CN109813885A - 一种牛布鲁氏菌病和牛结核病二联试纸条检测卡 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种同时检测牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ‑干扰素的胶体金试纸条检测卡，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标抗γ‑干扰素单抗MT307和金标兔抗牛二抗的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有牛结核病检测线、布鲁氏菌病抗体检测线和质控线，其中牛结核病检测线包被有抗γ‑干扰素单抗MT17.1，布鲁氏菌病抗体检测线包被有布鲁氏菌脂多糖抗原，质控线C包被有羊抗鼠IgG。本发明提供的检测卡可以有效的检测牛布鲁氏菌病和牛结核病。

Description

一种牛布鲁氏菌病和牛结核病二联试纸条检测卡

技术领域

本发明属于动物疫病检测制品技术领域，具体一种牛布鲁氏菌病和牛结核病二联试纸条检测卡。

背景技术

布鲁氏菌病是一种人兽共患病，不仅危害牛、羊、猪等各种动物，造成严重经济损失，还会通过发病动物或畜产品将疾病传染给人，造成人的发热、睾丸炎、流产和关节炎等病症，严重者甚至丧失劳动和生育能力。近年来我国人布鲁氏菌病流行严重，而人布鲁氏菌病的唯一传染来源即为动物布鲁氏菌病。控制动物布鲁氏菌病的主要方法为检出阳性动物并及时淘汰。牛布鲁氏菌病是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，目前我国牛布鲁氏菌病的诊断方法主要有虎红平板试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光偏振试验等。但这些方法均为实验室检测方法，在牛场等基层应用较为困难。

牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核病中约5％是由牛分枝杆菌引起。因此检疫淘汰感染牛、控制牛结核病的传播具有重要的公共卫生意义。目前应用最广泛的牛结核病检疫方法是结核菌素皮内变态反应和牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术。其中皮内变态反应操作繁琐，耗时较长，难以满足牛结核病大量检疫的需求。牛结核病γ-干扰素ELISA检测技术的特异性和敏感性均高于皮内变态反应，结果更为客观、可靠，现已被OIE批准为皮内变态反应的试验的替代试验。该方法的第一步是制备刺激上清，第二步是使用ELISA方法检测制备的刺激上清。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的可以同时检测牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ-干扰素的快速胶体金试纸条检测卡，通过检测刺激上清中牛布鲁氏菌病抗体和γ-干扰素的含量，来同时诊断牛布鲁氏菌病和牛结核病。

本发明所提供的牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡，包括载体板(底板)、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标抗γ-干扰素单抗MT307和金标兔抗牛二抗的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有牛结核病检测线(T1)、布鲁氏菌病抗体检测线(T2)和质控线(C)，其中牛结核病检测线包被有抗γ-干扰素单抗MT17.1，布鲁氏菌病抗体检测线包被有布鲁氏菌脂多糖抗原，质控线C包被有羊抗鼠IgG。

其中牛结核病检测线的单抗MT17.1浓度为1mg/mL；

布病检测线的脂多糖抗原的浓度为0.5mg/mL；

质控线的羊抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL。

附图说明

图1、本发明布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ干扰素胶体金试纸条检测卡的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：制备牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡

一、所需仪器以及试剂

1 XYZ-3000三维喷点仪:美国Biodot公司产品。

2金标耗材：检测卡、玻璃纤维、吸水棉、支持扳，上海金标公司产品。

3氯金酸：由上海化学试剂公司提供，用去离子水配成1％溶液使用。

4单抗：Mabtak MT17.1和MT307单抗。

5布鲁氏菌脂多糖抗原：实验室自己制备。

6兔抗牛抗体：SIGMA公司产品。

7羊抗鼠抗体：SIGMA公司产品。

8硝酸纤维素薄膜(NC)膜:FF170，Millipore公司产品，

9切割机：美国Biodot公司产品。

10压膜机：美国Biodot公司产品。

11封口机：上海森合包装器材有限公司。

12稀释液：0.1％TBS，自己配制。

13牛血清蛋白：购自Sigma公司。

14柠檬酸三钠：购自中国上海试剂一厂。

15冷冻离心机：Sigma公司。

二、金标垫制备

1胶体金的制备：100mL去离子水置于洁净的锥形瓶中，加入1mL1％的氯金酸，颜色由黄色变为紫红色后，继续煮沸3-5min，取下冷却至室温，避光4℃保存备用。

2金标垫制备

2.1用0.1M的碳酸钾调胶体金PH8.8，分别取1mL胶体金置10个1.5mL离心管中，充分摇匀后每个离心管加入0.1mL的NaCL，观察2h，以颜色由红变蓝的前一管蛋白含量即为稳定1mL胶体金所需的蛋白量。本试验稳定1mL胶体金所需的兔抗牛抗体量为1.0uL，标记时增加20％蛋白用量，即1.0×(1.0+20％)＝1.2uL；稳定1mL胶体金所需的单抗MT307量为2.0uL，标记时增加20％蛋白用量，即2.0×(1.0+20％)＝2.4uL。

2.2取120uL兔抗牛抗体，加入少许去离子水，用K₂CO3溶液调其PH为9.0(用精密PH试纸测PH值)，同时将胶体金溶液的PH值调至9.0。在磁力搅拌下，将100mL胶体金溶液加入至抗体中，继续搅拌10min，置4℃冰箱保存备用。

2.3取240uL单抗MT307，参照2.2方法，制备金标单抗MT307。

2.4分别将金标兔抗牛抗体和金标单抗MT307以2500r/min离心15min(以除去其中的胶体金聚合物)取上清液，以10000r/min离心1h,可见离心物分为3层，上清液含有大量的尚未结合的抗体，最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚集物。中间呈黄红色的絮状沉淀物即为结合良好的胶体金-抗体复合物，也即金标抗体。倾去上清液，收集絮状沉淀物，用含0.1％犊牛血清白蛋白(BSA)的0.01M pH8.2磷酸盐缓冲液(PB)混悬至原量，同上重复离心2次，最后收集分别收集金标兔抗牛抗体和金标单抗307，用0.01M pH8.2PB液混悬为原体积的10％，滤膜除菌，分装，于4℃冰箱保存备用。

2.5应用XYZ-3000三维喷点仪中的Airjet喷制胶金抗体棉。将玻璃纤维放于XYZ-3000三维喷点仪的平台上，用pH8.2 0.1％TBS将金标兔抗牛作1：2稀释，金标单抗307作1：1稀释，将稀释后的金标抗体混合，放于样品池A中，将置于平台上的玻璃纤维展平，并放上压条，58℃干燥后，加入干燥剂和变色硅胶，密封保存于4℃冰箱中。

三、印膜的制备

单抗MT17.1用于牛结核病检测线的显示，脂多糖抗原用于布鲁氏菌病抗体检测线的显示，羊抗鼠抗体用于质控线的显示。将FF170硝酸纤维素膜放于XYZ-3000三维喷点仪平台上，将单抗MT17.1用0.01M pH9.0TBS液作1:1稀释后放于样品池B，羊抗鼠抗体用0.01MpH9.0TBS液作1：2稀释后放于样品池C。将置于平台上的硝酸纤维素膜展平，并放上压条，牛结核病检测线与质控线相距0.5cm，位于膜的中间，距膜的边距分别为0.75cm。开机后用Biojet1和Biojet2将单抗MT17.1及羊抗鼠抗体分别点射于膜上形成两条线。然后将样品池B充分洗涤后，将布鲁氏菌脂多糖抗原用0.01M pH9.0TBS液作1:2稀释后放入，如上在牛结核病检测线与质控线正中间点射于膜上形成布鲁氏菌病抗体检测线。置室温自然干燥后，密闭保存备用。

四、检测卡的组装

1印膜的粘贴:将印膜平贴于8cm×30cm支持板的中央，两端边距各为3cm。要注意伸展平贴，贴后不能有空隙或气泡。

2金标垫粘贴(试纸板样品端):将1cm×30cm的胶金抗体棉平贴于印膜阳性线的下方，重叠印膜0.25cm。

3吸水棉的粘贴(试纸板吸水端、手柄端):将3.25cm×30cm吸水棉平放于印膜对照线的一端，重叠NC印膜0.25cm。

4试纸板压膜:把粘贴好的试纸板放于压膜机的凹陷处,盖好压膜机,真空压膜5min,取下,将试纸板密闭保存备用。

5试纸条的切割：将切割机启动，选择试纸条宽度(0.4cm)及切割速度，将试纸板放入槽内，进行切割。

6组装检测卡：将切割好的试纸条装入检测卡内，注意使检测线和质控线均在检测卡的结果区，胶体金垫在加样孔的靠近结果区的一侧。

7外包装：将检测卡、稀释液(0.01M PH7.4PBS)、使用说明书、干燥剂共同放入包装袋中，用封口机封口，贴上标签，完成外包装。

实施例2：牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡的使用方法

一、使用方法：

(一)刺激上清的制备方法

1采血，采集牛的血液(至少2mL)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养。

2加样，将抗凝血加入24孔组织培养板，每孔1.5mL抗凝血。

3加入刺激抗原，每孔无菌加入100μL牛PPD。

4孵育，将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。

5收样，用移液器小心吸取约400μL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中作为刺激上清。

(二)检测卡使用方法

1组成

检测卡、稀释液、使用说明书，干燥剂，外包装。

2使用方法

(1)取出检测卡，放于洁净的平台上；

(2)取10uL刺激上清加入到样品孔(S)中；

(3)约经10秒左右，垂直加入6滴稀释液；

(4)20分钟后观察结果。

3结果判定

检测卡上只在对质控线(C)上出现一条红线，表示为布鲁氏菌病和牛结核病均为阴性结果；

检测卡上在牛结核病检测线(T1)和质控线上出现两条红线，表示为牛结核病为阳性结果，牛布鲁氏菌病为阴性结果；

检测卡上在布鲁氏菌病抗体检测线(T2)和质控线(C)上出现两条红线，表示为牛布鲁氏菌病为阳性结果，牛结核病为阴性结果；

检测卡上在牛结核病检测线(T1)、布鲁氏菌病抗体检测线(T2)和质控线(C)上均出现红线，表示牛结核病、布病均为阳性结果；

检测卡上未出现红线，表示试验失败，需要重新取卡检测。

二、胶体金试纸条检测卡的检测敏感性

(一)本发明的布鲁氏菌病敏感性试验

取60份布鲁氏菌病阳性刺激上清，使用本发明的胶体金试纸条检测卡测定，仅有2份为阴性，试纸条检测卡的敏感性为96.6％。

(二)本发明的牛结核病敏感性试验(与γ-干扰素ELISA试验相比)

60份γ-干扰素ELISA试剂盒的阳性中，检出胶体金试纸条检测卡阳性44份，相对敏感性为73.3％。检测牛结核病γ-干扰素ELISA试剂盒的阳性刺激上清，OD值≥0.3的样品，在胶体金试纸条检测卡中呈阳性结果，反之则呈阴性结果。

三、特异性试验

使用90份布鲁氏菌病阴性刺激上清进行胶体金试纸条检测卡检测，其中有2份为阳性，胶体金试纸条检测卡的特异性97.8％。用不同阰次制造的胶体金试纸条检测卡对结核病、副结核病和口蹄疫病的病牛刺激上清各10份，用胶体金试纸条检测卡进行检测，布鲁氏菌病抗体检测线上均无线显现，即与上述细菌和病毒病均无交叉反应。见表1。

表1：本发明的布鲁氏菌病抗体检测线特异性试验结果表

(二)本发明的牛结核病特异性试验(与γ-干扰素ELISA试验相比)

70份γ-干扰素ELISA试验的阴性样品中，用胶体金试纸条检测卡检出阳性2份，相对特异性为97％。应用布鲁氏菌病阳性牛、副结核病阳性牛的刺激上清各10份，用本胶体金试纸条检测卡进行检测，10份布鲁氏菌病阳性牛刺激上清在牛结核病检测线上均无线显现，10份副结核病刺激上清中有2份在牛结核病检测线上有线显现，其他均为无线显现(见表2)。证实牛结核病检测线与布鲁氏菌病阳性牛没有交叉反应，与副结核病阳性牛存在一定的交叉反应。

表2：特异性试验结果

四、与其他方法的符合率试验

(一)本发明布鲁氏菌病试验与其他方法的符合率试验。

用布鲁氏菌病清净牛场的健康牛刺激上清30份，阳性牛刺激上清30份，分别用平板凝集试验和本发明的胶体金试纸条检测卡进行检测，结果显示，它们的符合率为100％。见表3。

表3：符合率试验结果(单位：份)

(二)本发明牛结核病试验与皮内变态反应的符合率试验

取30份变态反应阳性牛的刺激上清，和30份变态反应阴性牛的刺激上清，用本发明胶体金试纸条检测卡进行检测，结果30份变态反应阴性牛在牛结核病检测线上均无线显现，30份变态反应阳性牛中，有24份在牛结核病检测线上有线显现。结果显示，本发明的牛结核病试验与变态反应试验的符合率为80％[(24+30)/(30+30)]。见表4。

表4：符合率试验结果(单位：份)

五、本发明重复性试验

用本胶体金试纸条检测卡检测健康牛(布鲁氏菌病、结核均为阴性)刺激上清10份，牛结核病阳性刺激上清5份，布鲁氏菌病阳性刺激上清5份；不同的人进行检测，结果见表5。用3个不同阰次生产的胶体金试纸条检测卡对上述刺激上清进行检测，其检测结果完全一致。见表6。证明本胶体金试纸条检测卡检测牛结核病时具有较好的重复性。

表5：不同人的检测结果

表6：不同批次试纸条的检测结果表

六、保存期试验。

将胶体金试纸条检测卡置室温保存，每隔2个月检测布鲁氏菌病阳性刺激上清、牛结核病阳性刺激上清和阴性刺激上清各5份，结果见表7。证明本胶体金试纸条检测卡在室温下保存可达12个月。

表7：保存期试验结果

Claims (4)

1.一种牛布鲁氏菌病抗体和牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡，其特征在于，所述的检测卡包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标抗γ-干扰素单抗MT307和金标兔抗牛二抗的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有牛结核病检测线T1、布鲁氏菌病抗体检测线T2和质控线C，其中牛结核病检测线包被有抗γ-干扰素单抗MT17.1，布鲁氏菌病抗体检测线包被有布鲁氏菌脂多糖抗原，质控线C包被有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述的牛结核病检测线的单抗MT17.1浓度为1mg/mL。

3.如权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述的布病检测线的脂多糖抗原的浓度为0.5mg/mL。

4.如权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述的质控线的羊抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL。