlin-MC3-DMA浓度0.5mg/mL；设置泵3为外水相(DEPC超纯水)；三相流速分别为0.1mL/min,1.0mL/min,5.0mL/min；依据实施例1中的方法制备，得到纳米制剂PCI/Luci-mRNA。
使用构建的PCI/Luci-mRNA皮下或肌肉免疫动物注射后，在不同时间点对小鼠进行小动物活体成像，通过生物发光评价mLuc-NPs在免疫后的6h、12h、24h、48h的表达效率。实验一共设2组(皮下给药组和肌肉给药组)，每组2只小鼠。对于皮下给药组，每只小鼠皮下注射20μg的mLuc-NPs；对于肌肉给药组，每只小鼠肌肉注射20μ0的PCI/Luci-mRNA；在免疫后的第6h、12h、24h、48h，小鼠腹腔注射125μL戊巴比妥钠(1％)进行麻醉；紧接着尾静脉注射200μL荧光素酶底物荧光素(15mg/mL)，使用体内成像系统(IVIS)通过体内生物发光读出荧光素酶蛋白表达情况。实验表明：无论是皮下给药还是肌肉给药，上述方法制备的阳离子脂质杂化纳米颗粒mLuc-NPs能够成功地将mRNA递送到体内，并实现目标蛋白的高效表达(图7)。
同样以Luci-mRNA为模型，我们进一步考察了上述荷载mRNA的纳米颗粒静脉注射后的转染效率。使用构建的PCI/Luci-mRNA静脉注射免疫动物后，在6h对小鼠进行小动物活体成像，通过生物发光评价PCI/Luci-mRNA在免疫后的表达效率。每只小鼠静脉注射10μg的PCI/Luci-mRNA。在免疫后的第6h，小鼠腹腔注射125μL戊巴比妥钠(1％)进行麻醉；紧接着尾静脉注射200μL荧光素酶底物荧光素(15mg/mL)，使用体内成像系统(IVIS)通过体内生物发光读出荧光素酶蛋白表达情况。实验表明：静脉注射后，荧光素酶蛋白主要在脾脏、肺脏表达，在肝脏的表达量比较低(图8)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (19)

  1. 一种非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，其由核酸的水溶液作为内水相，包含聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质作为有机相制备而成；所述阳离子脂质与核酸的N/P比小于12，所述可电离脂质与核酸的N/P比大于1.5。
  2. 根据权利要求1所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，其由核酸的水溶液作为内水相，聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物、阳离子脂质、可电离脂质溶解于有机溶剂中作为有机相，以DEPC水为外水相，在微通道反应器中反应，制备得到。
  3. 根据权利要求1所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述核酸为siRNA、mRNA。
  4. 根据权利要求1所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质是溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2，3-双十八烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯中的一种。
  5. 根据权利要求1所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述可电离脂质选自以下中的至少一种：Dlin-MC3-DMA、SM-102、ALC-0315、Dlin-KC2-DMA、BHEM-DBA：BHEM-APMP：BHEM-EAA： BHEM-AEA：
  6. 根据权利要求1所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物为聚乙二醇修饰的聚丙交酯或聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)。
  7. 根据权利要求6所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述聚丙交酯或聚(乙交酯-co-丙交酯)中的LA/GA的比例范围为95/5～50/50，和/或所述的聚乙二醇的分子量范围为1000道尔顿～10000道尔顿。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质与核酸的N/P比2～12，所述可电离脂质与核酸的N/P比3～10.5。
  9. 根据权利要求8所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质与核酸的N/P比4～8，所述可电离脂质与核酸的N/P比4.5～9。
  10. 根据权利要求1-7任一项所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述阳离子脂质与所述可电离脂质在有机相中的质量比为1：0.5-1.5。
  11. 根据权利要求1-7任一项所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、四氢呋喃、或丙酮。
  12. 根据权利要求1-7任一项所述的非肝靶向的核酸纳米制剂，其特征在于，所述核酸纳米制剂复溶后的粒径范围为50nm～200nm。
  13. 一种权利要求1-12任一项所述核酸纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微通道反应器连续制备：在微通道反应器中，将所述内水相、所述有机相分别通过通道进入反应板1中混合反应，得到混合物，然后进入反应板2；所述外水相通过通道进入反应板2，与所述混合物进行混合，获得核酸纳米制剂溶液；
    (2)去除有机溶剂；
    (3)浓缩，得到浓缩后的核酸纳米颗粒溶液；
    (4)将核酸纳米颗粒溶液冻干干燥，得到所述核酸纳米制剂。
  14. 根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，在内水相中，核酸的浓度为700μg/mL-900μg/mL；和/或在有机相中，所述聚乙二醇-聚乳酸或者聚乙二醇-聚(乳酸乙醇酸)共聚物的浓度为8mg/mL-12mg/mL；和/或所述阳离子脂质浓度为0.4mg/mL-0.6mg/mL；和/或所述可电离脂质浓度为0.4mg/mL-0.6mg/mL。
  15. 根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述内水相、有机相、外水相的体积比1:8-12:46-55。
  16. 根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，还包括在所述浓缩后的核酸纳米颗粒溶液中加入终浓度为10％～20％w/v冻干保护剂，和/或加入的冻干保护剂为蔗糖或葡萄糖、海藻糖、甘露醇。
  17. 根据权利要求13或14所述的制备方法，其特征在于，所述去除有机溶剂为旋转蒸发的方式；和/或所述浓缩为切向流浓缩。
  18. 权利要求1-12任一项所述核酸纳米制剂在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
  19. 权利要求1-12任一项所述核酸纳米制剂在制备预防或治疗病毒感染的药物中的应用。
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