CN103254307A - Hpv18e7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用 - Google Patents
Hpv18e7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了人乳头瘤病毒HPV高危致癌亚型HPV18单克隆抗体，是对SEQ IDNO：2所示的HPV18E7致癌蛋白能特异性结合的单克隆抗体，较佳地，采用SEQ IDNO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到，由保藏号为CGMCC No.5714的杂交瘤细胞株产生。还提供了相关的杂交瘤细胞株以及抗体的应用技术，用以检测生物标志物(biomarker)，特别是肿瘤细胞特异性表达的HPV致癌蛋白。本发明的HPV18E7单克隆抗体能特异性检测HPV18E7，可以作为高灵敏度、高特异性试剂，用于癌症检测方法的建立，如开发体外试剂盒产品。此抗体能特异性结合HPV病毒转化的宫颈癌细胞，可以用于进行癌症治疗的研究，开发靶向治疗药物。此抗体用于检测试剂特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和免疫学技术领域，更具体地，涉及单克隆抗体技术领域，特别是指一种HPV18E7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位。大量研究发现，人乳头瘤病毒HPV(human papilloma virus)是导致宫颈癌的元凶，还可以引起多种其它肿瘤，包括生殖道、乳腺、消化道及呼吸道癌症。HPV近年来在我国人群中的传播有增无减，故宫颈癌预防、治疗的研究工作非常重要。
1949年，Sttauss首先在电镜下于疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒(HPV)颗粒。在1976年zur Hansen提出HPV可能是性传播致癌因素之后，HPV感染与宫颈癌关系的研究成为肿瘤病毒病因研究的热门课题。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括6个早期开放读码框架，E1，E2，E4-E7共6个基因，负责编码病毒复制相关蛋白，2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的E6、E7蛋白引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。
高危亚型HPV的E6，E7蛋白导致正常上皮细胞转化成癌症细胞的因果关系已被科学证明。因此，需要提供一种HPV18E7单克隆抗体及分泌HPV18E7单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞能稳定分泌HPV18E7单克隆抗体，为进一步研究HPV18E7的功能，用于癌症治疗癌症检测和的研究奠定基础。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种HPV18E7单克隆抗体、相关制备方法、杂交瘤细胞株和应用，该HPV18E7单克隆抗体能特异性检测HPV18E7，可用于HPV18高危致癌病毒亚型的感染，及宫颈癌早期诊断的特异性检测。特异性高，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。
为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种HPV18E7单克隆抗体，其特点是，所述HPV18E7单克隆抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。
本发明中所述“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，对抗原的识别能力就强。因此，上述的HPV18E7单克隆抗体能够特异性识别和结合SEQ ID NO：2所示的蛋白。SEQ ID NO：2所示的蛋白可以直接合成，也可以通过基因工程方法制备。在本发明的一具体实施例中，SEQ ID NO：2所示的蛋白可以是由SEQ ID NO：1第1至312位核苷酸编码产生。
制备本发明的单克隆抗体所用的抗原是通过基因工程的方法获得，利用在原核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列SEQ ID NO：1。本领域的技术人员通常熟知适用于表达本发明的抗原的载体。可根据所选用的适当启动子和待表达的目的基因序列来选择适当的载体。可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。适当宿主的例子包括：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以是化学物质或环境刺激。
较佳地，所述单克隆抗体是采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。
更佳地，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的。
更进一步地，所述单克隆抗体对HPV18E7有特异性。
较佳地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.5714的杂交瘤细胞株产生。
在本发明的第二方面，提供了一种杂交瘤细胞株，其特点是，所述杂交瘤细胞株用于产生上述的HPV18E7单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.5714。
上述杂交瘤细胞株已保藏在国际保藏单位之一“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCCNo.5714，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期：2012年1月10日，分类命名为分泌抗HPV18E7单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
上述的HPV18E7单克隆抗体的制备方法采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原来制备的。
较佳地，所述已知标签是，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽S-转移酶(GST标签)、Trx标签、S-tag标签、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G标签。在本发明的一具体实施例中，所述已知标签是GST标签，与SEQ ID NO：2所示的蛋白形成GST-HPV18E7融合蛋白。
较佳地，所述融合蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从所述杂交瘤细胞的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。
更佳地，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.5714。
在本发明的一优选具体实施例中，以GST-HPV18E7融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。
筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化。得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。
在本发明的第三方面，提供了上述的HPV18E7单克隆抗体在制备检测和/或辅助诊断人乳头瘤病毒感染所致宫颈癌或其它人类癌症的诊断工具中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种免疫测定法，其特点是，所述免疫测定法采用上述的HPV18E7单克隆抗体。
较佳地，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。
在本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，其特点是，所述试剂盒包括上述的HPV18E7单克隆抗体。
对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，例如酶标试剂盒和/或快速检测试纸条等，是显而易见的。因此，也是本发明所要求保护的内容。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的HPV18E7单克隆抗体是对SEQ ID NO：2所示的蛋白有特异性的单克隆抗体，可以特异性地结合SEQ ID NO：2所示的蛋白，从而可用于HPV感染的宫颈癌细胞，其细胞表达HPV18E7蛋白，HPV18E7按克隆抗体可提供特异性检测，特异性高。
2、本发明的HPV18E7单克隆抗体对HPV18E7有特异性，从而可以进行由于HPV感染所致的人类正常细胞转化成癌前病变细胞(CIN)或癌细胞的特异性检测，弥补目前尚无HPV特异性检测方法之不足，利用HPV18E7单克隆抗体进行检测特异性高，反应灵敏。
3、本发明的免疫测定法和试剂盒可用于HPV阳性肿瘤细胞的种特异性检测，弥补目前尚无宫颈癌特异性检测方法之不足。HPV18E7单克隆抗体可以特异性结合肿瘤细胞中的生物标志物，HPV18E7蛋白。提供特异性高，反应灵敏，成本低诊断技术，适于高通量检测和大规模推广应用。
附图说明
图1是融合小鼠6次免疫后血清效价的ELISA检测结果。
图2是纯化后的HPV18E7单克隆抗体H11的SDS-PAGE鉴定结果，其中，E1-E6为不同批次洗脱的单克隆抗体的编号。
图3是纯化的HPV18E7单克隆抗体H11和F1分别与HPV18E7和HPV16E7L2的结合检测结果。
图4是SiHa，Hela细胞内源性HPV18E7的IP WB检测结果。
图5是HPV18E7单克隆抗体E8，F1，H11分别对HPV阳性宫颈癌细胞Hela进行免疫细胞化学染色实验的结果，其中A为阴性对照小鼠IgG，B为E8，C为F1，D为H11。
图6是HPV18E7单克隆抗体H11对宫颈鳞状细胞癌病理切片进行免疫组化实验的结果，其中A为阴性对照，B为H11mAb。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种HPV18E7单克隆抗体，该HPV18E7单克隆抗体对HPV18E7具有优异的特异性结合作用。在此基础上完成了本发明。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
1、实验材料和方法
1.1试剂和药品
弗氏完全、不完全佐剂(Freund’s Adjuvant complete or incomplete)；PEG(Polyethyleenglycol4000*PEG*Macrogolum 4,000lot # BCBCO873)，购自Fluka公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Goat anti-mouse IgG-HRP lot # 15-035-164)，购自Jackson公司；DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，lot # SH3002.01B)，购自HyClone公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；TMB(Tetramethylbenzidine)，购自Sigma公司；鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒(Mouse Monoclonal Antiboay IsotypingReagents，058K4836)；IHC试剂盒(Dako，EnVision+ System-HRP Labelled PolymerAnti-mouse，K4000)；其它相关试剂均为优级纯或分析纯。
1.2仪器与耗材
超净化工作台(Boxun购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；CO2恒温培养箱(德国Thermo)；超低温冰箱(Forma-86C德国Thermo)；YDS-50B-125型液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)；普通显微镜(XDS-1A)；电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；85-1恒温磁力搅拌器(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司)；台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司)；超纯水制备装置(美国MILLPORE公司)；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；WellWASK4MK2洗板机(购自Thermo公司)；96孔、24孔细胞培养板(NUNC公司)；96孔酶标板(NUNC公司)。单道、多道移液器(德国Eppendorf公司)；细胞培养瓶、改良牛鲍氏血细胞计数板等。
1.3细胞株、组织标本和动物
SP 2/0骨髓瘤细胞，细胞系SiHa，Hela：SP2/0由北京肿瘤医院寿成超老师实验室赠送，细胞系SiHa，Hela购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
组织切片：肿瘤切片购买于西安艾丽娜生物科技有限公司。
4～6周龄雌性BALB/c小鼠：购买于扬州大学实验动物中心。
1.4主要溶液系统
包被缓冲液(碳酸盐溶液)：取0.2mol/L Na2CO38mL，与0.2mol/L NaHCO317mL混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9.6。
稀释缓冲液(PBS，无钙和镁)：
洗涤缓冲液(PBS-Tween 20，0.5‰)：Tween-200.5mL，加入到1L稀释缓冲液
(PBS)中，搅拌混匀，调pH值到7.0～7.2之间。
20×底物使用液A：取TMB 21mg，充分溶解于5mL乙醇中。
100×底物使用液B：取尿素过氧化氢16.5mg，溶解于1mL双蒸水中。
终止液(2mol/L H2SO4)：双蒸水178.3mL，滴加浓硫酸(98％)21.7mL。
不完全DMEM培养基：购于Hyclone公司。
完全DMEM培养基：购于Hyclone公司。
HAT培养基：完全DMEM培养基99ml，加500×HAT贮存液1ml，无菌条件下配制。
1.5单克隆抗体的制备
1.5.1抗原制备：
制备原核表达载体表达GST-HPV18E7(见SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)作为免疫抗原，以His-HPV18E7(见SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列)作为检测抗原。其余涉及的检测原核蛋白序列为：GST-HPV16E7(见SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)，His-HPV16E7L2(见SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列)，HPV18E7-P1(见SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列)，HPV18E7-P2(见SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列)。
1.5.2小鼠免疫程序
以GST-HPV18E7为免疫原，免疫程序见表1。
表1小鼠免疫程序
注：在三免后7天采血测效价
1.5.3细胞融合与培养
1.5.3.1饲养层细胞的制备(融合前一天取小鼠腹腔巨噬细胞)
取8周龄以上ICR老鼠，脱颈椎致死，75％酒精浸泡5min；15ml离心管中加入10ml培养基；用高压灭菌剪刀、镊子撕开老鼠皮肤暴露腹膜，用5ml灭菌注射器吸取RPMI-DMEM 5ml；镊子提起腹膜，将培养基注入腹腔，轻轻按摩腹部1min，抽取培养基；将抽出的细胞铺入96孔板中。
1.5.3.2细胞融合
将骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞进行融合，融合比率脾细胞：SP2/0＝5∶1，融合细胞分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中选择性培养。融合后用HAT培养基全换液3次；待杂交瘤细胞长满一个显微镜视野时，进行ELISA检测。
1.5.3.3阳性杂交瘤的筛选
检测时，采用间接ELISA筛选：抗原选用His-HPV18E7融合蛋白，2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入杂交瘤上清并设置阳性(P)、阴性(N)及空白对照(空白直接加入酶标二抗)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。
ELISA筛选结果以OD值大于0.6的为出阳性孔，并进行复检。经过两次连续检测为阳性后，将该阳性孔细胞进行扩增，及时冻存和亚克隆。
1.5.3.4阳性孔的亚克隆、扩大培养及冻存
对于2次筛选都为阳性的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，取一块96孔细胞培养板，每孔中加入150μl HAT培养液；对需亚克隆的阳性孔轻轻吹打悬浮，吸取100μl细胞悬液加到96孔细胞板中，从第一孔开始倍比稀释。细胞计数选取孔中约有100个细胞的孔并加入到含有6ml HAT培养液的加样槽中，按100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加前三列；再补加HAT培养基3ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加中三列；再补加HAT培养基5ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加后六列。计算每块板的阳性率达到100％时，可以得到稳定细胞株。转移到细胞培养板中，扩大培养并大量冻存。
1.5.3.5单克隆抗体的大量生产(腹水制备)
大量培养杂交瘤细胞(H11)，以1×106Cells/只的量腹腔注射预先用液体石蜡致敏的8-10周龄的BALB/C雌性小鼠，10天左右后采集腹水，用His-HPV18E7包被通过ELISA检测腹水阳性及效价，将小鼠腹水2ml，利用Binding buffer稀释10倍。准备Protein G，将2ml beads加入柱中，同时利用200ml Binding buffer进行平衡。平衡后，轻轻地将样品加入柱中，流速控制在每分钟0.5ml/min。样品过柱后，进行Wash Step，利用10ml Binding buffer以及10ml Washing buffer进行清洗，最后的1ml清洗后的Washing buffer进行OD260，280蛋白浓度测定，以便证明清洗效果。进行洗脱之前，先在EP管中加入100μl Neutralizing Buffer，进行洗脱，加入Elution buffer，每次1ml，一共收取6ml，之后，再用10ml Elution buffer过度洗脱。再利用20ml Binding buffer(plus NaN30.05％)进行平衡后，储存在Binding buffer-NaN3。
1.5.4单克隆抗体的功能鉴定
1.5.4.1单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定
检测单克隆抗体对His-HPV18E7，His-HPV16E7L2两种蛋白的反应。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用His-HPV18E7和His-HPV16E7L2融合蛋白，抗原均2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入阳性克隆上清并设置阴性SP2/0(N)及空白对照(空白直接加入酶标二抗)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。
1.5.4.2单克隆抗体的亚型鉴定
采用Sigma公司的亚型鉴定试剂盒，货号为：058K4836。试验步骤按厂家说明书操作。
1.5.4.3单克隆抗体的抗原表位分析
1.5.4.3.1单克隆抗体抗原表位氨基酸序列区域分析
鉴定单克隆抗体在HPV18E7抗原蛋白中的表位氨基酸序列区域。采用ELISA方法进行鉴定：抗原选用HPV18E7-P1(见SEQ ID NO：7示的氨基酸序列)和HPV18E7-P2(见SEQ ID NO：8示的氨基酸序列)合成多肽，抗原均2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入单抗并设置空白对照(空白直接加入酶标二抗)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。
1.5.4.3.2单克隆抗体结合抗原位点分析
用两个不同的抗体对同一个抗原进行竞争结合试验，用于区分两个抗体是否结合同一抗原位点。用His-HPV18E7蛋白2μg/ml包板，加入HPV18抗体E8、F1、H11，起始浓度为1mg/ml，分别作如下比例稀释：E8，1∶2000稀释；F1，1∶6000稀释；H11，1∶4000稀释，100μl/孔。再分别取HPV18单抗3种抗体各50μl(E8，1∶1000稀释；F1，1∶3000稀释；H11，1∶2000稀释)：按E8+F1、E8+H11、F1+H11混合后，加入到另外3孔中，于37℃孵育1h。洗板，加HRP标记的羊抗鼠IgG，同上孵育及洗涤后，TMB显色，于波长450nm测定A值。按公式[(2A1+2/A1+A2)-1]×100％计算相加指数(AI)。A1+2为两种培养上清混合后的A值；A1、A2为1种培养上清的A值，当AI＞50％时，即认为是与不同表位的结合。
1.5.4.4单克隆抗体特异性鉴定Western blot：
1.5.4.4.1单克隆抗体的鉴定
用HPV18E7和HPV16E7原核表达的蛋白1μg/带上样，100V电压，转膜45min，5％脱脂奶粉室温封闭2小时，加入阳性杂交瘤上清4℃过夜，洗涤4次后加羊抗鼠-HRP，室温反应1h，DAB显色。
1.5.4.4.2肿瘤细胞内源IP
将SiHa、Hela细胞各两盘PBS洗两遍后离心弃上清，分别加入500μl Cell lystate冰上裂解1小时，加入HPV18E7纯化后的抗体2μg，4℃孵育两小时，再加入15μlprotein A/G beads 4℃冰箱过夜，第二天，beads直接上样，100V电压，转膜35min，5％奶粉封闭2h，加入纯化后的克隆H11蛋白，mIgG做阴性对照，4℃过夜，洗涤4次后加羊抗鼠-HRP，室温反应1h，DAB显色。
1.5.4.5单克隆抗体结合肿瘤细胞检测：免疫细胞化学染色(ICC)
选用宫颈癌细胞株Hela细胞对单克隆抗体进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：①Hela细胞分于96孔板中，贴壁生长2天；②4％多聚甲醛固定后用0.1％Triton、3％H2O2分别处理10min；③5％牛血清37℃封闭2小时后加入抗体(5μg/ml)，37℃反应2小时；④PBS洗3遍后加入羊抗鼠-HRP二抗1∶2000稀释，37℃反应1小时；⑤PBS洗3遍后DAB显色，37℃孵育10min，拍照。
1.5.4.6单克隆抗体结合肿瘤切片的检测：免疫组化(IHC)
选用多种癌症的病理切片对单克隆抗体进行检测。切片放入二甲苯中15分钟，然后依次放入无水乙醇、95％、90％、80％、70％的酒精中5分钟。将切片放入抗原修复液中，90℃以上15分钟。待冷却至室温后，使用1％Trion处理10分钟，再使用3％双氧水处理10分钟。室温封闭2小时。然后加入抗体(5μg/ml)，4℃过夜。轻轻洗3次，每次3分钟，加入EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-mouse，室温30分钟。轻轻洗5次，每次3分钟，加入DAB室温2-5分钟，水洗。苏木精复染2分钟，水洗。脱水依次放入70％、80％、90％、95％各2分钟、无水乙醇4分钟，在放入二甲苯中5分钟，封片，显微镜观察。
2结果
2.1融合小鼠阳性血清效价
请参见图1所示，经过6次免疫后，血清效价的ELISA检测达到1∶25,000以上。
2.2融合后筛选
共融合了10块96孔细胞板，融合率在50％左右，阳性率为3％(以OD≥0.5为阳性孔)，其中OD≥1.0的有4株，第二天进行ELSIA复检，挑选出9株阳性孔进行亚克隆。
2.3亚克隆后筛选
亚克隆细胞板经过两次全换液，ELISA检测结果：9株阳性孔中有4株转阴，其余5株仍为阳性，阳性率为55.5％。
2.4单克隆抗体anti-HPV18E7对HPV18E7蛋白的交叉反应性
用ELISA方法检测单克隆抗体株的细胞分泌液。His-HPV18E7和His-HPV16E7L2两种蛋白均用2μg/ml包板。结果发现：单克隆抗体株F1，H11，E8的细胞分泌液对HPV16型蛋白(E7L2)无交叉反应。结果总结见表2。其中单克隆抗体株H11(细胞株ATTO-11-H11)即是保藏号为CGMCC No.5714的杂交瘤细胞，保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏日期：2012年1月10日。
表2ELISA检测单抗对HPV16E7L2交叉反应
2.5克隆的亚型分析鉴定
请见表3，对3株克隆分泌的抗体进行亚型分析的结果为：F1，H11，E8的抗体为IgG1型。
表3单克隆抗体的亚型鉴定
| 抗体 | 亚型 |
| F1 | IgG1 |
| H11 | IgG1 |
| E8 | IgG1 |
2.6单克隆抗体抗原表位氨基酸序列区域分析
见表4，HPV16E7-P1和HPV18E7-P2多肽2μg/ml包被采用ELISA方法检测单克隆抗体的抗原结合。结果发现：单克隆抗体E8，F1，H11均能与包被的两个多肽结合，且与HPV18E7-P2的结合活性较好。因此，这三个单抗的结合位点位于HPV18E7的第41-58位氨基酸序列区域。又由于E8，F1，H11均能特异的结合HPV18E7而与HPV16E7不结合(见表2)，而HPV16E7与HPV18E7氨基酸序列的第33-43位完全一致，即AspSer Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly，因此推测这三个单抗抗原结合位点位于HPV18E7的第44-58位氨基酸区域之内。
2.7单克隆抗体抗原结合位点的分析
将3株mAb E8，F1和H11，进行抗体相加试验，并计算相加指数。结果表明，mAbE8和F1可识别不同的抗原表位；mAb H11可能与E8，F1各自识别的位点相邻，所以表现为识别同一种抗原表位(表5)。
表5mAb的抗原表位分析
2.8SDS-PAGE鉴定
纯化后单克隆抗体(H11抗体)经SDS-PAGE鉴定结果，得到纯度在95％以上的单抗H11抗体。如图2所示，抗体IgG的重链(HC)和轻链(LC)蛋白条带由箭头指示。
2.9Western blot鉴定
纯化2株克隆的蛋白做Western blot检测，其中mIgG做阴性对照，GST抗体做阳性对照，请参见图3，结果为：2株单抗均在36KDa处与重组蛋白HPV18E7有结合，与HPV16E7蛋白没有结合。
3.0细胞内源性HPV18E7的IP WB检测
利用HPV18E7单克隆抗体H11对SiHa，Hela细胞进行IP WB检测。内源HPV18E7的分子量为15kDa，结果表明SiHa细胞不存在内源性HPV18E7，因此在15kDa处没有条带，而Hela有内源性HPV18E7，因此在15kDa处有明显条带，图4中红色箭头所示位置。
3.1免疫细胞化学染色(ICC)鉴定
利用mIgG(阴性对照)，单克隆抗体E8，F1，H11对培养的宫颈癌Hela细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。其中A为阴性对照mIgG，B为E8mAb，C为F1mAb，D为H11mAb。结果表明单克隆抗体E8，F1，H11均能特异地使HPV18感染的宫颈癌细胞系染色而阴性对照mIgG则未能使细胞染色，并且在染色阳性的细胞中，HPV18E7位于细胞质和细胞核中，见图5。
3.2肿瘤切片免疫组化染色试验(IHC)
利用HPV18E7单克隆抗体H11对多种癌症病理切片进行免疫组化检测。结果表明单克隆抗体H11对宫颈鳞状细胞癌的石蜡切片标本在细胞浆内有阳性染色(在图6中呈现棕色染色，红色箭头所示)。此前已经通过HC2二代杂交捕获技术证实了这些标本已被HPV病毒感染。如图6所示，以不使用该单抗孵育的标本做为阴性对照(A)。而使用单克隆抗体H11孵育的标本呈现阳性染色结果(B)，进步一证实了此单抗与标本的HPV18E7是特异性结合。
综上所述，本发明的HPV18E7单克隆抗体能特异性检测HPV18E7，可用于HPV导致癌变细胞，包括癌前病变或宫颈癌细胞的特异性检测。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (10)
1.一种HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述HPV18E7单克隆抗体是对SEQ IDNO：2所示的蛋白能特异性结合的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用SEQ ID NO：2所示的蛋白与已知标签形成的融合蛋白作为抗原免疫动物得到的。
3.根据权利要求2所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是采用所述融合蛋白作为抗原免疫小鼠得到的。
4.根据权利要求3所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体对HPV18E7有特异性。
5.根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.5714的杂交瘤细胞株产生。
6.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株用于产生根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CGMCC No.5714。
7.根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体在制备检测和/或辅助诊断人乳头瘤病毒感染所导致的人类癌症疾病的诊断工具中的应用。
8.一种免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法采用根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫测定法，其特征在于，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1所述的HPV18E7单克隆抗体。
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