CN205679623U

CN205679623U - 一种快速检测登革病毒ns1抗原胶体金检测试纸条及试剂盒

Info

Publication number: CN205679623U
Application number: CN201620249476.3U
Authority: CN
Inventors: 杨恒林; 秦成峰; 聂丽芳
Original assignee: BLUE CROSS BIO-MEDICAL (BEIJING) CO LTD; Yunnan Institute Of Parasitic Diseases; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: BLUE CROSS BIO-MEDICAL (BEIJING) CO LTD; Yunnan Institute Of Parasitic Diseases; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2016-03-29
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2026-03-29

Abstract

本实用新型公开“一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸条及试剂盒”属于医用检测耗材，所述试纸条在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层固定在基板支撑层上，且从手持端到加样端依次设有手持端吸水材料垫，硝酸纤维素药膜，金标纤维垫，样品纤维垫，在金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，在硝酸纤维素药膜上印制有条状的且与试纸条长度方向垂直的检测线和质控线，从手持端到加样端，硝酸纤维素药膜依次包被有检测登革NS1抗原的质控线C线和检测线T线。本实用新型试剂盒可用于定性检测人血清/血浆/全血样本中的登革病毒NS1抗原。

Description

一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸条及试剂盒

技术领域

本实用新型属于生物检测领域，涉及一种医用检测耗材，具体涉及一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金试纸条及试剂盒。

背景技术

登革热是由登革病毒(Dengue viruse，DENV)引起，经蚊媒传播的急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨骼及关节痛，极度疲乏，部分患者可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。本病于1779年在埃及开罗、印度尼西亚雅加达及美国费城发现，并据症状命名为关节热和骨折热。1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。

20世纪，登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数百万计。该病多发生于热带和亚热带地区，在东南亚一直呈地方性流行^〔2〕。据记载，于40年代本病曾传入我国上海、福建、汉口、广东等地，并发生流行。1978年本病在广东省佛山市发生流行，近十年来疫情在广东、海南省迅速蔓延，波及广西，全国累计病例达几十万例。登革热传播迅猛，发病率高，并可引起轻型的登革热(Dengue fever，DF)和危及生命的症候群—登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)，所以登革病毒感染已成为热带和亚热带地区严重的公共卫生问题。

登革病毒有4个血清型，为单股正链RNA病毒，是黄病毒科的重要成员。病毒颗粒呈哑铃状(700×20--40nm)、棒状或球形(直径为20--50nm)。髓核为单股线状核糖核酸(RNA)，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有型和群特异性抗原。病毒基因组全长为11kb，依次编码3种结构蛋白(核蛋白C、膜结合蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中NS1蛋白是登革病毒一种高度保守的非结构糖蛋白，存在膜结合型和分泌性两种形式，均具有强免疫原性。登革病毒NS1蛋白在登革热发病早期即在病人血清中存在，随后IgM抗体出现，随着病人的已被证明可用于登革热的早期诊断和预后评估。此外，登革病毒NS1蛋白在登革热的致病和免疫过程中也起重要作用。因此登革病毒NS1蛋白的检测可对登革病毒进行早期诊断。

实用新型内容

根据上述领域的需求和不足，本实用新型旨在提供一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸条及试剂盒，本实用新型试剂盒用于定性检测人血清/血浆/全血样本中的登革病毒NS1抗原，用于登革病毒早期感染和后期预后的临床辅助诊断。

本实用新型的技术方案如下：

一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸条，其特征在于，试纸条在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层固定在基板支撑层上，且从手持端到加样端依次设有手持端吸水材料垫，硝酸纤维素药膜，金标纤维垫，样品纤维垫，在金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，在硝酸纤维素药膜上印制有条状的且与试纸条长度方向垂直的检测线和质控线，从手持端到加样端，硝酸纤维素药膜依次包被有检测登革NS1抗原的质控线C线和检测线T线。

所述试纸条金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗登革NS1单抗2，检测线T线上包被有抗登革NS1单抗1，质控线C线上包被有抗鼠IgG多抗。

所述金标纤维垫上包被胶体金标记的抗登革NS1单抗2的标记浓度为10-20ug/ml，所述检测线T线上包被抗登革NS1单抗1的包被浓度为1.0-2.0mg/ml，所述质控线C线上包被抗鼠IgG多抗的被浓度为1.0-2.0mg/ml。

一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金试剂盒，其特征在于：包括任一上述的胶体金检测试纸条。

还包括由盒体和盒盖构成的盒封闭体，所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽。

所述盒盖上设有加样孔和结果观察孔；当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫；对应于结果观察孔处为硝酸纤维素药膜。

所述试剂盒为长方形、椭圆形、半圆形或圆角矩形。生产、安装、运输、使用、保存极为方便，简单、美观、大方。

检验原理：

本实用新型试剂盒试纸条应用双抗体夹心法原理定性检测人血清/血浆/全血样本中的登革病毒NS1抗原，用于登革病毒早期感染的临床辅助诊断。如果样本中含有DengueNS1抗原，将与金标Dengue NS1单抗2反应形成复合物，在层析作用下，被预先固定在膜上的Dengue NS1单抗1捕获，在反应区形成肉眼可见的两条红色反应线，反之则只在质控线位置C出现一条红色反应线；

本实用新型试剂盒主要组成成份：

检测试剂盒：试纸条将Dengue NS1单抗1和抗鼠IgG多抗固相在硝酸纤维膜，金标垫上固定胶体金标记的Dengue NS1单抗2及其他试剂组成(氯金酸、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白、碳酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠)

抗登革NS1单抗1和抗登革NS1单抗2是不同表位的单抗。

技术效果：

本实用新型试剂盒通过登革NS1抗原检测，实现了登革病毒早期感染和后期预后的临床辅助诊断。

附图说明：

图1本实用新型试纸条的俯视图；

图2本实用新型试纸条的纵向剖面图；

图3本实用新型试剂盒俯视图；

图4优选的本实用新型试剂盒仰视图；

图5优选的本实用新型试剂盒仰视图；

图6本实用新型登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)生产工艺流程图；

其中：1-手持端，2-质控线C线，3-检测线T线，4-MAX标志线，5-加样端，6-硝酸纤维素药膜，7-样品纤维垫，8-手持端吸水材料垫，9-金标纤维垫，10-大无纺布，11-小无纺布，12-手持端胶带，13-箭头胶带,14-基板支撑层，15-盒盖，16-盒体，17-加样孔，18-结果观察孔。

具体实施方式：

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本实用新型，并不局限于所述最佳实施方式，不对本实用新型的内容和保护范围构成限制，任何人在本实用新型的启示下或是将本实用新型与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本实用新型相同或相近似的产品，均落在本实用新型的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

主要原材料的来源及质量控制方法

1.2.1抗鼠IgG多抗为商购来源.

性状：肉眼观察，为澄清透明的液体；只要符合如下规格型号便能实现本发明的发明目的：纯度＞95％；浓度≥5mg/ml。ELISA法测定效价应＞1：20000。

1.2.2Dengue NS1单抗1为商购来源.

性状：肉眼观察，为澄清透明的液体；只要符合如下规格型号便能实现本发明的发明目的：纯度＞95％；浓度≥2mg/ml。ELISA法测定效价应＞1：40000。

1.2.3Dengue NS1单抗2为商购来源.

性状：肉眼观察，为澄清透明的液体；只要符合如下规格型号便能实现本发明的发明目的：纯度＞95％；浓度≥1mg/ml；ELISA法测定效价应＞1：40000。

本实用新型一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金试纸条，其特征在于，包括试纸条在高度方向上包括基板支撑层14、反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层固定在基板支撑层14上，且从手持端1到加样端5依次设有手持端吸水材料垫8，硝酸纤维素药膜6，金标纤维垫9，样品纤维垫7，在金标纤维垫9和手持端吸水材料垫8上覆盖有保护膜层，在硝酸纤维素药膜6上印制有条状的且与试纸条长度方向垂直的检测线和质控线，从手持端1到加样端5，硝酸纤维素药膜6依次包被有检测登革NS1抗原的质控线C线2和检测线T线3，

试纸条金标纤维垫9上包被有胶体金标记的抗登革NS1单抗2，检测线T线3上包被有抗登革NS1单抗1，质控线C线2上包被有抗鼠IgG多抗。

所述金标纤维垫9上包被胶体金标记的抗登革NS1单抗2的标记浓度为10-20ug/ml，所述检测线T线3上包被抗登革NS1单抗1的包被浓度为1.0-2.0mg/ml，所述质控线C线2上包被抗鼠IgG多抗的被浓度为1.0-2.0mg/ml。

本实用新型一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金试剂盒包括上述的胶体金试纸条。

所述盒盖15上均设有加样孔17和结果观察孔18；当所述胶体金试纸条放置于盒体16内的定位槽时，对应于盒盖15加样孔处17为样品纤维垫7；对应于结果观察孔18处为硝酸纤维素药膜6。

所述试剂盒为椭圆形、圆角矩形、半圆形或圆角矩形。生产、安装、运输、使用、保存极为方便，简单、美观、大方。

实施例1.试剂盒的制备

3.1.1反应膜(S1-A0)制备

分别将1.0mg/ml的抗Dengue NS1单抗1溶液(检测线T)和1.0mg/ml的抗鼠IgG多抗溶液(质控线C)包被在硝酸纤维膜上，

3.1.2胶体金垫(S4-A0)制备

3.1.2.1胶体金溶液的制备

用柠檬酸三钠还原法制备。即氯金酸水溶液加热煮沸，加入柠檬酸三钠，混匀后煮沸，待胶体金溶液颜色至紫红色，继续煮沸5分钟，冷却即可。

3.1.2.2金标记抗体的制备

用碳酸钾溶液调整胶体金溶液pH值，加入20μg/ml抗Dengue NS1单抗2，30分钟后加入牛血清白蛋白溶液，离心制得金标抗体浓缩液后保存，使用前稀释至20％。

3.1.2.3胶体金垫的制备

取已经制备好的金标记抗体溶液均匀的涂抹在玻璃纤维上，干燥，检测，备用。

3.1.3pH7.4 20mM磷酸盐缓冲溶液的制备

称取氯化钠9g、磷酸氢二钠5.95g、磷酸二氢钠0.53g至1000ml容量瓶中定容，混匀备用。

3.1.4辅料垫的制备

取已经制备好的pH7.4 20mM磷酸盐缓冲溶液均匀的涂抹在玻璃纤维上，干燥，检测，备用。

3.1.5组装

将各组装材料组装成反应体后切成适宜条宽的测试条。

实施例2.本实用新型试剂盒的使用。

样本要求：

用常规方法采集血清、血浆或者全血样本，血清样本应收集在不含任何抗凝剂的容器中，血浆或者全血样本应收集于含有正常使用量枸橼酸钠、肝素、EDTA、草酸钾等抗凝剂的容器中。所有样本应视为传染因子对待，勿采用溶血样本。

检验方法：

1.在进行测试前必须先仔细阅读使用说明书。

2.待测样本、检测试剂及其他检测用材料等均平衡至室温后，取出测试条或测试板。

3.用所配滴管加2滴(约60μl-80μl)样本于左侧加样孔中。若测试全血样本，需要将60μl-80μl全血滴加在测试条MAX标志线下端或测试板加样孔，若样本出现爬行缓慢或不爬现象，需再滴加1滴稀释液。

4.15分钟观察显示结果，30分钟后的显示结果无临床意义。

【检验结果的解释】

1.Dengue NS1阳性：在检测线(T)及质控线位置(C)各出现一条红色反应线。

2.Dengue NS1阴性：仅在质控线位置(C)出现一条红色反应线。

3.无效：无红色反应线出现，或仅在检测线位置(T)出现一条红色反应线，提示试验失败或试剂失效，请用新试剂重试。如果问题仍然存在，请停止使用本批产品，并与当地经销商联系。

【产品性能指标】

1.产品的临床阳性符合率(诊断灵敏度)和阴性符合率(诊断特异性)均不低于99％。

2.产品可用于检测人血清/血浆/全血样本，结果一致。

3.产品与临床甲肝IgM抗体、乙肝表面抗原、丙肝抗体、戊肝IgM、梅毒螺旋体抗体、艾滋抗体、类风湿因子、EV71IgM抗体、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒阳性样本无交叉反应。

4.干扰试验中，高胆红素(TBil<220μmol/l)和高脂样本(TG<26.1mmol/l)对本产品使用未见明显干扰，但溶血样本(HGB≥5g/L)会影响产品背景退白。

实施3.本实用新型试剂盒的效果验证

1.灵敏度

结论：用本实用新型登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)在稀释度为1:8时测试条的检测结果为阳性，因此确定最低检出量为1:8。

2.特异性

表1.交叉反应

表2.血清/血浆/全血一致性试验和不同抗凝剂试验

表3.干扰试验

结论：与临床甲肝IgM抗体、乙肝表面抗原、丙肝抗体、戊肝IgM抗体、梅毒螺旋体抗体、艾滋抗体、类风湿因子、EV71IgM抗体、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒阳性血清反应结果为阴性，表明无交叉反应，通过对同一个人的阴/阳性血清、血浆和全血样本50例进行检测，临床血清、血浆和全血样本均可适用；检测不同抗凝剂结果基本一致，无明显区别；高血脂样本(TG＜26.1mmol/L)以及黄疸样本(TBil＜220μmol/L)时对产品检测结果无影响，但溶血样本(HGB≥5g/L)对实用新型的本底消退有影响，因此可能影响弱阳性样本的判读结果。

3.重复性

结论：登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)的重复性测试结果均完全一致，且反应色度(主要是检测线)没有显著差异，批内可重现性良好，批间差异不明显。

结果分析：本实用新型登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)采用高度特异性的抗原-抗体反应、免疫层析分析及胶体金标记技术，用于定性检测人血清/血浆/全血样本中的Dengue NS1抗原。测试方法简单，快速，准确。经过一系列的性能评估试验表明，该产品的灵敏度高、特异性好，批内可重复性良好，批与批之间质量相对稳定。因而从最大程度上满足了临床工作的需求，更好地方便一线临检操作者的使用。

4.稳定性试验结果

(1)常温稳定性试验结果

1.1在2℃-10℃环境下稳定性试验结果

1.1.1产品批号：20111201

1.1.2产品批号：20111202

1.1.3产品批号：20111203

1.1.4产品批号：20111204

1.1.5产品批号：20111205

1.1.6产品批号：20111206

1.2在10℃-30℃环境下稳定性试验1.2.1产品批号：20111201

1.2.2产品批号：20111202

1.2.3产品批号：20111203

1.2.4产品批号：20111204

1.2.5产品批号：20111205

1.2.6产品批号：20111206

结论：将6批产品分别放置在2℃-10℃和10℃-30℃，在26个月内按期检测均能达到技术标准要求，因此能保证4-30℃24个月的贮存条件。

(2)加速稳定性试验

2.1产品批号：20111201

2.2产品批号：20111202

2.3产品批号：20111203

2.4产品批号：20111204

2.5产品批号：20111205

2.6产品批号：20111206

2.7结论：将6批产品放置在37℃恒温箱20天，经检测，产品性能均能达到技术标准要求，产品无明显变化。

(3)破坏性试验

3.1-20℃冰箱放置15天

3.1.1试验结果

产品批号：20111201

3.1.2结论

产品放置在-20℃冰箱15天，经检测，产品性能均能达到技术标准要求，产品无任何变化。

3.2 45℃水浴放置15天

3.2.1试验结果

产品批号：20111201

3.2.2结论

产品放置在45℃水浴箱15天，经检测，产品在第15天时检测虽也在标准范围之内，出现CT线下降趋势，因此产品在高温高湿条件不能超过15天。

4.开封试验结果

所用批号20111202

4.1湿度＜20％，温度25±5℃试验结果

4.2湿度20-60％，温度25±5℃试验结果

4.3湿度60-80％，温度25±5℃试验结果

4.4湿度80-100％，温度25±5℃试验结果

4.5试验结论：

根据以上结果，产品开封后湿度＜20％和20-60％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在8小时之内检测是合格的；湿度60-80％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在2小时之内检测是合格的；湿度80-100％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在1小时时出现液体移行速度慢，灵敏度弱，假阳和假阴。因此，试纸条从包装内取出后应尽快进行试验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。

稳定性试验结论：

1.该产品于原包装常温4℃-30℃储存条件下放置26个月，其物理检查、最低检出量、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和重复性均符合产品技术要求的要求。

2.该产品在37℃恒温箱放置20天，其物理检查、最低检出量、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和重复性完全符合产品技术要求的要求。

3.该产品在-20℃冰箱放置15天，其物理检查、最低检出量、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和重复性完全符合产品技术要求的要求。

4.该产品在45℃水浴箱下放置15天，其C、T线色度有下降趋势，但其物理检查、最低检出量、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和重复性仍符合产品技术要求的要求，但是考虑其条件对产品性能有影响，建议产品应避光干燥处密封贮存，谨防高温、受潮。

5.产品开封后湿度＜20％和20-60％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在8小时之内检测是合格的；湿度60-80％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在2小时之内检测是合格的；湿度80-100％的条件下，测试条暴露在空气中的时间在1小时时出现液体移行速度慢，灵敏度弱，假阳和假阴。因此，试纸条从包装内取出后应尽快进行试验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。

4.临床考核结果

表4考核试剂与金标准临床研究的结果统计

阳性符合率：A/(A+C)×100％＝99.2％

阴性符合率：D/(B+D)×100％＝99.6％

假阳性率：B/(B+D)×100％＝0.4％

假阴性率：C/(A+C)×100％＝0.8％

总体符合率：(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝99.4％

表5临床试验中的干扰样本和交叉样本试验的结果统计

表6临床试验中血清、血浆和全血样本一致性的结果统计

结果分析：申请人选择一家省级医疗单位、一家寄生虫病防治所及一家疾病预防控制中心，对1079例临床样本进行了检测，其中登革病毒NS1阳性样本362例，登革病毒NS1阴性样本717例。登革病毒阳性符合率99.2％，阴性符合率为99.6％，总体符合率为99.4％。X²检验结果显示临床研究产品与金标准核酸检测方法或抗原检测方法用于临床样本的检测结果无统计学差异。本实用新型的登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)与金标准核酸检测方法或抗原检测方法相比较无统计学差异。同时也验证了巨细胞样本、艾滋样本、丙型肝炎样本、乙型肝炎样本、溶血样本、高血脂样本、高胆红素样本等临床常见病理样本对本产品无干扰或交叉反应。因此本实用新型有良好的临床灵敏度和临床特异性。通过本次试验检测90例同一受试者的血清、血浆和全血样本，表明本实用新型的登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)在检测血清、血浆和全血样本时无差异。

结论

通过上述一家省级医疗单位、一家寄生虫病防治所及一家疾病预防控制中心1079例临床样本的考核，结果表明本实用新型的“登革病毒NS1抗原检测试剂盒(胶体金法)”灵敏度高，特异性好。并且该试剂盒检测方便快速，相对价廉，而且多个样本可同时进行检测，不需特殊仪器，非常适合于医院、卫生所的使用。

以上详细描述了本实用新型的较佳的具体的实施例。应当理解，本领域普通技术人员无需付出创造性的劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡是本领域技术人员依照本实用新型的构思在现有技术的基础之上通过逻辑分析、推理或者是有限次的实验可以得到的技术方案，皆应在本实用新型权利要求书所确定的保护范围之内。

Claims

1.一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金检测试纸条，其特征在于，所述试纸条在高度方向上包括基板支撑层、反应试剂载体吸附层，反应试剂载体吸附层固定在基板支撑层上，且从手持端到加样端依次设有手持端吸水材料垫，硝酸纤维素药膜，金标纤维垫，样品纤维垫，在金标纤维垫和手持端吸水材料垫上覆盖有保护膜层，在硝酸纤维素药膜上印制有条状的且与试纸条长度方向垂直的检测线和质控线，从手持端到加样端，硝酸纤维素药膜依次包被有检测登革NS1抗原的质控线C线和检测线T线。

2.根据权利要求1所述的胶体金检测试纸条，其特征在于，所述试纸条金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗登革NS1单抗2，检测线T线上包被有抗登革NS1单抗1，质控线C线上包被有抗鼠IgG多抗。

3.根据权利要求2所述的胶体金检测试纸条，其特征在于，所述金标纤维垫上包被胶体金标记的抗登革NS1单抗2的标记浓度为10-20ug/ml，所述检测线T线上包被抗登革NS1单抗1的包被浓度为1.0-2.0mg/ml，所述质控线C线上包被抗鼠IgG多抗的包被浓度为1.0-2.0mg/ml。

4.一种快速检测登革病毒NS1抗原胶体金试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一所述的胶体金检测试纸条。

5.根据权利要求4所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，还包括由盒体和盒盖构成的盒封闭体，所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽。

6.根据权利要求5所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述盒盖上设有加样孔和结果观察孔；当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫；对应于结果观察孔处为硝酸纤维素药膜。

7.根据权利要求6所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为长方形、椭圆形、半圆形或圆角矩形。