CN103694346B - 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体及其编码基因和应用，所述抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ？ID？NO.5～7所示，所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ？ID？NO.8～10所示。本发明还提供了所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体在制备检测、预防、治疗人乳头瘤病毒相关疾病的试剂、药物中的应用。本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体与人乳头瘤病毒L1蛋白具有高亲和力，能用于检测和治疗人体疾病。

Description

抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体及其编码基因和应用。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，缩写HPV）是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒。HPV病毒由蛋白衣壳这层外衣和被包裹着的双链环状的DNA核心构成。蛋白衣壳由主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）组成。1949年，Strauss首先在电镜下观察到HPV颗粒，它呈球形，其20面体对称，直径约45-55nm。

HPV的基因组包含约8000个碱基对。HPV基因组包括8个早期开放读码框架（Open Reading Frame，简称ORF）（即E1--E8）、2个晚期读码框架（ORF）和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。研究发现某些HPV型别E6、E7编码的E6、E7蛋白分别与抑癌基因p53和Rb结合，引起上皮细胞（如宫颈上皮细胞）增殖失控。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。

根据病毒分析已经发现100余种类型的人乳头状瘤病。目前基因组序列已经确定的HPV型别约有80余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV。低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，不引起临床症状或引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤等；而高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68等型别，与被感染的上皮细胞高度病变包括肿瘤的发生有很高的相关性，尤其是HPV16和18型。这些类型的人乳头状瘤病毒主要与生殖道恶性病变的发生有关，如子宫颈癌、肛门癌、阴道癌和阴茎癌。此外，高危型HPV发现与某些口腔和咽喉癌有关。

HPV感染生殖道是一个长期的过程，可潜伏在细胞内若干年，一旦机会成熟(如宿主机体免疫力降低)，潜伏的病毒可恢复活动。HPV感染过程通常分为潜伏感染期、亚临床感染期、临床症状期和HPV相关的肿瘤期。宫颈癌也有一系列的前驱病变，即宫颈上皮不典型增生，在病理上称宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，缩写CIN），通常又根据严重程度分成三级：宫颈上皮内轻度瘤变（CIN I）、宫颈上皮内中度瘤变（CINII）和宫颈上皮内高度瘤变（CIN III），这些癌前病变均有可能发展为宫颈浸润癌。

HPV的感染过程有其特殊性。HPV病毒的繁殖往往仅限于处于末端分化的鳞状上皮细胞内，此外，HPV病毒能在相当长时间内延迟人体对其产生免疫反应(Schill JT,Day PM,Kines R.(2010)Current understanding of themechanism of HPV infection.Gynecol.Oncol.118:S12-S17.)。近年来HPV感染过程研究的长足发展得益于现代分子生物学的进展。Kirnbauer等证明(Kirnbauer R,Booy F,Cheng N,Lowy DR,Schiller JT.(1992)PapillomavirusL1major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highlyimmunogenic.Proc Natl Acad Sci USA.89:12180–12184.)主要衣壳蛋白（L1蛋白）单独表达或者与次要衣壳蛋白（L2蛋白）共表达均可自组装成无感染性的空衣壳病毒样颗粒（virus-like-particle，简称VLP），并具有很高的免疫原性。VLP可以有效地通过多种上皮细胞和培养的细胞系表面的受体与细胞相结合[Roden RB,Kirnbauer R,Jenson AB,Lowy DR,Schiller JT.(1994)Interaction of papillomaviruses with the cell surface.J Virol.68:7260–7266.]。这种VLP结构与天然的病毒颗粒相似，具有与完整病毒相同的抗原空间表位，可感染诱导动物模型或人体产生高滴度的中和抗体，以保护机体免受感染。

L1衣壳蛋白的这一特性为开发预防性HPV疫苗提供了良好的手段(Suzich JA,Ghim SJ,Palmer-Hill FJ,White WI,Tamura JK,Bell JA,et al.(1995)Systemic immunization with papillomavirus L1protein completelyprevents the development of viral mucosal papillomas.Proc Natl Acad SciUSA.92:11553–11557;Kirnbauer,R,Chandrachud LM,O’Neil BW,WagnerER,Grindlay GJ,Armstrong A,McGarvie GM,Schiller JT,D.R.Lowy,Campo MS.(1996)Virus-like particles of bovine papillomavirus type4inprophylactic and therapeutic immunization.Virology219:37–44;和Schiller JT,Lowy DL.(2006)Prospects for cervical cancer prevention by humanpapillomavirus vaccination.Cancer Res.66:10229–10232)。

VLP诱导产生的抗体可以有效地预防乳头瘤病毒的感染[BreitburdFKR,Hubbert NL,Nonnenmacher B,Trin-Dinh-Desmarquet C,Orth G,Schiller JT,et al.(1995)Immunization with virus-like particles from cottontailrabbit papillomavirus(CRPV)can protect against experimental CRPVinfection.J Virol.69:3959–3963;和Suzich JA,Ghim SJ,Palmer-Hill FJ,White WI,Tamura JK,Bell JA,et al.(1995)Systemic immunization withpapillomavirus L1protein completely prevents the development of viralmucosal papillomas.Proc Natl Acad Sci USA.92:11553–11557]。研究表明，抗VLP的单克隆抗体也能有效地中和HPV病毒对人细胞的感染性(Day PM,Thompson CD,Buck CB,Pang YY,Lowy DR,Schiller JT.(2007)Neutralization of human papillomavirus with monoclonal antibodies revealsdifferent mechanisms of inhibition.J Virol.81:8784–8792.)。

此外，有研究表明检测HPV L1蛋白在宫颈人乳头状瘤病毒感染的诊断和预后判定中的也有作用(贾咏存,樊杨，纳文霞（2010）.HPV L1检测在宫颈人乳头状瘤病毒感染预后判定中的作用。《宁夏医学杂志》8：688-690]；[齐瑞玲,贾晓云,唐思源(2012)人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测对宫颈疾病诊断价值.《中华实用诊断与治疗杂志》26(8):785-786]；[史健，邓宽国，刘玉霞，尹石华(2010)人乳头瘤病毒及其L1蛋白检测在宫颈病变诊断中的应用。医学检验与临床.21(6):70-76]。

因此，获得能检测与中和人乳头瘤病毒的全人源抗L1衣壳蛋白抗体对于检测和治疗HPV引起的疾病显得非常有意义。

发明内容

本发明提供了一种抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，该抗体为全人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，与人乳头瘤病毒L1蛋白(衣主要壳蛋白)具有高亲和力，特异性好。

一种抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GGSIRSGDY、SYSGT、TVDSGYDFIPDWFHP；所述轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为SGSNSNIGNSYVH、RNNQRPS、AAWADSLGTYV。

CDRH1位于重链可变区第26～34位，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；CDRH2位于重链可变区第54～58位，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDRH3位于重链可变区第100～114位；氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

CDRL1位于轻链可变区第23～35位，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；CDRL2位于轻链可变区第51～57位，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；CDRL3位于轻链可变区第90～100位，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区（CDR），不同重链、轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。

优选的，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体可以为全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述的全抗体优选为IgG1型；所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体，更优选为单链抗体。

抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用。其中，单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。

抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白单链抗体的制备方法为：采用公开号为CN1444651A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体。

本发明还提供了编码所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体的基因，其中，编码重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体为pACT2或pET27b。

本发明还提供了所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体在制备预防、治疗人乳头瘤病毒相关疾病的药物中的应用。

本发明还提供了所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体在制备检测人乳头瘤病毒相关疾病的试剂中的应用。

本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体能特异地结合人乳头瘤病毒L1蛋白，检测HPV感染的细胞。其中，利用全长重组的人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体能检测HPV感染的细胞，因此，可利用本发明的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体来制备检测人乳头瘤病毒相关疾病的试剂。

另外，研究发现，HPV抗体能够有效地中和HPV病毒对人细胞的感染性，因此，可利用本发明高亲和力的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体制备药物，以预防、治疗人乳头瘤病毒相关疾病。

其中，在上述两种应用中，所述人乳头瘤病毒相关疾病可以为任何与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关（直接或间接引发）的疾病，如子宫颈癌、肛门癌、阴道癌、阴茎癌、口腔癌、咽喉癌等。进一步的，所述人乳头瘤病毒相关疾病具体为人乳头瘤病毒引起的宫颈上皮内瘤变或宫颈癌，更进一步的，所述人乳头瘤病毒相关疾病可以为与16型人乳头瘤病毒感染相关的疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体是能用于检测HPV感染，也可以用于预防、治疗人体疾病的全人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，亲和力高，能特异结合人乳头瘤病毒L1蛋白，因此，可制成药物或试剂，有效检测、预防和治疗HPV感染引起的疾病。

附图说明

图1为本发明单链抗体的结构示意图。

图2为本发明在昆虫sf9细胞所表达的人乳头瘤病毒16型L1蛋白在SDS-PAGE后Coomassie兰染色结果。其中，第1道：空载体感染后sf9细胞总蛋白；第2道：含HPV16-L1的载体感染后sf9细胞总蛋白；第3道：纯化后的HPV16型L1蛋白。

图3为本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白单链抗体#H16L1-A的ELISA检测结果。

图4为本发明抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体YFH16L1-A的WesternBlot结果；其中，第1道：正常宫颈细胞样本；第2道：CIN2期患者的宫颈脱落细胞；第3道：CIN3期患者的宫颈脱落细胞；第4道：宫颈癌患者的宫颈脱落细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1抗人乳头瘤病毒L1蛋白单链抗体的筛选

采用公开号为CN1444651A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人乳头瘤病毒L1蛋白单链抗体，具体实施过程如下：

1扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA

以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA（购自Clontech）为模板，利用oligo（dT）和随机引物（random primers），使用逆向转录酶试剂盒（购自Clontech），根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。

以上述cDNA为模板，利用一系列识别人抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因的引物，进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：

第一组为扩增人抗体重链可变区（VH）基因的5’-端引物（SEQ IDNo.11～17），包括：

VH1b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；

VH2b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；

VH3b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’；

VH4b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C(C/T)-3’；

VH5b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3’；

VH6b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；

VH7b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3’；

第二组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.18～23），包括：

VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；

VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；

VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；

VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；

VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；

VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；

第三组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物（SEQ IDNo.24～32），包括：

VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；

VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；

VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’；

VL4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；

VL5b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；

VL6b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；

VL7b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；

VL8b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；

VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；

第四组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.33～34），包括：

VL1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；

VL2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；

第五组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物（SEQ IDNo.35～38），包括：

VK1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；

VK2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；

VK3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；

VK4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；

第六组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物（SEQ IDNo.39～42），包括：

VK1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’；

VK2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3’；

VK3f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3’；

VK4f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’。

扩增人抗体中的重链可变区(VH)时，利用第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应；扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时，利用第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时，利用第五组引物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。

第一组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2（Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,Zhou H,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.）（Hua SB,Qiu M,ChanE,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.）多克隆位点的上游同源序列（下划线部分）；第四组和第六组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2多克隆位点的下游同源序列（下划线部分）；而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列（下划线部分），连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。

扩增时，PCR反应体系与反应条件均相同，PCR反应体系为：

将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为：94℃解链1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环30次。

2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列

（1）以步骤1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物，序列为：

上游引物（引物7，SEQ ID No.43，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列）：

5’-ACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTGTATGGCTTACCC ATACGATGTTCCAGATTAC-3’；

下游引物（引物8，SEQ ID No.44，下划线部分为连接肽反链序列）：

5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCC GCCTGATCCACCACCGCC-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含5’-载体pACT2多克隆位点的上游同源序列和3’-连接肽反链序列的人抗体重链可变区DNA序列。

（2）以步骤1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物，序列如下：

上游引物（引物10，SEQ ID No.45，下划线部分为连接肽顺链序列）：

5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGG CAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；

下游引物（引物9，SEQ ID No.46，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列）：

5’-GAGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGAACTTGCGGGGT TTTTCAGTATCTACGA-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含3’-载体pACT2多克隆位点的下游同源序列和5’-连接肽顺链序列的人抗体轻链可变区DNA序列。

3连接单链抗体

将步骤2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合，以该混合DNA为模板，分别以引物7和引物9为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。

如图1所示，反应完成后得到包括人抗体重链可变区DNA序列、轻链可变区DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体（scFv）DNA。

4构建人单链抗体基因文库

将步骤3得到的单链抗体（scFv）DNA与经限制性内切酶（Bam HI和Eco RI）处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法（Yeast Protocol Handbook,PT3024-1）共同转入酵母菌株Y187（MATα，ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,met-,URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lac Z,MEL1）内，经细胞内同源重组后将单链抗体DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体文库，单链抗体DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域（Activation Domain，AD）融合在一起。

为检查该单链抗体基因文库的质量，从中随机挑出了21个克隆，对插入片段进行测序分析。分析结果表明，所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体DNA片段，而且所有单链抗体DNA序列都是独特的。

经同源重组而得到的酵母双杂交单链抗体基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×10⁸个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。

5筛选抗体

（1）抗体筛选

使用人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白(衣壳主要蛋白)作为抗原，对酵母双杂交单链抗体基因文库进行抗体筛选。

将编码人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白的DNA（序列见GenBank的ID号U89348）重组到载体pGBKT7中，构建pGBK-H16L1。pGBK-H16L1编码Gal4DNA结合区域（Binding Domain，简称BD），并在其C端融合了人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白。

在编码人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白的DNA序列得到验证后，将pGBK-H16L1质粒DNA转化入酵母菌株AH109（MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3,GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2,URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lac Z）；带有pGBK-H16L1质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基（SD/-W）上生长。

将等量的含pGBK-H16L1的MATa型酵母细胞（AH109菌株）与含单链抗体基因文库的MATα型酵母细胞（Y187菌株）进行共同培养，使此二型细胞交配结合。由于载有单链抗体基因文库的pACT2载体含有Leu2基因，且pGBK-H16L1包含Trp1基因，因此，包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基（SD/-LW）。

存在单链抗体scFv与L1蛋白相互作用的酵母细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基（SD/-AHLW）上，并在该平板培养基上形成菌落。

（2）特异性抗体筛选

1）β半乳糖苷酶分析?

由于存在scFv与L1蛋白相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lac Z，因此检测酵母细胞内β半乳糖苷酶是否表达可判断酵母细胞内scFv/L1蛋白的存在。

在筛选培养基（SD/-AHLW）上总共挑选出67个菌落，使用β半乳糖苷酶检测法检测lac Z表达。检测方法如下：

①将存在scFv/L1蛋白相互作用的酵母接种到筛选培养基（SD/-AHLW）平板上生长；

②将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上；

③将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂；

④将滤纸从液氮中取出，并置于30℃的烘箱内；重复步骤（3）和（4）两次；

⑤将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37℃的温箱内约15分钟；若菌落处显示蓝色，表明为β半乳糖苷酶阳性，即lac Z基因被激活表达。

其中，X-gal溶液配方如下：

16.1g/L Na₂HPO₄·7H₂O；

5.50g/L NaH₂PO₄·H₂O；

0.75g/L KCl；

0.246g/L MgSO₄·7H₂O；

35mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)；

5mMβ-巯基乙醇；pH7.0。

检测结果：上述挑选出的67个菌落中，有37个是β半乳糖苷酶阳性，

表明在这些菌落中报告基因lacZ被激活了。

2）特异结合分析

对上述37个β半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以验证单链抗体scFv是否特异性地与人乳头瘤病毒L1蛋白结合。

从上述37个β半乳糖苷酶阳性的酵母中提取含有scFv的pACT2质粒DNA，再分别与pGBKT7空载体DNA、pGBKT-IRα质粒DNA、pGBKT-Lam质粒DNA（编码Gal4DNA结合区域并在其C端融合有人核纤层蛋白C）共同转化到AH109酵母细胞内；转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上；对长出的菌落作β半乳糖苷酶分析，验证为阳性的菌落视为含有非特异性的scFv，将其剔除。?

经上述特异性分析后，得到一个对人乳头瘤病毒L1蛋白具有特异性的单链抗体，编号为#H16L1-A，使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析，结果显示：

#H16L1-A的重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.3所示。

#H16L1-A的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID No.1）为：

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRSGDYFWSWIRQSPGKGLECIGYISYSGTTYCNPSLQRRVTISVDTSKNQFNLKLKSVTAADTAVYYCARTVDSGYDFIPDWFHPWGQGTLVTVSS；

下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3（SEQ ID No.5～7）；

#H16L1-A的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No4所示。

#H16L1-A的轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID No.2）为：

QPGLTQPPSASGTPGQRITISCSGSNSNIGNSYVHWYQQLPGTAPKLLIQRNNQRPSGVPDRFFGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWADSLGT YVFGTGTKLTVL；

下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3（SEQ IDNo.8～10）。

实施例2重组人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白表达及兔子抗血清的制备

重组人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白的制备参照彭清林等(彭清林，张婷，范东升，郑伟，谢喜秀，许于飞，许雪梅(2009)“HPV18L1病毒样颗粒的表达纯化及其豚鼠抗血清的制备。”基础医学与临床，29:1039-1043)。简述之：将HPV16型L1编码DNA片段根据sf9昆虫细胞的密码子频率调整HPV16型L1编码DNA的密码子进行优化，优化后的编码DNA插入pFastBac Dual载体Xba I位点中获得重组载体pFastBac-HPV16L1。通过转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid。用重组Bacmid转染昆虫sf9细胞，27℃恒温培养箱中培养72小时后收集细胞培养上清，获得表达HPV16型L1蛋白的重组杆状病毒。利用空斑法测定病毒滴度后，以MOI=0.1感染细胞进行病毒富集。随后,用高滴度的病毒液感染sf9昆虫细胞，SDS-PAGE分析（见图2）。

重组病毒大量感染sf9细胞，72h后，收集感染细胞，超声破碎，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液，经CsCl密度梯度超速离心法纯化VLP(Shi W,Liu J,Huang Y等(2001)Papillomavirus pseudovirus:a novelvaccine to induce mucosal and systemic cytotoxic T-lymphocyte responses.JVirol75:10139-10148.)。最后用透析液(10mM HEPES,150mM NaCl)透析3小时得到纯化的HPV16型L1蛋白（见图2）。

兔子抗HPV16型L1血清的制备按照Harlow等的传统方法(Harlow E,和Lane D(1988)Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory出版社，第53页至第138页)。取纯化后的HPV16L1蛋白稀释至400微升后与等体积弗氏佐剂充分混匀乳化，分别于0、4、8和12周皮下多点注射免疫兔子。于最后一次免疫后1周进行静脉取血，ELISA检测血清抗体滴度，滴度达到预期后进行取血，收集血清。

实施例3特异性检测

1单链抗体表达与纯化

将单链抗体#H16L1-A的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中，构建得到pET27b-H16L1a；

将pET27b-H16L1a转化入表达细菌E.coli BL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG（0.5mM）诱导表达；表达出的目标蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔（periplasmic space）中；scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物，方便目标蛋白的纯化；

应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗人乳头瘤病毒HPV16型L1蛋白的单链抗体。

2ELISA测试单链抗体对HPV16型L1蛋白的特异性

昆虫细胞sf9表达并纯化后的HPV16型L1蛋白见上述实施例2。

ELISA测试方法如下：

（1）用HPV16型L1蛋白包被96-孔板，在2-8℃过夜；

（2）包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；

（3）将单链抗体#H16L1-A在0.02%BSA中作系列稀释后加入已包被有HPV16L1蛋白的96-孔中，与HPV16L1蛋白结合；

（4）将96-孔板清洗后，加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；

（5）将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；

（6）将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；

（7）用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱。

检测结果如图3所示，表明单链抗体#H16L1-A能有效地结合HPV16型L1蛋白。

实施例4抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体检测HPV感染宫颈脱落细胞

委托北京义翘神州生物技术有限公司制备全长重组人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体YFH16L1-A。YFH16L1-A为IgG1型，其可变区序列与单链抗体#H16L1-A的可变区序列相同。

正常宫颈细胞样本、宫颈上皮内瘤样病变II期（即CIN2期）、宫颈上皮内瘤样病变III期（即CIN3期）、和宫颈癌患者的宫颈脱落细胞均来自浙江大学医学院附属妇产科医院，并获得患者知情同意。

Western Blot分析全长人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体。约104宫颈脱落细胞经SDS-PAGE样品液处理后加样到10%的SDS-PAGE凝胶电泳系统。SDS-PAGE电泳后，把蛋白转移到硝酸纤维素膜上。然后，该膜用3%脱脂奶粉-磷酸缓冲液(pH7.4)封闭30分钟后，加入1ng/ml的全长重组人源抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体YFH16L1-A室温摇60分钟。该膜用磷酸缓冲液(pH7.4)清洗后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG(Zymed公司)(1:4000稀释)。Western Blot发光检测试剂盒购自PIERCE公司。检测结果如图4所示，表明抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体YFH16L1-A可特异性的检测被HPV感染的宫颈脱落细胞。

Claims (9)

1.一种抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，其特征在于，所述抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体为全抗体或全抗体的抗原结合部分。

3.如权利要求2所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，其特征在于，所述的全抗体为IgG1型。

4.如权利要求2所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体，其特征在于，所述的抗原结合部分为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体。

5.编码如权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体的基因，其特征在于，编码重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.含有如权利要求5所述的基因的重组载体。

7.含有如权利要求5所述的基因的表达系统。

8.如权利要求1～4任一所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体在制备预防、治疗人乳头瘤病毒相关疾病的药物中的应用。

9.如权利要求1～4任一所述的抗人乳头瘤病毒L1蛋白抗体在制备检测人乳头瘤病毒相关疾病的试剂中的应用。