CN105785000A - 一种快速检测流行性出血热病毒IgM抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测流行性出血热病毒EHF‑IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。利用胶体金免疫层析技术原理，待检待样品中的EHF‑IgM抗体与样品垫中的胶体金标记EHFV特异性重组抗原结合，通过层析作用与硝酸纤维素膜上的抗EHFV重组抗原的多克隆抗体和抗鼠IgM抗体结合，出现肉眼可见的红色沉淀，以此来判断流行性出血热病毒EHF‑IgM抗体是否存在。本发明的试剂盒，能在5‑15分钟内得到检测结果，操作简单，灵敏度高，有很好的临床推广意义。

Description

一种快速检测流行性出血热病毒IgM抗体的试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地涉及一种快速检测流行性出血热病毒IgM抗体的试剂盒。
背景技术
流行性出血热又称肾综合征出血热，是由汉坦病毒引起的自然疫源性疾病。具有发热、出血、肾损害三大主要特征。流行广，病情危急，病死率高，危害极大。老鼠(黑线姬鼠)是主要的传染源，可经过多种途径传播给人。流行性出血热病毒(EHFV)属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，汉坦病毒属(Hantavirus，HV)，现统称汉坦病毒(HV)。流行性出血热毒为有膜RNA病毒，形态有圆形，卵圆形和长形三种，病毒核心为基因组RNA和核壳，外层为脂质双层包膜，表面是糖蛋白，直径70～210nm。
流行性出血热发病地域广泛，主要分布于欧亚两大洲，包括中国、朝鲜、日本、原苏联、苏兰、丹麦、瑞典、挪威、荷兰、波兰、捷克、斯洛伐克、匈牙利、罗马尼亚、保加利亚、南斯拉夫、希腊、瑞士、比利时、英国和法国等。近些年，在中国的发病率一直呈上升趋势，鼠类是主要传染源，在我国农村的主要传染源是黑线姬鼠和褐家鼠。东北林区的主要传染源是大林姬鼠。城市的主要传染源是褐家鼠，实验动物室的主要传染源是大白鼠。此外，黄胸鼠、小家鼠、巢鼠、普通田鼠等亦可为流行性出血热的传染源。发病机理主要是一方面病毒感染能导致感染细胞功能和结构的损害，另一方面病毒感染诱发人体的免疫应答和各种细胞因子的释放，既有清除感染病毒，保护机体的作用，又能引起机体组织损伤的不利作用。一般认为汉坦病毒进入人体后随血流到达全身，病毒首先与血小板、内皮细胞和单核细胞表面表达的受体p3整联蛋白相结合，然后进入细胞内以及肝、脾、肺、肾等组织，进一步复制后再释放进入血流，引起病毒血症，由于病毒感染和感染后诱发的免疫反应，以及多种细胞因子的释放，导致细胞变性、坏死或凋亡，因而器官功能受损。由于汉坦病毒对人体呈泛嗜性感染，因而能引起多器官损害。
目前对EHFV的检验主要是实验室检查：血象白细胞总数增高，分类中淋巴细胞增多，并有异常淋巴细胞，血小板数下降，尿检有蛋白、红细胞、白细胞、管型等，这些只能对EHFV起到辅助诊断的作用，检测周期长，准确率低，近些年来血清学方法检测有助于病人早期诊断，对临床不典型的病人尤有助于诊断，因此人体血清中的EHF-IgM抗体阳性对流行性出血热有很好的确诊价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速检测流行性出血热病毒IgM抗体的试剂盒。本发明所提供的检测试剂盒利用胶体金免疫层析技术，快速直观的检测出EHFV中IgM抗体从而有利于流行性出血热患者的早期诊断。
本发明的技术方案为：一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。
进一步的，所述的底板为PVC材料制得，PVC作为医用材料，具有良好的生物相容性，不致畸致癌，不引起过敏反应，还有很好的血液相容性、溶血性低、抗凝血性好；所述硝酸纤维素膜上分别设有包被抗EHFV重组抗原的多克隆抗体的检测线和包被有抗鼠IgM抗体的质控线，所述检测线采用抗EHFV重组抗原的多克隆抗体浓度为0.5～0.8mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用抗鼠IgM抗体浓度为1.0～1.5mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为玻璃纤维素膜。
一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒的制备方法为：
(1)胶体金溶液制备：将容器用纯化水清洗干净后，在35-45℃温度下烘干，加入1wt％氯金酸水溶液加热至沸腾，再按0.5～0.8％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，胶体金溶液由灰白色逐渐变成紫色，继续沸煮，胶体金溶液变成红色调后，停止加热并冷却，使用0.1-0.5mol/LK2CO3溶液调节pH至8.0-9.0，备用；所述的胶体金颗粒粒径为25纳米～40纳米；
(2)样品垫制备：
a.用PBS缓冲液将EHFV特异性重组抗原稀释至蛋白含量为0.3-0.5mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液是将Na2HPO40.5g，NaCl7.5g，KH2PO41.5g，加850mL去离子水约充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.5，最后定容到1L。再将稀释液在5℃条件下3000r/min离心15-30min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到(1)制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，加入稳定剂8％BSA溶液，在5℃条件下3000r/min离心30-45min，静置5-8h后，给得到的沉淀物中加入缓冲液充分溶解，再在5℃条件下1800r/min离心15min，去除聚集物，留上清液，再次将上清液在5℃条件下2400r/min离心30min，重悬底部疏松沉淀，即得到胶体金标记的EHFV特异性重组抗原；
b.将标记好胶体金的EHFV特异性重组抗原溶液均匀以5cm/秒的速度喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，再将玻璃纤维素膜粘贴在保护垫上，即制得所述的样品垫。
(3)硝酸纤维素膜制备：将抗EHFV重组抗原的多克隆抗体稀释成浓度为0.5～0.8mg/mL的包被液，将抗鼠IgM抗体稀释成浓度为1.0～1.5mg/mL的包被液，将稀释好的抗鼠IgM抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的MP蛋白均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃干燥4h，形成样品带和质控带，封存，即得到所述的硝酸纤维素膜。
(4)试剂盒制备：给PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴样品垫，样品垫上有观测孔，硝酸纤维素膜和样品垫之间相互交叠0.2mm，按3-5mm的宽度切为小条，制得试剂条，将试剂条放在塑料壳体中，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒。
本发明试剂盒的使用方法：将待检测血清50μl滴于检测卡的样品垫上，在15～25℃的环境中，5～15min之内观察色变情况，若待检样品中含有EHF-IgM抗体，则与样品垫中的胶体金标记EHFV特异性重组抗原结合，通过层析作用与硝酸纤维素膜上的抗EHFV重组抗原的多克隆抗体结合后，会形成肉眼可见的一条红色检测线，未结合完的胶体金标记抗体继续层析与和抗鼠IgM抗体结合后亦形成肉眼可见的第二条红色质控线；若待检样品中无EHF-IgM抗体，则仅出现一条红色质控线；若红色质控线未出现，则该检测试剂盒失效。
本发明的试剂盒的有益效果体现在：该试剂盒是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作EHF-IgM抗体检测试剂盒，由于人体感染流行性出血热病毒后不久，在血清中就可检测到IgM抗体，在7-10天内达高峰，因此EHF-IgM的测定对诊断早期流行性出血热感染有重要价值，此方法可以将流行性出血热的检测推广到更基层的医疗机构，从而能更早地诊断流行性出血热病毒的感染。
具体实施方式
实施例1：一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。
其中，所述的底板为PVC材料制得，购自上海金标生物科技有限公司，PVC作为医用材料，具有良好的生物相容性，不致畸致癌，不引起过敏反应，还有很好的血液相容性、溶血性低、抗凝血性好；所述吸水垫购自上海金标生物科技有限公司；所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司，硝酸纤维素膜上分别设有包被抗EHFV重组抗原的多克隆抗体的检测线和包被有抗鼠IgM抗体的质控线，所述检测线采用抗EHFV重组抗原的多克隆抗体浓度为0.5mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用抗鼠IgM抗体浓度为1.0mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为玻璃纤维素膜，购自上海金标生物科技有限公司。
一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒的制备方法为：
(1)胶体金溶液制备：将容器用纯化水清洗干净后，在35℃温度下烘干，加入1wt％氯金酸水溶液加热至沸腾，再按0.5％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，胶体金溶液由灰白色逐渐变成紫色，继续沸煮，胶体金溶液变成红色调后，停止加热并冷却，使用0.1mol/LK2CO3溶液调节pH至8.0，备用；所述的胶体金颗粒粒径为25纳米；
(2)样品垫制备：
a.用PBS缓冲液将EHFV特异性重组抗原稀释至蛋白含量为0.3mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液是将Na2HPO40.5g，NaCl7.5g，KH2PO41.5g，加850mL去离子水约充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.5，最后定容到1L。再将稀释液在5℃条件下3000r/min离心15min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到(1)制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，加入稳定剂8％BSA溶液，在5℃条件下3000r/min离心30min，静置5h后，给得到的沉淀物中加入缓冲液充分溶解，再在5℃条件下1800r/min离心15min，去除聚集物，留上清液，再次将上清液在5℃条件下2400r/min离心30min，重悬底部疏松沉淀，即得到胶体金标记的EHFV特异性重组抗原；
b.将标记好胶体金的EHFV特异性重组抗原溶液均匀以5cm/秒的速度喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，再将玻璃纤维素膜粘贴在保护垫上，即制得所述的样品垫。
(3)硝酸纤维素膜制备：将抗EHFV重组抗原的多克隆抗体稀释成浓度为0.5mg/mL的包被液，将抗鼠IgM抗体稀释成浓度为1.0mg/mL的包被液，将稀释好的抗鼠IgM抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的MP蛋白均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃干燥4h，形成样品带和质控带，封存，即得到所述的硝酸纤维素膜。
(4)试剂盒制备：给PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴样品垫，样品垫上有观测孔，硝酸纤维素膜和样品垫之间相互交叠0.2mm，按3mm的宽度切为小条，制得试剂条，将试剂条放在塑料壳体中，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒。
实施例2：一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。
其中，所述的底板为PVC材料制得，购自上海金标生物科技有限公司，PVC作为医用材料，具有良好的生物相容性，不致畸致癌，不引起过敏反应，还有很好的血液相容性、溶血性低、抗凝血性好；所述吸水垫购自上海金标生物科技有限公司；所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司，硝酸纤维素膜上分别设有包被抗EHFV重组抗原的多克隆抗体的检测线和包被有抗鼠IgM抗体的质控线，所述检测线采用抗EHFV重组抗原的多克隆抗体浓度为0.65mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用抗鼠IgM抗体浓度为1.25mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为玻璃纤维素膜，购自上海金标生物科技有限公司。
一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒的制备方法为：
(1)胶体金溶液制备：将容器用纯化水清洗干净后，在40℃温度下烘干，加入1wt％氯金酸水溶液加热至沸腾，再按0.65％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，胶体金溶液由灰白色逐渐变成紫色，继续沸煮，胶体金溶液变成红色调后，停止加热并冷却，使用0.25mol/LK2CO3溶液调节pH至8.5，备用；所述的胶体金颗粒粒径为32.5纳米；
(2)样品垫制备：
a.用PBS缓冲液将EHFV特异性重组抗原稀释至蛋白含量为0.4mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液是将Na2HPO40.5g，NaCl7.5g，KH2PO41.5g，加850mL去离子水约充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.5，最后定容到1L。再将稀释液在5℃条件下3000r/min离心22.5min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到(1)制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，加入稳定剂8％BSA溶液，在5℃条件下3000r/min离心37.5min，静置6.5h后，给得到的沉淀物中加入缓冲液充分溶解，再在5℃条件下1800r/min离心15min，去除聚集物，留上清液，再次将上清液在5℃条件下2400r/min离心30min，重悬底部疏松沉淀，即得到胶体金标记的EHFV特异性重组抗原；
b.将标记好胶体金的EHFV特异性重组抗原溶液均匀以5cm/秒的速度喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，再将玻璃纤维素膜粘贴在保护垫上，即制得所述的样品垫。
(3)硝酸纤维素膜制备：将抗EHFV重组抗原的多克隆抗体稀释成浓度为0.65mg/mL的包被液，将抗鼠IgM抗体稀释成浓度为1.25mg/mL的包被液，将稀释好的抗鼠IgM抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的MP蛋白均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃干燥4h，形成样品带和质控带，封存，即得到所述的硝酸纤维素膜。
(4)试剂盒制备：给PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴样品垫，样品垫上有观测孔，硝酸纤维素膜和样品垫之间相互交叠0.2mm，按4mm的宽度切为小条，制得试剂条，将试剂条放在塑料壳体中，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒。
实施例3：一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。
其中，所述的底板为PVC材料制得，购自上海金标生物科技有限公司，PVC作为医用材料，具有良好的生物相容性，不致畸致癌，不引起过敏反应，还有很好的血液相容性、溶血性低、抗凝血性好；所述吸水垫购自上海金标生物科技有限公司；所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司，硝酸纤维素膜上分别设有包被抗EHFV重组抗原的多克隆抗体的检测线和包被有抗鼠IgM抗体的质控线，所述检测线采用抗EHFV重组抗原的多克隆抗体浓度为0.8mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用抗鼠IgM抗体浓度为1.5mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为玻璃纤维素膜，购自上海金标生物科技有限公司。
一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒的制备方法为：
(1)胶体金溶液制备：将容器用纯化水清洗干净后，在45℃温度下烘干，加入1wt％氯金酸水溶液加热至沸腾，再按0.8％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，胶体金溶液由灰白色逐渐变成紫色，继续沸煮，胶体金溶液变成红色调后，停止加热并冷却，使用0.5mol/LK2CO3溶液调节pH至9.0，备用；所述的胶体金颗粒粒径为40纳米；
(2)样品垫制备：
a.用PBS缓冲液将EHFV特异性重组抗原稀释至蛋白含量为0.5mg/mL的稀释液，所述的PBS缓冲液是将Na2HPO40.5g，NaCl7.5g，KH2PO41.5g，加850mL去离子水约充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.5，最后定容到1L。再将稀释液在5℃条件下3000r/min离心30min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到(1)制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，加入稳定剂8％BSA溶液，在5℃条件下3000r/min离心45min，静置8h后，给得到的沉淀物中加入缓冲液充分溶解，再在5℃条件下1800r/min离心15min，去除聚集物，留上清液，再次将上清液在5℃条件下2400r/min离心30min，重悬底部疏松沉淀，即得到胶体金标记的EHFV特异性重组抗原；
b.将标记好胶体金的EHFV特异性重组抗原溶液均匀以5cm/秒的速度喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，再将玻璃纤维素膜粘贴在保护垫上，即制得所述的样品垫。
(3)硝酸纤维素膜制备：将抗EHFV重组抗原的多克隆抗体稀释成浓度为0.8mg/mL的包被液，将抗鼠IgM抗体稀释成浓度为1.5mg/mL的包被液，将稀释好的抗鼠IgM抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的MP蛋白均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃干燥4h，形成样品带和质控带，封存，即得到所述的硝酸纤维素膜。
(4)试剂盒制备：给PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴样品垫，样品垫上有观测孔，硝酸纤维素膜和样品垫之间相互交叠0.2mm，按5mm的宽度切为小条，制得试剂条，将试剂条放在塑料壳体中，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒。
临床统计试验：
临床患者流行性出血热EHF-IgM抗体检测：收集流行性出血热疑似病例血清65份，确诊病例血清25份，将待检测血清50μl用滴定管缓慢滴于检测卡的样品垫上，在15～25℃的环境中，5～15min之内观察色变情况，相继出见的二条红线的血清为73份，出现一条红线的血清为15份，未出现红线的血清为2份；同时将所有血清用免疫荧光技术检测和酶免疫染色法进行常规检测，检测结果如表1所示。
表1：三种方法检测结果统计
试验结果表明：本发明的检测试纸条与传统常用的免疫荧光技术检测和酶免疫染色法比较具有较高的灵敏度和特异性，非常适合临床推广应用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，包括盒体和检测卡，其特征在于，所述检测卡包括壳体和试剂条，所述试剂条包括底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜和样品垫，所述样品垫包括保护垫和胶体金层。
2.如权利要求1所述的一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，其特征在于，所述的底板为PVC材料制得；所述硝酸纤维素膜上分别设有包被抗EHFV重组抗原的多克隆抗体的检测线和包被有抗鼠IgM抗体的质控线，所述检测线采用抗EHFV重组抗原的多克隆抗体浓度为0.5～0.8mg/mL的包被液进行包被，所述质控线采用抗鼠IgM抗体浓度为1.0～1.5mg/mL的包被液进行包被；所述的保护垫为玻璃纤维素膜。
3.如权利要求1所述的一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒，其特征在于，制备方法为：
(1)胶体金溶液制备：将容器用纯化水清洗干净后，加入1wt％氯金酸水溶液加热至沸腾，再按0.5～0.8％的体积比滴加加入1.5wt％柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，胶体金溶液由灰白色变成紫色，继续沸煮，胶体金溶液变成红色调后，停止加热并冷却，使用K2CO3溶液调节pH至8.0-9.0，备用；样品垫制备：
a.用PBS缓冲液将EHFV特异性重组抗原稀释至蛋白含量为0.3-0.5mg/mL的稀释液，再将稀释液在5℃条件下3000r/min离心15-30min，去除沉淀得到上清液，将上清液逐滴加入到(1)制备的胶体金溶液中，离心去除多余的抗原，加入稳定剂，在5℃条件下3000r/min离心30-45min，静置5-8h后，给得到的沉淀物中加入缓释剂，即得到胶体金标记的EHFV特异性重组抗原；
b.将标记好胶体金的EHFV特异性重组抗原溶液均匀喷射到玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，再将玻璃纤维素膜粘贴在保护垫上，即制得所述的样品垫。
(3)硝酸纤维素膜制备：将抗EHFV重组抗原的多克隆抗体稀释成浓度为0.5～0.8mg/mL的包被液，将抗鼠IgM抗体稀释成浓度为1.0～1.5mg/mL的包被液，将稀释好的抗鼠IgM抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的MP蛋白均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，37℃干燥4h，封存，即得到所述的硝酸纤维素膜；
(4)试剂盒制备：给PVC底板上硝酸纤维素膜的上方粘帖吸水纸，硝酸纤维素膜与吸水滤纸相互交叠0.2mm，在硝酸纤维素膜的下方依次粘贴样品垫，样品垫上有观测孔，硝酸纤维素膜和样品垫之间相互交叠0.2mm，按3-5mm的宽度切为小条，制得试剂条，将试剂条放在塑料壳体中，加上干燥剂，装入盒体，即制得一种快速检测流行性出血热病毒EHF-IgM抗体的试剂盒。
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