CN101186636A - 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 - Google Patents
人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101186636A CN101186636A CNA2007101687139A CN200710168713A CN101186636A CN 101186636 A CN101186636 A CN 101186636A CN A2007101687139 A CNA2007101687139 A CN A2007101687139A CN 200710168713 A CN200710168713 A CN 200710168713A CN 101186636 A CN101186636 A CN 101186636A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hpv
- human papillomavirus
- shell protein
- short peptide
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种多肽,具体地说是一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽及其应用。其特征是:该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为:N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。本发明能够同时诱导对高危型和低危型均能产生免疫反应的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,它可以诱导形成针对多种型别人乳头瘤病毒(HPV)和外壳蛋白(HPVL1)的抗体,以便用于多种型别HPV或HPV L1的检测,这种抗体还可用于生物制药工程,用于多种型别HPV或HPV L1的纯化、制备。
Description
技术领域:
本发明涉及一种多肽,具体地说是一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽及其应用。
技术背景:
1933年人类首次发现人乳头瘤病毒(HPV),1978年,第一例生殖道HPV被鉴定。目前,根据人乳头瘤病毒(HPV)DNA序列表达基因不同,已确定的人乳头瘤病毒(HPV)亚型超过200种,其中,85种HPV的基因克隆被鉴定,另有120种的部分基因型被鉴定,并且,有30余种是从生殖道组织中分离得到。根据人乳头瘤病毒(HPV)感染的部位,分为皮肤型和粘膜型;根据其致病性的大小,分为高危型和低危型。高危型主要有HPV16、18、33、31、58和52等,与宫颈癌的发病有关,低危型主要有HPV6、11、42和44等,与生殖道疣状物有关。
目前,随着宫颈癌病因学的研究进展,其防治方法也在不断地提高和发展。在HPV疫苗尚未在人群中应用之前,普查仍是预防和控制宫颈癌的主要手段。大量研究表明人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是引起宫颈上皮癌变的主要危险因素,尤其是高危型HPV。随着检测技术的提高,宫颈癌组织中HPV的检出率高达99%,其中,HPV16占55%至60%,HPV 18占10%至12%,HPV 31和HPV 45分别占有4%至5%。因此许多学者提出把检测HPV作为宫颈癌的筛查手段。目前,HPV的检测主要有病理学变化、免疫组化、分子生物学技术和血清学检测等方法。
1.HPV感染宫颈的病理学改变
细胞病理学改变:在宫颈移行区取材,行巴氏染色,可见由HPV引起的挖空细胞,即可诊断。此方法简单易行,无痛苦,经济实用,可用于大规模普查和筛查。但其敏感性低,假阴性率高。近年来,已由传统的巴氏涂片发展成薄层巴氏涂片和涂片自动检测系统。此方法应用新的收集和制作过程,大大降低了结果的假阴性率。主要有以下:PAPNET系统、Auto Pap3000Qc、Thinprep2000和CYTORICH等。
组织病理学改变:对宫颈无明显癌变的可疑区取材做病理检查,当发现挖空细胞,就可诊断有HPV的感染,并可发现宫颈细胞是否有异型性,是宫颈癌及其癌前病变确诊的依据。
2.免疫组化检测HPV感染
取少量病变组织制成涂片,用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原,则抗原抗体结合。常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法(即PAP),此方法有较好的特异性,还能显示出病毒感染的部位,操作简单,有一定的诊断价值,但是检测率低,敏感性不高,且不能分型。另外,有学者在不典型鳞状细胞(ASCUS)患者的宫颈涂片和活检组织中加入抗P16抗体和克隆E6H4后进行免疫组化染色,发现巴氏涂片为ASCUS并且活检为鳞状上皮内瘤样变(SILs)的患者P16表达的强弱与HR HPV的病毒量密切相关,P16免疫染色检测HR HPV病毒量的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为95%、96%、91%、98%。P16的过度表达是HR HPV致病活跃的指示器。此法可作为宫颈癌普查中检测宫颈上皮细胞是否感染高危型HPV的可靠简单的方法。
3.分子生物学技术
3.1样本
分子生物学技术检测的样本通常是宫颈部的上皮组织,可以是用于细胞学检查的宫颈刮片或宫颈细胞拭子,这些生殖道脱落细胞为检材避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。但如果样本量不够,会影响结果的灵敏度,故大多数还是通过阴道镜下宫颈活检来获得样本。也有学者提出,宫颈癌患者的血液也可用来检测HPV DNA。但是,Patti Key通过实验指出:宫颈癌患者晚期,HPV DNA才释放到血液,即使被检测到,也无诊断学意义,它只对判定有无宫颈癌血液转移具有一定的参考价值。最近,B.K.Prusty等提出,宫颈外周的上皮及阴道正常的脱落细胞进入尿液,当有HPV感染时,这些脱落细胞中也会含有病毒基因或毒粒。收集尿液可直接用于PCR检测HPV DNA,他们对55名已婚妇女的尿液、宫颈刮片、活检组织分别进行PCR检查,结果发现三者中检测到的HPV阳性符合率接近100%。用尿液作为检测生殖性HPV的感染是一种有用简单无创伤性的方法,可进一步证实并被采用。
3.2检测指标
目前,检测的指标主要有以下三种:(1)HPV DNA检测:是最常用的检测指标,作为宫颈癌的初筛手段可更灵敏地检出宫颈癌及其癌前病变,其方法简单,客观性强。但是不能区分是持续性感染还是重新感染。(2)HPV mRNA检测:可以监测致癌基因如E6、E7的表达,这与疾病的恶化进程相关,当病变恶化,E6、E7mRNA的水平升高,但RNA稳定性差,不宜储存。HPV mRNA检测的敏感度高达100%,特异性为70%,但假阳性率较高。Lie AK等通过实验指出,对于低度病变,DNA检测的阳性率较高,而对于高度病变,mRNA检测的阳性率很高,mRNA检测似乎更适合预测宫颈病变的危险程度。(3)HPV病毒量:HPV病毒量被提出作为识别疾病的危险性的手段,但是存在争议,大多数研究还不能为每份样本的细胞数定下统一标准,因此,在进行有效的HPV病毒量评估前应调整标本中的细胞数。
3.3影响分子生物学实验结果的因素
HPV检测的结果会受诸多因素的影响。主要有以下几方面:(1)样品的来源:HPV检测的阳性率与取样患者的年龄段有关。另外,还与宫颈病变程度有关,收集样本的量也影响HPV检测的成败。(2)样本运输和储存的稳定性也很重要,检测的假阴性可由于内生的核酸内切酶使其核酸降解所造成。现有一些商业性样品储存液,如:PreservCyt(Cytyc Corp.),它可延长核酸在室温下的储存时间。(3)检测的方法:不同分子生物学实验方法检测宫颈中HPV的灵敏度和特异度也不同。引物为PGMY09/11和GP5+/6+(PGMY/GP+)的巢式PCR检测宫颈样品中的HPV DNA,与以MY/GP+为引物的巢式PCR相比较,发现前者更具有型特异性和敏感性,可检测更广泛的型别和复制低下的病毒。更好发现样本的多型病毒感染。(4)实验仪器和设备:发展中国家的仪器设备收集和分析样本,进行HPV检测的敏感性普遍低于发达国家。
3.4临床常用检测方法
3.4.1核酸分子杂交技术
原位核酸杂交(ISH):此技术是一种敏感、特异、相对简便的方法,又有细胞定位准的优点,能在亚细胞水平上定位特异性核酸分子序列,从细胞分子水平上来探讨HPV感染。例如:Narimatsu R等利用荧光原位杂交法(FISH)检测高度鳞状上皮内瘤样病变(HSIL)标本中HPV E6、E7 mRNA,结果显示,其灵敏度为83.3%,特异度为91.3%,均高于杂交捕获法(HC)(Digene公司)。
杂交捕获试验(HC):它利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。能检测13种高危型HPV,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。Zoltán Hernádi等用HC(Digene,USA)检测61名上皮内瘤样病变(CIN)患者治疗后宫颈中HPV DNA,发现43例HPV阴性者,最终没有发展成为CIN和持续性细胞不典型性增生(NPV=100%),结果提示,CIN治疗后HPV阴性说明消除了复发的危险。
第二代杂交捕获试验(HC2):试验采用RNA探针,能特异性确定一定型别的高危HPV型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)或低危HPV型(6、11、42、43、44),可对病毒量进行半定量测定。对于检测CIN2、3和浸润癌中的HPV,其敏感度为66%至100%,特异度为61%至96%。
3.4.2聚合酶联反应(PCR)
PCR:此方法特异性敏感性高,是目前最好的HPV检测方法,简单易行,标本来源不受限,可用型特异性引物进行HPV分型,但可发生样品间的交叉反应,从而导致假阳性率。H.De Vuyst等对653名妇女进行HPV DNA PCR检测,结果:对于CIN2及以下的病人,HPV PCR和HR HPV PCR灵敏度分别为94.4%和73.3%,特异度分别为69.3%和77.6%。
实时定量PCR:该方法灵敏度高,漏诊率低,可一次性完成生殖道HPV的检测,但其设备和仪器较贵,限制了其临床应用。Lo KW等用实时定量PCR对HPV16阳性的宫颈赘生物标本中的病毒加载进行定量检测,结果发现,高度病变组(HG-L)、低度病变组(LG-L)和正常组中DNA复制明显不同,其程度与病情严重程度呈正比。HPV 16 E6/7在三组中的阳性率分别为88.6%、58.8%和5.9%。实验表明,实时定量PCR在区分上述三组人中具有诊断价值。
多重巢式PCR(MNP):检测15种HR HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和70),它的引物是针对HPV基因的早期区,它比其它巢式HR HPV PCR检测CIN中HPV的阳性率高。另外,可通过对其产物分析进行HPV分型。Brian Brestovac等用MNP对282个常规刮片进行HPV检测,HPV阳性率为17%。对于CIN1,CIN2和CIN3患者超薄细胞样品,HR HPV阳性率为91.7%均高于限制性片段长度多态性分析(RHRP)(12.5%和57.0%)。
PCR-酶免疫测定法:此法特异性强,灵敏度高,可大量样本同时检测,且操作简单,检测成本低。Soderlund-Strand A等用PCR-EIA对患者进行HPV DNA检测,结果发现,PCR-EIA对CIN III和CIN II+诊断的灵敏度分别为100.0%和92.9%,是CIN II/III诊断的有效手段。
半巢式PCR结合反向杂交:一种简单便宜的高危型HPV的检测及分型方法。Hao Lin等用纯化的SiHa DNA连续稀释10倍后作为半巢式PCR结合反向杂交及荧光检测的模板进行半巢式PCR结合反向杂交实验,结果发现,正常者、CIN和浸润癌中HPV阳性率分别为15%、89.7%和96.4%。
3.4.3HPV检测新的分子生物学实验方法
AMPLICOR HPV检测方法(Roche公司):它是利用PCR和分子核酸杂交技术对HPV-DNA进行扩增,可检测高危型HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68等13种基因型。Joseph Monsonego等人用AMPLICOR方法对270名巴氏涂片检查异常(MAPS)的患者和234名参与宫颈癌普查的患者进行检查,发现对于中重度上皮内瘤样病变(CIN2、3)患者,Roche AMPLICOR HPV检测特异度为42.4%(35.7%-49.2%),灵敏度为95.2%(89.9%-100.0%)。
INPORM(R):Layfield LJ等比较了第二代杂交捕获(R)(HCII(R))和INFORM(R)两种方法对ASCUS患者诊治的价值,他们用这两种方法对431位ASCUS患者进行HPV DNA检查,通过治疗费和诊断精确性表明,INFORM方法优于HCII,尽管前者比后者费用增加了16%,但减少了41%的患者进行阴道镜检查,且前者特异性较高。
短PCR片段PCR结合线状探针排列反向杂交法(SPF10/LiPA):可检测11种低危型HPV(6、11、34、40、42、43、44、53、54、70、74)和14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68),并且,SPF10/LiPA系统可判断高危型HPV持续感染及型别。Chris Perrons等用SPF10/LiPA对138名因宫颈病变做阴道镜检查和6个月后再复查阴道镜的患者进行HPV检测。两次检测HPV阳性率分别为81%(112/138)和51%(142/276)。通过宫颈涂片,将患者分为正常组、临界病变组(BNC)、LSIL和HSIL四组,其HPV阳性率分别为55%,69%,50%,72%。并且,SPF10/LiPA可检测低量HPV DNA,具有高敏感性。
HPV DNA芯片:最近出现的一种新的HPV分型方法。它通过大量固化的寡核苷酸探针与生物样品的靶系列进行分子杂交,根据产生的杂交图谱排列出靶DNA的序列。可以快速高效对已知序列进行重测序。Hai KwangLee等用一种以寡核苷酸微集阵列系统为基础的HPV DNA芯片检测20个HPV为阳性的妇科临床标本,此HPV DNA芯片可检测22种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7种低危型HPV(6、11、34、40、42、43、44),结果证明HPV DNA芯片的精确性和重复性几乎高达100%。
3.5HPV DNA检测临床价值
HPV DNA检测的临床价值主要有几个方面:(1)单独应用HPV检测进行宫颈癌普查。很多研究发现,HPV DNA检测的灵敏度很高,特别对于高度病变。但是,其特异性低,特别是对于年轻已婚妇女。(2)HPV检测联合细胞学进行宫颈癌普查。在宫颈普查中,细胞学检查有效但缺乏敏感性,高危型HPV DNA检测可有效地、极大地减少细胞学检查的假阴性结果。对于CIN1,两者联合使用,灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为100%、97.2%、30.8%和100%。(3)决定低度病变进一步诊断和治疗。减少阴道镜检查及病理活检率,延长复查间隔时间。(4)作为宫颈病变治疗后的随访指标。
4.血清学检查
因HPV不能在体外组织细胞中增殖,故血清学检查发展缓慢。并且,血清学方法准确性不高,不能区别是现在还是过去感染。目前,尚不能用血清学方法对HPV进行确诊及分型。但是,随着不断的研究,在血清中可检测到一些具有参考价值的指标,作为宫颈癌诊断治疗检测及随诊中的标志物。先前,有研究指出,HPV16/52/58DNA阳性的CIN有显著的针对自身L1衣壳蛋白的抗体反应。针对HPV16抗原的IgG1和IgG2在宫颈癌中明显高于CIN患者,因此,对血清学反应为阳性的患者进行IgG亚类分析或直接检测针对病毒抗原的细胞免疫可以有效预测CIN的自然消退,但是,Koji Matsumoto通过实验发现L1衣壳蛋白的IgG抗体与2年后CIN的消退无关联,因此指出HPV L1衣壳蛋白的IgG反应不能预测未治疗的CIN I/II的自然消退。另外,最近发现,宫颈病变患者的血清之中,L1表面暴露区缩氨酸18283(55PNNNKILVPKVSGLQYRVFR74)和18294(284LYIKGSGSTANLASSNYFPT300)可被抗体特异性识别,有学者用EILSA法对这两个缩氨酸进行检测,发现抗缩氨酸18283和18294抗体与HR HPV所致宫颈病变密切相关,其灵敏度和特异度分别为94.5-97.2%和90.9-97.5%,并且,EILSA法简单、便宜、快速,可用于大规模血清学普查。
近年来,HPV的检测发展迅速,在宫颈癌的筛查和宫颈癌前病变的预报中发挥了的重要作用。目前的观点是联合应用薄层巴氏涂片法和HPV检测,对所有高危妇女定期复查,逐渐消除宫颈癌的可能。此外,HPV检测技术的改进方向是使其灵敏度和特异度进一步提高,可以大规模应用,同时可分型,能够自动化,减少财力、人力和物力,成为宫颈病变筛查中不可少的辅助手段。
发明内容:
本发明的目的就是提供一种能同时诱导针对多种型别,尤其是同时诱导对高危型和低危型均能产生免疫反应的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,它可以诱导形成针对多种型别人乳头瘤病毒(HPV)和外壳蛋白(HPVL1)的抗体,以便用于多种型别HPV或HPV L1的检测,这种抗体还可用于生物制药工程,用于多种型别HPV或HPV L1的纯化、制备。
本发明的技术方案是:一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征是:该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为:
N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是以HPV16 L1 448-477aa区段的蛋白序列为基础,肽长度为30个的氨基酸,序列为:EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是多克隆抗血清或单克隆抗体。
本发明具有以下用途:
1、以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的氨基酸序列为基础作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型人乳头瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白L1的检测。
2.对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的一个或多个氨基酸残基进行变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
3.以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽为基本结构单元,借连接段肽链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多个重复结构单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
4.将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与具有佐剂效应的蛋白相联接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
5.将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与化学合成佐剂或生物佐剂混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
6.将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽作为抗体诱导物,以所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV或HPV L1的分离、纯化。
7.将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽作为人乳头瘤病毒抗血清或人乳头瘤病毒外壳蛋白L1抗血清和单克隆抗体的被检测物。
附图说明
图1.Western Blot检测。1带为表达重组HPV16 L1的sf9培养细胞;2带为Marker。
图2.兔抗血清对细胞裂解物的ELISA检测
图3.Western Blot检测。1,4带为Caski细胞;3,5带为Hela细胞;2带为Marker。
图4.兔抗血清对临床标本的ELISA检测。HPV16、18型的样本为宫颈癌组织;HPV6、11型的样本为尖锐湿疣组织;HPV其他型别的样本为寻常疣组织。
图5.鼠抗血清对临床标本的Western Blot检测。1带为蛋白MARKER:条带分别对应119KD、79.0KD、46.0KD、31.0KD、24.0KD、19.0KD;2带HPV16型;3带HPV18;4带HPV6型;5带HPV11型;6带其他型别。
图6.兔抗血清对临床标本的组化检测。HPV11型的尖锐湿疣标本。阳性主要见于表面的角化层,某些挖空细胞核内呈阳性反应。
图7.兔抗血清对临床标本的组化检测。HPV16型的宫颈上皮内病变标本。阳性见于上皮各层,细胞胞质或核内出现棕黄色颗粒。
图8.短肽内优势表位的ELISA试验确定。对照为抗短肽抗血清对短肽的反应。
图9.4个小肽对抗短肽抗血清封闭效能的ELISA检测。对照为抗短肽抗血清对短肽的反应。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明及其用途作进一步说明:
本发明人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为:
N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是以HPV16 L1 448-477aa区段的蛋白序列为基础,肽长度为30个的氨基酸,序列为:EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是多克隆抗血清或单克隆抗体。
以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的氨基酸序列为基础作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型人乳头瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白L1的检测。
对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的一个或多个氨基酸残基进行变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV及HPV L1的检测。
以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽为基本结构单元,借连接段肽链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多个重复结构单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV及HPV L1的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与具有佐剂效应的蛋白相联接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV及HPV L1的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与化学合成佐剂或生物佐剂混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV及HPV L1的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽作为抗体诱导物,以所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV或HPV L1的分离、纯化。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽可以作为人乳头瘤病毒抗血清或人乳头瘤病毒外壳蛋白L1抗血清和单克隆抗体的被检测物。
实施例1
(a)HPV L1短肽的合成
本实施例中,以HPV16 L1 aa448-477区段的蛋白序列为基础,肽长度为30个氨基酸,序列为:EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
委托北京赛百盛基因技术有限公司在美国Genemed Synthesis Inc.公司用常规方法合成该序列短肽。
(b)抗血清的制备
将合成短肽以PBS溶解后,1∶1加Furend`s完全佐剂,乳化后分别以25ug及10ug的剂量免疫日本长耳大白兔及Balb/c小鼠,共3次。于最后一次免疫的第14天,处死动物,取抗短肽的兔抗血清及鼠抗血清。
实施例2
抗短肽抗血清对重组HPV16 L1反应性的Western Blot检测
表达重组HPV16 L1的sf9细胞由中国医学科学院基础医学研究所获得。
将表达重组HPV16 L1的sf9培养细胞的裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维膜,再以兔或小鼠的抗短肽抗血清为一抗与之进行反应。结果,小鼠及兔的短肽免疫抗血清能使表达重组HPV16 L1的sf9培养细胞裂解液的电泳泳道上,在56KD的位置上出现特异性的反应条带(图1)。
实施例3
抗短肽抗血清对含HPV病毒培养细胞反应性的ELISA检测及WesternBlot检测
含HPV16病毒的Caski细胞和含HPV18病毒的Hela细胞购自武汉大学中国细胞保藏中心。进口HRP标记及荧光标记二抗购于北京中山生物技术有限公司(sigma产品)。
分别将含HPV16病毒的Caski培养细胞及含HPV18的Hela培养细胞裂解液包被塑料板,以兔或小鼠的抗短肽抗血清为一抗与之进行反应。结果,小鼠及兔的抗短肽抗血清能使Caski培养细胞及Hela培养细胞裂解液包被的塑料板呈现阳性反应(图2)。
将含HPV16病毒的Caski培养细胞及含HPV18的Hela培养细胞的裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维膜,再以兔或小鼠的抗短肽抗血清为一抗与之进行反应。结果,小鼠及兔的短肽免疫抗血清能使Caski培养细胞及Hela培养细胞裂解液的电泳泳道上,在56KD的位置上出现特异性的反应条带(图3)。
实施例4
抗短肽抗血清对PCR鉴定HPV阳性临床标本反应性的ELISA检测
分别将经PCR鉴定的临床标本中筛选出的HPV6、11、16、18四种主要HPV型别及除此以外的其他型别的5种类型的标本进行裂解,将裂解液包被塑料板,以兔或小鼠的抗短肽抗血清与之进行反应。结果,小鼠及兔的短肽免疫抗血清,能使标本裂解液包被的塑料板呈现阳性反应(图4)。
实施例5
抗短肽抗血清对HPV阳性临床标本反应性的Western Blot检测
分别将经PCR鉴定的临床标本中筛选出的HPV6、11、16、18四种主要HPV型别及除此以外的其他型别的5种类型的标本进行裂解,裂解液作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后以兔抗短肽抗血清作一抗,结果于蛋白分子量约为56K的区间,均可见有一条阳性反应带(图5)。
实施例6
抗短肽抗血清对HPV阳性临床标本反应性的免疫组织化学检测
将临床病理检验为肿瘤,或尖锐湿疣的病理组织进行PCR鉴定,取PCR鉴定为HPV6,11,16,和18阳性的进行反应。结果抗短肽抗血清可使HPV6,11阳性的尖锐湿疣组织内的一些细胞的胞质内呈现阳性反应,可见阳性反应仅出现于胞浆之内,胞质被染成棕黄色,胞核透亮,呈负染状态,反应越近表层越强,角化层反应最强。抗血清可使HPV16,18阳性的病变组织内的一些细胞出现阳性反应,反应常呈巢状,阳性细胞与阴性细胞分界明显,胞质内反应强(图6,7)。
实施例7
(a)短肽序列内的小肽合成
由吉尔生化(上海)有限公司以上述短肽氨基酸序列为基础、合成15个氨基酸残基长、相互错开5个氨基酸残基的4个小肽,序列分别为:EVNLKEKFSADLDQF,EKFSADLDQFPLGRK,DLDQFPLGRKFLLQA和PLGRKFLLQAGLKAK(以下简称为:EF、EK、DA、PK)。
(b)抗血清的制备
按实施例1的方法取得上述4个小肽的抗血清。
实施例8
短肽内优势表位的ELISA试验确定
以上述4个小肽包被塑料板,以抗短肽抗血清(1∶100)作为一抗与之结合,检测抗短肽抗血清与包被在塑料板上的小肽的反应能力,通过对4个小肽反应能力,确定短肽内的优势表位存在的区段。结果显示,抗短肽抗血清对4个小肽的反应强度基本相近,仅对EK区段的小肽反应稍强,平均反应强度仅为12.8%。说明短肽内表位分布相对比较均衡,没有明显的优势线性表位,短肽内可能有独立的构象表位(图8)。
实施例9
4个小肽对抗短肽抗血清封闭效能的ELISA检测
以短肽包被塑料板,以4个小肽与抗短肽抗血清(2∶900)共同孵育,37℃封闭1h后作为一抗,检测抗短肽抗血清与包被在塑料板上的短肽的反应能力,通过4个小肽对抗短肽抗血清的封闭效应,确定短肽内的优势表位。结果4个小肽对抗短肽抗血清的封闭效应基本相近,仅EK区段的小肽封闭作用稍强,平均封闭效能约为33.6%。这也说明短肽内表位分布相对比较均衡,没有明显的优势线性表位(图9)。
氨基酸序列表
Claims (10)
1.一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征是:该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为:
N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征是:所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是以HPV16 L1 448-477aa区段的蛋白序列为基础,长度为30个的氨基酸,序列为:EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
3.根据权利要求1或2所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征是:所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽是多克隆抗血清或单克隆抗体。
4.权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的氨基酸序列为基础作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型人乳头瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白L1的检测。
5.权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的一个或多个氨基酸残基进行变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
6.权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽为基本结构单元,借连接段肽链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多个重复结构单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
7.权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与具有佐剂效应的蛋白相联接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
8.权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与化学合成佐剂或生物佐剂混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV L1的检测。
9.权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽作为抗体诱导物,以所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV或HPV L1的分离、纯化。
10.权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的用途,其特征是:将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽作为人乳头瘤病毒抗血清或人乳头瘤病毒外壳蛋白L1抗血清和单克隆抗体的被检测物。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2007101687139A CN101186636A (zh) | 2007-12-06 | 2007-12-06 | 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 |
CN200810186360A CN101538319A (zh) | 2007-12-06 | 2008-12-05 | 用于多型人乳头瘤病毒检测的多肽及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2007101687139A CN101186636A (zh) | 2007-12-06 | 2007-12-06 | 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101186636A true CN101186636A (zh) | 2008-05-28 |
Family
ID=39479282
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2007101687139A Pending CN101186636A (zh) | 2007-12-06 | 2007-12-06 | 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 |
CN200810186360A Pending CN101538319A (zh) | 2007-12-06 | 2008-12-05 | 用于多型人乳头瘤病毒检测的多肽及其用途 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200810186360A Pending CN101538319A (zh) | 2007-12-06 | 2008-12-05 | 用于多型人乳头瘤病毒检测的多肽及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN101186636A (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102286104A (zh) * | 2010-06-21 | 2011-12-21 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | Hpv6型l2n120e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途 |
CN103694345A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN103694346A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN103694347A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
WO2015096269A1 (zh) * | 2013-12-23 | 2015-07-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN104761623A (zh) * | 2013-12-17 | 2015-07-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
CN105153302A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-12-16 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv6l1蛋白的抗体、其制备方法和应用 |
CN105367652A (zh) * | 2015-07-23 | 2016-03-02 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv16l1蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用 |
CN105585631A (zh) * | 2014-11-12 | 2016-05-18 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 人乳头瘤病毒16型单克隆抗体及其应用 |
CN108794623A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-13 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种抗hpv16 e6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
CN109705196A (zh) * | 2017-10-25 | 2019-05-03 | 三峡大学 | 用于多型人乳头瘤病毒检测的单克隆抗体 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105153304B (zh) * | 2012-06-08 | 2018-09-11 | 厦门大学 | 抗hpv l1蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途 |
-
2007
- 2007-12-06 CN CNA2007101687139A patent/CN101186636A/zh active Pending
-
2008
- 2008-12-05 CN CN200810186360A patent/CN101538319A/zh active Pending
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102286104B (zh) * | 2010-06-21 | 2013-10-16 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | Hpv6型l2n120e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途 |
CN102286104A (zh) * | 2010-06-21 | 2011-12-21 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | Hpv6型l2n120e7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途 |
CN104761623A (zh) * | 2013-12-17 | 2015-07-08 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
CN104761623B (zh) * | 2013-12-17 | 2019-11-29 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 |
CN103694345A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN103694346A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN103694347A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
WO2015096269A1 (zh) * | 2013-12-23 | 2015-07-02 | 杭州德同生物技术有限公司 | 抗人乳头瘤病毒l1蛋白抗体及其编码基因和应用 |
CN105585631A (zh) * | 2014-11-12 | 2016-05-18 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 人乳头瘤病毒16型单克隆抗体及其应用 |
CN105367652A (zh) * | 2015-07-23 | 2016-03-02 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv16l1蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用 |
CN105367652B (zh) * | 2015-07-23 | 2019-08-09 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv16 l1蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用 |
CN105153302B (zh) * | 2015-07-23 | 2019-08-13 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv6l1蛋白的抗体、其制备方法和应用 |
CN105153302A (zh) * | 2015-07-23 | 2015-12-16 | 北京生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗hpv6l1蛋白的抗体、其制备方法和应用 |
CN109705196A (zh) * | 2017-10-25 | 2019-05-03 | 三峡大学 | 用于多型人乳头瘤病毒检测的单克隆抗体 |
CN108794623A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-13 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种抗hpv16 e6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
CN108794623B (zh) * | 2018-07-04 | 2021-08-13 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种抗hpv16 e6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101538319A (zh) | 2009-09-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101186636A (zh) | 人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用 | |
US7732166B2 (en) | Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer | |
US7972776B2 (en) | Protein chips for HPV detection | |
Herrero | Epidemiology of cervical cancer | |
US5824466A (en) | Purified polypeptide of human papillomavirus type 49 (HPV49) type 50 (HVP50), and type 55 (HPV55) | |
US6346377B1 (en) | Screening for papilloma viruses | |
US20100003704A1 (en) | IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection | |
JP5819851B2 (ja) | Hpv関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力hpv免疫アッセイ | |
Ostrow et al. | Detection of human papillomavirus DNA in invasive carcinomas of the cervix by in situ hybridization | |
US20030219726A1 (en) | Detection of abnormalities leading to cervical malignancy | |
US10465254B2 (en) | Method for detecting and typing high-risk human papillomaviruses | |
CN105755169A (zh) | 一种高危型人乳头瘤病毒的检测和分型试剂盒及其应用 | |
JP2010540932A (ja) | 改良型子宮頸部細胞スクリーニング方法 | |
CN112575123B (zh) | 引物组合、探针组合以及人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒 | |
US6743593B2 (en) | Immunological methodology for discerning human papillomavirus | |
Wang et al. | Comparative testing of HPV L1 protein monoclonal antibody panel for the detection of HPV in cervical exfoliated cells | |
Poljak | A review of 20 years of human papillomavirus research in Slovenia | |
Baay et al. | Follow‐up of antibody responses to human papillomavirus type 16 E7 in patients treated for cervical carcinoma | |
US5665533A (en) | Skin test to human papillomavirus type 16 | |
CN109705196A (zh) | 用于多型人乳头瘤病毒检测的单克隆抗体 | |
Wang et al. | HPV16 E7 oncoprotein test as a triage strategy for HPV16-positive women in cervical cancer screening: long-term follow-up outcome | |
Guo et al. | Cervical cancer screening: hTERC gene amplification detection by FISH in comparison with conventional methods | |
Chin-Hong et al. | Diagnostic tests for HPV infection. | |
Wang et al. | Prevalence and distribution of human papillomavirus genotypes among women in northern Henan Province of China | |
Ali | Molecular Localization of Latent Epstein–Barr Virus Early Repeats (EBERS) in Cervical Tissues with Adenocarcinoma by RNA-In Situ Hybridization |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |