CN1800854B - 肾综合征出血热快速金标诊断试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于肾综合征出血热诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。其主要针对子HFRS诊断的截短NP重组抗原e112及可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体的HFRS快速金标诊断试纸条。利用基因克隆技术获得汉坦病毒的截短NP重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。快速金标诊断试纸条克服了现有HFRS诊断方法的局限性，可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体，可判断患者的感染状态，并对患者作出早期诊断，能够降低病死率，提高治愈率。此外，由于金标试纸条无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，适用于大规模的血清流行病学调查。

Description

肾综合征出血热快速金标诊断试纸条

技术领域

本发明涉及疾病诊断的抗原，具体说是一种用于肾综合征出血热诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。 

背景技术

汉坦病毒(Hantaviruses，HV)流行范围广泛、危害严重，已成为一个全球性的公共卫生问题。由HV感染引起的肾综合征出血热(hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS)是一组以发热、出血和肾脏损害为主要临床表现的急性传染病。疫区分布于亚洲、欧洲、非洲和美洲32个国家和地区，但主要流行于亚洲的我国和韩国，次为欧洲的俄罗斯、芬兰和前南斯拉夫等国，非洲和美洲的病例较少；疫源地则遍及世界五大洲70余个国家。在中国，HFRS是除病毒性肝炎之外危害最大的病毒性传染病，其发病人数占世界发病总数90％以上。 

1978年韩国学者李镐汪等率先成功地分离到HFRS的病原——HV，并建立了检测抗原和抗体的特异性免疫荧光技术，使HFRS防治的研究进入了一个新的阶段。在血清学检测和实验研究中，目前已经建立了一系列技术方法，如间接免疫荧光法(IFA)、免疫酶联吸附实验(ELISA)、血凝抑制试验(HI)、空斑减少中和试验(PRNT)等。但是，就实验室诊断而言，目前在国内应用最普遍的仍属IFA。IFA具有很好的敏感性和特异性，但需要荧光显微镜和训练有素的专业人员，难以在农村、基层医院及现场使用。总的来说，近年问世的各种HV基因、抗原和抗体的检测新技术尚不够稳定，有些方法较为复杂，操作流程长，难以在基层单位或工作现场应用；此外，国内HFRS检测试剂或药盒的标准化和商品化率还较低。因此，急需建立一种快速、简便、特异、敏感、稳定和规范的，并能满足不同需要的早期诊断方法。 

研究发现汉坦病毒核衣壳蛋白上含有属特异性、型特异性、组特异性和病毒株特异性抗原位点。N蛋白的N未端100aa(氨基酸)主要是亲水性的，具有免疫优势，存在交叉反应性的线性抗原表位。近年来随着分子生物学技术的发展， 新的病毒学检测方法不断被应用于HFRS防治研究中，如应用重组HV核衣壳蛋白(NP)替代从细胞培养或乳鼠鼠脑制备的病毒抗原，具有安全、省时、易于纯化和标化等优点，而且汉坦病毒的核衣壳蛋白同源性最高，抗原性最保守，免疫原性强，且容易表达，患者对该蛋白的抗体应答产生早而且滴度高。因而，可以运用重组的NP抗原进行HFRS血清学诊断。 

胶体金是一种处于半还原状态的悬浮颗粒，能迅速吸附蛋白质等大分子而不影响其活性，胶体金具有易分辨的红至紫红色，在与大分子结合后，易于用肉眼识别，不需二级放大即可直接观察结果，胶体金诊断产品因而可直接进入没有复杂检测设备的诊所甚至家庭里。近年来，以早孕检测试纸为代表的胶体金免疫诊断试剂已进入千家万户，给人们的生活带来很大的方便。 

从包括中国专利等有关资料检索表明，目前尚未有利用基因工程方法获得高表达、高活性的截短NP重组抗原用于肾综合征出血热的诊断及可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体的HFRS金标快速诊断试纸条的相关报道。 

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是要提出一种用于HFRS诊断的截短NP重组抗原e112及可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体的HFRS快速金标诊断试纸条。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一.溶液配方： 

(1)重组抗原溶解液：SDS       0.1％ 

                   甘氨酸    250mmol/L 

                   Tris.Cl   25mmol/L 

(2)胶体金溶液：0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒； 

(3)二抗：羊抗人IgG单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠IgG单抗由厦门波生生物技术有限公司研制； 

(4)包被缓冲液：含1～3％蔗糖的磷酸盐缓冲液； 

(5)基础缓冲液：由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋 白的缓冲液； 

(6)反应缓冲液：含0.01～0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液； 

(7)磷酸盐缓冲液(PBS)：为在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。 

二.本发明重组抗原的工艺流程： 

(1)本研究所用的汉坦病毒株A₅₃₇是1985年在福建省周宁县HFRS疫区捕获的一黑线姬鼠肺组织中应用Vero E6细胞直接分离出汉坦病毒株A₅₃₇； 

(2)以汉坦病毒株A₅₃₇基因组为模板，以P₁₄为逆转录引物、₄S₁/S₂为PCR扩增引物，用逆转录PCR法常规扩增得到S基因全长片段，其大小为1696bp，用TA克隆技术将此大片段克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组质粒TA-A₅₃₇； 

(3)以该重组质粒TA-A₅₃₇为模板，以P₁、P₁₁₂为引物(p1为正向引物，添加了NcoI酶切位点；p112为反向引物，添加了Sal I酶切位点和终止密码子tta)，从中扩增出长度约330bp的截短片段p1-112，将此片段定向插入原核表达载体pET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；Western blot证实该重组抗原e112能被HFRS患者阳性血清所识别，以上所用引物见表1； 

表1  汉坦病毒克隆、表达所应用的引物 

(4)克隆基因p1-112的核酸序列及其所编码的氨基酸序列： 

1  ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG   45 

1  Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu   15 

46 GTG ATA GCC AGG GAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA   90 

16 Val Ilc Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu   30 

91 AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA  135 

31 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu   45 

136  GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG    180 

46   Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg     60 

181  CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CTT GGG AAA GAA    225 

61   Gln Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu     75 

226  CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA    270 

91   Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg    105 

271  TCA ATG CTT AGT TAT GGA AAT GTA TTG GAT TTG AAC CAC CTG GAT    315 

91   Scr Mct Lcu Scr Tyr Gly Asn Val Lcu Asp Lcu Asn His Lcu Asp    105 

316  ATT GAT GAG CCT TAA  330 

106  Ile Asp Glu Pro End 110 

(5)采用电洗脱方法纯化重组蛋白：对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎后，将超声上清先经过饱和硫铵沉淀粗纯后，取饱和硫铵沉淀物进行SDS-PAGE电泳，用0.3mol/L CuCl₂进行染色确定目标蛋白带e112在凝胶中的位置，切下目标蛋白带e112，置于透析袋中进行电洗脱；纯化蛋白进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。 

三.本发明的试纸条制作工艺 

(1)以胶体金标记重组抗原e112和鼠IgG； 

(2)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干； 

(3)羊抗人μ链单抗1.0～5.0mg/ml、羊抗人IgG单抗1.0～5.0mg/ml与羊抗鼠IgG单抗1.0～5.0mg/ml包被NC膜，自然晾干； 

(4)将吸水纸、NC膜和吸附了金标抗原的玻璃纤维组装成检测IgM、IgG的金标试纸条。 

用本发明制作的重组抗原e112及利用重组抗原制作成的HFRS快速金标诊断试纸条就可以用于HFRS临床诊断。 

本发明的有益效果是：本发明利用基因工程技术，克隆汉坦病毒的免疫优势抗原的结构基因，并在大肠杆菌内表达，以方便地获得大量廉价的重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。由此方法得到的重组抗原及快速诊断试纸条克服了现有HFRS诊断方法的局限性，具有很高的灵敏度、特异度，而且可以同时检 测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体。这对判断患者的感染状态，及对患者作出早期诊断，以赢得最佳的治疗时间，降低病死率及提高治愈率无疑具有重要的意义。此外，由于金标试纸条无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，适用于大规模的血清流行病学调查。 

附图说明

图1是本发明的快速金标诊断试纸条。 

图中1对照线，2IgM，3IgG，4加样处。 

具体实施方式

实施例1： 

一、重组抗原的制备 

1、本研究所用的汉坦病毒株A₅₃₇是从1985年在福建省周宁县HFRS疫区捕获的一黑线姬鼠肺组织中应用Vero E6细胞直接分离的毒株； 

2、取病毒感染上清，用Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取试剂盒提取病毒RNA。 

3、用P₁₄逆转录引物及S₁/S₂PCR扩增引物从汉坦病毒A₅₃₇株基因组中扩增出全长的S基因共1696bp。RT-PCR反应体系如下： 

逆转录：20μl反应体系包含以下成份 

逆转录反应条件：室温10min，42℃逆转录1h，96℃5min，置冰上5min，cDNA冻存于-20℃ 

PCR：50μl反应体系包含以下成份 

PCR扩增反应条件：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃2min，35cycles；72℃10min 

4、采用QIAquick Gel extraction试剂盒对扩增产物进行纯化。用TA克隆技术将纯化后的PCR产物直接克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组克隆质粒，命名为TA-A₅₃₇； 

5、以该重组克隆质粒TA-A₅₃₇为模板，用P₁/P₁₁₂引物扩增出长度约330bp的片段p1-112，将扩增得到的截短片段p1-112及原核表达载体pET-30a分别用NcoI和Sal I双酶切，并用QIAquick Gel extraction试剂盒纯化回收产物。 

6、将目的基因片段与表达载体pET-30a进行定向连接，从而构建重组表达质粒，命名为pET-112： 

按TaKaRa DNA连接试剂盒(Version2.1)操作说明书进行。 

①将质粒载体DNA(0.03pmol)与插入DNA片段(0.1～0.3pmol)混合制备成体积为5μl～10μl的DNA溶液。 

②向上述DNA溶液中加入等体积的Solution I，混合均匀。 

③16℃反应30min～2h。 

④取10～20μl上述连接反应液转化100μl相应的感受态细胞BL21(DE3)。 

7、重组表达质粒的鉴定：筛选阳性克隆，以Sal I单酶切，Nco I、Sal I双酶切对重组表达质粒进行酶切鉴定，筛选阳性克隆。 

8、重组蛋白的诱导表达： 

(1)挑单菌落于5ml含Kan+(30ug/ml)的LB培养液中，37℃250rpm/min过夜培养； 

(2)将过夜培养的含重组质粒的表达菌以1∶100扩种。 

(3)表达菌生长到OD值约0.8时，加入IPTG使终浓度为1mM，37℃诱导4h。 

(4)菌液用4℃8000rpm/min，离心5min收集菌体，沉淀倒置扣干备用。 

9、对诱导前后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定表达效果 

10、对重组抗原进行Western blot鉴定表达产物的抗原活性 

11、用电洗脱方法纯化重组抗原： 

(1)细菌的裂解(超声波粉碎法) 

①将1500ml表达菌液于4℃，6000r/min，离心10min。 

②Buffer I 100ml悬浮沉淀，置冰浴上，350W超声粉碎20min(2sec超声，5sec间隔)。 

Buffer I(pH 7.2)：5mM     EDTA 

                  20mM    Tris.Cl 

                  150mM   NaCl 

③4℃，12000r/min，离心10min，取少量沉淀和上清进行SDS-PAGE，确定目标蛋白位置及纯度，可溶性蛋白存在于上清中。 

(2)饱和硫铵沉淀： 

①将上述细菌裂解上清转移到烧杯中，置冰浴上，放在磁力搅拌器上边搅拌边加饱和硫铵(S_终为10％)，流速控制在1ml/min。混合液置4℃冰箱静置过夜或＞4h。以防因局部硫铵浓度过高而使蛋白在局部浓缩沉淀。 

饱和硫铵加样量 

(X为细菌裂解液体积，S为饱和硫铵浓度) 

②取出混合液，4℃，12000r/min，离心10min。留取上清，沉淀用少量去离子水重悬，于4℃冰箱保存。 

③测量下上清体积，并将上清移到烧杯中，按上述公式计算所需加入的饱 和硫铵的量(S_终为20％)。置冰浴上，边搅拌边缓慢地加入饱和硫铵，混合液置4℃冰箱静置过夜或＞4h。 

④重复2～3步骤，但S_终为30％，以此类推，每次饱和硫铵加样量递增10％。直到几乎所有目标蛋白出现沉淀为止。 

(3)电洗脱 

①配制分离胶8块，积层胶不加梳子，留出位置用于加样。 

②对大量诱导时收集的菌体进行超声粉碎。 

③超声上清先经过饱和硫铵沉淀粗纯后，取饱和硫铵沉淀物加6×加样缓冲液上样，每板加6ml，注意不要有气泡。 

④SDS-PAGE：先80V电泳，当样品后沿进入分离胶后，升至110-120V，电泳过夜。 

⑤切胶：取下胶，约在胶的纵向1/3处切一小条胶进行CuCl₂染色。约3min后，将凝胶小条取出，重新放置于原来的位置，观察目标条带在凝胶中的位置，切下目标条带，置于1×SDS电泳缓冲液中。 

CuCl₂染色： 

染色液：        0.3M CuCl₂

脱色液(pH 9.0)：0.25M EDTA 

                0.25M Tris.Cl 

⑥将胶条分成3段，置于透析袋中，并加入1×SDS电泳缓冲液，以浸没胶为宜，置于水平电泳槽上电泳。电洗脱12h，每4h吸出透析袋中的溶液，更换新的电泳缓冲液(共3次)，吸出的液体即为洗脱出的纯化蛋白溶液。 

⑦纯化样品进行SDS-PAGE，确定纯度。 

⑧蛋白定量：参照DU530核酸蛋白分析仪说明书进行。 

①在主菜单上选择蛋白分析程序。 

②选择UV280方法测定蛋白浓度。 

③以牛血清白蛋白(BSA)为参考蛋白，以溶解待测定蛋白的溶液配制一系列浓度的BSA溶液，测定其OD值，建立标准曲线。 

④以溶解BSA的溶液调零。 

实施例2： 

HFRS金标快速诊断试纸条的制作 

(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液25ml，继续煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由有蓝经紫变红后，自然冷却后备用； 

(2)取胶体金溶液1ml，加入0.2M K₂CO₃ 10μl、50μg纯化抗原，搅匀后静置1h； 

(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,000 15μl，8,000r/min，离心8min，弃上清； 

(4)将沉淀悬浮于1ml基础缓冲液中，即为金标抗原溶液； 

(5)同法标记鼠IgG； 

(6)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干； 

(7)羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、羊抗人μ链单抗2.0mg/ml、羊抗人IgG单抗2.0mg/ml，分别在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干； 

(8)在约10cm宽的底板上，将吸水纸、NC膜、吸附了金标抗原的玻璃纤维和未吸附抗原的玻璃纤维组装成检测IgM与IgG的试纸条。 

评价：将血清或血浆10ul+90ul PBS进行1∶10稀释后，取至少60ul的样本稀释液加到样品吸收处，5-10分钟内观察金标抗原释放后NC膜上检测线和对照线的反应情况，检测线和对照线同时出现红色条带判为阳性，仅对照线出现红色条带判为阴性，对照线未出现条带为无效试验，具体判断方法见表2。 

表2  金标诊断试纸条的判断原则 

用HFRS金标试剂条对福建(家鼠型为主)、江苏(混合型)、山西(家鼠型为主)、陕西(姬鼠型为主)四省疾控中心保存的肾综合征出血热阳性、阴性血清共828份进行检测。以IFAT/ELISA为参照标准，HFRS金标试剂条的敏感性为97.9％，特异性为98.2％，总一致率为98.1％。这充分显示出该金标试剂条具有很高的灵敏度、特异度，而且具有操作简便、快速，不需要特殊仪器设备，结果易于观察，便于保存和运输等优点，非常适用于各种层次尤其是基层医疗单位、农村卫生院等缺乏实验条件和专业人员的地方开展此项工作。

p1-112.ST25.txt 

SEQUENCE LISTING 

<110>福建省疾病预防控制中心 

<120>肾综合征出血热快速金标诊断试纸条 

<130>Hujakka H，Koistinen V，Kuronen I，et al.Diagnostic rapid tests for acute hantavirus 

infections：specific tests for 

hantaan，Dobrava and Puumala viruses a hantavirus combination test[J].J Virol Methods.2003 

Mar，108(1)：117-22. 

<140>200510099746.3 

<141>2005-09-05 

<160>1 

<170>PatentIn verslon3 .1 

<210>1 

<211>330 

<212>DNA 

<213>Hantaan virus 

<220> 

<221>exon 

<222>(1)..(330) 

<223> 

<400>1 

atg gag gaa ctg cag agg gaa atc aat gcc cat gag ggt caa ctg gtg      48 

Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu Val 

1               5                   10                  15 

ata gcc agg cag aag gtg agg gat gca gaa aaa caa tat gaa aag gat      96 

Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu Lys Asp 

            20                  25                  30 

cca gat gag ctg aat aaa aga aca tta aca gac aga gaa ggg gtt gca      144 

Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu Gly Val Ala 

        35                  40                  45 

gca tct atc cag gcc aag att gat gaa ttg aaa agg cag tta gca gat      192 

Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg Gln Leu Ala Asp 

    50                  55                  60 

agg att gca acc gga aag aac ctt ggg aaa gaa cag gat ccc aca ggg      240 

Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu Gln Asp Pro Thr Gly 

65                  70                  75                  80 

gtt gag cct gga gac cat ctg aaa gag aga tca atg ctt agt tat gga      288 

Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg Ser Met Leu Ser Tyr Gly 

                85                  90                  95 

aat gta ttg gat ttg aac cac ctg gat att gat gag cct taa              330 

Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp Ile Asp Glu Pro 

            100                 105 

Claims (7)

1.一组肾综合征出血热快速金标诊断试纸条的溶液组分，其特征是：

(1)重组抗原溶解液：        SDS             0.1％

                           甘氨酸          250mmol/L

                           Tris.Cl         25mmol/L

其中，重组抗原为重组抗原e112，其核酸序列及其所编码的氨基酸序列为：1   ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG    451   Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu    1546  GTG ATA GCC AGG CAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA    9016  Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu    3091  AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA    13531  Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu    45136 GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG    18046  Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg    60181 CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CTT GGG AAA GAA    22561  Gln Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu    75226 CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA    27076  Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg    90271 TCA ATG CTT AGT TAT GGA AAT GTA TTG GAT TTG AAC CAC CTG GAT    31591  Ser Met Leu Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp    105316 ATT GAT GAG CCT TAA                                            330106 Ile Asp Glu Pro End                                            110

(2)胶体金溶液：0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒；

(3)二抗：羊抗人IgG单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠IgG单抗；

(4)包被缓冲液：含1～3％蔗糖的磷酸盐缓冲液；

(5)基础缓冲液：由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的缓冲液；

(6)反应缓冲液：0.01～0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液；

(7)磷酸盐缓冲液：为在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。

2.制备肾综合征出血热快速金标诊断试纸条重组抗原e112的工艺流程，其特征是：

(1)从一黑线姬鼠肺组织中应用Vero E6细胞直接分离出汉坦病毒株A₅₃₇；

(2)以汉坦病毒株A₅₃₇基因组为模板，以P₁₄为逆转录引物、S₁/S₂为PCR扩增引物，用逆转录PCR法常规扩增得到S基因全长片段，其大小为1696bp，用TA克隆技术将此片段克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组质粒TA-A₅₃₇；

(3)以该重组质粒TA-A₅₃₇为模板，以P₁、P₁₁₂为引物，从中扩增出长度约330bp的截短片段p1-112，将片段定向插入原核表达载体pET-30a，构建重组表达质粒pET-112，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；蛋白免疫印迹实验证实该重组抗原e112能被HFRS患者阳性血清所识别；

截短片段p1-112表达的重组抗原e112的核酸序列及其所编码的氨基酸序列为：1   ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG  451   Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu  1546  GTG ATA GCC AGG CAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA  9016  Val Ile Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu  3091  AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA  13531  Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu  45136 GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG  18046  Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys Ile Asp Glu Leu Lys Arg  60181 CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CTT GGG AAA GAA  22561  Gln Leu Ala Asp Arg Ile Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu  75226 CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA  27076  Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp His Leu Lys Glu Arg  90271 TCA ATG CTT AGT TAT GGA AAT GTA TTG GAT TTG AAC CAC CTG GAT  31591  Ser Met Leu Ser Tyr Gly Asn Val Leu Asp Leu Asn His Leu Asp  105316 ATT GAT GAG CCT TAA                                          330106 Ile Asp Glu Pro End                                          110

(4)采用电洗脱方法纯化重组蛋白：对大量诱导时收集的菌体进行超声破碎后，将超声上清先经过饱和硫酸铵溶液沉淀粗纯后，取饱和硫酸铵沉淀物进行SDS-PAGE电泳，用0.3mol/L CuCl₂进行染色确定目标蛋白带e112在凝胶中的位置，切下目标蛋白带e112，置于透析袋中进行电洗脱；纯化蛋白进行SDS-PAGE，确定纯度并进行蛋白定量。

3.根据权利要求2所述的RT-PCR反应体系，其特征是：

逆转录：20μl反应体系包含以下成份

逆转录反应条件：室温10min，42℃逆转录1h，96℃5min，置冰上5min，cDNA冻存于-20℃

PCR：50μl反应体系包含以下成份

PCR扩增反应条件：94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃2min，35cycles；72℃10min。

4.根据权利要求2所述的汉坦病毒克隆、表达所应用的引物，P₁为正向引物，添加了Nco I酶切位点；P₁₁₂为反向引物，添加了Sal I酶切位点和终止密码子tta，其特征是：

5.根据权利要求2所述的重组蛋白e112，其重组蛋白e112诱导表达：

(1)挑取含重组表达质粒pET-112的单菌落于5ml含Kanamycin，30μg/ml的LB培养液中，37℃250r/min过夜培养；

(2)将过夜培养的含重组质粒的表达菌以1∶100扩种；

(3)表达菌生长到OD值约0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃诱导4h；

(4)菌液用4℃8000r/min，离心5min收集菌体，沉淀倒置扣干，备用。

6.根据权利要求2所述的用电洗脱方法纯化重组抗原，其特征是：

(1)用超声波破碎法裂解细菌

①将1500ml表达菌液于4℃，6000r/min，离心10min；

②Buffer I 100ml悬浮沉淀，置冰浴上，350W超声破碎20min，2s超声，5s间隔；

Buffer I，pH 7.2：      5mM     EDTA

                        20mM    Tris.Cl

                        150mM   NaCl

③4℃，12000r/min，离心10min，取少量沉淀和上清进行SDS-PAGE，确定目标蛋白位置及纯度，可溶性蛋白存在于上清中；

(2)饱和硫酸铵沉淀：

①将上述细菌裂解上清转移到烧杯中，置冰浴上，放在磁力搅拌器上边搅拌边加饱和硫酸铵溶液，S_终为10％，流速控制在1ml/min；混合液置4℃冰箱静置过夜或＞4h；以防因局部硫酸铵浓度过高而使蛋白在局部浓缩沉淀；

X为细菌裂解液体积，S为饱和硫酸铵浓度

②取出混合液，4℃，12000r/min，离心10min；留取上清，沉淀用少量去离子水重悬，于4℃冰箱保存；

③测量上清体积，并将上清移到烧杯中，按上述公式计算所需加入的饱和硫酸铵的量，S_终为20％；置冰浴上，边搅拌边缓慢地加入饱和硫酸铵，混合液置4℃冰箱静置过夜或＞4h；

④重复2～3步骤，但S_终为30％，以此类推，每次饱和硫酸铵加样量递增10％。直到几乎所有目标蛋白出现沉淀为止；

(3)电洗脱

①配制分离胶8块，积层胶不加梳子，留出位置用于加样；

②对大量诱导时收集的菌体进行超声破碎；

③超声上清先经过饱和硫酸铵沉淀粗纯后，取饱和硫酸铵沉淀物加6×加样缓冲液上样，每板加6ml，注意不要有气泡；

④SDS-PAGE：先80V电泳，当样品电泳入分离胶后，将电压升至110-120V，电泳过夜；

⑤切胶：取下胶，约在胶的纵向1/3处切一小条胶进行CuCl₂染色；约3min后，将凝胶小条取出，重新放置于原来的位置，观察目标条带在凝胶中的位置，切下目标条带，置于1×SDS电泳缓冲液中；

CuCl₂染色：

染色液：             0.3M CuCl₂

脱色液，pH 9.0：     0.25M EDTA

                     0.25M Tri s.Cl

⑥将胶条分成3段，置于透析袋中，并加入1×SDS电泳缓冲液，以浸没胶为宜，置于水平电泳槽上电泳；电洗脱12h，每4h吸出透析袋中的溶液，更换新的电泳缓冲液，共3次，吸出的液体即为洗脱出的纯化蛋白溶液；

⑦纯化样品进行SDS-PAGE，确定纯度；

⑧蛋白定量：

a.选择蛋白分析程序；

b.选择UV280方法测定蛋白浓度；

c.以牛血清白蛋白为参考蛋白，以溶解待测蛋白的溶液配制一系列浓度的牛血清白蛋白溶液，测定其OD值，建立标准曲线；

d.以溶解待测蛋白的溶液调零，取50μl待测蛋白溶液，测定其蛋白浓度。

7.肾综合征出血热快速金标诊断试纸条的制作工艺，其特征是：

(1)取0.03％四氯金酸1000ml，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液25ml，继续煮沸5min，待胶体金溶液颜色由有蓝经紫变红后，自然冷却后备用；

(2)取胶体金溶液1ml，加入0.2M K₂CO₃10μl、50μg根据权利要求2所述工艺制备的纯化重组抗原e112，搅匀后静置1h；

(3)加入20％牛血清白蛋白25μl、20％PEG 20,00015μl，8,000r/min，离心8min，弃上清；

(4)将沉淀悬浮于1ml基础缓冲液中，即为金标抗原溶液；

(5)同法标记鼠IgG；

(6)两种金标抗原溶液混合后充分浸润玻璃纤维纸，置冻干机冻干；

(7)羊抗鼠IgG单抗3.0mg/ml、羊抗人μ链单抗2.0mg/ml、羊抗人IgG单抗2.0mg/ml，分别在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干；

(8)在约10cm宽的底板上，将吸水纸、NC膜、吸附了金标抗原的玻璃纤维和未吸附抗原的玻璃纤维组装成检测IgM与IgG的试纸条。

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