EA010506B1

EA010506B1 - Способы, наборы и композиции для разработки и применения моноклональных антител, специфичных к антигенам с низкой иммуногенностью

Info

Publication number: EA010506B1
Application number: EA200600646A
Authority: EA
Inventors: Всеволод Иванович КИСЕЛЕВ; Петр Георгиевич СВЕШНИКОВ
Original assignee: Всеволод Иванович КИСЕЛЕВ; Петр Георгиевич СВЕШНИКОВ
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2008-10-30
Also published as: KR20060079239A; EP1673393B1; CN1886425A; EA200600646A1; AU2004274368B2; WO2005028510A2; AU2004274368A1; US20080267982A1; EP1673393A2; WO2005028510A3; CA2539562A1; RU2251699C1; DE602004020489D1; ATE427963T1; JP2007537705A

Abstract

Изобретение относится к разработке и применению моноклональных антител, специфичных к антигенам с низкой иммуногенностью. Настоящее изобретение относится к способам получения моноклональных антител посредством химического конъюгирования представляющего интерес антигена с молекулой-носителем, которая делает возможным ответ иммунной системы на иммунизацию конъюгированным антигеном. Изобретение также относится к конкретным композициям конъюгированных антигенов, а также к моноклональным антителам, специфичным к таким конъюгированным антигенам. Настоящее изобретение также относится к наборам для применения при выявлении патологических состояний с использованием моноклональных антител.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Способы и композиции согласно изобретению относятся к области медицинской биохимии и, в общем, связаны с разработкой и применением моноклональных антител, специфичных к антигенам, обычно обладающим низкой иммуногенностью.

Уровень техники

Иммунная система имеет две ветви, адаптивный и врожденный ответы. Две указанных ветви иммунной системы работают вместе, осуществляя борьбу с чужеродным вторжением. Любое вещество, способное вызвать адаптивный иммунный ответ, называют антигеном. Чужеродные молекулы могут действовать в качестве антигенов и стимулировать иммунный ответ, приводя к продукции антител. Однако некоторые молекулы не стимулируют иммунного ответа. В прошлом это преодолевали, используя адъювант, подобный полному адъюванту Фрейнда, чтобы активировать врожденную иммунную систему.

Однако несмотря на использование адъювантов, еще остается много молекул, которые не вызывают иммунного ответа, приводящего к продукции антиген-специфичных антител. В частности, многие антигены из природных источников часто не вызывают достаточного и специфичного к молекулам иммунного ответа. Во многих случаях используют химический синтез и рекомбинантную технологию для получения антигена. Однако указанные синтетически полученные антигены часто не имеют такой же третичной структуры, как нативная молекула. При выработке антител к синтетическим антигенам антитела не узнают нативную молекулу.

Настоящее изобретение относится к новым способам и композициям, которые позволяют получать антиген-специфичные антитела к антигенам, которые обычно неспособны вызвать адекватный и специфичный иммунный ответ. Указанные антитела могут быть использованы в случае многих различных применений, таких как, без ограничения, терапевтическое лечение заболевания (такого как, без ограничения, злокачественная опухоль, вирусные инфекции и т.д.), иммунодиагностика, иммунохимия, иммуногистология, иммуноцитология, иммуноаффинная хроматография и геномные и белковые исследования.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения моноклональных антител, специфичных к антигену с низкой иммуногенностью, включающим в себя химическое конъюгирование антигена с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток от животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному антигену. В одном варианте молекулой-носителем является Н8Р70. В другом варианте животное обладает интактной иммунной системой. В еще одном варианте животным является млекопитающее. В следующих вариантах В-клетки собирают из асцита, селезенки, лимфатических узлов или крови, либо по отдельности, либо в комбинации. В следующих вариантах создают гибридому, используя иммортализованную клетку, такую как, без ограничения, клетка миеломы мышей, иммортализованная клетка человека или иммортализованная клетка крысы. В других вариантах скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ίη δίΐπ. Вестернблота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим моноклональное антитело, специфичное к антигену с низкой иммуногенностью, полученное посредством химического конъюгирования антигена с молекулой-носителем, иммунизации животного конъюгированным антигеном, сбора Вклеток из организма животного, создания гибридомы из собранных В-клеток и скрининга гибридом в отношении специфичности к нативному антигену. В конкретном варианте молекулой-носителем является Н8Р70. В другом варианте животное имеет интактную иммунную систему. В еще одном варианте животное является млекопитающим. В следующих вариантах В-клетки собирают из асцита, селезенки, лимфатических узлов или крови, либо по отдельности, либо в комбинации. В следующих вариантах гибридому создают, используя иммортализованную клетку, такую как, без ограничения, клетка миеломы мышей, иммортализованная клетка человека или иммортализованная клетка крысы. В других вариантах скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ίη кйл, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения моноклональных антител, специфичных к онкобелку Е7, включающим в себя химическое конъюгирование онкобелка Е7 с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток из организма животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности

- 1 010506 к нативному онкобелку Е7. В другом варианте химическое конъюгирование заключается в создании плазмиды с олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, и олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70; и трансфекции клетки-хозяина плазмидой, при этом клеткахозяин транскрибирует олигонуклеотидные последовательности в конъюгированный онкобелок Е7. В еще одном варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. В следующем варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:3. В еще одном варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:5. В других вариантах клеткой-хозяином является Е. со11. В одном варианте молекулой-носителем является Н8Р70. В другом варианте животное обладает интактной иммунной системой. В еще одном варианте животное является млекопитающим. В следующих вариантах В-клетки собирают из асцита, селезенки, лимфатических узлов или крови либо по отдельности, либо в комбинации. В следующих вариантах гибридому создают, используя иммортализованную клетку, такую как, без ограничения, клетка миеломы мышей, иммортализованная клетка человека или иммортализованная клетка крысы. В конкретном варианте клеткой миеломы мышей является клетка миеломы 8р2/0-Ад14. В других вариантах скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ίη 8Йи, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим моноклональное антитело, специфичное к онкобелку Е7, получаемое способом, включающим в себя химическое конъюгирование онкобелка Е7 с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток из организма животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному онкобелку Е7. В другом варианте химическое конъюгирование заключается в создании плазмиды с олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, и олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70; и трансфекции клеткихозяина плазмидой, при этом клетка-хозяин транскрибирует олигонуклеотидные последовательности в конъюгированный онкобелок Е7. В еще одном варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:1. В следующем варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:3. В еще одном варианте олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70, является последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:5. В других вариантах клеткой-хозяином является Е. сой. В одном варианте молекулой-носителем является Н8Р70. В другом варианте животное обладает интактной иммунной системой. В еще одном варианте животное является млекопитающим. В следующих вариантах В-клетки собирают из асцита, селезенки, лимфатических узлов или крови, либо по отдельности, либо в комбинации. В следующих вариантах гибридому создают, используя иммортализованную клетку, такую как, без ограничения, клетка миеломы мышей, иммортализованная клетка человека или иммортализованная клетка крысы. В конкретном варианте клеткой миеломы мышей является клетка миеломы 8р2/0-Ад14. В других вариантах скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ίη §йи, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.

Настоящее изобретение также относится к способам применения моноклональных антител, специфичных к онкобелку Е7, для выявления цервикальной интраэпителиальной неоплазии, включающим в себя получение образца эпителиальных клеток шейки матки и скрининг образца в отношении присутствия онкобелка Е7. В конкретных вариантах способ скрининга в отношении присутствия онкобелка Е7 выбран из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, редакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ίη δίΐυ. Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа. В другом варианте количество онкобелка Е7 равно или выше 0,05 нг/мл. В следующих вариантах моноклональные антитела содержат по меньшей мере два изотипа иммуноглобулина. В следующих вариантах одним изотипом иммуноглобулина является Ι§02α, а другим - Ι§026. В еще одном варианте один изотип иммуноглобулина обладает специфичностью к антигенной детерминанте, отличной от детерминанты, к которой специфичен второй изотип иммуноглобулина.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам для определения того, существует ли риск развития у субъекта цервикальной интраэпителиальной неоплазии, содержащим по меньшей мере один

- 2 010506 реагент, который специфично выявляет онкобелок Е7, и инструкции по определению того, существует ли повышенный риск развития у субъекта цервикальной интраэпителиальной неоплазии. В одном варианте реагентом являются моноклональные антитела, специфичные к онкобелку Е7.

Настоящее изобретение также относится к способам получения моноклональных антител, специфичных к прионному белку, включающим в себя химическое конъюгирование прионного белка с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток из организма животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному прионному белку. В конкретных вариантах конъюгирование осуществляют химически, используя глютаральдегид. В других вариантах молекулой-носителем является Н8Р70. В другом варианте животным является мышь. В следующем варианте скрининг осуществляют, используя твердофазный иммуноферментный анализ.

Настоящее изобретение также относится к наборам для определения того, существует ли риск развития у субъекта губчатой энцефалопатии, содержащим по меньшей мере один реагент, который специфично выявляет прионный белок, и инструкции по определению того, существует ли повышенный риск развития у субъекта губчатой энцефалопатии.

Настоящее изобретение также относится к способам получения моноклональных антител, специфичных к гиалуроновой кислоте, включающим в себя химическое конъюгирование гиалуроновой кислоты с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток из организма животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности к нативной гиалуроновой кислоте.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения моноклональных антител, специфичных к металлопротеазе 3 матрикса, включающим в себя конъюгирование металлопротеазы 3 матрикса с молекулой-носителем, иммунизацию животного конъюгированным антигеном, сбор В-клеток из организма животного, создание гибридомы из собранных В-клеток и скрининг гибридом в отношении специфичности к нативной металлопротеазе 3 матрикса. В конкретном варианте конъюгирование осуществляют химически, используя глютаральдегид. В другом варианте молекулой-носителем является Н8Р70. В еще одном варианте животным является мышь. В еще одном варианте скрининг осуществляют, используя твердофазный иммуноферментный анализ.

Описание чертежей

На фиг. 1 показано, как Н8Р70 способствует презентации антигенов;

на фиг. 2 изображена блок-схема, показывающая патологию, обусловленную вирусом папилломы человека. ΟΙΝ означает цервикальную интраэпителиальную неоплазию. Н8У означает вирус простого герпеса. НЬЛ означает человеческий лейкоцитарный антиген;

на фиг. 3 показаны последовательности праймеров для амплификации гена Е7 с использованием ПЦР (8ЕО ΙΌ N0: 14-17);

на фиг. 4 показана олигонуклеотидная (8ЕЦ ΙΌ N0: 1) и аминокислотная (8Е0 ΙΌ N0: 2) последовательности для онкобелка клона Е7 из НРУ16 с сайтами рестрикции ЕсоК1 и ВатН1;

на фиг. 5 показана олигонуклеотидная (8Е0 ΙΌ N0: 3) и аминокислотная (8Е0 ΙΌ N0: 4) последовательности для онкобелка клона Е7 из НРУ18 с сайтами рестрикции ЕсоК1 и ВатШ;

на фиг. 6 показана конструкция положения, в котором ген Е7 НРУ16 и альтернативно ген Е7 НРУ18 встраивали в сайт ЕеоШ-ВатШ в плазмиде рВ1ие8С1р1 8К (+) (81га1;щспс) (8ЕЦ ΙΌ N0: 18);

на фиг. 7 показана картина электрофореза в геле, демонстрирующая изолированные полосы онкобелка Е7 из лизатов Е. сой, трансфицированных генами Е7 НРУ16 и Е7 НРУ18;

на фиг. 8 показаны матрицы ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 19-22), используемые для ПЦР-амплификации ДНК, содержащей гены Е7. Матрицы основаны на плазмидных ДНК рНЕ716 и рНЕ718, которые содержат гены Е7 НРУ;

на фиг. 9 показана схематичная диаграмма структуры плазмиды РОЕ30-Е716-бпаК;

на фиг. 10 показана олигонуклеотидная последовательность плазмиды рЦЕ30-бпаК (8Е0 ΙΌ N0: 5); на фиг. 11 показана калибровочная кривая для количественного определения онкобелка Е7 НРУ16 в оптимальных условиях.

Подробное описание изобретения

Определения.

Чтобы облегчить понимание изобретения, ниже определен ряд терминов.

В используемом в данном описании смысле термин «химически конъюгированный» или «химическое конъюгирование» относится к связыванию антигена с молекулой-носителем. Указанное связывание можно осуществлять на генетическом уровне с использованием рекомбинантной технологии, при этом может быть получен гибридный белок, содержащий аминокислотные последовательности или их части как антигена, так и молекулы-носителя. Указанный гибридный белок получают с помощью олигонуклеотидной последовательности, кодирующей как антиген, так и молекулу-носитель, или их части. Указанное связывание также включает ковалентные связи, образуемые между антигеном и белком-носителем с использованием других химических реакций, таких как, без ограничения, реакции с использованием глутаральдегида. Ковалентные связи также могут быть образованы с использованием третьей молекулы, обра

- 3 010506 зующей мостик между антигеном и молекулой-носителем. Указанные перекрестно связывающие агенты способны взаимодействовать с группами, такими как, без ограничения, первичные амины, сульфгидрилы, карбонилы, углеводы или карбоновые кислоты, на антигене и молекуле-носителе. Химическое конъюгирование также включает нековалентное связывание между антигеном и молекулой-носителем.

В используемом в данном описании смысле термин «молекула-носитель» относится к любой молекуле, которая химически конъюгирована с представляющим интерес антигеном, которая делает возможным иммунный ответ, приводящий к антителам, специфичным к нативному антигену.

В используемом в данном описании смысле термины «нативный», «природный», «нативный антиген» или «природный антиген» относятся к антигену, который встречается в природе. Что касается изобретения, то «нативные антигены» обладают «низкой иммуногенностью». «Низкая иммуногенность» относится к неспособности природной молекулы вызывать сильный иммунный ответ, приводящий к продукции высокоаффинных антител. Термин «антиген», «представляющий интерес антиген» или конкретные молекулы, такие как, без ограничения, онкобелок Е7, прионный белок, металлопротеаза 3 матрикса, гиалуроновая кислота, включают целую молекулу или любые их части, которые сохраняют отличительные антигенные признаки, специфичные для нативного антигена.

В используемом в данном описании смысле термин «интактная иммунная система» относится к животному с функциональной иммунной системой, способной к формированию иммунного ответа на чужеродный антиген. Иммунный ответ включает в себя способность создавать В-клетки, которые секретируют антитела.

В используемом в данном описании смысле «аминокислотная последовательность» относится к аминокислотной последовательности встречающейся в природе молекулы белка, «аминокислотная последовательность» и подобные термины, такие как «полипептид» или «белок» не означают ограничение аминокислотной последовательности полной, нативной аминокислотной последовательностью, связанной с указанной белковой молекулой.

В используемом в данном описании смысле термины «молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая», «последовательность ДНК, кодирующая» и «ДНК, кодирующая» относятся к порядку или последовательности дезоксирибонуклеотидов вдоль нити дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок указанных дезоксирибонуклеотидов определяет порядок аминокислот вдоль цепи полипептида (белка). Таким образом, последовательность ДНК кодирует аминокислотную последовательность.

Говорят, что молекулы ДНК имеют «5'-концы» и «З'-концы», поскольку мононуклеотиды подвергаются взаимодействию с образованием олигонуклеотидов или полинуклеотидов таким образом, что 5'фосфат пентозного цикла одного мононуклеотида связывается с З'-кислородом своего соседа в одном направлении посредством фосфодиэфирной связи. Поэтому конец олигонуклеотидов или полинуклеотида назван «5'-концом», если его 5'-фосфат не связан с З'-кислородом пентозного цикла мононуклеотида, и «З'-концом», если его З'-кислород не связан с 5'-фосфатом пентозного цикла следующего мононуклеотида. В используемом в данном описании смысле также можно говорить, что последовательность нуклеиновой кислоты, даже в том случае если она является внутренней по отношению к более крупному олигонуклеотиду или полинуклеотиду, имеет 5'- и З'-концы. В любой линейной или кольцевой молекуле ДНК дискретные элементы называют «расположенными выше» или 5'-элементами или «расположенными ниже» или З'-элементами. Указанная терминология отражает тот факт, что транскрипция происходит от 5'к З'-концу вдоль нити ДНК. Промоторные и энхансерные элементы, которые управляют транскрипцией связанного гена, обычно расположены с 5'-стороны или выше кодирующей области. Однако энхансерные элементы могут оказывать свое влияние даже в том случае, когда они расположены с З'-стороны от промоторного элемента и кодирующей области. Сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования расположены с З'-стороны или ниже кодирующей области.

В используемом в данном описании смысле термины «олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую» и «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую» означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую область гена, или другими словами последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует продукт гена. Кодирующая область может присутствовать в форме кДНК, геномной ДНК или РНК. Если она присутствует в форме ДНК, то олигонуклеотид или полинуклеотид может быть однонитевым (т. е. в виде смысловой нити) или двунитевым. Подходящие регуляторные, такие как энхансеры/промоторы, точки сплайсинга, сигналы полиаденилирования и т.д., могут быть при необходимости размещены в тесной близости с кодирующей областью гена, чтобы обеспечить возможность правильной инициации транскрипции и/или точного процессинга первичного транскрипта РНК. Альтернативно, кодирующая область, используемая в экспрессирующих векторах согласно настоящему изобретению, может содержать эндогенные энхансеры/промоторы, точки сплайсинга, последовательности вставок, сигналы полиаденилирования и т.д., или комбинацию как эндогенных, так и экзогенных регуляторных элементов.

В используемом в данном описании смысле термин «регуляторный элемент» относится к генетическому элементу, который контролирует определенный аспект экспрессии последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, промотор является регуляторным элементом, который способствует инициации транскрипции оперативно связанной кодирующей области. Другие регуляторные элементы включа

- 4 010506 ют сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, сигналы терминации и т.д.

«Амплификация» является особым случаем репликации нуклеиновой кислоты при наличии матричной специфичности. Амплификацию необходимо отличать от репликации на неспецифичной матрице (т.е. репликации, которая зависит от матрицы, но не зависит от специфичной матрицы). Матричная специфичность в данном случае отличается от точности репликации (т.е. синтеза правильной полинуклеотидной последовательности) и нуклеотидной (рибо- или дезоксирибо-) специфичности. Матричную специфичность часто описывают термином специфичность «мишени».

Последовательности-мишени являются «мишенями» в том смысле, что их необходимо отсортировать от других нуклеиновых кислот. Способы амплификации разработаны главным образом для указанной сортировки.

Матричной специфичности достигают в случае большинства способов амплификации посредством подбора фермента. Ферментами для амплификации являются ферменты, которые в тех условиях, при которых их используют, будут подвергать обработке только специфичные последовательности нуклеиновой кислоты в гетерогенной смеси нуклеиновых кислот. Например, в случае репликазы О специфичной матрицей для репликазы является РНК МЭУ-1 |П.Ь. Каааи с1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8е1 И8А, 69: 3038 (1972)]. Другие нуклеиновые кислоты не будут реплицироваться указанным ферментом амплификации. Подобным образом, в случае РНК-полимеразы Т7 указанный фермент для амплификации обладает строгой специфичностью к своим собственным промоторам [СйатЬегйи с1 а1., Ыа1иге, 228: 227 (1970)]. В случае ДНК-лигазы Т4 фермент не будет лигировать два олигонуклеотида или полинуклеотида, когда существует ошибочное спаривание между олигонуклеотидным или полинуклеотидным субстратом и матрицей в месте лигирования [Ό.Υ. XVи и К.В. Зайасе, Сеиотюк, 4: 560 (1989)]. Наконец обнаружено, что полимеразы Тад и Р1и в силу их способности функционировать при высокой температуре проявляют высокую специфичность к последовательностям, ограниченным и таким образом определяемым праймерами; высокая температура приводит к термодинамическим условиям, которые благоприятствуют гибридизации праймера с последовательностями-мишенями и отсутствию гибридизации с последовательностями, не являющимися мишенями [Н.А. Егйсй (еб.), РСК. Тесйио1о§у, 81оск1ои Рге§8 (1989)].

В используемом в данном описании смысле термин «амплифицируемая нуклеиновая кислота» используют по отношению к нуклеиновым кислотам, которые могут быть амплифицированы любым способом амплификации. Подразумевается, что «амплифицируемая нуклеиновая кислота», как правило, будет содержать «матрицу образца».

В используемом в данном описании смысле термин «матрица образца» относится к нуклеиновой кислоте, происходящей из образца, который анализируют в отношении наличия «мишени» (определенной ниже). Напротив, термин «фоновая матрица» используют по отношению к другой нуклеиновой кислоте, отличной от матрицы образца, которая может присутствовать и может не присутствовать в образце. Фоновая матрица наиболее часто является случайной. Она может быть результатом привносимых примесей или может быть следствием присутствия примесей нуклеиновой кислоты, от которых необходимо очистить образец. Например, нуклеиновые кислоты из других организмов, отличных от выявляемых организмов, могут присутствовать в виде фона в тестируемом образце.

В используемом в данном описании смысле термин «праймер» относится к олигонуклеотиду, либо встречающемуся в природе как в очищенном продукте рестрикционного расщепления, либо полученному синтетически, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза в случае его помещения в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который является комплементарным нити нуклеиновой кислоты (например, в присутствии нуклеотидов и индуцирующего агента, такого как ДНК-полимераза, и при подходящей температуре и значении рН). Предпочтительно праймер является однонитевым для максимальной эффективности амплификации, но альтернативно может быть двунитевым. Если праймер является двунитевым, то его сначала обрабатывают, чтобы разделить его нити перед применением для получения продуктов элонгации. Предпочтительно праймер является олигодезоксирибонуклеотидом. Праймер должен иметь достаточную длину, чтобы праймировать синтез продуктов элонгации в присутствии индуцирующего агента. Точные длины праймеров будут зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и применение способа.

В используемом в данном описании смысле термин «зонд» относится к олигонуклеотиду (т. е. к последовательности нуклеотидов), либо встречающемуся в природе, как, например, в очищенном продукте рестрикционного расщепления, или полученному синтетически, рекомбинантно или посредством ПЦРамплификации, который способен гибридизоваться с другим представляющим интерес олигонуклеотидом. Зонд может быть однонитевым или двунитевым. Зонды применимы для выявления, идентификации и выделения конкретных последовательностей гена. Предполагается, что любой зонд, используемый в настоящем изобретении, будет мечен любой «репортерной молекулой», так что он может быть выявлен в любой системе регистрации, включая, без ограничения, ферментную (например, ЕЬ18А, а также основанные на ферментах гистохимические анализы), флуоресцентную, радиоактивную и люминесцентную системы. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо конкретной системой регистрации или меткой.

В используемом в данном описании смысле термин «мишень» при использовании в отношении по

- 5 010506 лимеразной цепной реакции относится к области нуклеиновой кислоты, ограниченной праймерами, используемыми для полимеразной цепной реакции. Таким образом, «мишень» пытаются отсортировать от других последовательностей нуклеиновой кислоты. «Участок» определяют как область нуклеиновой кислоты в последовательности-мишени.

В используемом в данном описании смысле термин «полимеразная цепная реакция» («ПЦР») относится к способу К.В. МиШк, описанному в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4965188, тем самым включенным в виде ссылки, в которых описан способ увеличения концентрации участка последовательности-мишени в смеси геномной ДНК без клонирования или очистки. Указанный способ амплификации последовательности-мишени заключается во введении большого избытка двух олигонуклеотидных праймеров в смесь ДНК, содержащую требуемую последовательность-мишень, с последующей точной последовательностью температурных циклов в присутствии ДНК-полимеразы. Два праймера являются комплементарными их соответствующим им нитям двунитевой последовательности-мишени. Для осуществления амплификации смесь денатурируют и затем праймеры отжигают с комплементарными им последовательностями в молекуле-мишени. После отжига праймеры удлиняют полимеразой так, чтобы образовать новую пару комплементарных нитей. Стадии денатурации, отжига праймеров и полимеразного удлинения можно повторять много раз (т.е. денатурация, отжиг и удлинения составляют один «цикл»), чтобы получить высокую концентрацию амплифицированного участка требуемой последовательности-мишени. Длину амплифицированного участка требуемой последовательности-мишени определяют относительным положением праймеров по отношению друг к другу, и, следовательно, указанная длина является регулируемым параметром. Так как процесс является повторяющимся, то способ называют «полимеразной цепной реакцией» (в дальнейшем «ПЦР»). Поскольку требуемые амплифицированные участки последовательности-мишени становятся преобладающими последовательностями (в смысле концентрации) в смеси, то говорят, что они «ПЦР-амплифицированы».

С помощью ПЦР можно амплифицировать одну копию специфичной последовательности-мишени в геномной ДНК до уровня, регистрируемого несколькими разными способами (например, гибридизацией с меченым зондом; включением биотинилированных праймеров с последующей регистрацией конъюгата авидин-фермент; включением ³²Р-меченых дезоксинуклеотидтрифосфатов, таких как 6СТР или 6АТР, в амплифицированный участок). Кроме геномной ДНК можно амплифицировать любую олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность с использованием подходящего набора молекул праймеров. В частности, амплифицированные участки, созданные способом ПЦР, сами по себе являются эффективными матрицами для последующих ПЦР-амплификаций.

В используемом в данном описании смысле термины «продукт ПЦР» «фрагмент ПЦР» и «продукт амплификации» относятся к полученной в результате смеси соединений после завершения в ПЦР двух или более циклов стадий денатурации, отжига и удлинения. Указанные термины охватывают случай, когда амплифицированы один или несколько участков одной или нескольких последовательностеймишеней.

В используемом в данном описании смысле термин «реагенты для амплификации» относится к таким реагентам (дезоксирибонуклеотидтрифосфатам, буферу и т.д.), которые необходимы для амплификации, за исключением праймеров, матрицы нуклеиновой кислоты и фермента для амплификации. Обычно реагенты для амплификации вместе с другими компонентами реакции помещают и хранят в реакционном сосуде (пробирке, микролунке и т.д.).

В используемом в данном описании смысле термины «эндонуклеазы рестрикции» и «ферменты рестрикции» относятся к бактериальным ферментам, каждый из которых разрезает двунитевую ДНК в конкретной нуклеотидной последовательности или вблизи нее.

В используемом в данном описании смысле термин «рекомбинантная молекула ДНК» относится к молекуле ДНК, которая состоит из фрагментов ДНК, связанных вместе с помощью способов молекулярной биологии.

Термин «Вестерн-блот» относится к анализу белка(ов) (или полипептидов), иммобилизованных на подложке, такой как нитроцеллюлоза или мембрана. Белки разгоняют в акриламидных гелях, чтобы разделить белки, затем переносят белок из геля на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза или нейлоновая мембрана. Затем иммобилизованные белки подвергают воздействию антител с реактивностью против представляющего интерес антигена. Связывание антител можно регистрировать различными способами, включая применение радиоактивно меченых антител.

Термин «антигенная детерминанта» в используемом в данном описании смысле относится к такой части антигена, которая осуществляет контактирование с конкретным антителом (т.е. эпитоп). В том случае, когда используют белок или фрагмент белка или химический остаток для иммунизации животного-хозяина, многочисленные области антигена могут индуцировать продукцию антител, которые специфично связываются с данной областью или трехмерной структурой белка; указанные области или структуры называют антигенными детерминантами. Антигенная детерминанта может конкурировать с интактным антигеном (т.е. «иммуногеном», используемым для того, чтобы вызвать иммунный ответ) за связывание с антителом.

В используемом в данном описании смысле термин «вектор» используют по отношению к молеку

- 6 010506 лам нуклеиновых кислот, которые переносят участок(ки) ДНК из одной клетки в другую. Термин «носитель» иногда используют взаимозаменяемо с термином «вектор».

Термин «экспрессирующий вектор» в используемом в данном описании смысле относится к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей требуемую кодирующую последовательность и подходящие последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии оперативно связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии в прокариотах, обычно содержат промотор, оператор (необязательный) и сайт связывания рибосомы, часто вместе с другими последовательностями. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования.

В используемом в данном описании смысле термин клетка-хозяин относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальным клеткам, таким как Е. со11, дрожжевым клеткам, клеткам млекопитающих, клеткам птиц, клеткам амфибий, клеткам растений, клеткам рыб и клеткам насекомых), локализованной либо ίπ νίίτο, либо ίπ νίνο. Например, клетки-хозяева могут находиться в трансгенном животном.

Термин «трансфекция» в используемом в данном описании смысле относится к внедрению чужеродной ДНК в эукариотические клетки. Трансфекцию можно осуществить различными способами, известными в данной области, включая копреципитацию ДНК с использованием фосфата кальция, опосредованную ΌΕΆΕ-декстраном трансфекцию, опосредованную полибреном трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, слияние липосом, липофекцию, слияние протопластов, ретровирусную инфекцию и биолистику.

I. Некоторые антигены, обладающие низкой иммуногенностью.

Существует много низкомолекулярных соединений, которые не способны независимо вызывать иммунный ответ из-за их небольшого размера. В одном варианте гаптен может быть конъюгирован с белком-носителем (таким как, без ограничения, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин или гемоцианин морского блюдечка «замочная скважина»), и полученный конъюгат используют для иммунизации. В таких вариантах возникает множество проблем. Например, первичный иммунный ответ может быть направлен к белку-носителю, а не к молекуле гаптена, и это необходимо выяснить при тестировании сывороток от иммунизированных животных и надосадков гибридом. Тестирование должно выявлять, являются ли антитела специфичными к гаптену или к конъюгату в целом.

Другая проблема может заключаться в изменениях трехмерной структуры (конформации) гаптена, которые могут происходить во время конъюгирования с носителем. Это может приводить к тому, что антитела являются специфичными к гаптену в конъюгате, но неспособны узнавать свободную молекулу гаптена. В таких случаях можно пробовать различные варианты конъюгирования так, чтобы разные функциональные группы гаптена были экспонированы на поверхности носителя.

В еще одном варианте можно использовать иммунизацию иммунными комплексами, когда представляющий интерес антиген является либо консервативным низко иммуногенным белком, либо является минорной антигенной детерминантой, в которой уже имеется очень низкое процентное содержание всех специфичных антител, направленных к ней во время иммунного ответа. В первом случае компонентом иммунного комплекса в виде антитела могут быть моноклональные антитела с неудовлетворительной аффинностью, полученные ранее после обычной иммунизации. Во втором случае используют моноклональные антитела против сильных антигенных детерминант. Примером успешного применения указанного способа является продукция антител против эритропоэтина человека, интерферонов α и γ и иммуноглобулинов близкородственных видов (такие как, без ограничения, моноклональные антитела крыс против 1дС мыши). См. табл. 1.

В других вариантах некоторые антигены имеют очень высокую степень консервативности и неспособны вызывать какой-либо заметный иммунный ответ, несмотря на их белковую природу и достаточную молекулярную массу (например, но не ограничивая указанным, гемоглобин, некоторые ферменты). В указанных конкретных вариантах антигены могут быть конъюгированы с белком теплового шока (таким как, без ограничения, белок теплового шока 70 кД, иначе известный как Н8Р70). См. табл. 1, указан в виде АРР-конъюгата. Данные показывают, что Н8Р70 способствует презентации пептидных фрагментов посредством экспонирования их определенным образом (см. фиг. 1). Конъюгирование белков и пептидов с Н8Р70 обычно приводит к резкой интенсификации продукции антител против указанных белков и пептидов. В других конкретных вариантах наблюдали полное подавление иммунного ответа в случае конъюгирования Н8Р70-интерферон γ.

II. Применение Н8Р для повышения иммуногенности.

Способы, предлагаемые в данном описании, включают новое применение белка теплового шока в качестве носителя для презентации представляющего интерес антигена, чтобы получить антигенспецифичные антитела к антигенам, которые обычно не вызывают адекватного иммунного ответа по отношению к нативной молекуле. В клетках в ходе развития появились многие механизмы, помогающие им выжить в непредсказуемом и опасном мире. Одним из таких механизмов является ответ теплового шока, который развивается в результате воздействия на клетки необычно высоких температур (напри

- 7 010506 мер, без ограничения, в случае заболевания с высокой температурой) и других стрессов, включая гипоксию, лишение питательных веществ, радикалы кислорода, метаболический распад, вирусную инфекцию, фагоцитоз и трансформацию. Указанный ответ теплового шока включает в себя продуцирование белков теплового шока («Н8Р»). Одним семейством таких белков являются белки Н8Р70. Обнаружено, что представители семейства белков Н8Р70 функционируют в цитозоле, митохондриях, а также эндоплазматическом ретикулуме клеток. Каждый из белков Н8Р70 работает с небольшой группой связанных белков, когда они помогают другим белкам подвергаться фолдингу. Н8Р70 и связанные с ним белки имеют тенденцию связываться с гидрофобными аминокислотами на поверхности белка, где они гидролизуют АТФ, часто связываясь и высвобождая свой белок при каждом цикле гидролиза АТФ. Указанные повторяющиеся циклы, например, помогают белку-мишени подвергаться фолдингу.

Некоторые из указанных белков теплового шока помогают стабилизировать и репарировать частично денатурированные клеточные белки. Указанные Н8Р также действуют как молекулярные шапероны. В качестве шаперонов Н8Р помогают превращению расплавленной глобулярной формы белка в правильно уложенную конечную компактную конформацию белка, защищающая функциональные белки от деградации, перенося аномальные белки в области деградации, перенося белки между разными компартментами клетки, способствуя сборке белковых мультимеров или помогая презентации антигенов с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) на поверхности антигенпрезентирующих клеток.

Показано, что иммунная система дает сильный ответ на белки теплового шока микробов, таких как бактерии, паразиты и грибы. Присутствие чужеродного Н8Р запускает немедленный и мощный иммунный ответ организма. [Миту, Р., Уоипд. В., 1. Вас!егю1. 174: 4193-4196 (1992)]. Н8Р70 является основной мишенью иммунного ответа на многие разные патогены, включая бактерии, грибы, гельминты и паразитические простейшие. [Уоипд, В.А., апй ЕШо1, Т.Е, Се11, 59:5-8 (1989); КаиГтапп, 8.Н., 1ттипо1. Тойау, 11:129-136, (1990); Уоипд, Ό.Β., е! а1, 81гез8 рго!еш8 апй шГесйоиз йщеазез, р. 131-165 т 81гез8 рго!еш8 т Ыо1оду апй тейюте, МоптоЮ, В.1., е! а1., (ейк.) Со1й 8рпп§ НагЬоиг ЬаЬогаФгу, Со1й 8рпп§ НагЬог, ΝΥ (1990); Υоипд, В.А., Апп. Веу. 1ттипо1., 8:401-420(1990)]. Иммунизация различными Н8Р патогенов индуцирует сильный иммунный ответ и обеспечивает защиту от заболеваний, вызванных такими патогенами. [8и/це, К. апй Υоипд, В.А., 1. 1ттипо1., 156: 873-876 (1996)].

Применение Н8Р в качестве носителей вакцины, основанной на сильном иммунном ответе организма, началось в начале 1990-х годов. [Ийопо, Н. апй Зпуайауа, Р.К., 1. Ехр. Мей, 178:1391-1396, (1993); Ийопо, Н., е! а1, Ргос. №11, Асай. 8сЕ И8А, 91:3077-3081, (1994); 8и1о, В. апй Зпуайауа, Р.К., 8с1епсе, 269:1585-1588, (1995); В1асйеге, Ν.Ε., е! а1, 1. Ехр. Мей, 186:1315-1322, (1997); Татига, Υ.Β, е! а1., 8с1епсе, 278:117-120, (1997); Νπιγ, 8., е! а1, 1. 1ттипо1., 162:6426-6432 (1999)]. Посредством химического конъюгирования [Ьиззоте, А.В., е! а1, Еиг. 1. 1ттипо1. 21:2297-2302 (1991); Ваток, С, е! а1, Еиг. 1. 1ттипо1., 22:1365-1372, (1992); апй Реггаи!, В., е! а1, С1ш. Ехр. 1ттипо1., 93:382-386 (1993); 8и/ие, К. апй Υоипд, В.А., 1. 1ттипо1., I, 156:873-876, (1996); 811/1^ К., е! а1, Ргос. №!1 Асай. 8сЕ И8А, 94:13146-13151, (1997); В1со, А.1., е! а1, 1пГес!. 1ттип., 66:347-352, (1998), включенные в данное описание в виде ссылки] антигенов с Н8Р70 можно создавать сильные и подходящие по параметрам иммуногены, которые вызывают ограниченные классом I МНС ответы цитотоксических Т-клеток СИ8+, достаточные для того, чтобы опосредовать отторжение опухолей, экспрессирующих слитый партнер. Такой же клеточный аппарат используют в настоящем изобретении, чтобы создать антиген-специфичные антитела, специфичные к нативному неконъюгированному антигену. См. фиг. 1.

В предшествующем уровне техники описано применение Н8Р70 для стимуляции иммунного ответа, при этом стимулирующую активность оценивали в соответствии со степенью индукции клеточного и гуморального иммунитета. Однако существует значительное различие между индукцией образования антител и продукции моноклональных антител. Присутствие антител в сыворотке не всегда приводит к продукции высокоаффинных моноклональных антител, которые способны узнавать природные молекулы. В конкретном варианте при продукции моноклональных антител к онкобелкам Е7 образование антител наблюдали после иммунизации мышей очищенным рекомбинантным белком, однако, при тестировании ни один из клонов не узнавал природный Е7 в лизатах клеточных линий, содержащих геном НРУ. Иммунная система, по-видимому, распознает некоторые детерминанты рекомбинантных белков, которые не существуют в нормальных белках. Другими словами, полученные антитела взаимодействовали с антигеном, используемым для иммунизации, но не взаимодействовали с природным белком.

Настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным механизмом, однако, предполагается, что трехмерная белковая структура рекомбинантных белков отличалась от трехмерной структуры природных белков. Следовательно, иммунной системе могли быть презентированы неприродные антигенные детерминанты. Чтобы преодолеть указанную проблему, в настоящем изобретении используют природный механизм презентации антигена (с использованием гибридных белков, содержащих представляющий интерес белок или антиген, конъюгированный с белками теплового шока), чтобы презентировать иммунной системе детерминанты с природной конформацией. В конкретных вариантах это осуществляют с использованием Н8Р70.

В указанных конкретных вариантах представляющий интерес антиген конъюгируют с Н8Р70 или

- 8 010506 любой частью НЗР70, которая обеспечивает возможность того, чтобы представляющий интерес антиген был иммуногенным. Конъюгирование можно осуществлять химическим способом. [Ьиззоте, А. В., е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 21:2297-2302 (1991); Ваток, С, е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1, 22:1365-1372, (1992); апб Реггаи!, К, е! а1., С1т. Ехр. 1ттипо1., 93:382-386 (1993); Зихие. К. апб Уоипд, В.А., 1. 1ттипо1. I, 156:873-876, (1996); Зихие, К., е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А, 94:13146-13151, (1997); К1со, А.1., е! а1., 1п1ес!. 1ттип., 66:347-352, (1998)]. Антигеном может быть любой белок, пептид, нуклеотидная последовательность или химический остаток. НЗР70 может быть из любого источника, включая, но не ограничивая указанным, млекопитающих, рептилий, амфибий, рыб, птиц, насекомых, бактерии, грибы, гельминты, простейшие, вирусы и растения.

После того как представляющий интерес антиген конъюгируют с молекулой НЗР70, конъюгат вводят в чужеродную интактную иммунную систему, способную процессировать конъюгат и вызывать иммунный ответ на иммунизацию конъюгатом. Можно иммунизировать любое животное, и животное не ограничено млекопитающими, и обычные лабораторные примеры включают крысу, мышь, хомячка, песчанку, морскую свинку, кролика, собаку, обезьяну, цыпленка, козу, овцу, свинью, верблюда, корову, лошадь и кошку.

III. Иммунизация.

Эффективность иммунизации непосредственно определяет, могут ли продуцироваться высокоаффинные моноклональные антитела. Различные способы хорошо известны в данной области и используются для повышения эффективности иммунизации, некоторые из них описаны в данной публикации.

A. Выбор субъекта для иммунизации.

В конкретных вариантах имеется три обычных типа гибридомных систем: мыши, крысы и человека. Мышиную гибридому используют наиболее широко, а человеческую гибридому используют меньше всего. Изобретение никоим образом не ограничено указанными примерами. Любое животное с интактной иммунной системой может быть использовано в качестве источника В-клеток для гибридизации с миеломой или любой другой иммортализованной клеткой, включая, без ограничения, иммортализованные клетки человека и иммортализованные клетки крысы, чтобы создать гибридому.

Линию мышей ВАЕВ/с наиболее часто используют для иммунизации мышей; все линии миеломы мышей происходят из указанной линии. В случае антигенов с низкой иммуногенностью можно иммунизировать мышей другой линии. Такие мыши могут продуцировать более сильный иммунный ответ на некоторые антигены по сравнению с ВАЕВ/с. Потомство первого поколения, полученное при скрещивании ВАЕВ/с и линии, используемой для иммунизации, можно использовать для выращивания асцита для получения гибридом.

В других вариантах используют крыс, в литературе настойчиво рекомендуется линия БОИ/С, но вполне удовлетворительные результаты получали в случае крыс линии УГЗТАВ.

B. Схемы иммунизации мышей.

1. Схема кратковременной иммунизации.

В конкретных вариантах антиген вводят дважды с 2-недельным интервалом в подушечки задних лап мышей Ва1Ь/с. В следующих вариантах количество антигена обычно находится в пределах от 5 до 200 мкг на мышь (но не ограничено указанными пределами) в зависимости от его доступности и иммуногенности. В случае токсичных антигенов доза может быть уменьшена до 0,1 мкг. Для первого введения антигена (раунда иммунизации) раствор антигена обычно имеет пределы 50-200 мкг в объеме (но не ограничен указанными конкретными пределами при условии, что достигается иммунный ответ) и антиген комбинируют с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда («СЕА»). СЕА широко известен в данной области и используется в виде минерального масла с суспензией убитых микобактерий. Также можно использовать другие адъюванты, такие как, без ограничения, минеральные гели (например, гидроксид алюминия) и поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины морского блюдечка «замочная скважина», динитрофенол и потенциальные человеческие адъюванты, такие как ВСС («бацилла Кальметта-Герена») и СогупеЬас!егшт рагуцт). Энергичное смешивание раствора антигена с СЕА дает тонкодисперсную эмульсию для замедления и продления проникновения антигена в ткань. Второй раунд иммунизации осуществляют как первый, но используя неполный адъювант Фрейнда (ГЕА), который не содержит микобактерий.

В следующих вариантах в случае антигенов с низкой иммуногенностью полезно иммунизировать группу животных разными дозами антигена и использовать разные схемы иммунизации. В конкретном варианте на третий или четвертый день после второго раунда иммунизации берут образцы крови и анализируют в отношении содержания в них антител против определенного антигена. Для анализа обычно отбирают животных с наиболее высоким титром. Однако существуют исключения, такие как белкитоксины, используемые в качестве антигенов. Указанные типы антигенов могут давать высокий титр специфичных антител, но это также сочетается с высоким процентом гибели В-лимфоцитов под действием токсина. В указанных случаях необходимо отбирать животных, которые не имеют самого высокого титра и/или необходимо сосредоточить внимание на жизнеспособности клеток для слияния. На четвертый день после второго раунда иммунизации животное умерщвляют и клетки подколенных лимфатиче

- 9 010506 ских узлов сливают с клетками миеломы. Также можно использовать другие лимфатические узлы животного.

2. Схемы длительной иммунизации.

В другом варианте, когда схема кратковременной иммунизации не эффективна, можно попытаться использовать различные типы длительных схем. В данном случае животных обычно иммунизируют с интервалом 2-4 недели либо внутрибрюшинно, либо подкожно (альтернативно, но реже внутривенно или перорально). СТА используют для первого раунда иммунизации и ΙΡΑ используют для следующего раунда.

На 10-14 день после каждого раунда иммунизации (начиная со второго раунда) кровь от иммунизированных животных тестируют в отношении содержания специфичных антител хорошо известными в данной области способами. Если титр антител достиг требуемого уровня, то проводят последний раунд иммунизации антигеном (называемый бустер-иммунизацией) внутривенно без адъювантов. В предпочтительных вариантах дают 1/10 исходной дозы. Вследствие бустер-иммунизации избирательно стимулируются клоны, продуцирующие антитела с высокой аффинностью к антигену.

Затем собирают В-клетки, которые секретируют антитело, специфичное к нативному антигену, и проводят скрининг в отношении активности способами, известными специалистам в данной области и как описано в данной публикации. [Наг1оте апб Еаие, АиНЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу Рге88, №\ν Уогк, (1988)]. Некоторые из таких способов скрининга включают, но не ограничены указанным, радиоиммуноанализ, ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ), иммуноанализ типа «сэндвич», иммунорадиометрический анализ, реакцию диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионный анализ, иммуноанализ ίη δίΐιι (например, с использованием коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), Вестерн-блот, реакции преципитации, анализ агглютинации (например, анализы агглютинации в геле, анализы гемагглютинации и т.д.), анализ фиксации комплемента, иммунофлуоресцентный анализ, анализ белка А, анализ визуализации вируса, анализ модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретический анализ и т. д.

После идентификации клона с титром антител, по меньшей мере равным 1:1000, создают гибридому способами, известными специалистам в данной области и как описано в данной публикации. |Наг1о\у апб Ьапе, АпНЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8, №\ν Уогк, (1988); КоЫег апб МПйет, Ыа!иге, 256:495-497 (1975); КохЬог е! а1., 1ттипо1. Тоб., 4:72 (1983); Со1е е! а1., т Мопос1опа1 АпИЬоб1е8 апб Сапсег Тйегару, А1ап В. ЬЬх. 1пс. рр.77-96 (1985); РСТ/И890/02545; Со!е е! а1, Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А, 80:2026-2030 (1983)]. Затем полученные моноклональные антитела можно использовать для терапии заболевания (такого как, без ограничения, злокачественная опухоль, вирусные инфекции и т.д.), иммунодиагностики, иммунохимии, иммуногистологии, иммуноцитологии, иммуноаффинной хроматографии и геномных и белковых исследований.

В табл. 1 представлены конкретные варианты применения способов согласно изобретению для создания высокоаффинных моноклональных антител к белкам, которые обычно обладают низкой иммуногенностью. Указанные варианты являются только некоторыми примерами и никоим образом не являются ограничивающими. В первой колонке слева указан представляющий интерес антиген. Во второй колонке указан иммуноген, который используют для иммунизации животного с интактной иммунной системой. В данной колонке АРР относится к способам, описанным в данной публикации, при которых представляющий интерес антиген химически конъюгируют с Н8Р70. Также в данной колонке КЬН-конъюгат означает конъюгат с гемоцианином морского блюдечка «замочная скважина», а не с Н8Р70. В третьей колонке показано количество клонов, получаемых в результате иммунизации, и в четвертой колонке показано количество клонов, которые способны связываться с нативным представляющим интерес антигеном. В пятой колонке указан количественный способ, используемый для выяснения того, являются ли моноклональные антитела специфичными к представляющему интерес антигену. ЕЫ8А используют для обозначения твердофазного иммуноферментного анализа. XVВ используют для обозначения Вестернблота. ΙΡ используют для обозначения иммунофлуоресценции. 1АС используют для обозначения иммуноаффинной хроматографии. В последней колонке дано краткое пояснение того, почему антигены не вызывают сильного иммунного ответа без конъюгации.

- 10 010506

Таблица 1

Мышиные моноклональные антитела, полученные с использованием способа на основе адъювантного полипептида (АРР)

Мишень	Иммуноген	Общее количество полученных клонов	Количество клонов, которые узнают интактную мишень	Способы	Проблема
1. Металлопротеиназа 3 матрикса (ММРЗ) человека	Рекомбинантный каталитический домен ММР-3, 40212, М.м. 19369 Д - интактный	0	0	ЕЫЗА	Консервативный, низко иммуногенный, с неправильной укладкой
Рекомбинантный каталитический домен ММР-3, 4 0212, М.м. 19369 Д - АРР-конъюгат	4	1	ЕЫЗА, ИВ
2. Тропонин Т, кардиоспецифичный, человеческий (ТТ)	16-мерный пептид, специфичный к сердечной изоформе 1 тропонина Т, КДН-конъюгат	7	9	ЕЫЗА, ИВ	Множественные изоформы, перекрестная реактивность
16-мерный пептид, специфичный к сердечной изоформе 1 тропонина Т, АРР-конъюгат	3	2	ЕЫЗА, ИВ
3. Эритропоэтин, человеческий (ЕРО)	Рекомбинантный полноразмерный эритропоэтин человека интактный.	0	0	ЕЫЗА '	Высоко консервативный, низко иммуногенный
Рекомбинантный полноразмерный эритропоэтин человека денатурированный, 6М мочевина	2	1	ЕЫЗА, ИВ
Рекомбинантный полноразмерный эритропоэтин человека иммунный комплекс с мАт	0	0	ЕЫЗА,
Рекомбинантный полноразмерный эритропоэтин человека - АРРконъюгат	5	3	ЕЫЗА, НВ
4. Специфичная для нейронов енолаза (γγ-субъединица), человеческая (Ν3Ε)	Природная Ν5Ε из головного мозга человека, тетрамер, М.м. 160 кД - интактная	9	1	ЕЫЗА, ИВ, ΙΕ	Консервативная, низко иммуногенная, инактивируемая при покрывании
Природная Ν8Ε из головного мозга человека, тетрамер, М.м. 160 кД денатурированная, 6М мочевина	0	0	ЕЫЗА
Природная Ν8Ε из головного мозга человека, тетрамер, М.м. 160 кД - иммунный комплекс с мАт	0	0	ЕЫЗА
Природная Ν5Ε из головного мозга человека, тетрамер, М.м. 160 кД - АРРконъюгат	2	2	ЕЫЗА, ИВ
5. Тканевой активатор плазминогена человека (ТРА)	Рекомбинантный полноразмерный ргоТРА человека, М.м. 46 кД - АРРконъюгат	7	5	ЕЫЗА, ИВ, 1АС, ингибирование ферментативной активности	Избегают перекрестной реактивности с амино-концевым фрагментом, получают мАт, которое связывает ргоТРА в 1М СпНС1

- 11 010506

6. Паратиреоидный гормон, человеческий (РТН)	Ν-концевой 1-34 синтетический пептид - АРРконъюгат	5	5	ЕЫЗА	Низко иммуногенный, небольшого размера, дорогостоящая потребность в подборе пары мАт
7. Паратиреоидный	Синтетический	2	1	ЕЫЗА			Низко
гормон, человеческий	пептид 28-48						иммуногенный,
(РТН)	середины молекулы						небольшого
	- АРР-конъюгат						размера, дорогостоящая потребность в подборе пары мАт
8. Паратиреоидный	Синтетический	2	1	ЕЫЗА			Низко
гормон, человеческий	пептид 44-68						иммуногенный,
(РТН)	середины молекулы						небольшого
	- АРР-конъюгат						размера, дорогостоящая потребность в подборе пары мАт

9. Гемоглобин,	Природный НЬ из	0	0	ЕЫЗА			Высоко
человеческий (НЬ)	объединенных						консервативный,
	эритроцитов						низко
	человека -						иммуногенный,
	интактный						необходимо
	Природный НЬ из	1	1 (только	ЕЫЗА			различать
	объединенных		гликозили-				гликозилирован-
	эритроцитов		рованный)				ные/дегликози-
	человека -						лированные
	денатурированный, 6М мочевина						изоформы
	Природный НЬ из объединенных	3	3 (обе)	ЕЫЗА
	эритроцитов человека - АРРконъюгат
10. Грелин,	Полноразмерный 1-	3	3	ЕЫЗА			Небольшого
человеческий	28 синтетический						размера, низко
	пептид, не						иммуногенный.
	содержащий группы октаноила - АРР-						консервативный
	конъюгат
11. Коннексин 40,	16-мерный пептид,	2	0	ЕЫЗА			Низкое
человеческий	специфичный для						относительное
	коннексина 40 человека - КЪНконъюгат						содержание
	16-мерный пептид, специфичный для коннексина 4 0 человека - АРР-	3	3	ЕЫЗА,	ИВ,	ΙΓ
	конъюгат
12. Интерферон гамма	Рекомбинантный	3	2	ЕЫЗА			Низко
человеческий	полноразмерный						иммуногенный,
	интерферон гамма						необходимо
	человека, М.м.						получение
	16,7 кД -						нейтрализующих
	интактный Рекомбинантный полноразмерный интерферон гамма человека, М.м. 16,7 кД - АРР-	4	3	ЕЫЗА			мАт
	конъюгат
13. Вирус гриппа А	Пре дп ол а гаемые	5	2	ЕЫЗА,	НВ		Низкое
(Η5Ν1),	16 а/к- и 18 а/к-						относительное
гемагглютинин	пептиды,						содержание,
	типоспецифические						перекрестная
	для гемагглютинина Н5 16 а/к - АРР- конъюгат						реактивность
	Предполагаемые 16 а/к- и 18 а/к-	2	1	ЕЫЗА,	ИВ
	пептиды, типоспецифические для гемагглютинина Н5 18 а/к - АРР-
	конъюгат

- 12 010506

14. Онкобелок Е7 вируса папилломы человека типа 18 (Ε7ΗΡν18)	₽ е комбина н т ный п олнора эме р ный Е7НРУ18, М.М. 11995 Д интактный Е7	0	0	ЕЫ5А, »В	Иммуносупрессия, низкая иммуногенность, олигомеризация, неправильная укладка
Рекомбинантный полноразмерный Ε7ΗΡνΐ8, М.м. 11995 Д денатурированный, 6М мочевина	0	0	ЕЫЗА, НВ
Рекомбинантный полноразмерный Ε7ΗΡνΐ8, М.м. 11995 Д рекомбинантный слитый белок Е7НРУ18 - АРР	3	3	ЕЫЗА, ИВ, ΙΓ
15 - Прионный белок человека (РгР)	13-мерный пептид, специфичный для 130-142 а/к РгР АРР-конъюгат	5	3	ЕЫЗА, ИВ	Высоко консервативный, низко иммуногенный
16. Нейротоксин А ΟΙοΒΐτίάίιιπι ЬоЬиНпшп (ΒοΝΤ/Α)	Четыре пептида, специфичные для Нцепи ΒοΝΤ/Α - АРРконъюгат	Проводится исследование		ЕЫЗА, НВ	Высоко токсичный, низко иммуногенный после инактивации формальдегидом
17. Гиалуроновая кислота (НПА)	Конъюгат ЕНА-АРР	3	3	ЕЫЗА	Высоко консервативный, неиммуногенный

IV. Моноклональные антитела для выявления вируса папилломы человека/рака шейки матки.

В одном варианте изобретения использовали предлагаемый в изобретении способ разработки моноклональных антител, специфичных к онкобелкам Е6 и Е7 вируса папилломы человека («ΗΡν»). Разработка специфичных моноклональных антител к указанным онкобелкам была очень трудной, поскольку природные онкобелки Е6 и Е7 трудно очищать вследствие их низкой концентрации, а рекомбинантные белки имеют тенденцию к неправильному фолдингу и агрегируют. Кроме того, онкобелки Е6 и Е7 обладают иммуносупрессирующей активностью. Антитела, полученные с использованием рекомбинантных онкобелков Е6 и Е7 в качестве иммунизирующего агента, не обладают высокими аффинностями по отношению к нативным белкам Е6 и Е7. Вследствие этого использовали новый способ, чтобы создать антитела, которые затем можно использовать для многих применений, которые описаны в данной публикации.

А. Предпосылка рака шейки матки.

Цервикальная карцинома занимает второе место среди наиболее распространенных злокачественных опухолей у женщин. Показана корреляция между инвазивным раком шейки матки и ΗΡν на основании эпидемиологических и вирусологических исследований (фиг. 2). Сходная корреляция также обнаружена между ΗΡν и неоплазией наружных половых органов и ануса, а также инвазивной карциномой матки [К1ке1еу, ν.Ι, с1 а1., 1и1егге1а1юикЫр οί 8ехиа11у ТгаиктШеб νίταΐ 1иТес1юик аиб Опсо1ощса1 111иеккек οί 1йе ИгодешШ Тгас! 1и 8ехиа11у Тгаиктй!еб ПЦеакек: Vасс^иек, Ргеуеийои, аиб Сои!го1, (еб.) Ό.Ι. Вегик!еш. Асабетю Ргекк, Ьоибои, Нега1б οί Эегта1о1о§у, Ыо. 6:20-23 (2000)].

Цитологические исследования (общеизвестные как мазки-отпечатки по Папаниколау) все еще представляют собой основной лабораторный диагностический способ выявления атипичных многоядерных клеток. Указанный способ использовали для ранней диагностики рака шейки матки в течение многих лет. Однако указанные способы не выявляют более 30% всех носителей ΗΡν и не могут предсказать риск развития более серьезного заболевания.

При исследовании структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты («ДНК») ΗΡν, включая исследование девяти иммуногенных белков, которые кодируются ДНК наряду с исследованием закономерностей репликации вирусов, иммортализации и трансформации эпителиальных клеток разработан способ скрининга, основа которого заключалась в выявлении биохимических, иммунологических и генетических параметров, которые имеют отклонения от нормальных значений в случае наличия патологии.

Не всегда можно интерпретировать указанный тип данных, чтобы сделать ранний диагноз для оценки риска развития рака шейки матки или предсказания эффективности лечения. Это обусловлено тем, что используемые способы измерения также не имеют требуемой чувствительности и/или специфичности, измеряемые параметры непосредственно не отражают процесс дегенерации клетки или измерения отражают процесс непропорционально.

Описаны способы диагностики рака шейки матки посредством измерения титров антител, специфичных к белкам ΗΡν, в сыворотке пациентов с использованием ферментных иммуноанализов (которые включают ЕЫ8А, но не ограничены указанным) и иммунорадиометрических анализов [см. европейские патенты №№ 386734, 375555, 406542 и 523391]. Однако указанный способ не соответствовал ожиданиям, так как не было выявлено надежной корреляции между титром антител и раком шейки матки.

- 13 010506

Также существуют способы диагностики и предсказания развития рака шейки матки, основанные на типировании и количественном определении уровней ДНК НРУ в образце, подвергаемом исследованию с использованием полимеразной цепной реакции («ПЦР»). [У.1. К18е1еу, е( а1., ТНе Ро1утегаке Скат Кеасйоп Оиппд (Не Ωίαβηοδίδ о£ игодешЫ МГссБопк: А НапбЬоок £ог Рку81С1ап8, Моксоте, 2000; международный патент (νθ) № 00506645; и патент США № 5679509].

Однако применение указанных способов привело к преувеличенной в значительной степени диагностике, так как инфекция НРУ является кратковременной в природе, примерно в 80% всех случаев может завершаться спонтанным выздоровлением, а также элиминацией вируса. См. фиг. 2. Тем не менее, положительный результат в отношении ДНК НРУ в большинстве случаев надежно предсказывает развитие рака шейки матки.

Новое решение, предлагаемое настоящим изобретением, заключается в способе ранней диагностики рака шейки матки и определения риска развития на основании количественного иммунологического измерения онкобелков Е6 и Е7 НРУ в биопсийном образце клеток, а не в сыворотке пациента [ЕР № 1253924, А 61К 38/18, 08.02.2001].

В конкретном варианте белки Е6 и Е7 служили в качестве маркеров НРУ, и их выявляли в депарафинизированных образцах ткани с помощью способа иммунофлуоресценции и с использованием цифровых компьютерных технологий (для количественного определения), чтобы проанализировать многомерно представляемые образцы. Когда содержание белка Е6 или Е7 в образцах биопсии превышало нормальные значения в контроле более чем на 54%, делали заключение о существовании повышенного риска развития рака шейки матки. Также предположили, что могут быть использованы другие биохимические маркеры, такие как, без ограничения, рецептор эпидермального фактора роста и инсулиноподобный фактор роста.

В еще одном варианте разрабатывали способ скрининга, который был проще и дешевле и который мог быть легко стандартизован вследствие высокого уровня совместимости отбора образцов и анализа. Указанный способ скрининга имеет чувствительность, которая соответствует чувствительности ранее описанного варианта осуществления иммунофлуоресценции.

Указанный способ скрининга можно использовать для ранней диагностики рака шейки матки на основании цитологических образцов с использованием онкобелка Е7 НРУ в качестве маркера. Возможность применения любого из диагностических способов зависит от использования высокоаффинных моноклональных антител, специфичных для онкобелков Е6 или Е7. Ниже описано, как получали указанные антитела.

B. Разработка моноклональных антител к Е6 и Е7.

Существует пороговое увеличение синтеза белка Е7 НРУ в реакции на процесс дегенерации эпителиальных клеток, которому предшествует интеграция вирусной ДНК в ДНК клетки. В конкретном варианте ген Е7 выделяли из образцов, взятых у человека, и клонировали, затем экспрессировали в ЕксйепсЫа со11. Затем рекомбинантный белок Е7, выделенный из бактериальных клеток, использовали для иммунизации мышей. Однако в большинстве случаев антитела, продуцируемые при иммунизации рекомбинантными белками, не взаимодействовали с природным белком, так как они узнавали другие детерминанты. Чтобы преодолеть указанную проблему, использовали описанный выше способ, при котором белок Е7 конъюгировали с Н8Р70 и затем использовали в качестве антигена для иммунизации.

В конкретных вариантах получали два типа высоко чувствительных моноклональных антител против белка Е7 природного происхождения, которые перекрестно реагировали с двумя типами НРУ «повышенного риска» (НРУ16 и НРУ18). Указанная перекрестная реактивность позволяла выявлять 80-85% всех пациентов с неоплазией, связанной с НРУ. Применение в паре указанных двух типов моноклональных антител, которые взаимодействуют с разными антигенными детерминантами белка Е7, усиливает специфичность и обеспечивает отсутствие фона при диагностическом скрининге.

C. Способы скрининга НРУ.

В конкретном варианте способ ранней и доклинической диагностики рака шейки матки заключается в количественном иммунологическом определении онкобелка вируса папилломы человека (НРУ) у пациента в биопсийном образце клеток. Биопсийный образец клеток лизируют и надосадок клеточного лизата анализируют в отношении белка Е7 НРУ, используя пару моноклональных антител. В конкретном варианте пары моноклональных антител относятся к подизотипам 1дС2а и 1дС2Ь, и они узнают различные антигенные детерминанты белка Е7. В конкретном варианте антитела 1дС2а 716-321, 716-325, 716332 и 716-343 связываются по меньшей мере с одной антигенной детерминантой Е7. В другом варианте антитела 1дС2Ь 716-281 и 716-288 связываются по меньшей мере с одной другой антигенной детерминантой Е7. В другом варианте одну из двух групп антител конъюгируют с ферментной меткой, которая известна специалистам в данной области [см. Наг1о\\' ;·ιηά Баге, АпЦЬоШск: А ЬаЬогаЮгу Машаф СоИ 8ρπη§ НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, №\ν Уогк, (1988)]. Затем указанные антитела используют в твердофазном иммуноферментном анализе («ЕЫБА»), также хорошо известном специалистам в данной области. В конкретном варианте, когда концентрация белка Е7 в образце равна или выше 0,05 нанограмм (нг) в миллилитре (мл), диагностику ранней стадии рака шейки матки или риска его развития осуществляют с определенностью. В других конкретных вариантах условия осуществления количественного анализа оп

- 14 010506 тимизировали с помощью изменения концентрации антител для покрывания полистироловых планшетов, разбавления конъюгата, состава буферного раствора и времени и температуры инкубации в случае ЕЬ18А, который хорошо известен в данной области.

В предпочтительном варианте использовали антитело 716-281, специфичное к одной антигенной детерминанте онкобелка Е7, для первичного связывания белка, и антитело 715-332, специфичное к другой антигенной детерминанте Е7, конъюгировали с ферментной меткой. В еще одном варианте используемые моноклональные антитела специфичны к Е7 НРУ16, но также перекрестно реагируют с Е7 НРУ18. НРУ16 и НРУ18 являются двумя наиболее распространенными типами НРУ «высокого риска».

В следующем варианте в том случае, когда образец является позитивным в отношении белка Е7 при использовании способа скрининга на основе ЕЫ8А, осуществляют типирование НРУ. Тип НРУ можно определить различными способами, включая использование полимеразной цепной реакции и гибридизации ДНК ίη 811и, но не ограничивая указанным.

V. Моноклональные антитела, специфичные к прионному белку.

В другом варианте изобретения предлагаемый в изобретении способ применяли для разработки моноклональных антител против прионного белка («РгР»). В общем, предполагают, что возможной причиной губчатой энцефалопатии (В8Е, коровьего бешенства) является конформационный переход нормального прионного белка в патогенную изоформу. По мере того как патогенная изоформа РгР накапливается, происходит последующая деградация нейронов. Моноклональные антитела к указанному белку могут быть применимы в качестве диагностического средства для В8Е. Основная трудность в получении моноклональных антител к указанному белку заключается в высоко консервативной структуре РгР.

Множественные иммунизации мышей Ва1Ь/с полноразмерным рекомбинантным бычьим РгР как в нативной, так и в денатурированной формах не вызывали ни достаточного иммунного ответа, ни образования первичных позитивных клонов. Чтобы получить моноклональное антитело к РгР осуществляли конформационный анализ молекулы РгР и выбрали три аминокислотных последовательности. Указанные три пептидных последовательности были из Ν-концевой части, из середины молекулы и из С-концевой части бычьего РгР:

05: 25-36/62-69 ККРРКР000№ЭТ...рРН000№0 (20 ак) (8ЕО ГО N0: 6 и 7 соответственно)

03: 109-121 ('ЖМКУКРКТМК (13 ак) (8ЕО ГО N0: 8)

04: 226-242 1Л)¥(ЖЕ8ОА¥¥ОНС1А8 (17 ак) (8ЕО ГО N0: 9)

В конкретных вариантах указанные три пептида химически конъюгировали с Н8Р70 и затем использовали для иммунизации мышей Ва1Ь/с, используя способы, приведенные в данном описании. После завершения режима иммунизации собирали подколенные лимфатические узлы (также можно использовать другие лимфатические узлы, асцит, кровь или селезенку) для получения клонов, продуцирующих антитела, специфичные к РгР. Гибридомы получали, как известно в данной области и описано в данной публикации, и проводили скрининг гибридом в отношении продукции высокоаффинных моноклональных антител. Моноклональные антитела с высокой аффинностью идентифицировали, используя иммуноанализы, которые хорошо известны в данной области, такие как, без ограничения, ЕЬ18А. Затем полученные моноклональные антитела могут быть использованы для лечения заболевания, иммунодиагностики, иммунохимии, иммуногистологии, иммуноцитологии, иммуноаффинной хроматографии и геномных и белковых исследований.

VI. Моноклональные антитела, специфичные к гиалуроновой кислоте.

В другом варианте изобретения предлагаемый в изобретении способ применяют для создания моноклональных антител к гиалуроновой кислоте. Гиалуроновая кислота является высокомолекулярным полимером, состоящим из повторяющихся димерных единиц глюкуроновой кислоты и Νацетилглюкозамина, который образует сердцевину сложных агрегатов протеогликана, обнаруживаемых во внеклеточном матриксе. Гиалуроновая кислота играет важную роль в заболеваниях соединительной ткани человека, таких как, без ограничения, симптоматический остеоартрит коленного сустава. Количественное определение гиалуроновой кислоты и продуктов ее деградации считается важным диагностическим параметром, который можно получить с использованием моноклональных антител, специфичных к гиалуроновой кислоте.

Вследствие небелковой природы полимера и его идентичности у многих разных видов в диапазоне от бактерий до млекопитающих очень трудно создать высокоаффинные антитела изотипов 1д01, 1д02а, 1§02Ь.

В конкретном варианте гиалуроновую кислоту конъюгировали с Н8Р70 для иммунизации и моноклональные антитела получали, как описано для РгР. См. пример 9. Скрининг моноклональных антител осуществляли, используя ЕЬ18А с биотинилированной гиалуроновой кислотой и стрептавидиномпероксидазой хрена в качестве второго реагента для реакции окрашивания. Указанный тип ЕЫ8А хорошо известен в данной области. [Наг1оте апб Ьапе, АпДЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8, №\ν Уогк, (1988)].

В результате получили три генетически стабильных линии клеток гибридом, НЦГО3 - 1д02а; НПГО9 1д01, НИ.Е3 - 1д03, каждая из которых секретирует высокоаффинные моноклональные антитела (1д01 и 1д02а) против гиалуроновой кислоты. Затем указанные моноклональные антитела могут быть использо- 15 010506 ваны для лечения заболевания, иммунодиагностики, иммунохимии, иммуногистологии, иммуноцитологии, иммуноаффинной хроматографии и геномных и белковых исследований.

VII. Моноклональные антитела, специфичные к металлопротеазе 3 матрикса.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемый в изобретении способ применяют для создания моноклональных антител к металлопротеазе 3 матрикса («ММР3»). Белки семейства металлопротеаз матрикса (ММР) вовлечены в разрушение внеклеточного матрикса в ходе нормальных физиологических процессов, таких как эмбриональное развитие, репродукция и ремоделирование тканей, а также в патологические процессы, такие как артрит и метастазы. Большинство ММР секретируются в виде неактивных пробелков, которые активируются при расщеплении внеклеточными протеазами. ММР3 является ферментом, который разрушает фибронектин, ламинин, коллагены III, IV, IX и X, и протеогликаны хряща. Считают, что фермент вовлечен в заживление ран, прогрессирование атеросклероза и инициацию опухолей. Сообщается, что ММР3 вовлечен в ревматоидный артрит и некоторые формы злокачественной опухоли. Указанные моноклональные антитела затем могут быть применены для лечения заболевания, иммунодиагностики, иммунохимии, иммуногистологии, иммуноцитологии, иммуноаффинной хроматографии и геномных и белковых исследований.

VIII. Наборы для анализа риска заболевания с использованием моноклональных антител.

В настоящем изобретении также предлагаются диагностические наборы. В некоторых вариантах наборы применимы для определения того, существует ли риск развития у субъекта заболевания или состояния, например, без ограничения, рака шейки матки, губчатой энцефалопатии, заболеваний соединительной ткани, артрита и метастазов. Природа и применение набора будут зависеть от специфичности моноклонального антитела, предоставленного в наборе. Диагностические наборы получают множеством способов. В некоторых вариантах наборы содержат по меньшей мере одно моноклональное антитело, которое создано с применением способов согласно изобретению, к антигену, обычно имеющему низкую иммуногенность. В предпочтительных вариантах наборы содержат реагенты для проведения ЕЫ8А или другого сходного иммуноанализа, которые хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах набор содержит инструкции по определению того, существует ли риск развития у субъекта заболевания или состояния. В предпочтительных вариантах в инструкции указано, что риск развития заболевания или состояния определяют, выявляя наличие или отсутствие представляющего интерес антигена, такого как онкобелок Е7, РгР, ММР3 или гиалуроновая кислота, но не ограничивая указанным. В некоторых вариантах наборы содержат вспомогательные реагенты, такие как буферные агенты, реагенты, стабилизирующие нуклеиновые кислоты, реагенты, стабилизирующие белки, и системы, формирующие сигнал (например, системы, генерирующие флуоресценцию, такие как системы Бге1). Набор для тестирования может быть упакован любым подходящим способом, обычно в виде элементов в одной емкости или, при необходимости, в разных емкостях вместе с листочком инструкций по осуществлению тестирования. В некоторых вариантах наборы также предпочтительно содержат образец позитивного контроля.

Примеры

Следующие примеры предлагаются для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, и их не следует рассматривать, как ограничивающие объем изобретения.

В описании экспериментов, которое следует далее, использованы следующие сокращения: М (молярный); мкМ (микромолярный); мМ (миллимолярный); моль (моли); ммоль (миллимоли); мкмоль (микромоли); нмоль (наномоли); г (граммы); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); нг (нанограммы); л (литры); мл (миллилитры); мкл (микролитры); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); °С (градусы по Цельсию); мин (минуты); с (секунды); % (процент); т.п.о. (тысяч пар оснований); п.о. (пар оснований); ПЦР (полимеразная цепная реакция); а/к (аминокислота).

Пример 1. Выявление и типирование вируса папилломы человека (НРУ).

A. Сбор клинического материала.

Клинические образцы получали и транспортировали хорошо известным в данной области способом. Использовали стерильный одноразовый зонд, чтобы взять соскоб клинических образцов эпителиальных клеток шейки матки. Зонд промывали 500 мкл физиологического раствора (0,83% ЫаС1), чтобы извлечь клетки из зонда и раствор собирали в пробирку Эппендорфа с крышкой объемом 1,5 мл, затем образец хранили вплоть до использования обычно при 4°С до пяти дней и при температуре от -10 до -20°С до одного месяца.

B. Очистка ДНК.

Способы экстракции ДНК хорошо известны в данной области, и способы очистки ДНК для настоящего изобретения не ограничены указанным конкретным примером. Если образец был заморожен, то его подвергают оттаиванию хорошо известным в данной области способом и затем центрифугируют при 10000 об./мин в течение 1 мин. На дне образуется осадок, а надосадок отбрасывают. В пробирку добавляют 100 мкл физиологического раствора и осадок гомогенизируют. Добавляют 500 мкл лизирующего раствора и встряхивают в течение 10 с. Затем образец и пробирку инкубируют при 65°С. Лизирующий раствор содержит 6 М тиоцианат гуанидина (8щша. И8А), 10 мМ ΕΌΤΑ (81дта, И8А), 1% тритон Х-100 (81дта, И8А), 10 мМ трис-НС1, рН 7,3 (81дта, И8А), 1% 2-в-меркаптоэтанол (ВюсБет1са1, Еид1апф. До

- 16 010506 бавляют 20 мкл гомогенизирующего сорбента (8Шса, 8щта. И8А) и встряхивают в течение 10 мин при 50-100 об./мин. Образец и пробирку центрифугируют при 10000 об./мин в течение 1 мин и надосадок отбрасывают. Добавляют 500 мкл раствора для промывки и пробирку встряхивают до тех пор, пока осадок не смешивается с раствором, и снова центрифугируют при 10000 об./мин в течение 1 мин, снова отбрасывая надосадок. Раствор для промывки содержит 4 М тиоцианат гуанидина (81дта, И8А), 10 мМ ЕИТА (81дта, И8А). В пробирку добавляют 1 мл 70% этанола и хорошо встряхивают и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 1 мин, отбрасывая надосадок. Указанную промывку этанолом повторяют. Затем пробирки открывают и дают возможность осадку высохнуть в течение 5-10 мин при 55°С. В пробирку добавляют 100 мкл не содержащей нуклеаз воды (Рготеда, И8А) и инкубируют в течение 5 мин при 55°С. Затем образцы используют для полимеразной цепной реакции. Образцы можно хранить при 4°С до недели или при -20° до шести месяцев.

С. Полимеразная цепная реакция («ПЦР») для типирования НРУ.

Реакции ПЦР осуществляли в 25 мкл раствора, содержащего 5 мкл матрицы ДНК, 67 мМ трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, 1,5 мМ МдС1₂, 100 мМ бАТР, бСТР, бТТР и бСТР, 10 пмоль каждого праймера и 1 единицу Тац-полимеразы (5 единиц/мкл; Рготеда, И8А). Использовали способ горячего старта, который хорошо известен в данной области. Условия температурных циклов: 94°С в течение 3 мин и затем 40 циклов при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. В таблице ниже показаны тип НРУ и праймеры, используемые для амплификации ДНК указанных типов НРУ.

Тип ΗΡν	Праймер 5'-3'	Размер ампликона (п.о.)
НРУ-16	Е7-16-Г Сда сад с1с ада дда дда д (ЗЕ<2 ΙΟ ΝΟ: 10)	118
Е7-16-К дса саа ссд аад сд£ ада д (ЗЕС Ю ΝΟ: 11)
НРУ-18	Е7-18-Е дед ас£ сад адд аад ааа ас (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 12)	195
Е7-18-К са аад дас адд дЬд ЬЬс ада (ЗЕО Ю N0: 13)

Продукты амплификации анализировали в 1,5% агарозных гелях и фотографировали в УФ-свете (254 нм).

Пример 2. Конструирование рекомбинантных плазмид, которые кодируют синтез онкобелков Е7 типов НРУ16 и НРУ18.

Биопсийные образцы ткани шейки матки пациентов, у которых диагностирована цервикальная дисплазия, служили в качестве источника гена Е7. Клинические образцы исследовали в отношении присутствия НРУ и типировали, используя способ полимеразной цепной реакции, описанный в данной публикации. Гены Е7 типов НРУ 16 и НРУ18 амплифицировали способом ПЦР с использованием геноспецифичных праймеров [фрагмент длиной 303 пары оснований (п.о.) для НРУ16 и фрагмент длиной 324 п.о. для НРУ18] (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 14-17) (см. фиг. 3), после этого указанные гены клонировали в сайтах ЕсоШВатН1 в плазмиде рВ1ие8С1р1 8К (+) (81га1адеие). Определение олигонуклеотидных последовательностей клонированных генов показало полное соответствие данным СепВапк (например, номер доступа в СепВапк: АЕ 125673 для НРУ16 и АУ262282 для НРУ18) (см. фиг. 4 и 5, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 и 3).

Затем в гены включали последовательности терминации трансляции вблизи 3'-концов. Полученные в результате генетические конструкции, рНЕ716 и рНЕ718, представлены на фиг. 6 для НРУ16 и НРУ18 (8ЕО Ш ΝΟ: 18).

Синтез белков Е7 типов НРУ16 и НРУ18 в клетках Е. сой.

Плазмида рНЕ716 кодирует белок Е7-16 [Ме1(Н15)₆-С1иРйеПе-Е716-С1у8ег [111 аминокислотных остатков («а/к»), 12,5 килодальтон (кД) и изоэлектрическая точка (ИЭТ) 4,6]. А плазмида рНЕ718 кодирует белок Е7-18 [Ме1(Нщ)₆-С1иРйе8ег-Е718-С1у8ег (117 а/к, 13,5 кД и ИЭТ 5,4]. Необходимо отметить, что при осуществлении электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия («8Ό8ПААГ») [Ьаеттй, и.К., №1иге, 227: 680-685 (1970)] указанный белок имеет аномальную подвижность (примерно 21 кД), что соответствует библиографическим данным [1еоп, Г-Н., е1 а1., Ехрептеп1а1 апб Мо1еси1аг Мебюше, 34: 496-499, (2002)].

Штамм ВЬ21 (ИЕ3) Е. сой (81га1адеп, И8А) использовали для экспрессии полученных в результате генов. Трансфекцию осуществляли хорошо известным в данной области способом. После обработки ультразвуком онкобелок Е7 НРУ16 и онкобелок Е7 НРУ18 выявляли в растворимой фракции клеточных белков; поэтому хроматографической анализ на Νί-ША-агарозе осуществляли в нативных условиях без добавления мочевины (фиг. 7).

Более конкретно, клетки Е. сой штамма ВЬ21 (ИЕ3) трансформировали с использованием плазмид рНЕ716 и рНЕ718. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в среде Луриа-Бертани («ЬВ») с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и глюкозы (0,2%). Затем клетки разбавляли 1:25 свежей средой ЬВ с ампициллином и инкубировали в течение 2-3 ч до достижения плотности клеток значения оптической

- 17 010506 плотности ΟΌ₆οο=0,5. Оптическую плотность измеряли на анализаторе МиШзсап при длине волны 600 нм. Затем к культуре добавляли изопропил-в-О-тиогалактопиранозид («1РТС») до концентрации 0,2 мМ до общего объема 50 мл и инкубировали еще в течение З ч. Затем культуры центрифугировали при 5000 об./мин в течение 10 мин и надосадок отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 1 мл трис-НС1 20 мМ, рН 8, 0,ЗМ ЫаС1, 0,1% тритоне Х-100 и обрабатывали ультразвуком в течение 15 с. Затем культуры центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин. Осадок промывали трис-НС1 20 мМ, рН 8, 0,ЗМ ЫаС1, 0,1% тритон Х-100 (0,5 мл). Осадок гомогенизировали и ресуспендировали в 5 мл буфера А (10 мМ трисНС1, рН 8, 6М мочевина, 0,4М ЫаС1, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 5 мМ имидазол). Затем образец инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч при встряхивании. Затем образец центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывали. Колонку с ГОА-агарозой (1 мл) промывали раствором Νί8Ο₄, затем колонку уравновешивали буфером А. Надосадок наносили на колонку с 5 мл буфера А и затем 10 мл буфера В (буфер А с 10 мМ имидазолом). Элюирование осуществляли буфером С (10 мМ трис-НС1, рН 8, 2М мочевина, 0,4М №С1, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,ЗМ имидазол) фракциями по 0,5 мл. Обычно белок Е7 из НРУ16 и НРУ18 элюировался во фракциях 1-З. Фракции, содержащие белок, объединяли и диализовали против 100-кратного объема от объединенных фракций буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1, рН 8, 150 мМ №С1.

Пример З. Экспрессия гибридного белка, состоящего из пептида Е7 НРУ типа 16 (18) и ЭпаК (Н8Р70) М. 1иЬегси1о818.

Использовали ПЦР для амплификации гена Е7 вируса папилломы человека типов 16 и 18. Плазмидные ДНК рНЕ716 и рНЕ718, содержащие гены Е7 вируса папилломы человека (НРУ) типа 16 и 18, использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации фрагментов, содержащих гены Е7 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 19-22). См. фиг. 8. Кодон инициации находится в рамке с последовательностью, кодирующей метку 6Н18, и стоп-кодон отсутствует. Белок ЭиаК экспрессировали, используя клонированные фрагменты ДНК, содержащие гены Е7, трансфицированные в рекомбинантном векторе, основанном на рЦЕЗ0.

Рекомбинантный вектор рОЕЗ0-Ф1аК-У конструировали ранее и использовали в качестве основной плазмиды (фиг. 9), обеспечивающей экспрессию слитого белка 6Н18-бпаК. Нуклеотидная последовательность РОЕЗ0-бпаК (8ЕЦ ГО ΝΟ: 5) показана на фиг. 10. Чтобы создать указанный вектор, ПЦРфрагменты, содержащие гены Е7, расщепляли ВатН1 и Вд111 и клонировали в ВатН1-сайте рОЕЗ0-бпаКΥ. Рекомбинанты, несущие вставки в правильной ориентации, идентифицировали, используя рестрикционный анализ, который хорошо известен в данной области. Рекомбинантные плазмиды рЦЕЗ0-Е716бпаК и рОЕЗ0-Е718-бпаК обеспечивали экспрессию гибридных белков 6Н18-Е7 (тип 16)-бпаК и 6Н18-Е7 (тип 18)-бпаК соответственно.

Экспрессию осуществляли посредством трансфекции клеток Е. со11 ЭЬТ1270 плазмидами рЦЕЗ0Е716-бпаК и рОЕЗ0-Е718-бпаК в отдельных культурах и инкубации в течение ночи. (Клетки ΌΕΤ1270 получали интегрированием гена 1ас1 в Е.соН штамма ЭН10В с использованием Р1-трансдукции. ЭН10В имел следующий генотип: 10 В (ага Э1З9 Ό (ага, 1еи) 7697 Ό (1ас) X 74 да1и да1К грзЬ беоР Г80 1ас2 ΌΜ15 епб А1 ппрС гесА1 тсгА Ό (тгг 1186РМ8 тсг ВС)). См. 6гап1, 8., е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А, 87: 4645-4649 (1990)). Трансфицированные культуры ΌΕΤ1270 выращивали в бульоне Луриа-Бертани («ЬВ»), который разбавляли в 100 раз и инкубировали при З7°С при встряхивании вплоть до достижения плотности, измеряемой по оптической плотности, ΟΌ₆₀₀=0,5. Затем добавляли изопропил-β-Όтиогалактопиранозид («1РТС») до концентрации 0,1 мМ и культуру выращивали, как указано выше, еще в течение 2 ч. Как хорошо известно в данной области, 1РТС индуцирует ген ΕκΖ и его используют для селекции клеток, трансфицированных представляющей интерес плазмидой. В 8Э8-ПААГ наблюдали синтез гибридных белков ожидаемой молекулярной массы.

Пример 4. Выделение рекомбинантного белка Н8Р70 из Е. со11.

A. Буферные растворы.

Буферные растворы не готовили заранее. Буфер А готовили перед процедурой выделения и использовали в пределах одного часа. Матричный раствор 50 мМ К2НЮ4, рН 7, можно приготовить заранее, но его необходимо использовать в течение трех дней. Матричный раствор 10х РВ8 также можно приготовить заранее. Хранение буферных растворов и хроматографические способы необходимо проводить при комнатной температуре.

Буфер А содержит 25 мМ №(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-этансульфоновой кислоты) («НЕРЕ8»), рН 7,З, 0,1% №шбе1 Р-40 (мас./об.), 20% глицерин (об./об.), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид («РМ8Е») и 0,5М №С1.

Буфер В содержит 50 мМ ΙΕΕΡΟ.ι, рН 7, 5 мМ имидазол, 0,5М №С1, рН не корректируют.

Буфер С содержит 50 мМ ΚΕΡΟ.ι, рН 7, 150 мМ имидазол, 0,5М №С1.

Буфер Ό содержит 50 мМ К₂НΡΟ₄, рН 7, 50 мМ ЕЭТА, 0,5М №С1, рН не корректируют.

Буфер РВ8 содержит 10 мМ К2НЮ4, рН 7,5 и 0,14 5М №С1.

B. Подготовка хелатирующей колонки.

Промывают колонку 1x10 см деионизованной водой, выгоняя пузырьки из нижнего фильтра, оставляя слой воды на уровне примерно 1 см от нижнего фильтра. Измеряют необходимое количество хелати

- 18 010506 рующей сефарозы СЬ-6В (Атегайат Рйагтас1а Вю1есй). чтобы получить объем 5 мл. Используя пипетку, колонку загружают сефарозным гелем. Колонку промывают 5 объемами деионизованной воды со скоростью 3 мл/мин. Затем колонку промывают 10 объемами раствора 2иС1₂ (концентрация 1 мг/мл (1СИ)) со скоростью 3 мл/мин. Затем колонку промывают 10 объемами деионизованной воды со скоростью 3 мл/мин. Колонку соединяют с УФ-детектором (280 нм). Затем колонку промывают 10 объемами воды со скоростью 3 мл/мин. Теперь колонка готова для выделения белка из клеток Е. сой. выращенных в 500 мл культуральной среды.

Ό. Подготовка Е. сой.

Операции проводят при 4°С как можно быстрее. Сначала 5 раз промывают 1 г Е. сой (влажная биомасса) 2 объемами РВ8. центрифугируя при 5000 об./мин в течение 15 с в каждом цикле и затем ресуспендируя бактериальные клетки. После последней промывки клетки разбавляют в 5 мл РВ8. Затем клетки обрабатывают ультразвуком (20 кГц. 50-60 Вт) 6 раз по 30 с. Полученный в результате раствор центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывают. а надосадок наносят на колонку.

Е. Разделение белка.

После нанесения надосадка колонку промывают 10 объемами колонки буфера А. Затем 5 объемами буфера В. Белковые фракции элюируют 5 мл буфера С и собирают.

Е. Диализ белка. извлеченного с колонки.

Объединенные фракции помещают в диализный мешок и диализуют в течение 30 мин против 200 объемов РВ8 при 0°С и постоянном перемешивании. Через 30 мин раствор заменяют свежими 200 объемами РВ8 при 0°С также с постоянным перемешиванием. Затем фракции диализуют в течение ночи в 5 л РВ8 при 4°С. Концентрацию белка определяют способами количественного определения по Бредфорду или Лоури. которые хорошо известны в данной области [Наг1оте апб Тале. АпйЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8. Иете Уогк. (1988)]. Раствор замораживают при -70°С и лиофилизируют.

Пример 5. Получение мышиных моноклональных антител против рекомбинантных белков Е7 НРУ16 и НРУ18 Е7.

Мышей Ва1Ь/с [10 самок массой 16-18 г] дважды иммунизировали в подушечки задней лапы с двухнедельным интервалом между иммунизациями. используя высоко очищенный Е7 НРУ16 и Е7 НРУ18. Препараты Е7 НРУ16 и Е7 НРУ18 лизатов рекомбинантных Е. сой очищали. используя одностадийную металлохелатную хроматографию. Первую иммунизацию проводили 20 мкг белка. разбавленного в 20 мкл фосфатно-солевого буфера («РВ8»). смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Вторую иммунизацию также проводили 20 мкг белка. разбавленного в 20 мкл РВ8. но смешивали с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. На четвертый день после второй иммунизации лимфоциты из подколенных лимфатических узлов гибридизовали с клетками миеломы 8р2/0-Ад14 (американская коллекция типов культур («АТСС») СВЬ 1581; АТСС СВЬ 8287; европейская коллекция культур клеток 85072401; культуры клеток человека и животных Ό8ΜΖ АСС146). используя полиэтиленгликоль (ПЭГ) 4000. Гибридомы инкубировали в среде. содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин («НАТ»). две недели при 37°С с 5% СО₂. Выжившие при селекции гибридомы подвергали скринингу. используя непрямой ЕЬ18А. Позитивные культуры клонировали дважды. используя способ лимитирующих разведений [см. СатрЬе11. А.М.. Мопос1опа1 АпйЬобу апб 1ттипо§еп8ог Тесйпо1о§у ίη ЬаЬога1огу Тесйпк|ие5 ш ВюсйетШгу апб Мо1еси1аг Вю1о§у. уо1. 23(1991)]. ЕЫ8А осуществляли посредством абсорбции рекомбинантных белков Е7 НРУ16 и НРУ18 на полистироловых планшетах в концентрации 2 мкг/мл при инкубации планшетов в течение 1 ч при 37°С. затем планшеты 3 раза промывали РВ8. в планшеты добавляли 50 мкл надосадков культур тканей и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Моноклональные антитела. которые связываются с иммобилизованным антигеном. регистрировали. используя антитело козы против иммуноглобулина С (1дС) [Н+Ь] мыши. конъюгированное с пероксидазой. в течение периода времени. равного 1 ч. при 37°С. Раствор тетраметилбензидина («ТМВ»). который содержал пероксид водорода. служил в качестве субстрата. Оптическую плотность измеряли при 450 нм. Получили группу гибридом для белка Е7 НРУ16. которые продуцировали антитела 716-281 и 716-288 (1дС2Ь). а также антитела 716-321. 716-325. 716-332 и 716-343 (1дС2а). которые в равной мере хорошо взаимодействовали с Е7 НРУ16 и НРУ18 в непрямом ЕЬ18А (см. табл. 2).

- 19 010506

Таблица 2

Значения оптической плотности при 450 нм в непрямом ЕЫЗА при титровании моноклональных антител с использованием иммобилизованных белков Е7 НРУ16 и НРУ18

	Концентрация мАт в нг/мл
100	30	10	3	1	0
Покрывание Е7 НРУ16	716-281	>2	1,777	0,947	0,398	0,154	0,017
716-288	>2	1,515	0,705	0,301	0,091	0,007
716-321	>2	1, 382	0,462	0,160	0,047	0,013
716-325	>2	1,131	0,375	0,117	0, 030	-0,008
716-332	>2	1,393	0,473	0,168	0, 045	-0,012
716-343	>2	1,737	0,652	0,265	0, 003	0,0
Покрывание Е7 НРУ18	716-281	>2	1,807	1,010	0,445	0,176	0,029
716-288	>2	1,709	0,939	0,412	0,170	0,026
716-321	>2	>2	1, 331	0,508	0,176	0,021
716-325	>2	>2	1,194	0,425	0,145	0, 020
716-332	>2	>2	1,350	0,526	0,190	0, 025
716-343	>2	>2	1,672	0, 839	0,365	0,028

Пример 6. Оптимизация условий осуществления иммуноферментного анализа для количественного определения белков Е7 НРУ16 и НРУ18 с использованием моноклональных антител.

Моноклональные антитела против Е7 НРУ16 собирали из асцитов мышей и очищали на аффинной колонке с белком С-сефарозой (чистота более 95%). Антитела метили пероксидазой хрена, используя способ на основе периодата. Все парные комбинации моноклональных антител выбирали по аффинности к антигену Е7 НРУ16, используя ЕЫЗА. Чтобы получить пары моноклональных антител, один член пары моноклональных антител иммобилизовали на полистироловом планшете. Семь двукратных разведений белка Е7 НРУ16, находящихся в пределах концентраций 0,039-5,0 нг/мл, добавляли к моноклональному антителу, иммобилизованному на планшете. Образованные иммунные комплексы регистрировали добавлением второго члена пары моноклональных антител, конъюгированного с пероксидазой, с использованием тетраметилбензидина, служащего в качестве субстрата. Все тестированные пары моноклональных антител обладали способностью образовывать тройной комплекс (сэндвич) - иммобилизованное антитело - Е7 - конъюгированное антитело - что свидетельствует об олигомерном состоянии белка Е7 НРУ16 в растворе даже в пределах концентраций 10^-12-10^-9 моль (М). Несмотря на тот факт, что все комбинации моноклональных антител работали, пары идентичных антител или антител, которые относились к одному и тому же изотипу иммуноглобулина, проявляли более низкий уровень чувствительности (значение оптической плотности, связанное с фиксированной концентрацией Е7 НРУ16, и наклон калибровочной кривой), чем пары моноклональных антител разных изотипов. В отношении чувствительности и отсутствия фона наилучшие результаты получали в том случае, когда моноклональные антитела 716-281 связывали с планшетом, а моноклональные антитела 716-332 использовали в качестве конъюгата с пероксидазой. Анализ с использованием указанной пары моноклональных антител оптимизировали, варьируя концентрацию антител для абсорбции, разбавление конъюгата, состав буферного раствора и время, и температуру на всех стадиях ЕЫ8А. Калибровочная кривая для количественного определения Е7 НРУ16 в оптимальных условиях представлена на фиг. 11. Моноклональные антитела 716-288 абсорбировали из 0,1 М раствора карбонатного буфера с рН 9,6 и концентрацией 5 мкг/мл. Рабочее разведение содержащего пероксидазу конъюгата мАт 716-332 составляло 1/5000 в фосфатно-солевом буфере (РВЗ), который содержал 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05% твина 20. Субстрат представлял собой тетраметилбензидин (ТМВ). Концентрация белка указана вдоль оси х в нг/мл. Оптическая плотность при 450 нм показана вдоль оси у. Экспериментальная ошибка для трех независимых измерений показана на данной кривой. Из фигуры видно, что калибровочная кривая является почти линейной в диапазоне концентраций антигена 0,039-5,0 нг/мл, а также характеризуется полным отсутствием фона. Наличие Е7 НРУ16 можно определить уже при 40 пг на мл, что является достаточным для определения уровня экспрессии Е7 НРУ16 в трансфицированных клетках и клинических образцах (см. фиг. 11).

Пример 7. Измерение онкобелка Е7 в образцах шейки матки.

Образец из соскоба шейки матки помещали в 1 мл физиологического раствора (0,83% ЫаС1) и три раза подвергали замораживанию и оттаиванию. Затем образец центрифугировали в микроцентрифуге (ЕррепбогГ) в течение 10 мин при 10000 об./мин. Надосадок разбавляли 1:1 (об./об.) в РВЗ-АТ (РВЗ, который содержит 0,2% БСА и 0,1% твина), после этого 200 мкл вносили в лунку планшета, в которой предварительно связывали моноклональные антитела против Е7 НРУ16 в концентрации 5 мкг/мл, и титровали двукратным серийным разведением на 4 лунки. В том же самом планшете очищенный рекомбинантный белок Е7 НРУ16 титровали от 4 нг/мл до 0,062 нг/мл в качестве стандарта. После одночасовой инкубации и промывки вносили меченые пероксидазой конъюгированные моноклональные антитела

- 20 010506 против Е7 НРУ16, инкубацию продолжали в течение 1 ч и проводили реакцию ТМВ. Оптическую плотность измеряли на анализаторе МиШксап при длине волны 450 нм. На основании значений оптической плотности (0Ό) для разведений стандарта, строили калибровочную кривую, с помощью которой определяли концентрацию Е7 в образце.

Проводили скрининговые исследования (п=100). Образцы от здоровых пациентов, у которых не выявлен НРУ или у которых выявлена инфекция НРУ «низкого риска», служили в качестве контроля (п=10).

Образцы от всех здоровых пациентов были отрицательными в отношении Е7 или в некоторых случаях были слабо положительными. Но во всех случаях содержание Е7 было меньше 0,05 нг/мл.

Положительные образцы превышали пороговую концентрацию 0,05 нг/мл. Полученные данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Определение онкобелка Е7 в образцах шейки матки

№ пациента	Анти- Е7-1дС	Е7-16	Суммарный белок 00 1/20	Подтверждение в ПЦР	Диагноз
Р1	00 со Г гН О О	0,1 нг/мл	0,084	НРУ16 и 18	С1Ы* III
Р2	0,-4 66 0,317	2,2 нг/мл	0,151	НР731	αίΝ ι-ιι
РЗ	0,232 0,127	0,8 нг/мл	0,152	НРУ с высоким онкогенным риском	ΟΙΝ ΙΙ-ΙΙΙ
Р4	0,337 0,158	3,5 нг/мл	0,228		οινιιι и подозрение на карциному шейки матки
Р5	0,268	10 нг/мл	0,041	НРУ16 и 18	ΟΙΝΙΙΙ и подозрение на карциному шейки матки
Р6	0,422 0,202	1 нг/мл	0,058	ΗΡΥ16 и 18	С1Ы II
Р7	0,215	0,06 нг/мл	0,174	НРУ16 и 18	С1М ΙΙ-ΙΙΙ
Р8	0,357 0,164	0,3 нг/мл	0,089	ΗΡνΐ6	ΟΙΝ Ι-ΙΙ
Н9	0,412 0,197	1,6 нг/мл	0,096	ΗΡν18	ΟΙΝ ΙΙ-ΙΙΙ
Р10	0,335 0,130	0,9 нг/мл	0,165	ΗΡνΐ6	ΟΙΝ III и подозрение на карциному шейки матки
Р11	0,280	1,2 нг/мл	0,180	ΗΡν16	С1Ы II
Р12	0,554 0,233	0,8 нг/мл	0,220	НРУ16	С1Ы ΙΙ-ΙΙΙ
Р13	0,443	0,8 нг/мл	0,097	ΗΡνΐ6	С1Ы Ι-ΙΙ
Р14	0,214	1,8 нг/мл	0,162	ΗΡν16	ΟΙΝ II

*СШ - цервикальная интраэпителиальная неоплазия

Как показывают данные, результаты способа диагностического скрининга соответствовали медицинскому диагнозу. Данные типирования НРУ также соответствовали диагностическим данным и поэтому могут быть использованы для предсказания риска развития рака шейки матки.

Пример 8. Получение моноклональных антител к РгР.

Каждый из пептидов 03, 04 и 05 получали способом синтеза, который известен специалистам в данной области [Ртос 8ο1ίά Рйаке РерНйе ЗупШещк, А Ргасйса1 Арргоасй, ейк. \У.С. СНап апй Р.Э. \У1и1е. ίη ТНе РгасПса! АрргоасН Зепек, кепек ей. В.Э. Натек, 0хГогй ИшуегкИу Ргекк, (2000)]. Пептиды лиофилизировали и тестировали с помощью ВЭЖХ как, по существу, не содержащие солей и с чистотой 95%. 100 мкг каждого пептида повторно растворяли в 0,1 мл 100 мМ фосфатно-солевого буфера, рН 6,8 (буфер для связывания), чтобы получить «раствор пептида». Раствор НЗР70 (1 мг/мл) готовили в буфере для связывания, получая «раствор НЗР70». В случае каждого пептида раствор пептида (0,1 мл) смешивали с 0,2 мл

- 21 010506 раствора Н8Р70, содержащего 200 мкг белка, получая примерно 15-20-кратный молярный избыток пептида по сравнению с Н8Р70. К смеси сразу же добавляли раствор глутаральдегида (25% глутаральдегид в воде) до 0,05% (об./об.) и инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном встряхивании. Реакцию связывания останавливали добавлением 0,5М раствора глицина до конечной концентрации 0,1М и инкубировали еще в течение 30 мин при таких же условиях. Затем реакционную смесь диализовали против 100 мл РВ8 (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,2) при 4°С в течение ночи. Эффективность реакции связывания проверяли в δΌδ-ПААГ хорошо известным в данной области способом, и результаты показали, что не оставалось свободного Н8Р70. Полученный конъюгат делили на аликвоты и хранили при -70°С без добавления консервантов.

Самок мышей Ва1Ь/с (18-20 г) иммунизировали дважды в подушечки задних лап 50 мкл раствора конъюгата пептид-115р70 с двухнедельным интервалом между иммунизациями. На 16 день собирали подколенные лимфатические узлы и обрабатывали, получая В-клетки для слияния с подходящей линией клеток миеломы Ва1Ь/с с использованием обычной методики гибридом, которая хорошо известна в данной области и описана в данной публикации.

Первичный скрининг осуществляли непрямым ЕЫ8А, используя пептиды С3, С4, С5, нанесенные в виде покрытия на полистироловые планшеты, получая следующие результаты.

Пептид С3 - гибридизация давала небольшое количество первичных культур с еще меньшим количеством позитивных культур, которые впоследствии теряли свою активность.

Пептид С4 - создали 4 клона из разных групп, трижды клонированы.

Пептид С5 - создали 6 клонов из разных групп, трижды клонированы.

Получали асциты и также тестировали в отношении соответствующих пептидов и полноразмерного рекомбинантного РгР. В табл. 3 показаны названия выделенных клонов, каждый специфичный пептид и изотип иммуноглобулина. В табл. 4 показаны результаты непрямого ЕЬ18А, при котором пептиды, используемые для получения конъюгированного белка, абсорбировали на полистироловом планшете. В табл. 5 показаны результаты непрямого ЕЬ18А, при котором нативный белок РгР абсорбировали на полистироловом планшете.

Таблица 3 Описание иммуногена и подизотипа иммуноглобулина мыши полученных мАт

Клон	Иммуноген	Изотип
4011	64-йзр70	1д62Ь
4029	64-йзр70	1д62Ь
4057	04-Изр70	1дО2Ь
4069	64-Ьзр70	1д62а
5013	65-Изр70	1д63
5029	65-Ьзр70	1д61
5С38	65~Нзр70	1д63
5648	65-кзр70	1д61
5655	О5-Й5р70	1д61
5677	65-11зр70	1д61

- 22 010506

Таблица 4

Данные титрования в непрямом ЕЫ8А моноклональных антител (0Ό 450 нм) с использованием пептидов для покрывания

Антиген для покрывания	Пептид С4	Пептид 65
Разведение асцита	4611	4629	4657	4669	5613	5629	5638	564 8	5655	5677
1/1000	1,428	1,527	1,479	*	★	★	*	*	1, 604	1, 643
1/3000	1,267	1,456	1,279	*	1,815		*	1,880	1, 629	1,866
1/9000	1,016	1,412	1,094		1,824	★	*	1,838	1,572	*
1/27000	0, 621	1,176	0, 644	★	1,659	1,863	1,815	1,793	1,530	1,882
1/81000	0,284	0,877	0,273	*	1,306	1, 691	1,018	1, 613	1,421	1,811
1/243000	0,107	0,392	0,071	1,651	0,719	1,255	0,388	1,375	1,216	1,502
1/729000	0,035	0,118	0,010	0,755	0,247	0,725	0,114	0,752	0,873	0,961
1/2187000	0,015	0,043	0,003	0,270	0,044	0,330	0,039	0,294	0,481	0,537

Таблица 5

Данные титрования в непрямом ЕЫ8А моноклональных антител (0Ό 450 нм) с использованием РгР для покрывания

Антиген для покрывания	Прионный белок
Разведение асцита	4611	4029	4657	4669	5613	5629	5638	5648	5655	5677
1/1000	0,139	0,089	0,137	0,257	0,193	0,296	0,138	0,129	1,832	0,159
1/3000	0,056	0,039	0,063	0,109	0,070	0,129	0,035	0,041	1,646	0,109
1/9000	0,036	0,031	0,044	0,070	0,030	0,093	0,014	0,018	1,726	0,088
1/27000	0, 030	0,027	0,034	0,045	0,018	0,066	0,002	0,005	1,739	0,050
1/81000	0,027	0,025	0,030	0,027	0,005	0,033	0	0,004	1,742	0,032
1/243000	0,026	0,079	0,026	0,025	0	0,014	0	0,003	1,745	0,014
1/729000	0,025	0,023	0,025	0,026	0	0,009	0	0,001	1,550	0,003
1/2187000	0,031	0,024	0,024	0,024	0	0, 001	0	0	1,168	0, 002

Все моноклональные антитела, указанные выше, обладают высокой аффинностью по отношению к иммуногенам, используемым для их создания. Однако в одном конкретном варианте моноклональное антитело 5055 сильно взаимодействует с рекомбинантным РгР. Указанное антитело может быть использовано для любых применений с использованием ЕЬТЗА, Вестерн-блота и иммуногистохимии. Остальные моноклональные антитела проявляют специфичность связывания с рекомбинантным РгР от низкой до умеренной.

Пример 9. Получение моноклональных антител к ММР3.

Как описано ранее для других антигенов, мышей ВАЬВ/с иммунизировали в подушечки задних лап ММР 3 (25 мкг/мышь). Мыши получали вторую иммунизацию спустя 2 недели. На четвертый день после второй иммунизации лимфатические узлы собирали, и В-клетки из лимфатических узлов сливали с клеткам миеломы 8р2/0-Ад14 и помещали в 96-луночные планшеты. Также собирали и тестировали иммунные сыворотки.

В табл. 6 показаны результаты непрямого ЕЬТЗА, измеренные при 0Ό 450 нм, с использованием ММР3 в концентрации 2 мкг/мл в РВ8, который абсорбировали на полистироловых планшетах при 4°С в течение ночи. Все другие инкубации осуществляли в РВ8 с 0,5% БСА и твином 20 хорошо известным в данной области способом. Результаты показывают, что сыворотка от мышей, иммунизированных ММР3, не проявляла какого-либо значимого отличия от сыворотки неиммунизированных мышей.

- 23 010506

Таблица 6

Непрямой ЕЬ18А, измеренный при ΘΌ 450 нм с использованием неконъюгированной ММР3

Разведение сыворотки	Измерения
Иммунная сыворотка
1:1000	0,52
1:3000	0,42
1:9000	0,36
1:27000	0,37
Неиммунная сыворотка
1:1000	0,53
1:3000	0,31
1:9000	0,25
1:27000	0,30

Все первичные клоны также тестировали непрямым ЕЫ8А с использованием ММР3 и прямым ЕЫ8А с использованием меченого биотином ММР3. Положительные клоны не образовывались при использовании неконъюгированного ММР3. Затем ММР3 конъюгировали с Н8Р70, используя тот же способ, который описан выше для РгР, с использованием глутаральдегида.

Затем конъюгированный ММР3 (50 мкг/мышь) использовали для иммунизации мышей Ва1Ь/с, как описано ранее. На четвертый день после второй иммунизации собирали лимфатические узлы и обрабатывали хорошо известным в данной области способом. Выделенные В-клетки сливали с клетками миеломы кр 2/0 и помещали в 96-луночные планшеты. Также собирали и тестировали иммунные сыворотки. Результаты показаны в табл. 7. В табл. 7 показаны результаты непрямого ЕЬ18А, измеренные при ΘΌ 450 нм с использованием ММР3 в концентрации 2 мкг/мл РВ8, который абсорбировали на полистироловых планшетах при 4°С в течение ночи. Все другие инкубации проводили в РВ8 с 0,5% бычьего сывороточного альбумина («БСА») и твином 20 хорошо известным в данной области способом. Результаты показывают, что сыворотка мышей, иммунизированных конъюгированным ММР3-Н8Р70, обладает значительной аффинностью к ММР3 по сравнению с сывороткой неиммунных мышей.

Таблица 7 Непрямой ЕБ18А, измеренный при ΘΌ 450 нм с использованием конъюгированного ММР3

Разведение сыворотки	Измерения 00450
Иммунная сыворотка
1:1000	1,252
1:3000	0, 835
1:9000	0, 596
1:27000	0,452
Неиммунная сыворотка
1:1000	0,258
1:3000	0,268
1:9000	0,279
1:27000	0,277

Все первичные клоны также тестировали непрямым ЕБ18А, используя ММР3 (2 мкг/мл), и прямым ЕЫ8А с использованием меченого биотином ММР3 (500 нг/мл). Выявили восемь положительных клонов непрямым ЕЫ8А и 6 положительных клонов прямым ЕЫ8А. Все положительные клоны клонировали, четыре из них имели стабильную продукцию антител и были клонированы 2-3 раза. В табл. 8 указаны клоны и изотипы иммуноглобулина. В табл. 9 показаны результаты непрямого ЕЫ8А с использованием 1 мкг/мл ММР3, абсорбированного на планшете, и прямого ЕЫ8А с использованием 0,5 мкг/мл ММР3биотин. Результаты показывают, что клоны имеют высокую аффинность к ММР3.

- 24 010506

Таблица 8

Клоны, продуцирующие моноклональные антитела к ММР3, и изотипы иммуноглобулина

Название клона	Изотип иммуноглобулина
ММРЗН2	1д53
ММРЗН10	1дСЗ
ММРЗС7	1дС2а
ММРЗГ11	СЗ

Таблица 9

Характеристики антител против ММР3

мАт, нг/мл	ММРЗ С7, непрямой ЕЫЗА	ММРЗ 57, прямой ЕЫЗА	ММРЗ Е11, непрямой ЕЫЗА	ММРЗ Р11, прямой ЕЫЗА	ММРЗ Н2, непрямой ЕЫЗА	ММРЗ Н2, прямой ЕЫЗА	ММРЗ Н10, непрямой ЕЫЗА	ММРЗ Й10 прямой ЕЫЗА
10000	★ ★ Λ Ά	0,	093	0,772	0,	474		0,	057	* * * *	0,	102
3000	1,765	0,	020	0,295	0,	472	1,824	0,	090	1,809	0,	055
1000	1,795	0,	023	0,182	0,	384	1,782	0,	126	1,829	0,	077
300	1,830	0,	037	0,044	0,	269	1,607	0,	088	1,793	0,	025
100	1,745	0,	009	0,021	0,	147	1,248	0,	038	1,683	0,	017
30	1,470	0,	000	0,015	0,	069	0,719	0,	033	1,391	0,	019
10	0,957	0,	000	0,000	0,	057	0,295	0,	003	0, 941	0,	004
3	0,498	0,	000	0,000	0,	051	0,099	0,	000	0,463	0,	005

Все публикации и патенты, указанные в описании выше, включены в данное описание в виде ссылки. Различные модификации и изменения описанного способа и системы согласно изобретению, не выходящие за рамки объема и не отходящие от сути изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области. Хотя изобретение описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение, которое заявлено, не следует неправильно ограничивать такими конкретными вариантами. Действительно, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области иммунологии, медицинской биохимии, молекулярной биологии и родственных областях, входят в объем следующей далее формулы изобретения.

- 25 010506

Список последовательностей <110> ΚΐδβΙβν, νδβνοίοΰ 1

Рей, βνεβίιηΠων С <120> СПОСОБЫ, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ И ПРИМЕНЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К АНТИГЕНАМ, ОБЫЧНО ИМЕЮЩИМ НИЗКУЮ ИММУНОГЕННОСТЬ <130> Иммунизировать <150> Ни 2003128660 <151 > 2003-09-25 <160> 22 <170> Ра(еп*1п уегаюп 3.1 <210*1 <211*309 <212* ДНК <213* Вирус папилломы человека типа 16 <220* <221 > Кодирующая последовательность <222* (7)..(303) .

<223* <400* 1 даайс а(с а!д са( дда да* аса сс( аса йд са( даа (а( а*д йа 48 Не Ме( ΗΪ5 <31у Азр ТНг Рго Тйг Ьеи Ηΐδ <31и Туг Ме( Ьеи 1 510 да* йд саа сса дад аса ас* да* с*с (ас *д( *а( дад саа На аа* 96 Азр 1_еи <51п Рго 61и ТНг ТЬг Азр 1_еи Туг Суз Туг С1и 61п 1_еи Азп 15 20 2530 дас аде *са дад дад дад да* даа а(а да* дд* сса дс* дда саа дса144

Азр Зег Зег О1и С1и <31и Азр С1и Не Азр 61у Рго А1а О1у <31п А!а

4045 даа ссд дас ада дсс са( (ас аа( ай д(а асе Ш (д( (дс аад (д( 192 <31и Рго Азр Агд А1а Ηίε Туг Азп Не Уа1 ТКг РКе Суз Суз Ьуз Суз 50 5560 дас (с* асд ей едд йд (дс д*а саа аде аса сас д(а дас ай сд* 240

Азр Зег ТЬг 1_еи Агд (.ей Суз 5/а161л Зег Тйг Ηίδ \/а1 Азр Не Агд 65 7075 ас(Нддаа дас с(д йа а(д ддс аса с*а дда ай д(д (дс ссс а(с 288

Т(1г Ьеи С1и Азр 1_еи Ьеи Ме( О1у ТЬг Ьеи 61у Не Уа1 Суз Рго Не 80 8590 (д( (с( сад ааа сса дда(ос309

Суз Зег ΘΙη Ьуз Рго

- 26 010506 <210 2 <211>99 <212> Белок <213> Вирус папилломы человека типа 16 <400 2

5 1015

Азр Агд А1а ΗΪ8 Туг Азп Не Уа1 ТПг РЬе Суз Суз Ьуз Суз Азр Зег 50 5560

ТНг Ьей Агд Ьей Суз Уа1 ©1п Зег ΤΙίγ Н!з Уа! Азр Не Агд Ткг Ьей 65 70 7580 ©!и Азр Ьей Ьей Ме1 ©1у ТМг Ьей ©|у Не Уа1 Суз Рго Не Суз Зег 85 9095 ©1п Ьуз Рго <210>3 <211>330 <212> ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 18 <220>

<221 > Кодирующая последовательность <222> (7)..(324) <223>

<400> 3 даайс ад( а!д са1 дда сс1 аад дса аса Нд саа дас ай д!а Йд 48 Зег Ме! Ηΐ8 С1у Рго 1_уз А1а ТЬг Ьей ©1п Азр Не Уа1 Ьей 1 510 са! На дад ссс саа аа( даа ай ссд дй дас ей с1а 1д1 сас дад 96 ΗΪ3 Ьей ©Ιιι Рго ©1п Азп ©1и Не Рго Уа1 Азр !_еи Ьей Суз Ηίε ©1и 15 20 2530 саа йа аде дас 1са дад даа даа аас да! даа а(а да! дда дй аа! 144 ©)п 1_еи Зег Азр Зег ©1и ©1и ©1и Азп Азр ©1и Не Азр ©1у Уа1 Азп 35 4045

- 27 010506 са1 саа са1 На сса дсс еда еда дс1 даа сса саа сд1 сас аса а(д 192 Ηίδ ΘΙη Ηίδ Геи Рго А1а Агд Агд А!а 61и Рга ΘΙη Агд ΗΪ3 ТЬг Ме1 50 5560 «д 1д1 аГд (д1ТдТ аад 1д1 даа дсс ада ай дад с!а д1а д1а даа 240 1_еи Суа Ме1 Суа Суа Гуа Суз ΘΙυ А1а Агд Не С1и Ьеи Уа1 Уа1 С1и 65 7075 аде (са дса дас дас сП еда дса Не сад сад с(д Ш с(д аас асе 288 Зег Зег А1а Аар Аар Геи Агд А1а РЬе ΘΙη <Э1п (.ей РЬе 1_еи Аал ТЬг 80 8590 с!д 1сс Й1 д1д 1д1 ссд 1дд дса (се сад сад дда1сс 330

Геи Зег РЬе \/а1 Суз Рго Тгр Суа А1а Зег ΘΙη ΘΙπ

100105 <210>4 <211>106 <212> Белок <213> Вирус папилломы человека типа 18 <400> 4

Зег Ме1 Η ιέ С1у Рго Гуа А1а ТЬг Геи С1п Аар Не Уа1 Геи Ηίδ Геи 1 5 1015

С1и Рго ΘΙη Азп в!и Не Рго Уа! Аар Геи !_еи Суа Η ίδ ΘΙυ ΘΙη Геи

Зег Азр Зег С1и 61и ΘΙυ Азп Азр ΘΙυ Не Азр С1у \/а1 Азп Ηίδ ΘΙη 35 4045

Ηίδ Геи Рго А1а Агд Агд А1а С1и Рго ΘΙη Агд Ηΐβ ТЬг Ме1 Геи Суа 50 5560

Ме1 Суа Суа Гуа Суа С1и А1а Агд Не С1и Геи Уа! 7а1С1и Зег Зег 65 70 7580

А1а Аар Аар Геи Агд А1а РЬе ΘΙη ΘΙη Геи РЬе Геи Аап ТЬг Геи Зег 85 9095

РЬе Уа1 Суа Рго Тгр Суа А1а Зег ΘΙη ΘΙη 100105 <210> 5 <211> 5321 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220* <223> Нуклеотидная последовательность рекомбинантного вектора рОЕЗО-бпаК

- 28 010506 <400 5 йсдадааа! са1аааааа1 йай1дсй 1д1дадсдда 1аасаайа( аа1адайса 60 айд1дадсд да1аасаай 1сасасадаа йсайааад аддадааай аайа1дада 120 дда1сдса1с асса(сасса 1сасдда1сс дс(сд(дсдд 1сддда(сда сйсдддасс 180 ассаайссд 1сд(с1сдд11йддаадд1 ддсдасссдд 1сд1сд1сдс саайссдад 240 ддйссадда ссассссдк аайд(сдсд Псдсссдса асдд1дадд1 дйддЮддс 300 садсссдсса адаассаддс ад1дассаас д1сда1сдса ссд(дсдс1с ддкаадсда 360 саса(дддса дсдас(дд(с са1ададай дасддсаада аа1асассдс дссддада(с 420 адсдсссдса йс1да1даа дйдаадсдс дасдссдадд сс(асс!сдд {даддасай 480 ассдасдсдд Ка(сасдас дсссдсйас йсаа1дасд сссадсд(са ддссассаад 540 дасдссддсс ада!сдссдд сйсаасд1д йдсдда(сд (саасдадсс дассдсддсс 600 дсдйддсй асддсйсда саадддсдад ааддадсадс даа1сс1дд{ сйсдасйд 660 дд1дд1ддса сШсдасд! йссйдс1д дадакддсд аддд(д1дд( 1дадд(ссд1 720 дссасйсдд д1дасаасса сйсддсддс дасдас!ддд ассадсддд! сд1сдайдд 780 йдд1ддаса адйсааддд сассадсддс айздаййда ссааддасаа да!ддсда1д 840 садсддйдс дддаадссдс сдадааддса аада(сдадс {дадйсдад (сад1ссасс 900 1сда!саасс 1дссс1аса1 сассд1сдас дссдасаада асссдйдй сйадасдад 960 садс1дассс дсдсддадй ссаасдда1с айсаддасс 1дйддассд сайсдсаад 1020 ссдйссад! сдд(да1сдс {дасассддс ай1сдд1д1 сддада1сда 1сасдйд(д 1080 йсд(ддд1д дйсдасссд да!дсссдсд д!дассда!с 1дд1саадда айсассддс 1140 ддсааддаас ссаасааддд сд(саасссс да1даддйд 1сдсдд(ддд адссдййд 1200 саддссддсд кйсааддд сдадд{дааа дасдййдс 1дсйда1д1 (ассссдйд 1260 адсйддд!а 1сдадассаа дддсдддд1д а!дассаддс 1са1сдадод саасассасд 1320 а!ссссасса адсддгсдда даййсасс ассдссдасд асаассаасс д1сдд1дсад 1380 акхаддйй а(саддддда дсд!дада1с дссдсдсаса асаадйдй сдддксйс 1440 дадйдассд дса1сссдсс ддсдссдсдд дддайссдс ада1сдадд1 сасШсдас 1500 а1сдасдсса асддсайд! дсасд(сасс дссааддаса адддсассдд сааддадаас 1560 асдаЮсдаа (ссаддаадд йсдддсйд (ссааддаад асайдассд са(да1саад 1620 дасдссдаад сдсасдссда ддадда1сдс аадсдЬдсд аддаддссда (дйсд1аа1 1680 саадссдада сайддййа ссадасддад аадйсдйза аадаасадсд (даддссдад 1740

- 29 010506 дд1ддйсда адд1асс!да адасасдс(д аасааддйд а!дссдсдд1 ддсддаадсд 1800 ааддсддсас йддсдда(с ддайШсд дссэ!саад( сддсда1дда даадсйдддс 1660 саддад1сдс аддс1с(ддд дсаадсда(с (асдаадсад с1саддс1дс д(сасаддсс 1920 ас1ддсдс1д сссассссдд сддсдадссд ддсдд!дссс ассссддсЮ ддс(да(дас 1980 дйд1ддасд сддадд1дд1 сдасдасддс сдддаддсса ад1дасддас ддд1сдасс1 2040 дсадссаадс йаайадс) дадсйддас 1сс1дйда1 ада1ссад1а а{дасс1сад 2100 аас(сса(с( ддайдйс адаасдс1сд дПдссдссд ддсдййй айдд(дада 2160 а(ссаадс(а дсйддсдад аййсадда дс1ааддаад с1аааа(дда дааааааа1с 2220 ас1дда1а»а ссассдйда 1а1а1сссаа (ддса1сд(а аадаасаШ 1даддсай1 2280 сад1садйд с!саа1д(ас с!а1аассад ассдйсадс 1дда1айас ддссйШа 2340 аадассд(аа адааааайа дсасаадШ СаЮсддсс! йайсаса! (сйдсссдс 2400 С1да1даа1д с1са1ссдда аШсд(а1д дсаа(дааад асдд1дадс( дд1да1а1дд 2460 да(ад(дйс асссйдйа сассдййс са1дадсааа с1дааасдй йса!сдс1с 2520 1ддад1даа1 ассасдасда Шссддсад йкйасаса (аййсдса ада(д1ддсд 2580 1дйасдд1д аааасс1ддс с1атссс( ааадддШа йдадаа1а1 дШОДс 2640 1садссаа1с сс1ддд1дад №сассад1 ЖдаШаа асд1ддссаа 1а1ддасаас 2700 йсйсдссс ссдййсас са(дддсааа 1айа1асдс ааддсдасаа дд1дс!да1д 2760 ссдс1ддсда йсаддйса 1са1дссдй 1д1да1ддс11сса1д1сдд садаа(дсй 2820 аа1даайас аасад1ас1д сда(дад1дд садддсдддд сд1аайШ йааддсад! 2880 1айдд1дсс сйааасдсс (дддд1аа1д ас1с1с(адс Йдаддса1с ааайааасд 2940 аааддс1сад 1сдааадас( дддссЖсд Ййа1с1д11дЖд1сдд 1даасдс1с1 3000 сс1дад1адд асаааЮсдс ссййададс 1дсс(сдсдс дй1сдд(да 1дасдд1даа 3060 аассййдас аса1дсадс1 ссоддадасд д!сасадсй д1с1д1аадс дда!дссддд 3120 адсадасаад сссдЮаддд сдсд1садсд дд1дйддсд дд1д1сдддд сдсадсса1д 3180 асссад1сас д1адсда1ад сддад1д!а1 ас1ддсйаа сШдсддса 1сададсада 3240 йд1ас(дад ад1дсасса( а1дсдд1д1д ааа1ассдса сада(дсд1а аддадаааа1 3300 ассдса1сад дсдс1сйсс дсйсс1сдс 1сас1дас1с дс1дсдс1сд д(сдйсддс 3360 (дсддсдадс дд1а1садс1 сайсааадд сдд1аа1асд дйа(ссаса даа1садддд 3420 а1аасдсадд ааадааса1д (дадсаааад дссадсаааа ддссаддаас сд!ааааадд 3480

- 30 010506 ссдсдйдс( ддсдйМс са1аддс1сс дсссссс1да сдадса1сас ааааакдас 3540 дс1саад(са дадд1ддсда аасссдасад дас1а1ааад а(ассаддсд Й1ссссс1д 3600 даадс1ссс1 сд1дсдс1с1 сс1дйссда ссс1дссдс1 1ассдда(ас с1д(ссдсс( 3660 йскссйс дддаадсд(д дсдсШс1с а1адс1сасд с1д1адд1а1 с1садйсдд 3720 1д1адд1сд11сдс1ссаад с1дддс1д1д (дсасдаасс ссссдйсад сссдассдй 3780 дсдссйа(с сдд1аас(а1 сд1сйдад( ссаасссдд! аадасасдас йа1сдссас 3840 (ддсадсадс сас!дд1аас аддайадса дадсдаддЬ 1д1аддсдд1 дс1асадад1 3900 1сйдаад1д д1ддсс1аас 1асддс1аса сЬдааддас ад1ай1дд1 а1с1дсдс1с 3960 1дс1даадсс адйассйс ддааааадад йдд1адс1с йда1ссддс ааасааасса 4020 ссдс!дд£ад сдд1ддйй ШдГПдса адсадсада! (асдсдсада аааааадда! 4080 Лсаадаада 1сс(йда1с ййс1асдд ддкйдасдс 1сад1ддаас даааас1сас 4140 дйааддда! Шдд(са1д адайа(саа ааадда(сй сасс1ада1с сййааай 4200 ааааа(даад ййааа1са а1с1ааад1а 1а1а1дад1а аасйддкй дасадйасс 4260 аа1дсйаа1 сад1даддса сс1а1с1сад сда1с1д1с1 аШсдйса 1сса1адйд 4320 сс(дас1ссс од(сд(дйд а1аас1асда 1асдддаддд с«асса1с1 ддссссадГд 4380 Йдсаа1да1 ассдсдадас ссасдс(сас сддс1ссада Й1а1садса а1ааассадс 4440 садссддаад ддссдадсдс адаад1дд1с с1дсаасй1 а1ссдсс1сс а1ссад1с1а 4500 йаайдйд ссдддаадс! адад1аад(а дйсдссад11аа1адЖд сдсаасдйд 4560 йдссайдс 1асаддса1с д1дд1д1сас дс1сд1сдй 1дд1а1ддс11сайсадс14620 ссддйссса асда1саадд сдадйаса1 да1ссссса! дйд^дсааа ааадсддйа 4680 дс(ссйсдд 1сс1ссда1с дйд(садаа д1аадйддс сдсад1дйа 1сас1са{дд 4740 йа{ддсадс ас1дса(аа11с1сйас1д 1са1дсса1с сд!аада1дс Ййс1д1да 4800 с1дд1дад1а с1саассаад 1сайс1дад аа1ад(д1а1 дсддсдассд адйдйсй 4860 дсссддсд1с аа1асддда1 аа1ассдсдс саса1адсад аасШаааа д(дс1сака 4920 йддаааасд йсйсдддд сдаааас1с1 саадда(сй ассдс(дйд ада1ссадй 4980 сда1д1аасс сас1сд|дса сссаас1да1 сйсадса(с ййасШс ассадсдШ 5040 с1ддд1дадс ааааасадда аддсаааа(д ссдсаааааа дддаа(аадд дсдасасдда 5100 аа1дйдаа! ас1са1ас(с йссйШс аа1айайд аадсаЖа! садддйай 5160 дкйса1дад сдда1аса1а Шдаа1д1а Жадааааа 1ааасааа4а ддддйссдс 5220 дсасаШсс ссдааазд1д ссасйдасд ййаадааас сайайа1с аТдасайаа 5280

- 31 010506 сйа(ааааа <аддсд1а(с асдаддссс! йсд1сйса с 5321 <210* 6 <211> 12 <212> Белок <213> Воз1аигиз <400> 6

Буз Б уз Агд Рго Буз Рго Оу 61у С1у Тгр Азп ΊΊίγ

5 <210> 8 <211> 13 <212> Белок <213* Ьоз(аигиз <400>8

С1п Тгр Азп Буз Рго Зег Буз Рго Буз ТНг Азл Не Буз

5 10 <210> 9 <211> 17 <212> Белок <213> Роз (аигиз <400> 9

Не ТЬг С!п Туг <3Ιη Агд С1и Зег ΘΙη А1а Туг Туг ΘΙη Агд С1у А1а

10 15

Зег <210> 10 <211> 19 <212>ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 16 <400> 10 (дасадс(са даддаддад 19

- 32 010506 <210> 11 <211> 19 <212* ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 16 <400> 11 дсасаассда адсд1адад 19 <210> 12 <211 >20 <212> ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 18 <400> 12 дсдас1сада ддаадаааас 20 <210> 13 <211 >20 <212> ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 18 <400> 13 саааддасад дд1дйсада 20 <210> 14 <211 >31 <212>ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 18 <400> 14

1с1аасдаа1 1сад1а1дса 1ддасс1аад д 31 <210> 15 <211> 30 <212> ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 18 <400> 15 айасадда! ссс!дс1ддд а1дсасасса 30 <210> 16 <211> 31 <212> ДНК <213> Вирус папилломы человека типа 16 <400> 16 айс(сдаа11са1са1дса 1ддада1аса с 31 <210> 17 <211 >31 <212> ДНК

- 33 010506 <213> Вирус папилломы человека типа 16 <400>17 сйа1сдда1 сс1дд(йс1 дадаасада! д 31 <210> 18 <211>130 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Концевые последовательности рНЕ716 и рНЕ718 <220>

<221 > т15С 1еа1иге <222> (107)..(108) <223> Сайт инсерции гена Е7 Н8Р 16/Н5Р18 <400> 18

1аа1асдас1 сас1а1аддд адассасаас ддШсссЮ 1адааа1аа1 МдШаас 60

Шаадаадд ада1а1аса( а»дса1сасс а1сасса(са сдаайсдда 1сс1аайад 120 йдааадсй 130 <210>19 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Прямой праймер для рНЕ716 <400> 19 даада1с1а( дса1ддада( асасс!ас 28 <210> 20 <211 >28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Обратный праймер для рНЕ716 <400> 20 сддда(сс»д дШОдада асада1дд 28 <210> 21 <211>28 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Прямой праймер для рНЕ718

- 34 010506 <400 21 даада1с1а( дса1ддасс! ааддсаас 28 <210 22 <211 >28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Обратный праймер для рНЕ718 <400 22 сддда!ссс1 дс1ддда1дс асассасд 28

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения моноклональных антител, специфичных к антигену с низкой иммуногенностью, включающий в себя:

a) химическое конъюгирование антигена с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

б) создание гибридомы из собранных В-клеток;

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному антигену.
2. Способ по п.1, в котором молекулой-носителем является Η8Ρ70.
3. Способ по п.1, в котором животное имеет интактную иммунную систему.
4. Способ по п.1, в котором животное является млекопитающим.
5. Способ по п.1, в котором В-клетки собирают из асцита.
6. Способ по п.1, в котором В-клетки собирают из лимфатических узлов.
7. Способ по п.1, в котором В-клетки собирают из крови.
8. Способ по п.1, в котором В-клетки собирают из селезенки.
9. Способ по п.1, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки мыши.
10. Способ по п.9, в котором иммортализованной клеткой мыши является клетка миеломы мыши.
11. Способ по п.1, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки человека.
12. Способ по п.1, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки крысы.
13. Способ по п.1, в котором скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ш κίΐιι. Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.
14. Композиция, содержащая моноклональное антитело, специфичное к антигену с низкой иммуногенностью, полученное в результате:

a) химического конъюгирования антигена с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизации животного конъюгированным антигеном;

c) сбора В-клеток от животного;

б) создания гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининга гибридом в отношении специфичности к нативному антигену.
15. Композиция по п.14, где молекулой-носителем является Η8Ρ70.
16. Композиция по п.14, где животное имеет интактную иммунную систему.
17. Композиция по п.14, где животное является млекопитающим.
18. Композиция по п.14, где В-клетки собирают из асцита.
19. Композиция по п.14, где В-клетки собирают из лимфатических узлов.
20. Композиция по п.14, где В-клетки собирают из крови.
21. Композиция по п.14, где В-клетки собирают из селезенки.
22. Композиция по п.14, где гибридому создают с использованием клеток миеломы мыши.
23. Композиция по п.14, где гибридому создают с использованием иммортализованной клетки человека.

- 35 010506
24. Композиция по п.14, где гибридому создают с использованием иммортализованной клетки крысы.
25. Композиция по п.14, где скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ш к1!и, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.
26. Способ получения моноклональных антител, специфичных к онкобелку Е7, включающий в себя:

a) химическое конъюгирование онкобелка Е7 с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

й) создание гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному онкобелку Е7.
27. Способ по п.26, в котором химическое конъюгирование включает в себя:

a) создание плазмиды с нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70 и

b) трансфекцию клетки-хозяина плазмидой, при которой клетка-хозяин транскрибирует нуклеотидные последовательности в конъюгированный онкобелок Е7.
28. Способ по п.27, в котором нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1.
29. Способ по п.27, в котором нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3.
30. Способ по п.27, в котором нуклеотидной последовательностью, кодирующей Н8Р70, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 5.
31. Способ по п.27, в котором клеткой-хозяином является Е. сой.
32. Способ по п.26, в котором молекулой-носителем является Н8Р70.
33. Способ по п.26, в котором животное имеет интактную иммунную систему.
34. Способ по п.26, в котором животное является млекопитающим.
35. Способ по п.34, в котором животное является мышью.
36. Способ по п.26, в котором В-клетки собирают из асцита.
37. Способ по п.26, в котором В-клетки собирают из лимфатических узлов.
38. Способ по п.26, в котором В-клетки собирают из крови.
39. Способ по п.26, в котором В-клетки собирают из селезенки.
40. Способ по п.26, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки мыши.
41. Способ по п.40, в котором иммортализованной клеткой мыши является клетка миеломы мыши.
42. Способ по п.41, в котором клетка миеломы мыши представляет собой клетку миеломы 8р2/0А_ё14.
43. Способ по п.26, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки человека.
44. Способ по п.26, в котором гибридому создают с использованием иммортализованной клетки крысы.
45. Способ по п.26, в котором скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ш κίίυ, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.
46. Композиция, содержащая моноклональные антитела, специфичные к онкобелку Е7, полученные способом, включающим в себя:

a) химическое конъюгирование онкобелка Е7 с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

й) создание гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному онкобелку Е7.
47. Композиция по п.46, где химическое конъюгирование включает в себя:

а) создание плазмиды с нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, и нуклео

- 36 010506 тидной последовательностью, кодирующей НЗР70; и

Ь) трансфекцию клетки-хозяина плазмидой, при которой клетка-хозяин транскрибирует нуклеотидные последовательности в конъюгированный онкобелок Е7.
48. Композиция по п.47, где нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 1.
49. Композиция по п.47, где нуклеотидной последовательностью, кодирующей онкобелок Е7, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 3.
50. Композиция по п.47, где нуклеотидной последовательностью, кодирующей НЗР70, является последовательность 8ЕЦ ГО N0: 5.
51. Композиция по п.47, где клеткой-хозяином является Е. сой.
52. Композиция по п.46, где молекулой-носителем является НЗР70.
53. Композиция по п.46, где животное имеет интактную иммунную систему.
54. Композиция по п.46, где животное является млекопитающим.
55. Композиция по п.54, где животное является мышью.
56. Композиция по п.46, где В-клетки собирают из асцита.
57. Композиция по п.46, где В-клетки собирают из лимфатических узлов.
58. Композиция по п.46, где В-клетки собирают из крови.
59. Композиция по п.46, где В-клетки собирают из селезенки.
60. Композиция по п.46, где гибридому создают с использованием иммортализованной клетки мыши.
61. Композиция по п.60, где иммортализованной клеткой мыши является клетка миеломы мыши.
62. Композиция по п.61, где клетка миеломы мыши представляет собой клетку миеломы Зр2/0Ад14.
63. Композиция по п.46, где гибридому создают с использованием иммортализованной клетки человека.
64. Композиция по п.46, где гибридому создают с использованием иммортализованной клетки крысы.
65. Композиция по п.46, где скрининг в отношении специфичности осуществляют способом, выбранным из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ш δίΐιι. Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.
66. Способ выявления цервикальной интраэпителиальной неоплазии, включающий в себя:

a) получение образца эпителиальных клеток шейки матки и

b) скрининг образца в отношении наличия онкобелка Е7 с использованием моноклональных антител по п.46.
67. Способ по п.66, в котором способ скрининга в отношении наличия онкобелка Е7 выбран из группы, состоящей из радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа, иммуноанализа типа «сэндвич», иммунорадиометрического анализа, реакции диффузионной преципитации в геле, иммунодиффузионного анализа, иммуноанализа ш 8Йи, Вестерн-блота, реакции преципитации, анализа агглютинации, анализа фиксации комплемента, иммунофлуоресцентного анализа, анализа белка А, анализа визуализации вируса, анализа модулирования биологической активности и иммуноэлектрофоретического анализа.
68. Способ по п.66, в котором содержание онкобелка Е7 равно или выше 0,05 нг/мл.
69. Способ по п.66, в котором моноклональные антитела содержат по меньшей мере два изотипа иммуноглобулина.
70. Способ по п.69, в котором одним изотипом иммуноглобулина является изотип !§С2а.
71. Способ по п.69, в котором одним изотипом иммуноглобулина является изотип !§С2Ь.
72. Способ по п.69, в котором один изотип иммуноглобулина обладает специфичностью к антигенной детерминанте, отличной от антигенной детерминанты в случае второго изотипа иммуноглобулина.
73. Набор для определения того, существует ли риск развития у субъекта цервикальной интраэпителиальной неоплазии, содержащий:

a) по меньшей мере один реагент, который специфично выявляет онкобелок Е7, где реагент представляет собой моноклональные антитела по п.46; и

b) инструкции по определению того, существует ли повышенный риск развития у субъекта цервикальной интраэпителиальной неоплазии.
74. Способ получения моноклональных антител, специфичных к пептиду прионного белка, включающий в себя:

а) химическое конъюгирование пептида прионного белка с молекулой-носителем, представляющей собой НЗР70, где пептид прионного белка выбран из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 7

- 37 010506 и 8Ер ГО N0: 9;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

ά) создание гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативному прионному белку.
75. Способ по п.74, в котором конъюгирование осуществляют химически с использованием глутаральдегида.
76. Способ по п.74, в котором пептид прионного белка имеет последовательность 8ЕР ГО N0: 6.
77. Способ по п.74, в котором пептид прионного белка имеет последовательность 8ЕР ГО N0: 7.
78. Способ по п.74, в котором пептид прионного белка имеет последовательность 8ЕР ГО N0: 9.
79. Способ по п.74, в котором животное является мышью.
80. Способ по п.74, в котором скрининг осуществляют, используя твердофазный иммуноферментный анализ.
81. Набор для определения того, существует ли риск развития у субъекта губчатой энцефалопатии, содержащий:

a) по меньшей мере один реагент, который специфично выявляет прионный белок, где реагент представляет собой моноклональные антитела, полученные способом по п.74; и

b) инструкции по определению того, существует ли повышенный риск развития у субъекта губчатой энцефалопатии.
82. Способ получения моноклональных антител, специфичных к гиалуроновой кислоте, включающий в себя:

a) химическое конъюгирование гиалуроновой кислоты с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

ά) создание гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативной гиалуроновой кислоте.
83. Способ получения моноклональных антител, специфичных к металлопротеазе 3 матрикса, включающий в себя:

a) химическое конъюгирование металлопротеазы 3 матрикса с молекулой-носителем, представляющей собой белок теплового шока;

b) иммунизацию животного конъюгированным антигеном;

c) сбор В-клеток от животного;

ά) создание гибридомы из собранных В-клеток и

е) скрининг гибридом в отношении специфичности к нативной металлопротеазе 3 матрикса.
84. Способ по п.83, в котором конъюгирование осуществляют химически с использованием глутаральдегида.
85. Способ по п.83, в котором молекулой-носителем является Н8Р70.
86. Способ по п.83, в котором животное является мышью.
87. Способ по п.83, в котором скрининг осуществляют с использованием твердофазного иммуноферментного анализа.