CN114755418A

CN114755418A - 一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN114755418A
Application number: CN202210678409.3A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 杨致亭; 杨明霞; 曹传美; 赵倩
Original assignee: Shandong Kanghua Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Kanghua Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本发明涉及一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法，属于体外诊断技术领域，猴痘病毒抗原检测试剂盒包括检测卡和样本提取液，检测卡包括上盖、下盖和猴痘病毒抗原检测试纸条，猴痘病毒抗原检测试纸条包括样品垫、硅芯金壳结合垫、固相抗体反应膜、吸水纸和PVC板，上盖上设有加样孔和观察窗，一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，包括硅芯金壳结合垫的制备方法、样品垫的制备方法、固相抗体反应膜的制备方法，本发明检测样本种类多，包括口咽拭子、体液、血液以及皮肤病灶组织（包括水疱液、脓疱液、痂皮），且灵敏度高，可有效缩短病毒诊断的窗口期，以降低潜伏期带来的隐形传播风险，有效控制疫情的大规模传播。

Description

一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体的说，涉及一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

猴痘（Monkeypox）是一种由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患病，最早发现于非洲西部和中部地区原始森林。猴痘病毒与痘苗病毒、天花病毒相似，临床表现为暴露10-12天后发热，发热2-3天后皮肤出疹。皮疹的变化，从斑丘疹，一直到小水疱、脓疱，大约10天左右出现结痂。病毒可以通过直接密切接触由动物传染给人，传染途径主要包括血液、体液、皮肤或黏膜伤口。人类二次传播主要通过空气飞沫传播，飞沫可感染眼睛、鼻子和喉咙的黏膜。

2022年5月21日，世界卫生组织发布猴痘疫情暴发预警，并将这次在中非和西非以外国家引发的猴痘疫情定义为“极度不寻常事件”。截至26日，世界卫生组织表示，猴痘已蔓延至全球20多个国家，欧盟已确诊118例，其中西班牙和葡萄牙分别为51例和37例。英国卫生安全局表示英国已经确诊90例，美国、加拿大也纷纷确诊9例和16例。在这些病例中，世界卫生组织表示死亡率在3%到6%之间。

目前，生物学的聚合酶链反应PCR是国内外检测猴痘病毒的主要检测方法，但需要依赖设备，且较易产生污染。我国目前尚未建立除PCR检测法外的其他诊断方法。因此，建立快速准确的猴痘病毒诊断方法，才能制定相关措施政策，控制其可能造成的伤害，为我国应对可能出现的猴痘疫情以及生物反恐提供应急技术储备。

世界卫生组织2022年5月23日发布的《猴痘病毒实验室检测》中期指导文件中指出，临床推荐诊断样本为皮肤病灶组织，包括渗出液、病灶痂皮。猴痘病毒的潜伏期较长，通常为6至13天，可能长达21天。所以研制一种猴痘病毒检测试剂盒，检测皮疹出现前其他易取感染组织，缩短病毒诊断的窗口期，可有效降低潜伏期带来的隐形传播风险，控制疫情的大规模传播。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法，猴痘病毒抗原检测试剂盒检测样本种类多，包括口咽拭子、体液、血液以及皮肤病灶组织（包括水疱液、脓疱液、痂皮），且灵敏度高，可有效缩短病毒诊断的窗口期，以降低潜伏期带来的隐形传播风险，有效控制疫情的大规模传播。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，包括硅芯金壳结合垫的制备方法、样品垫的制备方法、固相抗体反应膜的制备方法；所述硅芯金壳结合垫的制备方法如下：

（1）对1mL硅芯金壳进行涡旋和超声处理；

（2）将EDC按100μg/mL比例加入至硅芯金壳中；

（3）将Sulfo-NHS按200μg/mL比例加入至硅芯金壳中，确保活化时pH值为5；

（4）在室温条件下涡旋孵育30min；

（5）在4℃、4000rpm条件下离心5min，移除上清液，除去所有过量的EDC或Sulfo-NHS，用同体积反应缓冲液重悬，重复两次；

（6）按20μg/mL比例添加标记的猴痘病毒单克隆抗体2，4℃条件下涡旋孵育1.5h；

（7）在4℃、7000 rpm条件下离心10min，除去上清液，用偶联物稀释液将沉淀物定容至原体积，然后进行涡旋和超声处理，使偶联物完全重悬，得到硅芯金壳标记抗体原液，测OD800值；

（8）将硅芯金壳标记抗体原液按OD800值6稀释，用喷金仪按2.5μL/cm溅射于聚酯膜上，37℃过夜干燥，制得硅芯金壳结合垫。

作为一种优化方案，所述反应缓冲液包括pH值为7.5的50mM的PBS缓冲液、质量分数为0.5%的BSA、质量百分比为0.5%的酪蛋白钠、体积分数为0.5%的吐温20。

作为一种优化方案，所述偶联物稀释液包括pH值为8.5的100mM的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为2%的蔗糖、质量分数为0.5%的海藻糖、质量分数为0.3%的PVP40。

作为一种优化方案，所述样品垫的制备方法如下：将样品垫处理液浸湿8964玻璃纤维素膜，5mL/条，37℃过夜干燥，制得样品垫。

作为一种优化方案，所述样品垫处理液包括pH值为8.5的Tris-HCL缓冲液、100mM柠檬酸三钠、质量百分比为0.5%的PVP40、质量百分比为0.05%的吐温20、质量百分比为0.3%的EDTA-4Na、1.0mg/mL主动型异嗜性抗体阻断剂、0.2mg/mL抗RBC单克隆抗体。

作为一种优化方案，所述固相抗体反应膜的制备方法如下：固相抗体反应膜上依次包被有检测T线、质控C线，检测T线包被有猴痘单克隆抗体1，质控C线包被有羊抗鼠IgG抗体。

作为一种优化方案，所述猴痘单克隆抗体1的浓度为1.5mg/mL，羊抗鼠IgG抗体的浓度为1.0mg/mL。

一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，包括检测卡和样本提取液，检测卡包括上盖、下盖和猴痘病毒抗原检测试纸条，猴痘病毒抗原检测试纸条包括样品垫、硅芯金壳结合垫、固相抗体反应膜、吸水纸和PVC板，上盖上设有加样孔和观察窗。

作为一种优化方案，所述固相抗体反应膜粘贴在PVC板上，固相抗体反应膜的两端分别搭接有硅芯金壳结合垫的一端和吸水纸的一端，硅芯金壳结合垫的另一端粘贴在PVC板上，硅芯金壳结合垫的另一端搭接有样品垫的一端，样品垫的另一端粘贴在PVC板上，吸水纸的另一端粘贴在PVC板上。

作为一种优化方案，所述样本提取液包括pH值为8.0的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为0.05%的S9、质量百分比为0.5%的胆酸、质量百分比为0.9%的NaCl和体积分数为0.05%的Proclin-300。

本发明采取以上技术方案，具有以下优点：

1、本发明采用200nm硅芯金壳标记，相比于传统的胶体金标记，硅芯金壳标记采用共价偶联金颗粒结合物更稳定，避免了因加样方式、加热时间、搅拌速度、反应温度和容器造成的金稳定性、均一性的影响；另外，硅芯金壳为200nm大颗粒，灵敏度可提高多达20倍，更适合于多样本类型的检测，可检测患者皮疹出现前口咽拭子、体液、血液中的低含量病毒，缩短病毒诊断的窗口期，有效降低潜伏期带来的隐形传播风险，控制疫情的大规模传播。

2、目前国内外无猴痘病毒抗原诊断试剂，本发明通过优化样品垫、样本处理液，可最大限度的提升试剂的样本兼容性。本发明猴痘病毒抗原检测试剂盒的样本提取液、样品垫中组分通过彼此之间的配合最终形成抗干扰力强且具有强缓冲能力的复合体系，可有效缓冲口咽拭子、体液、血液和皮肤病灶组织（包括水疱液、脓疱液、痂皮）不同样本间的电解质，兼容多种样本类型。

3、因样本提取液和样品垫中添加表面活性剂、亲水性聚合物、主动型异嗜性抗体阻断剂、抗RBC单克隆抗体等，可有效防止样本中的脂肪、细菌、细胞碎片、异嗜性抗体、红细胞等因素与抗原抗体非特异性结合，在保护待测抗原的基础上，降低假阳的发生，提高检测准确度。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的检测卡内部的结构示意图；

图2为本发明一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的猴痘病毒抗原检测试纸条的结构示意图；

图3为本发明一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的检测卡上盖的结构示意图。

图中，

3-猴痘病毒抗原检测试纸条，4- PVC板，5-样品垫，6-硅芯金壳结合垫，7-固相抗体反应膜，8-吸水纸，9-检测T线，10-质控C线，11-加样孔，12-观察窗，13-上盖，14-下盖。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

如图1-3所示，一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡和样本提取液，检测卡包括上盖13、下盖14和猴痘病毒抗原检测试纸条3，上盖13和下盖14相互卡扣连接，上盖13和下盖14之间形成容纳腔，猴痘病毒抗原检测试纸条3位于容纳腔内，猴痘病毒抗原检测试纸条3包括样品垫5、硅芯金壳结合垫6、固相抗体反应膜7、吸水纸8和PVC板4，固相抗体反应膜7粘贴在PVC板4上，固相抗体反应膜7的两端分别搭接有硅芯金壳结合垫6的一端和吸水纸8的一端，硅芯金壳结合垫6的另一端粘贴在PVC板4上，硅芯金壳结合垫6的另一端搭接有样品垫5的一端，样品垫5的另一端粘贴在PVC板4上，吸水纸8的另一端粘贴在PVC板4上，猴痘病毒抗原检测试纸条3的宽度为4.0mm，上盖13上设有加样孔11和观察窗12，加样孔11的位置对应样品垫5所在的位置，使待测样品能滴加到样品垫5上。

一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法包括硅芯金壳结合垫的制备方法、样品垫的制备方法、固相抗体反应膜的制备方法。

所述硅芯金壳结合垫的制备方法如下：

（1）对1mL硅芯金壳进行涡旋和超声处理；

（2）将EDC按100μg/mL比例加入至硅芯金壳中；

（4）在室温条件下涡旋孵育30min；

（5）在4℃、4000rpm条件下离心5min，移除上清液，除去所有过量的EDC或Sulfo-NHS，用同体积反应缓冲液重悬，重复两次，反应缓冲液包括pH值为7.5的50mM的PBS缓冲液、质量分数为0.5%的BSA、质量百分比为0.5%的酪蛋白钠、体积分数为0.5%的吐温20；

（7）在4℃、7000rpm条件下离心10min，除去上清液，用偶联物稀释液将沉淀物定容至原体积，然后进行涡旋和超声处理，使偶联物完全重悬，得到硅芯金壳标记抗体原液，测OD800值；

所述样品垫的制备方法如下：

将样品垫处理液浸湿8964玻璃纤维素膜，5mL/条，37℃过夜干燥，制得样品垫，样品垫处理液包括pH值为8.5的Tris-HCL缓冲液、100mM柠檬酸三钠、质量百分比为0.5%的PVP40、质量百分比为0.05%的吐温20、质量百分比为0.3%的EDTA-4Na、1.0mg/mL主动型异嗜性抗体阻断剂、0.2mg/mL抗RBC单克隆抗体。

所述固相抗体反应膜的制备方法如下：

固相抗体反应膜上依次包被有检测T线9、质控C线10，检测T线9包被有猴痘单克隆抗体1，质控C线10包被有羊抗鼠IgG抗体，猴痘单克隆抗体1的浓度为1.5mg/mL，羊抗鼠IgG抗体的浓度为1.0mg/mL。

观察窗12的位置对应检测T线9和质控C线10所在的位置。

步骤（1）中硅芯金壳为粒径为200nm的颗粒。

步骤（7）中偶联物稀释液包括pH值为8.5的100mM的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为2%的蔗糖、质量分数为0.5%的海藻糖、质量分数为0.3%的PVP40。

所述样本提取液包括pH值为8.0的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为0.05%的S9、质量百分比为0.5%的胆酸、质量百分比为0.9%的NaCl和体积分数为0.05%的Proclin-300。

实施例2：

一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：

（1）检测：

a、检测样本包括口咽拭子、体液、血液和皮肤病灶组织，其中皮肤病灶组织包括水疱液、脓疱液、痂皮；

b、在附属的试剂管中加入0.3mL样本提取液；

c、口咽拭子用棉签拭子擦拭舌根及两侧扁桃体至少三次，痂皮用消毒镊子收集，体液、水疱液、脓疱液用一次性注册器收集200μL，将上述收集的样本浸在试剂管中的样本提取液，充分搅拌均匀，作为待测样品液；

d、滴加80μL全血或步骤c制得的待测样品液到检测卡的加样孔，待测样品液通过加样孔到达试纸条，15分钟观察结果，20分钟后结果无效；

（2）结果判断：

a、阴性：仅质控C线出现一条红色条带，在检测T线内无红色条带出现。

b、阳性：两条红色条带出现。一条红色条带位于检测T线内，另一条红色条带位于质控C线。

c、无效：质控C线未出现红色条带，表明操作过程不正确或检测卡已损坏。

本发明试剂盒的敏感性、特异性验证：

（1）敏感性

外购猴痘病毒重组抗原，分别梯度稀释至1000、100、50、10、5pg/mL进行敏感性研究，结果如下表1：

表1 敏感性研究

备注：“+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。

本发明检测猴痘病毒重组抗原的最低检出限为10pg/mL。

（2）分析特异性

对下表中易引起相同或相似症状的交叉反应病原微生物进行验证，结果表明在下列浓度条件下对交叉反应物质特异性良好：

表2 分析特异性研究

为了更好的证明本发明试剂盒具有较好的敏感度和特异性，以实施例1为参考，通过3个对比例，将本发明实施例1中的试剂盒与对比例1-3中的试剂盒同时检测阴性样品，具体检测结果见表3；检测不同浓度重组蛋白，具体检测结果见表4。

对比例1：

与实施例1不同的是，金结合垫的制备不同，实施例1中为硅芯金壳结合垫，采用硅芯金壳标记，对比例1为胶体金结合垫，采用的是常规工艺胶体金标记，其余操作均相同，具体如下：

胶体金结合垫的制备方法如下：

将35nm胶体金溶液以0.1Mol/L K₂CO₃调PH值至9.0，加入20μg/mL猴痘病毒单克隆抗体2，充分反应后，在4℃、10000rpm离心30min，除去上清液，10倍浓缩，制得胶体金标记抗体，测OD520值。将胶体金标记抗体按OD520值10稀释，用喷金仪按2.5μL/cm溅射于聚酯膜上，37℃过夜干燥，制得胶体金结合垫。

对比例2：

与实施例1不同的是样品垫的制备，对比例2中的样品垫未添加主动型异嗜性抗体阻断剂，其余操作均相同，具体如下：

样品垫的制备方法如下：

将样品垫处理液浸湿8964玻璃纤维素膜，5mL/条，37℃过夜干燥，制得样品垫，样品垫处理液包括pH值为8.5的Tris-HCL缓冲液、100mM柠檬酸三钠、质量百分比为0.5%的PVP40、质量百分比为0.05%的吐温20、质量百分比为0.3%的EDTA-4Na、0.2mg/mL抗RBC单克隆抗体。

对比例3：

与实施例1不同的是样本提取液的制备，对比例3中的样品提取液未添加酪蛋白和表面活性剂S9，其余操作均相同，具体如下：

所述样本提取液包括pH值为8.0的Tris-HCL缓冲液、质量百分比为0.5%的胆酸、质量百分比为0.9%的NaCl和体积分数为0.05%的Proclin-300。

表3

表4

通过表3、表4研究发现，相对于对比例1、对比例2和对比例3而言，本发明实施例1中的试剂盒在实际检测应用中敏感度更高，特异性更强。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括硅芯金壳结合垫的制备方法、样品垫的制备方法、固相抗体反应膜的制备方法；所述硅芯金壳结合垫的制备方法如下：

对1mL硅芯金壳进行涡旋和超声处理；

将EDC按100μg/mL比例加入至硅芯金壳中；

将Sulfo-NHS按200μg/mL比例加入至硅芯金壳中，确保活化时pH值为5；

在室温条件下涡旋孵育30min；

在4℃、4000rpm条件下离心5min，移除上清液，除去所有过量的EDC或Sulfo-NHS，用同体积反应缓冲液重悬，重复两次；

按20μg/mL比例添加标记的猴痘病毒单克隆抗体2，4℃条件下涡旋孵育1.5h；

在4℃、7000 rpm条件下离心10min，除去上清液，用偶联物稀释液将沉淀物定容至原体积，然后进行涡旋和超声处理，使偶联物完全重悬，得到硅芯金壳标记抗体原液，测OD800值；

将硅芯金壳标记抗体原液按OD800值6稀释，用喷金仪按2.5μL/cm溅射于聚酯膜上，37℃过夜干燥，制得硅芯金壳结合垫。

2.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述反应缓冲液包括pH值为7.5的50mM的PBS缓冲液、质量分数为0.5%的BSA、质量百分比为0.5%的酪蛋白钠、体积分数为0.5%的吐温20。

3.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述偶联物稀释液包括pH值为8.5的100mM的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为2%的蔗糖、质量分数为0.5%的海藻糖、质量分数为0.3%的PVP40。

4.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述样品垫的制备方法如下：将样品垫处理液浸湿8964玻璃纤维素膜，5mL/条，37℃过夜干燥，制得样品垫。

5.根据权利要求4所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述样品垫处理液包括pH值为8.5的Tris-HCL缓冲液、100mM柠檬酸三钠、质量百分比为0.5%的PVP40、质量百分比为0.05%的吐温20、质量百分比为0.3%的EDTA-4Na、1.0mg/mL主动型异嗜性抗体阻断剂、0.2mg/mL抗RBC单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述固相抗体反应膜的制备方法如下：固相抗体反应膜上依次包被有检测T线、质控C线，检测T线包被有猴痘单克隆抗体1，质控C线包被有羊抗鼠IgG抗体。

7.根据权利要求6所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述猴痘单克隆抗体1的浓度为1.5mg/mL，羊抗鼠IgG抗体的浓度为1.0mg/mL。

8.根据权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，其特征在于：包括检测卡和样本提取液，检测卡包括上盖、下盖和猴痘病毒抗原检测试纸条，猴痘病毒抗原检测试纸条包括样品垫、硅芯金壳结合垫、固相抗体反应膜、吸水纸和PVC板，上盖上设有加样孔和观察窗。

9.根据权利要求8所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，其特征在于：所述固相抗体反应膜粘贴在PVC板上，固相抗体反应膜的两端分别搭接有硅芯金壳结合垫的一端和吸水纸的一端，硅芯金壳结合垫的另一端粘贴在PVC板上，硅芯金壳结合垫的另一端搭接有样品垫的一端，样品垫的另一端粘贴在PVC板上，吸水纸的另一端粘贴在PVC板上。

10.根据权利要求8所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒，其特征在于：所述样本提取液包括pH值为8.0的Tris-HCL缓冲液、质量分数为0.5%的酪蛋白、质量百分比为0.05%的S9、质量百分比为0.5%的胆酸、质量百分比为0.9%的NaCl和体积分数为0.05%的Proclin-300。