CN112495316B - 一种基于亚稳态乳液制备微纳米凝胶微球的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种基于亚稳态乳液制备微纳米凝胶微球的方法。所述方法使用一端亲氟另一端亲水的短链表面活性剂稳定氟化油包水乳液，可在短时间，小于1秒钟内获得亚稳态的乳液液滴，随后液滴趋于融合，乳液破乳。通过在液滴稳定的时间窗口内使水相中水凝胶预聚体固化，获得凝胶微球；该乳液液滴体系在发生自发破乳后，水油两相自动分离，凝胶微球自发分散于水相中。本发明方法可大大简化乳液液滴技术，包括微流控液滴技术和传统水油两相液滴技术，制备水凝胶微球的制备工艺，避免了传统方法制备稳定乳液液滴后需要清洗破乳的难题，并实现凝胶微球制备与分离一步法实现，对凝胶微球大规模放大生产有重要意义。

Description

一种基于亚稳态乳液制备微纳米凝胶微球的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种亚稳态乳液体系及其制备载生物活性物质微纳米凝胶颗粒的方法。
背景技术
水凝胶材料已逐渐成为生物医学领域中的一种非常重要的生物材料，其是由不溶于水但能在水中溶胀的高分子组成的交联网络，与人体组织类似，具有丰富含水的多孔结构。这样的多孔结构与人体组织相近，非常有利于物质交换。同时，部分水凝胶材料本身来源于生物大分子，具有良好的生物相容性，且凝胶化条件温和，因此这类材料被广泛的用于活细胞以及生物活性物质的包封。尽管这些水凝胶已在各种生物工程领域得到大量应用，但是其基于传统水凝胶的应用形式仍存在许多亟需解决的问题：块体水凝胶尺寸较大，尽管具有多孔结构，其内部的物质传递速率与传递距离仍然较低近，因而导致其内部包封的细胞由于养料不足而存活率较低，或是内部包封的生物活性分子无法均匀、有效、完全的释放。同时在医学应用方面，其块体的形态不具备可注射性，只能进行块体植入，无法利用新型微创介导方式进行植入。而微米尺度的微凝胶则可充分利用其多孔溶胀的特性，营造微米级的可固载、高渗透高生物相容性的微环境，也为活性大分子/活细胞直接注射提供了有效途径。
近年来，微流控液滴技术已被广泛应用于制备包封生物活性物质如生物活性大分子药物或者活体细胞）的微凝胶。该方法通常利用不混溶两相流体在剪切力作用下形成分散相与连续相。其典型制备方法为：将生物活性物质（生物活性大分子或活细胞/细菌）分散在水凝胶预聚体水溶液中，利用水溶液与油相在微流控芯片中相互作用形成油包水单乳液，待水凝胶聚合或交联后可获得获得固化的水凝胶微珠。基于上述机理，水油相互作用时两相间界面张力对实际所得微凝胶粒径及形态结构起到较大的影响。实际应用中常常采用加入表面活性剂方法来降低界面张力。
常用的离子型表面活性剂，如十二烷基苯磺酸钠，其本身自带的离子型亲水端在与生物活性分子或细胞膜接触时，将会对活性分子或细胞膜产生不利影响，从而导致活性分子失活或是细胞死亡（胡大裕，李高，陈鹰，黄建耿，斯陆勤，中国药师，2006, 04, 294-296.）。非离子型表面活性剂可以显著降低这个问题，然而常用的离子、非离子型表面活性剂的疏水链均为长链烷烃，本身具有亲脂性，因此这些表面活性剂需要配合烷烃溶剂油使用。而部分生物活性分子本身也具有一定的亲脂性，因此这些分子的包封无法使用传统表面活性剂与烷烃油来完成（凡青，李学丰，董金凤，武汉大学学报(理学版)，2016,01，31-35.）。同时长链烷烃本身气体溶解性较差，而部分有机小分子传递速率较高，导致液滴间部分不必要的分子传递过多，实际应用时容易导致细胞缺氧以及液滴间的污染。
一些新型的微凝胶制备工艺采用氟碳油作为连续相。氟碳油本身兼具疏水性与疏脂性，基本无法溶解生物活性分子，也因此对于液滴间的分子扩散具有较好的抑制能力。此外，氟碳油对于气体具有较高的溶解性，因此比较适宜细胞包封。其高密度与低粘度的特点也为微凝胶的生产与分离提供帮助。而传统的表面活性剂无法溶于氟碳油中，因此无法适用于氟碳油-水体系。已有的氟化表面活性剂由如聚全氟醚、全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物、全氟烷基酸全氟醚-聚乙烯醇嵌段共聚物等，在具有较低的表面活性的同时，也具有较高的液滴稳定性，这也导致其具有不易清洗去除（即无法“破乳”）的问题，增加了微凝胶的收集步骤，同时增加凝胶微球生产的时间和资金成本，限制了其广泛应用（OlafWagner, Julian Thiele, Marie Weinhart, Linas Mazutis, David A. Weitz, WilhelmT. S. Huck, Rainer Haag, Lab Chip, 2016, 16, 65-69. C. Holtze, A. C. Rowat,J. J. Agresti, J. B. Hutchison, F. E. Angil`e, C. H. J. Schmitz, S. K¨oster,H. Duan, K. J. Humphry, R. A. Scanga, J. S. Johnson, D. Pisignano, D. A.Weitz, Lab Chip, 2008, 8, 1632–1639.）。例如，全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物表面活性剂的市场售价在500美元/克，使得采用这类表面活性剂生产凝胶微球的工艺成本极高。
基于上述表面活性剂，微凝胶在生产时通常会由于表面活性剂的存在而难以去除，附着在水凝胶微球的表面无法洗脱，因此难以重新分散在水相中。因此，往往需要通过费时费力的反复清洗才能获得微凝胶产品。尤其在用于载活细胞凝胶微球的制备过程中，微凝胶形成与洗脱步骤分离的两步法生产方式使得细胞在乳液液滴中停留时间超过数小时，大大降低了细胞的活性和存活率；同时，由于表面活性剂的去除困难，也会造成对细胞的毒性；同时由于两步法制备工艺的步骤之间时间间隔较长且交联不均匀，微凝胶个体间交联条件也相差甚远，从而导致获得产品内部差异较大；同时大多数水凝胶体系的交联过程通常会带有一些生物毒性物质的产生或添加，因此在与生物学方面综合应用时，这种长时间中间步骤则可能直接影响细胞活力或是活性分子活性，从而影响产品品质；多步操作的实际生产流程也注定不适宜扩大生产（Tom Kamperman, Sieger Henke, Claas WillemVisser, Marcel Karperien, Jeroen Leijten, small, 2017, 13, 1603711.）。
通过在同一步骤或装置中将乳化与清洗集成完成的一步法微凝胶生产工艺在一定程度上简化了微凝胶的生产工艺，缩短并均一化了单个微凝胶的生产时间，在控制水凝胶质量以及适应生物方面应用上有了显著的改进。然而，洗脱剂的加入或是特殊方法去除表面活性剂又在一定程度上提高了微凝胶的生产成本，昂贵的生产成本仍然限制着微凝胶的生产与应用（Liyuan Zhang, Kaiwen Chen, Haoyue Zhang, Bo Pang, Chang-HyungChoi, Angelo S. Mao, Hongbing Liao, Stefanie Utech, David J. Mooney, HuananWang, David A. Weitz, Small 2018, 14, 1702955.）。
此外，现有双水相体系利用高分子间的阻排效应，在同一溶剂中形成不共混两个水相，具有低界面张力，高通透性的特点，乳化时有效的规避了表面活性剂的问题（Byeong-Ui Moon, DaeKun Hwang, Scott S. H. Tsai, Lab Chip, 2016, 16, 2601–2608.）。然而其原生的低张力界面稳定性极弱，破乳速度极快，因而留给水凝胶交联的时间窗口过小；两相共存条件较为苛刻，溶液中部分溶质浓度变化也可能直接导致两相体积比发生变化或是直接融合；同时其高通透性以及形成时高溶质分子浓度导致在液滴形成时，水凝胶可能存在扩散或是其他分子渗透的情况，由此可能直接导致水凝胶交联受阻或对细胞或活性物质活性造成影响（Iwona Ziemecka, Volkert van Steijn, Ger J. M. Koper, MichelRosso, Aurelie M. Brizard, Jan H. van Esch, Michiel T. Kreutzer, Lab Chip,2011, 11, 620–624.）。
综上所述，寻找低毒、廉价的表面活性剂体系，集成简化生产步骤，同时保证微凝胶的交联时间窗口以及搭载物本身的活性，仍然是载细胞微凝胶技术在向实际运用的过程中亟需实现的技术要求。因此，牺牲部分表面活性剂的界面维持特性，开发一类低毒、廉价，操作简单的表面活性剂体系，是解决生物类物质搭载微凝胶技术扩大应用的一个有效途径。
已有技术存在的缺陷或问题：
1）离子型表面活性剂本身具有一定的水溶性，少量溶解后即对细胞膜或其他活性物质造成直接影响，导致细胞死亡或是活性物质失活，因而不适宜在包封细胞或生物活性物质时使用。
2）非离子表面活性剂分子较大，水溶性不佳，因此对细胞或生物活性物质的活性影响相对较小；同时，其较大的分子体积导致Gibbs-Marangoni效应增强，形成液滴后不易洗脱，导致产品回收时破乳操作困难繁琐；另一方面，虽然水溶性较差，但其亲脂特性仍然使其具有与某些分子形态相似的生物活性物质反应，因此也限制了其在对应物质包封中的应用。
3）氟化表面活性剂以氟化油为连续相溶剂，具有传统C-H油所不具有的特性，因此在细胞以及生物活性物质包封领域具有良好的应用前景。然而其制作过程繁琐且成本高昂，同时乳液稳定性极强，增加了微凝胶制备的操作步骤及成本，同时限制其形成连续生产工艺的可能性，因此在实际应用以及连续扩大生产时存在一定应用限制。
4）基于已有的表面活性剂的两步法制备微凝胶的方式操作步骤繁琐，乳化与交联条件苛刻，因而对细胞或是包封物质的活性影响较大，多步骤的生产流程也不适宜扩大生产以及大规模应用。
5）将液滴制备、水凝胶交联、表面活性剂洗脱等步骤集成后形成的一步法制备微凝胶显著降低了生产过程对搭载物质的影响，同时简化步骤，提高大规模应用可行性。然而基于高分子合成的稳定、低毒表面活性剂的生产流程与成本仍然居高不下，因此原料成本成为限制其应用的关键因素。
6）双水相体系利用高分子阻排效应或盐析效应获得不相容的两个水相体系，从而组成两相体系进行乳化操作，有效的规避了表面活性剂的限制。该方式形成的两相具有极小的界面张力，因而在乳化上不存在问题；而在乳液保持上，其自然形成的两相界面显然不适宜长时间保持乳液状态，因此供给水凝胶交联固化的时间窗口极小，这也是这个体系的局限性所在。目前已有的提高固化时间窗口的方法对液滴生产装置有较高的要求，在工艺放大方面同样面临着高基础成本的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，克服现有表面活性剂的的种种限制，本发明提供一种油相中可使用的氟化表面活性剂体系，该体系基于微流控液滴技术，利用新的表面活性剂体系，一步法连续制备水凝胶微球，能够实现高通量、低成本、连续生产微凝微胶材料。
本发明提供了一种新制备亚稳态乳液的表面活性剂体系，包括氟化表面活性剂和氟碳油；
所述氟化表面活性剂为一种可短暂维持水-油乳液界面稳定作用的两亲性分子，分子式为F(CF2)n(CH2)mR，结构式为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
该两亲性分子一端由亲氟碳油的全氟烷基构成，且全氟烷基碳的个数为n为>3个，烷基基团的个数m为0~4；另一端R端是亲水性基团，是羟基
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、羧酸（盐）基
Figure DEST_PATH_IMAGE003
、磺酸（盐）基
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、磷酸（盐）基
Figure DEST_PATH_IMAGE005
、氨基
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、季铵基
Figure DEST_PATH_IMAGE007
、铵盐基
Figure DEST_PATH_IMAGE008
、酮
Figure DEST_PATH_IMAGE009
、醚
Figure DEST_PATH_IMAGE010
、磺酰胺基
Figure DEST_PATH_IMAGE011
中的一种；所述氟碳油为氟碳烷烃、氟取代醚、氟取代酯、氟取代芳香烃中的一种或多种的组合，分子中含碳数量为3-20个；优选为全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟丁基-甲基醚、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟癸烷、全氟十一烷、全氟十二烷、全氟十三烷、全氟十四烷、全氟十五烷、全氟十六烷、全氟十七烷、全氟萘烷、Novec HFE系列氟化液中的一种或多种的组合。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述氟化表面活性剂在氟碳油中的添加浓度为0.01-80w/w%。
以本发明所述的表面活性剂体系一步法制备微纳凝胶颗粒的制备原理如下：
本发明采用两亲性小分子作为表面活性剂，当液滴形成后，表面活性剂可在短时间（>50毫秒）内稳定液滴，并为水凝胶固化提供交联窗口；当液滴大量形成并大规模发生碰撞后，表面活性剂的液滴稳定能力不足，液滴发生自发聚合，同时实现破乳分离。
本发明另一方面提供了一种以上述表面活性剂体系制备海藻酸微凝胶的方法，所述方法使用上述表面活性剂体系获得亚稳态油包水乳液，包括以下制备步骤：
（1）配置溶液：以水溶性可自由基交联固化聚合物单体、可离子交联的聚合物单体为原料溶解于水中制备溶液，加入交联剂得水凝胶预聚体溶液，水凝胶预聚体溶液与搭载物的水溶液作为水相溶液；以上述表面活性剂体系作为油相；对于化学交联水凝胶体系，交联剂和/或交联引发剂须溶解于上述两相之一中；
（2）基于乳液法或微流控法制备不同粒径分布的凝胶球：
乳液法：
步骤（1）所得水相与油相共混于烧杯中，使用电磁搅拌器匀速搅拌或/和超声，搅拌速度>1000rpm，待两相形成油包水乳液A后缓慢滴加交联引发剂（离子交联的聚合物）或使用紫外光照射（光固化聚合物），完成后静置，上层水相即最终产品，所得凝胶球平均粒径为0.05-500μm。
微流控法：
以纯水或缓冲液作为清洗相；将步骤（1）所得水相溶液作为内相以第一流速注入微流芯片，以第二流速将油相溶液作为外相从第二输入口注入微流芯片，水相与油相经过乳化通道共混，形成尺寸均一的油包水乳液；立刻引发交联反应使液滴内水凝胶预聚体固化形成凝胶微球，由于亚稳态的表面活性剂难以长时间维持液滴的稳定，油包水乳液液滴在通道中碰撞后发生融合，从而得到油水两相初步分离的混合液体B；以第三流速将清洗相由第三输入口注入微流芯片，并结束交联；清洗相与混合液体B在乳化通道下游混合通道中充分共混，由于乳液失去稳定性而发生相分离，并在芯片输出通道收集水油两相的混合液体C，所得液体C中的水相溶液即为凝胶微球产物的分散液，收集水相溶液，或直接用容器收集输出溶液，静置分层后收集水相溶液即得最终产品，所得单分散的凝胶球粒径为5-500μm范围内可调控。
上文所述的技术方案中，所述水凝胶预聚体为可自由基聚合的水凝胶预聚体、离子交联、温敏交联的水凝胶预聚体的一种或多种的组合；当水凝胶预聚体为可自由基聚合的水凝胶预聚体或离子交联的水凝胶预聚体时，所用的交联剂和/或交联引发剂溶解于前述步骤（1）配置的水、油两相之一中；
具体地，所述可自由基聚合的水凝胶预聚体为多马来酸酯接枝或多丙烯酸酯接枝的水溶性高分子中的一种，浓度为2-40w/v%，优选5-15 w/v%；交联引发手段为紫外光照；紫外光波长为254-405nm，优选320-380nm；紫外光强度为500-5000mw/cm2，优选800-3000mw/cm2，更优选1000-1500mw/cm2；紫外光照射时间为1-100s，优选10-50s，更优选20-40s；所述光引发剂为苯基-1,4-6-三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP）、2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(光引发剂2959)、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引发剂659)、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮(光引发剂907)、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮(光引发剂1173)中的一种，浓度为0.01-1w/v%；
具体地，所述可离子交联的聚合物单体为多糖类亲水性高分子海藻酸盐（Alginate）或结冷胶，浓度为0.1-20w/v%，优选0.5-5w/v%；交联引发手段是在油相中加入可以共混的酸性物质作为交联引发剂；
当聚合物单体为海藻酸钠时，交联引发剂是金属离子螯合物、金属盐纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒中一种或多种的组合；所述金属离子螯合物中阴离子基团为氮川三乙酸基团、乙二胺二乙酸基团、乙二胺四乙酸基团中的一种或多种的组合；所述金属离子螯合物中阳离子基团可以是镁离子、钙离子、铬离子、锶离子、锰离子、锌离子、铁离子、铝离子、钡离子、铜离子中的一种或几种的组合；所述金属离子螯合物中阳离子与阴离子的摩尔比为0.5~2；金属盐纳米颗粒中的金属离子是由钙离子、铬离子、锶离子、锰离子、锌离子、铁离子、铝离子、镁离子、钛离子、钡离子、铜离子中的一种或几种的组合，金属盐纳米颗粒中的阴离子是碳酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、卤素离子、硝酸根离子、氢氧根离子、硅酸根离子的难溶性纳米颗粒中的一种或多种的组合；所述金属氧化物纳米颗粒的金属元素是钙、铬、锶、锰、锌、铁、铝、镁、钛、钡、铜中的一种或多种的组合；
所述酸性物质取自下述一种或多种的组合：硫酸、硝酸、盐酸、碳酸、醋酸、磷酸、硒酸、高氯酸、氯酸、次氯酸、溴酸、溴化氢、氢氟酸、丙酮酸、甲酸、柠檬酸、乳酸、苯甲酸、丙烯酸、丙酸、油酸、硬脂酸、硫化氢、硅酸、苯酚，引入量为水相体积0.01-5 v/v %，优选0.05-2v/v %。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述搭载物为生物活性物质，包括活细胞、细菌、真菌、酶、蛋白质多肽类、纳米颗粒；当搭载物为pH敏感型物质时，所述缓冲溶液pH为4-8，优选6.8-7.5；当活细胞包埋时使用培养基作为溶剂。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述微流控法所用的微流控芯片为具有两个流体聚焦结构、T型混合结构、同心轴流体结构或X型结构的微流通道或上述几种结构的两两组合，其中两个结构间距离为1-40mm；有至少3个液相输入口，至少一个乳化通道以及输出通道；所述微通道内壁表面需要进行疏水处理。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述微流控法水相溶液注入微流控芯片中水相与油相的流速比为0.01~1；油相与清洗相流速比为1:0.5~20；水相溶液注入微流控芯片的流速，即第一流速为5-2000μL/h，优选为10-1000μL/h，更优选为20-200μL/h；油相溶液注入微流控芯片的流速即第二流速为10-20000μL/h，优选为500-5000μL/h，更优选为800-2000μL/h；缓冲液注入微流控芯片的流速即第三流速为10-20000μL/h，优选为500-8000μL/h，更优选为800-4000μL/h。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述微流控法形成的水相液滴从第一水油共混通道到第二水油共混通道所经过的时间为1-10000ms；其中，由表面活性剂带来的微液滴稳定时间为0.2-0.8s。
上文所述的技术方案中，进一步地，所述乳液法水相与油相的混合比例为1:4-20；搅拌转速为500-50000rpm，优选为500-25000rpm，更优选为1000-18000rpm；搅拌转速大于15000rpm，优选为16000-18000rpm，得到纳凝胶颗粒，粒径为50-999nm。
上文所述的乳液法技术方案中，进一步地，酸性物质滴加速度为1-100μl/s，优选为5-50μl/s。
本发明有益效果：
本发明提供一种制备固载活细胞或生物活性物质的微纳米凝胶微球的亚稳态乳液制备体系：
1）对比传统的具有良好乳液稳定性的多嵌段表面活性剂乳液体系，本发明基于亚稳态乳液体系，能够有效降低水油间界面张力（< 30mN m-1），满足各类微纳米凝胶产品的尺寸控制以及生产需求。并且其局部稳定整体非稳的乳液特性，使其形成的乳液液滴能够在短时间内自发破乳（0.2-0.8s），实现相分离，因此能够避免传统表面活性剂体系所形成乳液过于稳定的问题；
2）对比传统的包含乳液乳化、水凝胶固化、微凝胶洗脱的微凝胶生产工艺，该制备体系基于亚稳态乳液体系，利用该乳液局部稳定整体非稳的物理特性，在局部稳定的条件下实现了载细胞或载活性物质的微纳米凝胶乳液的形成以及微球固化的过程，并依靠整体非稳得特性实现一步分离，将传统多步法生产流程中所必需的乳液清洗以及凝胶分离工序融合至芯片内，一步完成，显著简化了生产步骤。从而避免了传统工艺步骤繁杂、生物相容性较差、表面活性剂分子难以清除的问题；
3）该体系能够应用于基于微流控液滴技术的微凝胶制备工艺，从而实现一步法连续生产载有生物活性物质的凝胶微球（10μm-999μm）。由此可避免使用传统表面活性剂体系时所面临的生产原料毒性问题、生产流程中的细胞活性保持问题等。因此所得的载细胞凝胶微球具有尺寸分布窄（差异系数CV<4%）、搭载物的生物活性高（以细胞为例，微凝胶内搭载细胞存活率>95%）；
4）该方法能够应用于基于机械搅拌或破碎方式进行单乳液液滴制备，其较低的界面张力使其能够生产具有广泛尺寸分布的各类单分散微纳米级凝胶微球（50nm-999μm），同时乳液亚稳的特性在提供微纳颗粒交联固化足够的时间窗口的同时，也能够实现产品从乳液中的自发分离，显著简化了生产步骤，降低了操作成本；
5）该制备体系大大降低了传统乳液法制备凝胶微球工艺的生产成本，尤其相对于传统多嵌段聚合物表面活性剂昂贵的价格（约3800元/g，Ran Biotechnolgies，UK），本发明所述方法使用的制备亚稳态乳液的表面活性剂价格低廉（约1元/g，Aladdin，CN），可显著降低生产成本；
6）该乳液体系可在液滴形成这一局部窗口内，够提供不逊于传统多嵌段表面活性剂体系的低界面张力以及局部稳定性，因此可应用于不同材料（包括但不限于各类水凝胶材料、可溶性塑料以及树脂材料）、不同结构微颗粒（包括但不限于多瓣结构、多腔室结构以及核壳结构）的生产。
附图说明
图1 本发明中几种典型的氟化醇的界面张力与其浓度间的关系图；顶端直线为不含表面活性剂状态下水油间界面张力；
图2 实施例1中制备微凝胶的流程示意图；其中⑤代表海藻酸发生交联反应，⑥代表微凝胶被清洗相洗脱至水相中；
图3 中a是对比例1所述使用三嵌段表面活性剂制备的稳定液滴；b是实施例1所述清洗相对微球的清洗作用示意图，比例尺为50μm；
图4 是实施例1制备的微凝胶；
图5是不同流速比形成的微凝胶颗粒尺寸分布图；
图6是不同氟化醇在完全相同的操作流程及参数下制得的微凝胶颗粒细胞活性；
图7 通过不同方式制得的载细胞微凝胶中细胞的存活率；
图8 是制得并培养后所得的载细胞微凝胶颗粒，比例尺为10μm；
图9是实施例5流程示意图，其中⑤表示两个水相混合形成双水相层流，⑥表示海藻酸交联过程；
图10是实施例5所述方法进行阴阳结构微凝胶制备时双水相层流状态；
图11是实施例5所述方法制备的阴阳结构微凝胶颗粒，比例尺为50μm；
图12是实施例5所述直接收集的微凝胶颗粒聚集并分层的状态；
图13是实施例5所述直接收集的微凝胶颗粒聚集的显微照片；
图14 是实施例6所述方法制备的海藻酸微凝胶粒径分布图；
图15 是实施例6所述方法在高转速下制备的海藻酸微凝胶粒径分布图；
图16 是实施例6所述方法在高转速下制备的纳凝胶颗粒电镜图；
图17 是实施例6所述方法制备的海藻酸微凝胶实物图；
图18 是实施例8所述方法制备的聚乙二醇凝胶球实物图，比例尺为50μm；
图19 不同氟化醇在完全相同的操作流程及参数下制得的微凝胶颗粒尺寸分布；
图20 是实施例10所制备的核壳结构微凝胶；
图21是实施例10制备核壳结构微凝胶时微通道内液相的状态。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
如图1所示，少量的本发明所列出的氟化表面活性剂加入即可显著降低水油间界面张力，使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入海藻酸预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体溶液作为水相，由第一输入通道进入①水相通道。将1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇作为表面活性剂与醋酸加入氟化油Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道，其中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道C1中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h。两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDTA螯合的钙离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠。由于1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇作为表面活性剂并不能长时间稳定液滴，在⑤交联通道末端微凝胶颗粒将出现团聚成大颗粒的趋势。
随后上述混合液经过清洗通道C2时，③中的清洗相对乳液整体进行清洗，清洗相流速为1500μL/h，液滴经过C1、C2所需时间约为800ms。微凝胶由于其自身的亲水性以及界面不稳定效应，在⑥清洗通道中从油相中清洗出并分离在水相中，如图3b所示，完成微凝胶与油相的分离。最后直接收集水油相混合流体，得到自然分相的水油两层液体，此时微凝胶分散在上层水相中，如图4所示。上述溶液均由恒流注射泵输入微通道。
调整芯片结构，使用通道宽度为200μm、400μm，800μm的同结构芯片，使用如上所示方法制备海藻酸微凝胶球，水相/油相/清洗相流速分别调整为400:4000:4000μL/h，800:8000:8000μL/h，1200:12000:12000μL/h，液滴经过C1、C2所需时间分别为3200ms，6400ms，9600ms。其中，结果表明产品粒径受通道宽度控制，且在不同通道条件下均能实现微凝胶在芯片内的一步成型与分离，同时保持组各粒径分布差异系数均小于5%。由此证明本方法能够将微凝胶的形成、固化、分离步骤集成至同一芯片内完成，以达到简化生产流程的目的。
对比例1
相较实例1同样使用如图2所示微通道制备凝胶，①通道输入水相流速与组成均不变；②通道输入油相组分变为全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物、醋酸与NovecHFE7100，流速不变，其中全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物作为表面活性剂，浓度为1v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。③通道变为第二油相，由20v/v% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇与Novec HFE7100混合而成，通入流速为1000μL/h。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴；两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDTA螯合的钙离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠并稳定分散于油相中，如图3a所示。
上述混合流体通过⑤交联通道流至清洗结构后，③清洗相通道中的 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇将稳定水油界面的全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物表面活性剂洗脱，使水油界面不再稳定，微凝胶在⑥清洗通道中开始出现团聚趋势。最后由④输出通道输出进入含缓冲液的容器中，此时微凝胶由于其自生亲水性自发进入水相，完成微凝胶与油相的分离。
由实施例1和对比例1可以看出，本发明制备方法可实现芯片内乳化与破乳分离，显著减少操作步骤、原料消耗以及微凝胶停留在油相内的时间，一定程度上提高了生物相容性。
对比例2
使用如图2所示的微通道进行制备，将海藻酸钠、乙二胺二乙酸钡（Ba-EDDA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钡离子终浓度为100mM的海藻酸水凝胶预聚体溶液作为水相，由第一输入通道进入①水相通道。分别使用七氟丁酸、九氟戊磷酸，十七氟壬磺酸、十五氟三乙胺作为表面活性剂，与醋酸分别加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道，其中表面活性剂浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道C1中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h。两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDDA螯合的钡离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠。由于这些表面活性剂与1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇具有类似的界面稳定能力，并不能长时间稳定液滴，因此微凝胶颗粒均会在⑤交联通道末端出现团聚成大颗粒的趋势。与对比例1相比，使用这一类两性短链小分子作为表面活性剂时，均可以实现芯片内乳化与破乳分离，显著减少操作步骤、原料消耗以及微凝胶停留在油相内的时间，简化生产步骤。
实施例2
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入海藻酸预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，改变油相与第一水相的流速比例Qo/Qw<20，第二水相流速与油相相同。两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDTA螯合的钙离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠。结果如图5所示，随着Qo/Qw增大，微凝胶颗粒的尺寸随之减小。由此表明本方法能够通过调整微流控芯片内液相流动参数的方式，实现微凝胶产品的尺寸控制。
实施例3
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入海藻酸预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
为证明不同链长两性氟化物分子具有生产微凝胶颗粒的能力，将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将不同种氟化醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中氟化醇选取七氟丁醇（四碳）、1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇（八碳）、1H,1H,2H,2H-全氟-1-十六醇（十六碳）作为典例，浓度均为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h。两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDTA螯合的钙离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠。结果如图19所示，同浓度，同流速下，不同种氟化醇的表面活性能力均能达到要求，所制备出的微凝胶粒径分布差异系数均小于5%，表明不同链长的两性氟化物分子均具有生产微凝胶颗粒的能力。
对比例3
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入海藻酸预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
为证明不同浓度的两性氟化物分子均具有生产微凝胶颗粒的能力，将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将不同种氟化醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中氟化醇选取1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，浓度选用20v/v%，40v/v%，80v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h。结果表明不同表面活性剂浓度条件下制得的微凝胶粒径相仿，且制备出的微凝胶粒径分布差异系数均小于5%，基本符合其界面张力分布的特点，表明不同浓度的两性氟化物分子均具有生产微凝胶颗粒的能力。
对比例4
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入海藻酸预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
为证明不同亲水基团的两性氟化物分子均具有生产微凝胶颗粒的能力，将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将不同种氟化醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中氟化醇选取1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛酸、1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇、1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛烷磺酸钠、N-甲基-1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟代-1-丁烷磺酰胺为典例，浓度选用5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h。结果表明不同表面活性剂浓度条件下制得的微凝胶粒径相仿，且制备出的微凝胶粒径分布差异系数均小于5%，表明带有不同亲水基团的两性氟化物分子均具有生产微凝胶颗粒的能力。
实施例4
细胞培养：以MSC小鼠间周质干细胞培养为例，增值培养基由α-MEM，10%胎牛血清（FBS，Gibco）组成，培养条件37℃，95%相对湿度与5%CO2。细胞培养基每两天后更换。使用前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，置于胰蛋白酶/EDTA溶液5分钟，悬浮于培养基中备用。
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于α-MEM培养基中，并与上述细胞悬液共混，配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM，细胞浓度为106个/ml的海藻酸水凝胶预聚体溶液。以上配置预聚体溶液作为第一水相。分别使用七氟丁醇，1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，1H,1H,2H,2H-全氟-1-癸醇作为表面活性剂，与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相。上述油相中表面活性剂浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。用α-MEM培养基配置含20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相，实现了在微通道中对载细胞微凝胶的洗脱，以及对体系内过量的酸进行中和，使制备过程对细胞的损伤降到最低。
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入上述第一水相聚体溶液，②连接第二输入通道，上述油相，③连接第三输入通道，上述第二水相；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。其中，第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h，第二水相流速为1500μL/h。按照上述参数以及材料配比，以实施例1的方式制备载细胞微凝胶。制得的两相混合流体用与清洗相相同配比的α-MEM培养基HEPES缓冲液接收，以进一步降低酸含量。
通过使用死活荧光染色（LIVE/DEAD assay）对嵌段共聚物表面活性剂体系以及亚稳态乳液制备体系的细胞毒性进行考察。在微凝胶悬浮液中加入2mM钙黄绿素（旅社荧光染料标记活细胞）和4mM碘化丙啶（红色荧光染料标记死细胞），孵育20分钟后使用激光共聚焦扫描显微镜观察，结果如图6，图7，图8所示。以1H,1H,2H,2H-全氟-1-癸醇，1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇为表面活性剂时，细胞存活率均大于95%，与常规二维培养细胞存活率相当，证明本亚稳态乳液体系以及本微凝胶制备体系具有很好的生物相容性。而与1H,1H,2H,2H-全氟-1-癸醇，1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇相比，使用具有相对较高水溶性的七氟丁醇时细胞存活率显著下降，表明本发明在一定范围内能够满足生物相容性的要求，可适用于载细胞为凝胶的制备生产。
对比例5
使用对比例1嵌段共聚物表面活性剂一步法微凝胶制备工艺，制备载细胞微凝胶。将海藻酸钠、乙二胺二乙酸钙（Ca-EDDA）溶于α-MEM培养基中，并与上述细胞悬液共混，配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM，细胞浓度为106个/ml的海藻酸水凝胶预聚体溶液。以上配置预聚体溶液作为水相。将全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物与醋酸加入Novec HFE7100后作为第一油相，其中全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物作为表面活性剂，浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰，20v/v% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇与NovecHFE7100混合制得第二油相。
①，②中的水油相在α流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴；两相共混后，在⑤交联通道中，油相中的醋酸进入水相，使与EDTA螯合的钙离子不稳定，游离进入溶液后与海藻酸交联形成水凝胶，从而使液滴固化为水凝胶微珠并稳定分散于油相中。
上述混合流体通过⑤交联通道流至β清洗结构后，③清洗相通道中的 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇将稳定水油界面的全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物表面活性剂洗脱，使水油界面不再稳定，微凝胶在⑥清洗通道中开始出现团聚趋势。最后由④输出通道输出进入含缓冲液的容器中，此时微凝胶由于其自生亲水性自发进入水相，完成微凝胶与油相的分离。上述缓冲液为使用α-MEM培养基配置的含20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液。结果如图7所示细胞存活率约为85%，与本发明体系相比有所下降，显示出本专利体系良好的生物相容性。
对比例6
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于α-MEM培养基中，并与酿酒酵母悬液共混，配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM，菌体浓度为106个/ml的海藻酸水凝胶预聚体溶液。以上配置预聚体溶液作为第一水相。将醋酸加入Novec HFE7100（甲基九氟丁醚）后作为油相。上述油相中表面活性剂浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。用YPD培养基配置含20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相，实现了在微通道中对载细胞微凝胶的洗脱，以及对体系内过量的酸进行中和，使制备过程对细胞的损伤降到最低。
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入上述第一水相聚体溶液，②连接第二输入通道，上述油相，③连接第三输入通道，上述第二水相；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。其中，第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h，第二水相流速为1500μL/h。按照上述参数以及材料配比，以实施例1的方式制备载细胞微凝胶。制得的两相混合流体用与清洗相相同配比的YPD培养基HEPES缓冲液接收，以进一步降低酸含量。使用实施例4全套制备工艺及其参数，仅改变其中细胞种类，使用酿酒酵母，重复细胞包埋过程。利用所得产品，可继续进行下一步发酵工序，保持酵母活性的同时缓解发酵环境内剪切力带来的影响。由此工艺可获得菌体活性高、尺寸均一的载酵母海藻酸微凝胶，表明本发明同样可用于搭载菌体等其他生物微单元的微凝胶的微流控一步生产。
实施例5
使用如图9所示的流程制备阴阳结构微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入第一海藻酸预聚体溶液；②连接第二输入通道，输入第二海藻酸预聚体溶液；③连接第三输入通道，输入含酸、表面活性剂的油相；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体，并加入绿色荧光素标记的二氧化硅纳米颗粒；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①第一水相通道。将上述海藻酸预聚体中的绿色荧光素标记的二氧化硅纳米颗粒替换为红色荧光标记的二氧化硅纳米颗粒，并加入蓝墨水，使其均匀分散，得到带有荧光和颜色的海藻酸水凝胶预聚体，以上配置作为第二水相输入第二输入通道并进入②第二水相通道。将1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛酰胺与甲酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第三输入通道并进入②油相通道。上述油相中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇浓度为5v/v%，甲酸浓度为1v/v‰。
将上述各水相与油相溶液，分别通过上述连接方式由注射泵输入微通道结构，两相海藻酸预聚体溶液在α处汇聚，并在⑤通道并行流动如图10所示，至β处被油相剪切形成液滴，并流动至⑥交联通道处完成海藻酸交联并保留如图11所示的阴阳结构。其中，两种水相的流速均为50μL/h，油相流速为1000μL/h。
由于1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛酰胺作为表面活性剂时水油界面的不稳定性，在⑥交联通道下游处微凝胶将自发相分离，并由于水油密度差在收集容器内自动分层单独成水相，实现微凝胶与油相的分离如图12，图13所示，由此证明本发明体系可用于带结构微凝胶的微流控一步生产。
实施例6
配置海藻酸钠1w/v%，碳酸钙纳米颗粒5g/L为终浓度的预聚体溶液，作为水相；使用Novec HFE7100 配置2% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇，作为油相。将两相混合后置于电磁搅拌器上，搅拌至两相混匀成乳液，用注射泵缓慢加入醋酸至过量。反应结束后关闭搅拌器，静置分层，上层水相即为所得产品，其粒径分布如图14、15所示，产品图17所示（光学显微镜条件下颗粒不可见）。使用高速搅拌机，转速提高至15000rpm后，可获得纳米级海藻酸颗粒，产品如图16所示。其中，转速范围为1000-3000rpm，醋酸加入速度10μL/s。由此证明本发明体系可用于离子交联水凝胶微纳米凝胶的乳液法一步生产。
实施例7
配置聚乙二醇丙烯酸酯（600）10v/v%，光引发剂2959 1w/v%为终浓度的预聚体溶液，作为水相；使用Novec HFE7100 配置2% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇溶液，作为油相。将两相混合后置于电磁搅拌器上，调节转速至1500rpm，搅拌至两相混匀成乳液。使用紫外面光源对混合液进行照射。反应结束后关闭搅拌器，静置分层，上层水相即为所得产品，产品平均粒径65μm，粒径分布（CV）为17.2%。其中，紫外波长365nm，功率1200mw/cm2，照射时间40s。由此证明本发明体系可用于光引发水凝胶微凝胶颗粒的乳液法一步生产。
实施例8
37℃预热配置明胶A 10w/v%为终浓度的预聚体溶液，作为水相；使用NovecHFE7100 配置50% 1H,1H,2H,2H-全氟-1-癸醇溶液，作为油相。将两相混合后保持37℃水浴，并置于超声乳化装置中，乳化至两相混匀成乳液。使用冰水混合液替换水浴，诱发明胶固化，固化结束后关闭搅拌器，静置分层，上层水相即为所得产品。其中，超声乳化功率为600W，乳化时间为10～15min，所得明胶凝胶颗粒粒径分布范围为0.2-120μm。由此证明本发明体系可用于温敏水凝胶微纳米凝胶颗粒的乳液法一步生产。
实施例9
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入聚乙二醇丙烯酸酯预聚体溶液，②连接第二输入通道，输入含表面活性剂的油相，③连接第三输入通道，输入纯水或缓冲液；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。
将聚乙二醇丙烯酸酯（600）、苯基-1,4-6-三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP）溶于去离子水配置得聚乙二醇丙烯酸酯（600）含量为10 v/v%，LAP终浓度为0.25 w/v%的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇浓度为5v/v%。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h；两相共混后，在⑤交联通道中，使用紫外点光源光照，引发光交联反应，紫外光强度2000 mw/cm2。由于1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇作为表面活性剂并不能长时间稳定液滴，在⑤交联通道末端微凝胶颗粒将出现团聚成大颗粒的趋势。
随后上述混合液经过清洗通道时，③中的清洗相对乳液整体进行清洗，清洗相流速为1500μL/h。微凝胶由于其自身的亲水性以及界面不稳定效应，在⑥清洗通道中从油相中清洗出并分离在水相中，如图3所示，完成微凝胶与油相的分离。最后直接收集水油相混合流体，得到自然分相的水油两层液体，此时微凝胶分散在上层水相中，如图18所示。上述溶液均由恒流注射泵输入微通道。由此证明本发明体系可用于光引发水凝胶体系微颗粒的微流控法一步生产。
实施例10
使用如图9所示制备流程制备核壳结构微凝胶，其中①②③不变，④连接输出通道，所述微通道内壁面均进行疏水处理。
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于去离子水配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体，并加入绿色荧光素标记的二氧化硅纳米颗粒，使其均匀分散，得到带有荧光的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①第一水相通道。配置1%葡聚糖溶液或纯水，作为第二水相由第二输入通道注入②；将1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇加入Novec HFE7100后作为油相输入第三输入通道并进入③第一油相通道；将醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第四输入通道并进入④第二油相通道。上述油相中1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。
将上述各水相与油相溶液，分别通过上述连接方式由注射泵输入微通道结构，核壳两相溶液在α处汇聚，并立刻被剪切，在⑤通道内呈乳液状流动；流动至β交联通道处完成海藻酸交联并保留如图20所示的核壳结构。其中，壳相的流速均为50μL/h，核相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h，通道结构如图21所示。由此证明本发明体系可用于带结构微颗粒的微流控法一步生产。
实施例11
已有文献中报道的用于细胞包封于乳液液滴的方法中，通常采用制备稳定的油包水乳液液滴，必须引入稳定的、生物相容性好的表面活性剂（例如全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚合成流程）。这类表面活性剂合成工艺复杂，价格昂贵。文献（C. Holtze, A. C. Rowat, J.J. Agresti, J. B. Hutchison, F. E. Angil`e, C. H. J. Schmitz, S. K¨oster, H.Duan, K. J. Humphry, R. A. Scanga, J. S. Johnson, D. Pisignano, D. A. Weitz,Lab Chip, 2008, 8, 1632–1639.）描述了一种全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚三嵌段表面活性剂的合成方法如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
1.使用草酰氯将聚全氟丙二醇酸转化为酸性氯化物（65℃加热回流反应48h）；
2.使用过量的聚乙二醇二胺与聚全氟丙二醇酸性氯化物反应，形成聚全氟丙二醇与聚乙二醇之间具有酰胺键的三嵌段共聚物表面活性剂（30℃反应48h）。
其中，聚乙二醇二胺需要进行额外的步骤来合成，其步骤包括：1.甲苯酰氯活化聚乙二醇；2.将酰化聚乙二醇转化为含有对苯二甲酰亚胺端的聚乙二醇；3.加入肼使其转化成聚乙二醇二胺。
由此可见，全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚这一类三嵌段表面活性剂的合成步骤繁琐，其合成成本与购买成本高。
相对比，本发明描述的使用氟化醇作为表面活性剂制备的亚稳乳液液滴，并获得凝胶微球的方法可极大降低制备过程所需的成本。
以现有常用的表面活性剂与本发明所用表面活性剂成本对比如下表：
表面活性剂价格对比
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例12
将甲基丙烯酸酐化明胶、光引发剂2959（2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮）、四甲基吡嗪1w/v%溶于去生理盐水配置得甲基丙烯酸酐化明胶含量为10 w/v%，光引发剂2959终浓度为0.25 w/v%的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将六氟苯-1-辛醇加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道。上述油相中六氟苯-1-辛醇浓度为5v/v%。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h；两相共混后，在⑤交联通道中，使用紫外点光源光照，引发光交联反应，紫外光强度2000 mw/cm2。
随后上述混合液经过清洗通道时，③中的清洗相对乳液整体进行清洗，清洗相流速为1500μL/h。微凝胶由于其自身的亲水性以及界面不稳定效应，在⑥清洗通道中从油相中清洗出并分离在水相中，如图3所示，完成微凝胶与油相的分离。最后直接收集水油相混合流体，得到自然分相的水油两层液体，此时药物搭载的微凝胶分散在上层水相中。上述溶液均由恒流注射泵输入微通道。
取上层含产品水相，离心浓缩后，制成注射制剂。使用时通过静脉注射，水凝胶颗粒可在体内缓慢降解，同时药物可在体内缓慢释放，具有增加冠动脉流量、降低动脉压力、溶栓、增进微循环的功能。由此证明本发明体系可用于药物搭载微颗粒的微流控法一步生产。
实施例13
将海藻酸钠、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）溶于α-MEM培养基中，并与胰岛细胞悬液共混，配置得海藻酸钠含量为1w/v%，钙离子终浓度为50mM，细胞浓度为106个/ml的海藻酸水凝胶预聚体溶液。以上配置预聚体溶液作为第一水相。使用1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇作为表面活性剂，与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相。上述油相中表面活性剂浓度为5v/v%，醋酸浓度为1v/v‰。用α-MEM培养基配置含20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相，实现了在微通道中对载细胞微凝胶的洗脱，以及对体系内过量的酸进行中和，使制备过程对细胞的损伤降到最低。
使用如图2所示的微通道制备微凝胶，其中①连接第一输入通道，输入上述第一水相聚体溶液，②连接第二输入通道，上述油相，③连接第三输入通道，上述第二水相；④连接输出通道。所述微通道内壁表面均进行疏水处理。其中，第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h，第二水相流速为1500μL/h。按照上述参数以及材料配比，以实施例1的方式制备载细胞微凝胶。制得的两相混合流体用与清洗相相同配比的α-MEM培养基HEPES缓冲液接收，以进一步降低酸含量。最后直接收集水油相混合流体，得到自然分相的水油两层液体，此时细胞搭载的微凝胶分散在上层水相中。上述溶液均由恒流注射泵输入微通道。
取上层含产品水相，离心浓缩后，制成注射制剂。使用时通过大鼠静脉注射，水凝胶颗粒可起到免疫屏蔽的功能，防止其内部的胰岛细胞被机体免疫系统清除；同时具有活性的胰岛细胞在微凝胶内生产、释放胰岛素，起到降血糖、促进代谢、增进微循环的功能。由此证明本发明体系所生产的载细胞凝胶微颗粒可用于的生物体的静脉注射，进行细胞治疗。
实施例14
将甲基丙烯酸酐化海藻酸钠、光引发剂2959（2-羟基-4'-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮）、乙二胺四乙酸钙（Ca-EDTA）、四甲基吡嗪1w/v%溶于去生理盐水配置得甲基丙烯酸酐化海藻酸钠含量为1w/v%，光引发剂2959终浓度为0.25 w/v%，钙离子终浓度为50mM的海藻酸水凝胶预聚体；以上配置预聚体溶液作为水相由第一输入通道进入①水相通道。将六氟苯-1-辛醇与醋酸加入Novec HFE7100后作为油相输入第二输入通道并进入②油相通道，醋酸浓度为1v/v‰。上述油相中六氟苯-1-辛醇浓度为5v/v%。配置20mM，pH=7.4的HEPES缓冲液作为第二水相输入第三输入通道并进入③清洗相通道。①，②中的水油相在流体聚焦微通道中共混、剪切形成尺寸分布均一的油包水单相乳液液滴。其中第一水相流速为100μL/h，油相流速为1000μL/h；两相共混后，醋酸引发交联反应。
随后上述混合液经过清洗通道时，③中的清洗相对乳液整体进行清洗，清洗相流速为1500μL/h。微凝胶由于其自身的亲水性以及界面不稳定效应，在⑥清洗通道中从油相中清洗出并分离在水相中，如图3所示，完成微凝胶与油相的分离。最后直接收集水油相混合流体，得到自然分相的水油两层液体，此时药物搭载的微凝胶分散在上层水相中。上述溶液均由恒流注射泵输入微通道。
取上层含产品水相，离心浓缩后，由注射器注射成型，使用使用紫外点光源光照，引发光交联反应，紫外光强度2000 mw/cm2，从而构建由微凝胶组成的海藻酸水凝胶支架。由此证明本发明体系所生产的凝胶微颗粒可用于水凝胶支架的体外重构。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种表面活性剂体系在制备亚稳态乳液中的应用，其特征在于，所述表面活性剂体系包括氟化表面活性剂和氟碳油；
所述氟化表面活性剂为两亲性分子，分子式为F(CF2)n(CH2)mR，该两亲性分子一端由亲氟碳油的氟化烷基构成，且氟化烷基碳的个数n为n＜3≤16个，烷基基团的个数m为0~4；另一端R端基是亲水性基团，是醇基、羧酸盐、羧酸基、磺酸盐、磺酸基、磷酸盐、磷酸基、氨基、季铵基、铵盐基、酮、醚、酰胺基中的一种；
所述氟碳油为溶剂为氟碳烷烃、氟取代醚、氟取代酯、氟取代芳香烃中的一种或多种的组合，分子中含碳数量为3-20个；
所述氟化表面活性剂在氟碳油中的添加浓度为0.01-80w/w%。
2.一种基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的氟化表面活性剂体系获得亚稳态油包水乳液，包括以下制备步骤：
S1以溶解有水凝胶预聚体的水溶液以及搭载物的水溶液作为水相；以权利要求1所述氟化表面活性剂、氟碳油作为油相；需要交联因子引发的化学交联水凝胶体系，包括自由基聚合以及离子交联的水凝胶预聚体，交联剂和/或交联引发剂溶解于所述水相或所述油相中；
S2基于乳液法或微流控法制备不同粒径分布的凝胶球；
所述乳液法为：将步骤S1水、油两相共混，在>1000rpm的转速下高速搅拌或/和超声分散得到油包水乳液A，同时引发乳液液滴内的水凝胶预聚体发生交联/聚合反应而固化形成凝胶颗粒；待交联反应结束，静置或加入缓冲溶液混匀后静置，水油不共混两相发生相分离，所得水相溶液即为凝胶微球产物的分散液，所得凝胶球平均粒径在200nm-1000μm范围内可调控；
所述微流控法为：以纯水或缓冲水溶液作为清洗相；将步骤S1获得的水相溶液作为内相从第一输入口注入微流控芯片，将油相溶液作为外相从第二输入口注入微流控芯片，水相溶液和油相溶液经过第一水油共混通道乳化，形成油包水乳液液滴；立刻引发液滴内的水凝胶预聚体发生交联/聚合反应而固化形成凝胶微球，油包水乳液液滴在通道中碰撞后发生融合，从而得到油水两相初步分离的混合液体B；将清洗相的水溶液从第三输入口注入微流控芯片，并与混合液体B在第二水油共混通道共混，由于乳液失去稳定性而发生相分离，并在芯片输出通道收集水油两相的混合液体C，所得液体C中的水相溶液即为凝胶微球产物的分散液，所得单分散的凝胶微球粒径在5-1000μm范围内可调控。
3.根据权利要求2所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述水凝胶预聚体为可自由基聚合的水凝胶预聚体、离子交联、温敏交联的水凝胶预聚体的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述可自由基聚合的水凝胶预聚体为马来酸酯接枝或多丙烯酸酯接枝的水溶性高分子。
5.根据权利要求3所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述离子交联的水凝胶预聚体为多糖类亲水性高分子海藻酸盐或结冷胶，浓度为0.1-20w/v%；
当聚合物单体为海藻酸钠时，交联引发剂是金属离子螯合物、金属盐纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒中一种或多种的组合；
所述金属离子螯合物中阴离子基团为氮川三乙酸基团、乙二胺二乙酸基团、乙二胺四乙酸基团中的一种或多种的组合；所述金属离子螯合物中阳离子是镁离子、钙离子、铬离子、钛离子、锶离子、锰离子、锌离子、铁离子、铝离子、钡离子、铜离子中的一种或多种的组合；金属盐纳米颗粒中的金属离子是钙离子、铬离子、锶离子、锰离子、锌离子、铁离子、铝离子、镁离子、钛离子、钡离子、铜离子中的一种或几种的组合，金属盐纳米颗粒中的阴离子是碳酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、卤素离子、硝酸根离子、氢氧根离子、硅酸根离子的难溶性纳米颗粒中的一种或多种的组合；所述金属氧化物纳米颗粒的金属元素是钙、铬、锶、锰、锌、铁、铝、镁、钛、钡、铜中的一种或多种的组合；
所述离子交联的交联引发手段是在油相中加入可以共混的酸性物质作为交联引发剂，酸性物质取自下述一种或多种的组合：硫酸、硝酸、盐酸、碳酸、醋酸、磷酸、硒酸、高氯酸、氯酸、次氯酸、溴酸、溴化氢、氢氟酸、丙酮酸、甲酸、柠檬酸、乳酸、苯甲酸、丙烯酸、丙酸、油酸、硬脂酸、硫化氢、硅酸、苯酚；酸性物质引入量为水相体积0.01-5 v/v%。
6.根据权利要求2所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，步骤S1中所述搭载物为生物活性物质，包括活细胞、细菌、真菌、酶、蛋白质多肽类、纳米颗粒；当搭载物为pH敏感型物质时，所述缓冲溶液pH为4-8。
7.根据权利要求2所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述微流控法所用的微流控芯片为具有两个流体聚焦结构、T型混合结构、同心轴流体结构或X型结构的微通道或上述几种结构的组合，其中两个结构间距离为1-40mm；有至少3个液相输入口，至少一个乳化通道以及输出通道；所述微通道内壁表面需要进行疏水处理。
8.根据权利要求2所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述微流控法中水相溶液注入微流控芯片的流速为5-2000μL/h；油相溶液注入微流控芯片的流速为10-20000μL/h；缓冲液注入微流控芯片的流速10-20000μL/h；所述微流控法水相溶液注入微流控芯片中水相与油相的流速比为0.01~1；油相与清洗相流速比为1:0.5~20。
9.根据权利要求2所述的基于亚稳态油包水乳液一步法制备微纳米凝胶微球的方法，其特征在于，所述微流控法形成的水相液滴从第一水油共混通道到第二水油共混通道所经过的时间为1-10000毫秒；其中，液滴接触后，由表面活性剂带来的微液滴稳定时间为0.2-0.8秒。
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