JP2010518361A - 新規の遺伝子破壊、組成物、およびそれに関連する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、遺伝子機能の特徴付けに関与するトランスジェニック動物ならびに組成物および方法に関する。具体的に、本発明はPRO57290遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスを提供する。そのようなインビボ研究および特徴付けは、遺伝子破壊と関連する疾患または機能障害、例えば心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を予防、寛解または矯正するのに有用な、治療および/または処置の価値ある同定および発見を提供し得る。
Description
(発明の分野)
本発明は組成物、例えばトランスジェニック及びノックアウト動物及び疾患又は障害の診断及び治療のためにそのような組成物を使用する方法に関する。
本発明は組成物、例えばトランスジェニック及びノックアウト動物及び疾患又は障害の診断及び治療のためにそのような組成物を使用する方法に関する。
(発明の背景)
細胞外蛋白はとりわけ多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしている。多くの個々の細胞の消長、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は典型的には他の細胞及び/又は直属の環境から受領される情報により統括されている。この情報はしばしば、分泌ポリペプチド(例えばマイトジェン因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド及びホルモン)により伝達され、これはその後多様な細胞受容体又は膜結合蛋白により受領され、解釈される。これ等の分泌ポリペプチド又はシグナリング分子は通常は細胞分泌経路を通過して細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
細胞外蛋白はとりわけ多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしている。多くの個々の細胞の消長、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は典型的には他の細胞及び/又は直属の環境から受領される情報により統括されている。この情報はしばしば、分泌ポリペプチド(例えばマイトジェン因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド及びホルモン)により伝達され、これはその後多様な細胞受容体又は膜結合蛋白により受領され、解釈される。これ等の分泌ポリペプチド又はシグナリング分子は通常は細胞分泌経路を通過して細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌蛋白は医薬品、診断薬、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む種々の産業上の用途を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子及び種々の他のサイトカインのような現在入手可能な蛋白薬剤の大部分は分泌蛋白である。膜蛋白であるそれらの受容体もまた治療薬又は診断薬としての潜在性を有する。産業界及び学術界の両方で新規な天然の分泌蛋白を同定するための努力がなされている。多くの努力は新規な分泌蛋白に関するコーディング配列を同定するための哺乳類組み換えDNAライブラリのスクリーニングに着目している。スクリーニングの方法及び手法の例は文献に記載されている[例えば、非特許文献1;特許文献1参照]。
膜結合蛋白及び受容体はとりわけ多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たし得る。多くの個々の細胞の消長、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は典型的には他の細胞及び/又は直属の環境から受領される情報により統括されている。この情報はしばしば、分泌ポリペプチド(例えばマイトジェン因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド及びホルモン)により伝達され、これはその後多様な細胞受容体又は膜結合蛋白により受領され、解釈される。このような膜結合蛋白及び細胞受容体は、限定されないが、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与する受容体、及び、細胞接着分子、例えばセレクチン及びインテグリンを包含する。例えば、細胞の成育及び分化を調節するシグナルの伝達は一つには種々の細胞蛋白のホスホリル化により調節される。その過程を触媒する酵素である蛋白チロシンキナーゼは成長因子受容体としても機能できる。例としては線維芽細胞成長因子受容体及び神経成長因子受容体が挙げられる。
膜結合蛋白及び受容体分子は医薬品及び診断薬を含む種々の産業上の用途を有している。例えば受容体免疫接着は受容体−リガンド相互作用をブロックするための治療薬として使用できる。膜結合蛋白は、関連する受容体/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子の阻害剤のスクリーニングの為にも使用できる。
産業界及び学術界の両方で新規な天然の受容体又は膜結合蛋白を同定するための努力がなされている。多くの努力は新規な受容体又は膜結合蛋白に関するコーディング配列を同定するための哺乳類組み換えDNAライブラリのスクリーニングに着目している。
生物学及び疾患の過程における分泌及び膜結合の蛋白の重要性を鑑みれば、インビボの研究及び特性化は疾患又は機能不全の予防、緩解又は補正において有用な治療薬及び/又は治療法の価値ある識別及び道程を可能とし得る。この点に関し、遺伝子操作されたマウスは、免疫学、癌、神経生物学、心臓血管生物学、肥満及び他の多くを包含するヒトの疾患に関連する生物学的過程の機能的分析のための価値ある道具であることがわかっている。遺伝子ノックアウトは高度に特異的なアンタゴニストの活性をインビボで予測することにより薬剤作用の生物学的機序をモデル化しているものとして捉えることができる。ノックアウトマウスは薬剤の活性をモデル化していることがわかっており;特定の薬剤標的蛋白に関して欠損性であるマウスの表現型は相当する拮抗薬剤によって生じるヒト臨床表現型を模倣することができる。遺伝子ノックアウトは標的の作用機序、標的の主要な生理学的役割、及び、標的の抑制から生じると考えられる機序に基づいた副作用を哺乳類において発見可能とする。この型の例はアンジオテンシン変換酵素(ACE)[非特許文献2]及びシクロオキシゲナーゼ−1(COX1)遺伝子[非特許文献3]が欠損しているマウスを包含する。逆に、マウスにおいて遺伝子をノックアウトすることは相当する標的へのアゴニスト薬剤の投与後にヒトにおいて観察されるものとは逆の表現型作用を有する場合がある。その例としては突然変異の結果が赤血球生産不全であるエリスロポエチンノックアウト[非特許文献4]及び突然変異体マウスが活動亢進及び応答性亢進を示すGABA(A)−R−β3ノックアウト[非特許文献5]が挙げられる。これ等の表現型は共にヒトにおけるエリスロポエチン及びベンゾジアゼピン投与の作用とは逆である。マウス遺伝子学を用いて有効化された標的の意外な例はACC2遺伝子である。ヒトACC2遺伝子は数年前に同定されているが、薬剤開発の標的としてのACC2への関心はノックアウトマウスを用いたACC2機能分析後の最近になってようやく喚起された。ACC2突然変異マウスはその野生型同腹仔よりも大食であるが、より多くの脂肪を燃焼し、その脂肪細胞中への脂肪の貯留は低値であり、このことは、この酵素を肥満治療における化学的アンタゴニストに関する推定標的としている[非特許文献6]。
本出願においては、突然変異した遺伝子の破壊が、生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変を包含する種々の疾患状態又は機能不全に関連する表現型の観察事項をもたらしている。
Klein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.93:7108−7113(1996)
Esther,C.R.et al.,Lab.Invest.,74:953−965(1996)
Langenbach,R.et al.,Cell,83:483−492(1995)
Wu,C.S.et al.,Cell.,83:59−67(1996)
DeLorey,T.M.,J.Neurosci.,18:8505−8514(1998)
Abu−Elheiga,L.et al.,Science,291:2613−2616(2001)
(発明の要旨)
A.実施形態
本発明はPRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
A.実施形態
本発明はPRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
1つの局面において、単離された核酸分子は、(a)本明細書に開示する完全長のアミノ酸配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いたアミノ酸配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しない膜貫通蛋白の細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示した完全長アミノ酸配列の何れかの他の特に定義されるフラグメントを有するPRO57290ポリペプチドをコードするDNA分子、又は、(b)(a)のDNA分子の相補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約81%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約82%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約83%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約84%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約85%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約86%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約87%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約88%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約89%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約90%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約91%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約92%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約93%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約94%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約95%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約96%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約97%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約98%の核酸配列同一性、及び、或いは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
別の局面において、単離された核酸分子は、(a)本明細書に開示する完全長のポリペプチドcDNAのコーディング配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いたPRO57290ポリペプチドのコーディング配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しない膜貫通PRO57290ポリペプチドの細胞外ドメインのコーディング配列、又は、本明細書に開示する完全長アミノ酸配列の何れかの他の特に定義されるフラグメントのコーディング配列を含むDNA分子、又は、(b)(a)のDNA分子の相補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約81%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約82%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約83%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約84%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約85%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約86%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約87%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約88%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約89%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約90%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約91%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約92%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約93%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約94%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約95%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約96%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約97%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約98%の核酸配列同一性、及び、或いは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
更に別の局面において、本発明は、(a)本明細書に開示するATCCにより寄託されたヒト蛋白cDNAの何れかによりコードされる同様の成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は、(b)(a)のDNA分子の相補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約81%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約82%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約83%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約84%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約85%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約86%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約87%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約88%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約89%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約90%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約91%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約92%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約93%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約94%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約95%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約96%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約97%の核酸配列同一性、或いは少なくとも約98%の核酸配列同一性、及び、或いは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明の別の局面は、膜貫通ドメイン欠失又は膜貫通ドメイン不活性化されているか、又は、そのようなコードしているヌクレオチド配列に相補的なPRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインが本明細書において開示される。従って、本明細書に記載するPRO57290ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインも意図される。
本発明は更に、例えば、PRO57290抗体に対する結合部位を含むポリペプチドを場合によりコードしてよいPRO57290ポリペプチドのフラグメントをコードするためのハイブリダイゼーションプローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして使用してよい、抗PRO57290ポリペプチドコーディング配列又はその相補体のフラグメントを提供する。このような核酸フラグメントは通常は、約10ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約15ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約20ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約30ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約40ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約50ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約60ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約70ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約80ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約90ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約100ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約110ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約120ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約130ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約140ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約150ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約160ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約170ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約180ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約190ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約200ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約250ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約300ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約350ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約400ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約450ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約500ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約600ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約700ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約800ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約900ヌクレオチド長又はそれ以上、及び、或いは約1000ヌクレオチド長又はそれ以上であり、ここで、この文脈において、「約」という用語は言及したヌクレオチド配列長±その言及した長さの10%を意味する。PRO57290ポリペプチドコードヌクレオチド配列の新規なフラグメントは、多くのよく知られた配列アライメントプログラムの何れかを用いてPRO57290ポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知ヌクレオチド配列とアラインすること、及び、どのPRO57290ポリペプチドコードヌクレオチド配列フラグメントが新規であるかを決定することにより日常的に決定してよい。このような,PRO57290ポリペプチドコードヌクレオチド配列の全てを本明細書においては意図する。同様に意図されるものはこのようなヌクレオチド分子フラグメントによりコードされるPRO57290ポリペプチドフラグメント、好ましくは、PRO57290抗体に対する結合部位を含む抗PRO57290ポリペプチドフラグメントである。
本発明は上記の通り同定された単離された核酸配列の何れかによりコードされる単離されたPRO57290ポリペプチドを提供する。
特定の局面において、本発明は本明細書に開示する完全長のアミノ酸配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いたアミノ酸配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しない膜貫通蛋白の細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示した完全長アミノ酸配列の何れかの他の特に定義されるフラグメントを有するPRO57290ポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、及び、或いは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO57290ポリペプチドに関する。
更に別の局面において、本発明は本明細書に開示するATCCにより寄託されたヒト蛋白cDNAの何れかによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、及び、或いは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO57290ポリペプチドに関する。
1つの局面において、本発明は約10アミノ酸長又はそれ以上、或いは約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600アミノ酸長又はそれ以上のPRO57290変異体ポリペプチドに関する。場合により、PRO57290変異体ポリペプチドはネイティブのPRO57290ポリペプチド配列と比較して1つ又はそれより多くない保存的アミノ酸置換を有し、或いは、ネイティブのPRO57290ポリペプチド配列と比較して2、3、4、5、6、7、8、9又は10より多くない保存的アミノ酸置換を有する。
特定の局面において、本発明はN末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを有しない単離されたPRO57290ポリペプチドを提供し、前記したとおりそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これ等を製造するためのプロセスも本明細書に記載し、その場合、そのようなプロセスはPRO57290ポリペプチドの発現に適する条件下に適切なコードしている核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び、細胞培養物からPRO57290ポリペプチドを回収することを含む。
本発明の別の局面は膜貫通ドメイン欠失又は膜貫通ドメイン不活性化されている単離されたPRO57290ポリペプチドを提供する。これ等を製造するプロセスも本明細書に記載し、その場合、そのようなプロセスはPRO57290ポリペプチドの発現に適する条件下に適切なコードしている核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び、細胞培養物からPRO57290ポリペプチドを回収することを含む。
本発明は本明細書において定義されるネイティブのPRO57290ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。特に、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO57290抗体又は小分子である。
本発明はPRO57290ポリペプチドを候補分子と接触させること、及び、該PRO57290ポリペプチドにより媒介される生物学的活性をモニタリングすることを含む、PRO57290ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する。好ましくは、PRO57290ポリペプチドはネイティブのPRO57290ポリペプチドである。
本発明はPRO57290ポリペプチド、又は、本明細書に記載する、PRO57290のアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO57290抗体を担体と組み合わせて含む組成物を提供する。場合により、担体は製薬上許容しうる担体である。
本発明はPRO57290抗体に対して応答する状態の治療において有用な医薬の製造のための抗PRO57290ポリペプチド又は上記したそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗PRO57290抗体の使用を提供する。
本発明は本明細書に記載したポリペプチドの何れかをコードするDNAを含むベクターを提供する。何れかのそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例えば、宿主細胞はCHO細胞、E・コリ又は酵母であってよい。本明細書に記載したポリペプチドの何れかを製造するためのプロセスも更に提供され、それは所望のポリペプチドの発現の為に適する条件下において宿主細胞を培養すること及び細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
本発明は異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合させた本明細書に記載したポリペプチドの何れかを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例はエピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合させた本明細書に記載したポリペプチドの何れかを含む。
本発明は前述又は後述のポリペプチドのいずれかに、好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。場合により、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント又は一本鎖抗体である。
本発明はゲノム及びcDNAのヌクレオチド配列を単離するために、関連する遺伝子の発現を測定又は検出するために、又は、アンチセンスプローブとして有用な、オリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでこれ等のプローブは前述又は後述のヌクレオチド配列の何れかから誘導してよい。好ましいプローブ長は前述の通りである。
本発明はまた、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を同定する方法であって、方法が下記工程:
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;及び、
(c)測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること、
を含み、ここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた表現型として同定される上記方法を提供する。1つの局面において、非ヒトトランスジェニック動物は哺乳類である。別の局面において、哺乳類はげっ歯類である。更に別の局面において、哺乳類はラット又はマウスである。1つの局面において、非ヒトトランスジェニック動物は、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に対してヘテロ接合性である。別の局面において、性別一致野生型同腹仔と比較した場合の非ヒトトランスジェニック動物により示される表現型は以下のもの、即ち:心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;又は発達障害の少なくとも1つである。
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;及び、
(c)測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること、
を含み、ここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた表現型として同定される上記方法を提供する。1つの局面において、非ヒトトランスジェニック動物は哺乳類である。別の局面において、哺乳類はげっ歯類である。更に別の局面において、哺乳類はラット又はマウスである。1つの局面において、非ヒトトランスジェニック動物は、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に対してヘテロ接合性である。別の局面において、性別一致野生型同腹仔と比較した場合の非ヒトトランスジェニック動物により示される表現型は以下のもの、即ち:心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;又は発達障害の少なくとも1つである。
本発明は又、自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物から誘導した単離細胞を提供する。1つの局面において、単離細胞はマウス細胞である。別の局面において、マウス細胞は胚性幹細胞である。更に別の局面において、単離細胞は性別一致野生型同腹仔と比較した場合に以下の表現型、即ち:心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;又は発達異常の少なくとも1つを示す非ヒトトランスジェニック動物から誘導される。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、方法が下記工程:
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた表現型として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)試験薬剤が非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する同定された表現型を調節するかどうか決定すること;
を含む上記方法を提供する。
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた表現型として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)試験薬剤が非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する同定された表現型を調節するかどうか決定すること;
を含む上記方法を提供する。
1つの局面において、遺伝子の破壊に関連する表現型は心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;又は発達異常を含む。
更に別の局面において、発達異常は胚性致死又は生存性低下を含む。
更に又別の局面において、心臓血管、内皮又は脈管形成障害は動脈疾患、例えば真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大及び心不全、例えば鬱血性心不全;高血圧;炎症性血管炎;レイノー病及びレイノー現象;動脈瘤及び動脈再狭窄;静脈及びリンパの障害、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎及びリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫;腫瘍脈管形成;外傷、例えば創傷、熱傷及び他の傷害組織、移植物固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;腎疾患、例えば急性腎不全又は骨粗鬆症である。
更に別の局面において、免疫不全は全身エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身硬化症(硬皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー又はギラン−バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー;肝胆疾患、例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型及び他の非肝向性のウィルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性結腸炎;クローン病);グルテン感受性腸症及びホイップル病;自己免疫性又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬;アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎;又は移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主病である。
更に別の局面において、骨代謝異常又は障害は関節炎、骨粗鬆症、骨減少症又は大理石骨病である。
別の態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す。
本発明は又遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を提供する。1つの局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特性を調節する薬剤を同定する方法であって、方法が下記工程:
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物により示される生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物により示される生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物により示される生理学的特徴は遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴が調節されているかどうか決定すること;を含む上記方法を提供する。
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物により示される生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物により示される生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物により示される生理学的特徴は遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴が調節されているかどうか決定すること;を含む上記方法を提供する。
別の態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す。
別の局面において、非ヒトトランスジェニック動物は、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:オープンフィールド活動性試験中の不安様応答の低減;概日試験中の新しい環境に対する異常な馴化応答(ホームケージ活動性試験中の歩行回数の中央値の増加);尾部懸垂試験中の不動時間の中央値の減少を伴う、うつ様応答の低減;血糖値の上昇;耐糖能障害;骨梁体積および骨梁厚の増加;総体脂肪質量パーセントおよび総体脂肪パーセントの減少;皮膚線維芽細胞増殖速度の低下;ならびに収縮期血圧の上昇の少なくとも1つを示す。
本発明はまた、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を処置または予防または寛解する方法を提供し、この方法は、
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供すること;
(b)この非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;
(c)試験薬剤が非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節するかどうか決定すること
を含む。
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供すること;
(b)この非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;
(c)試験薬剤が非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節するかどうか決定すること
を含む。
更に別の局面において、発達異常は胚性致死又は生存性低下を含む。
更に又別の局面において、心臓血管、内皮又は脈管形成障害は動脈疾患、例えば真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大及び心不全、例えば鬱血性心不全;高血圧;炎症性血管炎;レイノー病及びレイノー現象;動脈瘤及び動脈再狭窄;静脈及びリンパの障害、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎及びリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫;腫瘍脈管形成;外傷、例えば創傷、熱傷及び他の傷害組織、移植物固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;腎疾患、例えば急性腎不全又は骨粗鬆症である。
更に別の局面において、免疫不全は全身エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身硬化症(硬皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー又はギラン−バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー;肝胆疾患、例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型及び他の非肝向性のウィルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性結腸炎;クローン病);グルテン感受性腸症及びホイップル病;自己免疫性又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬;アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎;又は移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主病である。
更に別の局面において、骨代謝異常又は障害は関節炎、骨粗鬆症、骨減少症又は大理石骨病である。
別の態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す。
本発明は又、遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節する薬剤を提供する。1つの局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型のアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明は又、神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常の治療のための治療薬を提供する。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、下記工程:
(a)PRO57290ポリペプチドを発現する宿主細胞に試験薬剤を接触させること;及び、
(b)試験薬剤が宿主細胞による,PRO57290ポリペプチドの発現を調節するかどうか決定すること;
を含む方法を提供する。
(a)PRO57290ポリペプチドを発現する宿主細胞に試験薬剤を接触させること;及び、
(b)試験薬剤が宿主細胞による,PRO57290ポリペプチドの発現を調節するかどうか決定すること;
を含む方法を提供する。
本発明は又PRO57290ポリペプチドの発現を調節する薬剤を提供する。1つの局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型のアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、薬剤は、PRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明はまた、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態に影響することができる治療薬を評価する方法であって、方法が下記工程:
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた状態として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する同定された状態に対する試験薬剤の作用を評価すること;
を含む上記方法を提供する。
(a)自身のゲノムがPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を準備すること;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定すること;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物のものと比較すること(ただしここで野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じた状態として同定される);
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与すること;及び、
(e)非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊に関連する同定された状態に対する試験薬剤の作用を評価すること;
を含む上記方法を提供する。
1つの局面において、状態は神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常である。
本発明は又、遺伝子の破壊に関連する状態に影響することができる治療薬を提供する。1つの局面において、薬剤は、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型のアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明は又、遺伝子の破壊に関連する状態に影響することができる治療薬を含む医薬組成物を提供する。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;又は胚性致死を治療又は予防又は緩解する方法であって、方法が既に疾患を有し得る者、又は疾患を有する傾向にあり得る者、又は疾患を予防すべきであり得る者であるそのような治療を必要とする被験体に治療薬、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの治療有効量を投与することにより、該障害又は疾患を効果的に治療又は予防又は緩解することを含む上記方法を提供する。
更に別の局面において、発達異常は胚性致死又は生存性低下を含む。
更に又別の局面において、心臓血管、内皮又は脈管形成障害は動脈疾患、例えば真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大及び心不全、例えば鬱血性心不全;高血圧;炎症性血管炎;レイノー病及びレイノー現象;動脈瘤及び動脈再狭窄;静脈及びリンパの障害、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎及びリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫;腫瘍脈管形成;外傷、例えば創傷、熱傷及び他の傷害組織、移植物固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;腎疾患、例えば急性腎不全又は骨粗鬆症である。
更に別の局面において、免疫不全は全身エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身硬化症(硬皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー又はギラン−バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー;肝胆疾患、例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型及び他の非肝向性のウィルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性結腸炎;クローン病);グルテン感受性腸症及びホイップル病;自己免疫性又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬;アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎;又は移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主病である。
更に別の局面において、骨代謝異常又は障害は関節炎、骨粗鬆症、骨減少症又は大理石骨病である。
別の局面において、治療薬はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型のアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節する薬剤を同定する方法であって、方法が下記工程:
(a)非ヒトトランスジェニック動物細胞培養物を準備すること(ここで該培養物の各々の細胞はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含んでいる);
(b)試験薬剤を該細胞培養物に投与すること;及び、
(c)試験薬剤が該培養物における神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節するかどうか決定すること;
を含む上記方法を提供する。
(a)非ヒトトランスジェニック動物細胞培養物を準備すること(ここで該培養物の各々の細胞はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含んでいる);
(b)試験薬剤を該細胞培養物に投与すること;及び、
(c)試験薬剤が該培養物における神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節するかどうか決定すること;
を含む上記方法を提供する。
更に別の局面において、発達異常は胚性致死又は生存性低下を含む。
更に又別の局面において、心臓血管、内皮又は脈管形成障害は動脈疾患、例えば真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大及び心不全、例えば鬱血性心不全;高血圧;炎症性血管炎;レイノー病及びレイノー現象;動脈瘤及び動脈再狭窄;静脈及びリンパの障害、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎及びリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫;腫瘍脈管形成;外傷、例えば創傷、熱傷及び他の傷害組織、移植物固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;腎疾患、例えば急性腎不全又は骨粗鬆症である。
更に別の局面において、免疫不全は全身エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身硬化症(硬皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー又はギラン−バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー;肝胆疾患、例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型及び他の非肝向性のウィルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性結腸炎;クローン病);グルテン感受性腸症及びホイップル病;自己免疫性又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬;アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎;又は移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主病である。
更に別の局面において、骨代謝異常又は障害は関節炎、骨粗鬆症、骨減少症又は大理石骨病である。
本発明は又、上記培養物において遺伝子の破壊に関連する神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;眼の異常;免疫不全;腫瘍学的障害;骨代謝異常又は障害;脂質代謝障害;又は発達異常を緩解又は調節する薬剤を提供する。1つの局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型のアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、薬剤はPRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストである。更に別の局面において、アゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。更に別の局面において、アンタゴニストの薬剤は抗PRO57290抗体である。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する方法であって、方法が既に表現型を有し得る被験体、又は表現型を有する傾向にあり得る被験体、又は表現型を予防すべきであり得る被験体に、該表現型を調節するものとして同定された薬剤、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの有効量を投与することにより、表現型を効果的に調節することを含む上記方法を提供する。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する方法であって、方法が既に生理学的特徴を示し得る被験体、又は生理学的特徴を示す傾向にあり得る被験体、又は生理学的特徴を予防すべきであり得る被験体に、該生理学的特徴を調節するものとして同定された薬剤、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの有効量を投与することにより、生理学的特徴を効果的に調節することを含む上記方法を提供する。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する挙動を調節する方法であって、方法が既に挙動を示し得る被験体、又は挙動を示す傾向にあり得る被験体、又は示された挙動を予防すべきであり得る被験体に、該挙動を調節するものとして同定された薬剤、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの有効量を投与することにより、挙動を効果的に調節することを含む上記方法を提供する。
本発明は又、PRO57290ポリペプチドの発現を調節する方法であって、方法が該PRO57290ポリペプチドを発現する宿主細胞に、該発現を調節するものとして同定された薬剤、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの有効量を投与することにより、該ポリペプチドの発現を効果的に調節することを含む上記方法を提供する。
本発明はまた、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を処置または予防または寛解する方法であって、その方法は、非ヒトトランスジェニック動物細胞培養物(この細胞培養物はそれぞれPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を有する)に、有効量の上記障害を処置または予防または寛解するとして同定された薬剤、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより上記障害を効果的に処置または予防または寛解する方法、を提供する。
本発明はまた、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節する薬剤を同定する方法であって、その方法は、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を有し得る被験体に、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節するとして同定された治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより上記障害を寛解または調節する方法、も提供する。
B.別の実施形態
更に別の実施形態において、本発明は本出願に係る潜在的請求項の以下のセットを指向している。
更に別の実施形態において、本発明は本出願に係る潜在的請求項の以下のセットを指向している。
(項目1)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;および
(c)測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程
を含み、
ここで、野生型動物の生理学的特徴と異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、方法。
(項目2)前記非ヒトトランスジェニック動物が、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊についてヘテロ接合性である、項目1に記載の方法。
(項目3)性別一致野生型同腹仔と比較した場合、前記非ヒトトランスジェニック動物によって示される表現型が、以下:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つである、項目1に記載の方法。
(項目4)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目3に記載の方法。
(項目6)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー(idiopathic demyelinating polyneuropathy)またはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目3に記載の方法。
(項目7)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目3に記載の方法。
(項目8)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目1に記載の方法。
(項目9)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物に由来する単離細胞。
(項目10)単離細胞がマウス細胞である、項目9に記載の単離細胞。
(項目11)前記マウス細胞が胚性幹細胞である、項目10に記載の単離細胞。
(項目12)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の表現型:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つを示す、項目9に記載の単離細胞。
(項目13)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連する同定された表現型を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目14)前記遺伝子破壊と関連する前記表現型が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目14に記載の方法。
(項目16)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目14に記載の方法。
(項目17)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目14に記載の方法。
(項目18)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目14に記載の方法。
(項目19)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目13に記載の方法。
(項目20)項目13に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目21)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目20に記載の薬剤。
(項目22)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目21に記載の薬剤。
(項目23)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目21に記載の薬剤。
(項目24)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物によって示される生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を、遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)遺伝子破壊と関連する生理学的特徴が調節されているか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目25)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目24に記載の方法。
(項目26)項目24に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目27)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目26に記載の薬剤。
(項目28)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目27に記載の薬剤。
(項目29)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目27に記載の薬剤。
(項目30)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(c)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物において、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目31)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目30に記載の方法。
(項目32)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目30に記載の方法。
(項目33)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目30に記載の方法。
(項目34)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目30に記載の方法。
(項目35)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目30に記載の方法。
(項目36)項目30に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目37)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目36に記載の薬剤。
(項目38)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目37に記載の薬剤。
(項目39)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目37に記載の薬剤。
(項目40)項目30に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目41)PRO57290ポリペプチドの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞を試験薬剤と接触させる工程;および
(b)該試験薬剤が、該宿主細胞による該PRO57290ポリペプチドの発現を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目42)項目41に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目43)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目42に記載の薬剤。
(項目44)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目43に記載の薬剤。
(項目45)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目43に記載の薬剤。
(項目46)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態に影響を及ぼし得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)前記PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する同定された状態に対して該試験薬剤の作用を評価する工程
を含む、方法。
(項目47)前記状態が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常である、項目46に記載の方法。
(項目48)項目46に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目49)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目48に記載の治療薬。
(項目50)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目49に記載の治療薬。
(項目51)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目49に記載の治療薬。
(項目52)項目48に記載の治療薬を含む医薬組成物。
(項目53)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または胚性致死を処置または予防または寛解する方法であって、該方法は、該障害をすでに有し得るか、または該障害を有する傾向にあり得るか、または該障害を予防する状態であり得る、そのような処置が必要な被験体に対して、治療有効量の項目40に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該障害を効果的に処置または予防または寛解する、方法。
(項目54)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目53に記載の方法。
(項目56)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目53に記載の方法。
(項目57)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目53に記載の方法。
(項目58)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する方法であって、該方法は、該表現型をすでに有し得るか、または該表現型を有する傾向にあり得るか、または該表現型を予防する状態にあり得る被験体に、有効量の項目20に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該表現型を効果的に調節する、方法。
(項目59)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する方法であって、該方法は、該生理学的特徴をすでに示し得るか、または該生理学的特徴を示す傾向にあり得るか、または該生理学的特徴を予防する状態であり得る被験体に、有効量の項目26に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該生理学的特徴を効果的に調節する、方法。
(項目60)PRO57290ポリペプチドの発現を調節する方法であって、該方法は、該PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞に、有効量の項目42に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該ポリペプチドの発現を効果的に調節する、方法。
(項目61)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態を調節する方法であって、該方法は、該状態を有し得るか、または該状態を有する傾向にあり得るか、または該状態を予防する状態であり得る被験体に、治療有効量の項目48に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該状態を効果的に調節する、方法。
(項目62)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣する薬剤を同定する方法であって、該方法は;
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が該非ヒトトランスジェニック動物において初期に観察される状態または表現型を模倣するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目63)項目62に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目64)PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、項目63に記載の薬剤。
(項目65)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目63に記載の薬剤。
(項目66)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型を模倣する状態であり得る被験体に、有効量の項目63に記載の薬剤、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
(項目67)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣し得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)(c)の該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤の該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する該状態または表現型を模倣する能力を評価する工程
を含む、方法。
(項目68)項目67に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目69)PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、項目68に記載の治療薬。
(項目70)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目68に記載の治療薬。
(項目71)項目68に記載の治療薬を含む医薬組成物。
(項目72)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型障害を模倣する状態であり得る被験体に、治療有効量の項目68に記載の治療薬、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;および
(c)測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程
を含み、
ここで、野生型動物の生理学的特徴と異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、方法。
(項目2)前記非ヒトトランスジェニック動物が、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊についてヘテロ接合性である、項目1に記載の方法。
(項目3)性別一致野生型同腹仔と比較した場合、前記非ヒトトランスジェニック動物によって示される表現型が、以下:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つである、項目1に記載の方法。
(項目4)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目3に記載の方法。
(項目6)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー(idiopathic demyelinating polyneuropathy)またはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目3に記載の方法。
(項目7)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目3に記載の方法。
(項目8)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目1に記載の方法。
(項目9)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物に由来する単離細胞。
(項目10)単離細胞がマウス細胞である、項目9に記載の単離細胞。
(項目11)前記マウス細胞が胚性幹細胞である、項目10に記載の単離細胞。
(項目12)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の表現型:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つを示す、項目9に記載の単離細胞。
(項目13)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連する同定された表現型を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目14)前記遺伝子破壊と関連する前記表現型が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目14に記載の方法。
(項目16)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目14に記載の方法。
(項目17)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目14に記載の方法。
(項目18)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目14に記載の方法。
(項目19)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目13に記載の方法。
(項目20)項目13に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目21)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目20に記載の薬剤。
(項目22)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目21に記載の薬剤。
(項目23)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目21に記載の薬剤。
(項目24)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物によって示される生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を、遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)遺伝子破壊と関連する生理学的特徴が調節されているか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目25)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目24に記載の方法。
(項目26)項目24に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目27)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目26に記載の薬剤。
(項目28)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目27に記載の薬剤。
(項目29)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目27に記載の薬剤。
(項目30)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(c)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物において、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目31)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目30に記載の方法。
(項目32)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目30に記載の方法。
(項目33)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目30に記載の方法。
(項目34)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目30に記載の方法。
(項目35)前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、項目30に記載の方法。
(項目36)項目30に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目37)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目36に記載の薬剤。
(項目38)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目37に記載の薬剤。
(項目39)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目37に記載の薬剤。
(項目40)項目30に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目41)PRO57290ポリペプチドの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞を試験薬剤と接触させる工程;および
(b)該試験薬剤が、該宿主細胞による該PRO57290ポリペプチドの発現を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目42)項目41に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目43)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目42に記載の薬剤。
(項目44)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目43に記載の薬剤。
(項目45)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目43に記載の薬剤。
(項目46)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態に影響を及ぼし得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)前記PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する同定された状態に対して該試験薬剤の作用を評価する工程
を含む、方法。
(項目47)前記状態が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常である、項目46に記載の方法。
(項目48)項目46に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目49)PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、項目48に記載の治療薬。
(項目50)前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、項目49に記載の治療薬。
(項目51)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目49に記載の治療薬。
(項目52)項目48に記載の治療薬を含む医薬組成物。
(項目53)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または胚性致死を処置または予防または寛解する方法であって、該方法は、該障害をすでに有し得るか、または該障害を有する傾向にあり得るか、または該障害を予防する状態であり得る、そのような処置が必要な被験体に対して、治療有効量の項目40に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該障害を効果的に処置または予防または寛解する、方法。
(項目54)前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、項目53に記載の方法。
(項目56)前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、項目53に記載の方法。
(項目57)前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、項目53に記載の方法。
(項目58)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する方法であって、該方法は、該表現型をすでに有し得るか、または該表現型を有する傾向にあり得るか、または該表現型を予防する状態にあり得る被験体に、有効量の項目20に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該表現型を効果的に調節する、方法。
(項目59)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する方法であって、該方法は、該生理学的特徴をすでに示し得るか、または該生理学的特徴を示す傾向にあり得るか、または該生理学的特徴を予防する状態であり得る被験体に、有効量の項目26に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該生理学的特徴を効果的に調節する、方法。
(項目60)PRO57290ポリペプチドの発現を調節する方法であって、該方法は、該PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞に、有効量の項目42に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該ポリペプチドの発現を効果的に調節する、方法。
(項目61)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態を調節する方法であって、該方法は、該状態を有し得るか、または該状態を有する傾向にあり得るか、または該状態を予防する状態であり得る被験体に、治療有効量の項目48に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該状態を効果的に調節する、方法。
(項目62)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣する薬剤を同定する方法であって、該方法は;
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が該非ヒトトランスジェニック動物において初期に観察される状態または表現型を模倣するか否かを判定する工程
を含む、方法。
(項目63)項目62に記載の方法によって同定される薬剤。
(項目64)PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、項目63に記載の薬剤。
(項目65)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目63に記載の薬剤。
(項目66)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型を模倣する状態であり得る被験体に、有効量の項目63に記載の薬剤、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
(項目67)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣し得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)(c)の該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤の該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する該状態または表現型を模倣する能力を評価する工程
を含む、方法。
(項目68)項目67に記載の方法によって同定される治療薬。
(項目69)PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、項目68に記載の治療薬。
(項目70)前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、項目68に記載の治療薬。
(項目71)項目68に記載の治療薬を含む医薬組成物。
(項目72)PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型障害を模倣する状態であり得る被験体に、治療有効量の項目68に記載の治療薬、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
(好ましい実施形態の詳細な説明)
1.定義
「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は本明細書においては、そして数の表記が直後に来る場合は、種々のポリペプチドを指すものとし、ここで完全な表記(即ちPRO/数)は本明細書に記載する特定のポリペプチド配列を指す。「数」という用語が本明細書において使用される実際の数の表記として提示される場合の「PRO/数ポリペプチド」及び「PRO/数」という用語は、ネイティブの配列のポリペプチド及びポリペプチドの変異体(これは本明細書において更に定義する)を包含する。本明細書に記載するPRO57290ポリペプチドは種々の原料から、例えばヒト組織型から、又は他の原料から単離してよく、又は、組み換え又は合成の方法により製造してよい。「PROポリペプチド」という用語は本明細書に開示した各々の個々のPRO/数ポリペプチドを指す。「PROポリペプチド」に言及する本明細書中の全ての開示は、ポリペプチドを個別に、並びに、総括して指すものとする。例えば、その製造、精製、誘導、それに対する抗体の形成、その投与、それを含有する組成物、それを伴う疾患の治療に関する説明等は本発明のポリペプチドの各々個々に関するものである。「PROポリペプチド」という用語はまた本明細書に開示したPRO/数ポリペプチドの変異体を包含する。
1.定義
「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は本明細書においては、そして数の表記が直後に来る場合は、種々のポリペプチドを指すものとし、ここで完全な表記(即ちPRO/数)は本明細書に記載する特定のポリペプチド配列を指す。「数」という用語が本明細書において使用される実際の数の表記として提示される場合の「PRO/数ポリペプチド」及び「PRO/数」という用語は、ネイティブの配列のポリペプチド及びポリペプチドの変異体(これは本明細書において更に定義する)を包含する。本明細書に記載するPRO57290ポリペプチドは種々の原料から、例えばヒト組織型から、又は他の原料から単離してよく、又は、組み換え又は合成の方法により製造してよい。「PROポリペプチド」という用語は本明細書に開示した各々の個々のPRO/数ポリペプチドを指す。「PROポリペプチド」に言及する本明細書中の全ての開示は、ポリペプチドを個別に、並びに、総括して指すものとする。例えば、その製造、精製、誘導、それに対する抗体の形成、その投与、それを含有する組成物、それを伴う疾患の治療に関する説明等は本発明のポリペプチドの各々個々に関するものである。「PROポリペプチド」という用語はまた本明細書に開示したPRO/数ポリペプチドの変異体を包含する。
「ネイティブ配列のPRO57290ポリペプチド」とは自然界より誘導される相当するPRO57290ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのようなネイティブの配列のPRO57290ポリペプチドは自然界から単離することができ、又は、組み換え又は合成手段により製造できる。「ネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド」という用語は特に特定のPRO57290ポリペプチド(例えば細胞外ドメイン配列)の天然に存在するトランケーションされた、又は分泌された形態、ポリペプチドの天然に存在する変異体型(例えばオルタナティブスプライシングされた形態)及び天然に存在する対立遺伝子変異体を包含する。本発明は添付図面に示す完全長のアミノ酸配列を含む成熟又は完全長のネイティブ配列ポリペプチドである本明細書に開示されたネイティブの配列のPRO57290ポリペプチドを提供する。開始及び終止コドンは図面中では太字で示し、下線を付した。しかしながら、添付図面において開示したPRO57290ポリペプチドは図面中アミノ酸位置1として本明細書において表記したメチオニン残基で開始するように示されているが、図面中のアミノ酸位置1よりも上流又は下流に位置する他のメチオニン残基もPRO57290ポリペプチドのための開始アミノ酸残基として使用してよい。
PRO57290ポリペプチドの「細胞外ドメイン」又は「ECD」とは膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に伴わないPRO57290ポリペプチドの形態を指す。通常は、PRO57290ポリペプチドのECDはそのような膜貫通及び/又は細胞質ドメイン1%未満を有し、好ましくはそのようなドメイン0.5%未満を有する。本発明のPRO57290ポリペプチドに関して同定される何れの膜貫通ドメインも疎水性ドメインのこのような型を同定するために当該分野で日常的に使用されている基準に従って同定される。膜貫通ドメインの厳密な境界は変動してよいが、最もあり得るのは本明細書において最初に同定されたドメインの何れかの末端において約5アミノ酸を超えないものである。従って場合により、PRO57290ポリペプチドの細胞外ドメインは実施例又は明細書において同定される膜貫通ドメイン/細胞外ドメインの境界の何れかの側において約5以下のアミノ酸を含んでよく、付随シグナルペプチドを有するか有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は本発明により意図される。
本明細書に開示した種々のPRO57290ポリペプチドの「シグナルペプチド」の大まかな位置は本明細書及び/又は添付図面に示す通りである。しかしながら、シグナルペプチドのC末端境界は変動してよいが、最もあり得るのは本明細書において最初に同定されたシグナルペプチドC末端境界の何れかの側において約5アミノ酸を超えないものであり、ここでシグナルペプチドのC末端境界を、アミノ酸配列エレメントのそのような型を同定するために当該分野で日常的に使用されている基準に従って同定してよい(例えばNielsen et al.,Prot.Eng.10:1−6(1997)及びvon Heinje et al.,Nucl.Acids.Res.14:4683−4690(1986)参照)。更に又、場合により分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、1つより多い分泌種をもたらす。シグナルペプチドが本明細書において同定されたシグナルペプチドC末端境界の何れかの側の5以下のアミノ酸内において切断されているこれ等の成熟ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドは本発明により意図される。
「PRO57290ポリペプチド変異体」とはPRO57290ポリペプチド、好ましくは、完全長のネイティブの配列の、本明細書に開示するPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に定義するシグナルペプチドを欠いたPRO57290ポリペプチド配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有するものとして本明細書において定義される活性なPRO57290ポリペプチド、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しないPRO57290ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示する完全長PRO57290ポリペプチド配列の何れかの他のフラグメント(例えば完全長PRO57290ポリペプチドに関する完全なコーディング配列の一部分のみを示す核酸によりコードされるもの)を意味する。そのようなPRO57290ポリペプチド変異体は例えば完全長のネイティブのアミノ酸配列のN又はC末端においてアミノ酸残基1つ以上が付加又は欠失しているPRO57290ポリペプチドを包含する。通常は、PRO57290ポリペプチド変異体は、本明細書に開示する完全長のネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いたPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しないPRO57290ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示する完全長PRO57290ポリペプチド配列の何れかの他の特に定義されたフラグメントに対して約80%又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するか、或いは、約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。通常はPRO57290変異体ポリペプチドは約10アミノ酸長又はそれ以上、或いは約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600アミノ酸長又はそれ以上である。場合により、PRO57290変異体ポリペプチドはネイティブのPRO57290ポリペプチド配列と比較して1つより多くない保存的アミノ酸置換を有するか、又は、ネイティブのPRO57290ポリペプチド配列と比較して2、3、4、5、6、7、8、9又は10より多くない保存的アミノ酸置換を有する。
本明細書において同定されるPRO57290ポリペプチド配列に関して「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」とは、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列をアラインし、ギャップを導入した後に、如何なる保存的置換も配列同一性の部分とはみなさない場合に、特定のPRO57290ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは当業者の知る種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような市販のコンピュータソフトウエアを用いて達成することができる。当業者は比較すべき配列の完全長に渡り最大アライメントを達成するために必要な何れかのアルゴリズムを含むアライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら本明細書の目的のためには、%アミノ酸同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて発生させ、ここでALIGN−2プログラムに関する完全なソースコードは以下の表1に示す。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはGenentech,Inc.により作成され、そして以下の表1に示すソースコードは合衆国著作権局Washington D.C.,20559において合衆国著作権登録番号TXU510087の下にユーザードキュメンテーションと共に保存されている。ALIGN−2プログラムはGenentech,Inc.,South San Francisco,Californiaから公的に入手するか、又は、以下の表1に示すソースコードからコンパイルしてよい。ALIGN−2プログラムはUNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標)V4.0D上で使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはALIGN−2プログラムにより設定され、変更されない。
アミノ酸配列比較のためにALIGN−2を使用する状況において、あるアミノ酸配列Aのあるアミノ酸配列Bに対する%アミノ酸配列同一性(これは代替としてあるアミノ酸配列Bに対する特定の%アミノ酸配列同一性を有する又は含むあるアミノ酸配列Aと表現できる)は下記式:
100×分数X/Y
[式中、XはA及びBのアライメントをプログラムする配列アライメントプログラムALIGN−2により同一マッチと採点されたアミノ酸残基の数であり、YはBにおけるアミノ酸残基の総数である]により計算される。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合は、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくならない。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性計算の例として、表2及び3は「PRO」と表記したアミノ酸配列に対する「比較蛋白」と表記したアミノ酸配列の%アミノ酸配列同一性をどのように計算するかを示しており、ここで「PRO」は目的の仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較蛋白」は目的の「PRO」ポリペプチドを比較する相手であるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、そして「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示す。特段の記載が無い限り、本明細書で使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値はALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフにおいて記載した通りに得られる。
100×分数X/Y
[式中、XはA及びBのアライメントをプログラムする配列アライメントプログラムALIGN−2により同一マッチと採点されたアミノ酸残基の数であり、YはBにおけるアミノ酸残基の総数である]により計算される。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合は、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性はAに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくならない。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性計算の例として、表2及び3は「PRO」と表記したアミノ酸配列に対する「比較蛋白」と表記したアミノ酸配列の%アミノ酸配列同一性をどのように計算するかを示しており、ここで「PRO」は目的の仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較蛋白」は目的の「PRO」ポリペプチドを比較する相手であるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、そして「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示す。特段の記載が無い限り、本明細書で使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値はALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフにおいて記載した通りに得られる。
「PRO57290変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO57290変異体核酸配列」とは、PRO57290ポリペプチド、好ましくは本明細書に定義する活性なPRO57290ポリペプチドをコードし、そして、本明細書に開示する完全長のネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いた完全長のネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しないPRO57290ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示する完全長PRO57290ポリペプチド配列の何れかの他のフラグメント(例えば完全長PRO57290ポリペプチドに関する完全なコーディング配列の一部分のみを示す核酸によりコードされるもの)に対して少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常は、PRO57290変異体ポリヌクレオチドは本明細書に開示する完全長のネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを欠いた完全長のネイティブの配列のPRO57290ポリペプチド配列、本明細書に開示するシグナルペプチドを有するか有しないPRO57290ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は、本明細書に開示する完全長PRO57290ポリペプチド配列の何れかの他のフラグメントをコードする核酸配列に対して、約80%又はそれ以上の核酸配列同一性を有するか、或いは、約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%又はそれ以上の核酸配列同一性を有する。変異体はネイティブヌクレオチド配列を包含しない。
通常はPRO57290変異体ポリヌクレオチドは約5ヌクレオチド長又はそれ以上、或いは約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990又は1000ヌクレオチド長又はそれ以上であり、ここで、この文脈において、「約」という用語は言及したヌクレオチド配列長±その言及した長さの10%を意味する。
本明細書において同定されるPRO57290コード核酸配列に関して「パーセント(%)核酸配列同一性」とは、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列をアラインし、ギャップを導入した後に、目的のPRO57290核酸配列におけるヌクレオチドと同一である候補配列におけるヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは当業者の知る種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような市販のコンピュータソフトウエアを用いて達成することができる。しかしながら本明細書の目的のためには、%核酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて発生させ、ここでALIGN−2プログラムに関する完全なソースコードは以下の表1に示す。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはGenentech,Inc.により作成され、そして以下の表1に示すソースコードは合衆国著作権局Washington D.C.,20559において合衆国著作権登録番号TXU510087の下にユーザードキュメンテーションと共に保存されている。ALIGN−2プログラムはGenentech,Inc.,South San Francisco,Californiaから公的に入手するか、又は、以下の表1に示すソースコードからコンパイルしてよい。ALIGN−2プログラムはUNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標)V4.0D上で使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメーターはALIGN−2プログラムにより設定され、変更されない。
核酸配列比較のためにALIGN−2を使用する状況において、ある核酸配列Cのある核酸配列Dに対する%核酸配列同一性(これは代替としてある核酸配列Dに対する特定の%核酸配列同一性を有する又は含むある核酸配列Cと表現できる)は下記式:
100×分数W/Z
[式中、WはC及びDのアライメントをプログラムする配列アライメントプログラムALIGN−2により同一マッチと採点されたヌクレオチドの数であり、ZはDにおけるヌクレオチドの総数である]により計算される。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと等しくない場合は、Dに対するCの%核酸配列同一性はCに対するDの%核酸配列同一性と等しくならない。%核酸配列同一性計算の例として、表4及び5は「PRO−DNA」と表記した核酸配列に対する「比較DNA」と表記した核酸配列の%核酸配列同一性をどのように計算するかを示しており、ここで「PRO−DNA」は目的の仮説的PRO−コード核酸配列を示し、「比較DNA」は目的の「PRO−DNA」核酸分子を比較する相手である核酸分子のヌクレオチド配列を示し、そして「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。特段の記載が無い限り、本明細書で使用する全ての%核酸配列同一性の値はALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフにおいて記載した通りに得られる。
100×分数W/Z
[式中、WはC及びDのアライメントをプログラムする配列アライメントプログラムALIGN−2により同一マッチと採点されたヌクレオチドの数であり、ZはDにおけるヌクレオチドの総数である]により計算される。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと等しくない場合は、Dに対するCの%核酸配列同一性はCに対するDの%核酸配列同一性と等しくならない。%核酸配列同一性計算の例として、表4及び5は「PRO−DNA」と表記した核酸配列に対する「比較DNA」と表記した核酸配列の%核酸配列同一性をどのように計算するかを示しており、ここで「PRO−DNA」は目的の仮説的PRO−コード核酸配列を示し、「比較DNA」は目的の「PRO−DNA」核酸分子を比較する相手である核酸分子のヌクレオチド配列を示し、そして「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。特段の記載が無い限り、本明細書で使用する全ての%核酸配列同一性の値はALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前のパラグラフにおいて記載した通りに得られる。
本発明は又PRO57290ポリペプチドをコードする核酸分子であり、そして、本明細書において定義した完全長PRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄の条件の下にハイブリダイズすることができるPRO57290変異体ポリヌクレオチドを提供する。PRO57290変異体ポリヌクレオチドによりコードされるものであってよい。
「完全長コーディング領域」という用語は、PRO57290ポリペプチドをコードする核酸に言及して使用する場合は、本発明の完全長PRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を指す(これは添付図面において開始〜終止コドンに示される場合が多い)。「完全長コーディング領域」という用語は、ATCC寄託核酸に言及して使用する場合は、ATCCに寄託されたベクター内に挿入されるcDNAのPRO57290ポリペプチドコード部分を指す(これは添付図面において開始〜終止コドンに示される場合が多い)。
「単離された」とは、本明細書において開示する種々のポリペプチドを説明するために用いる場合は、その天然の環境の成分中から同定及び分離及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、ポリペプチドの診断又は治療上の使用を典型的に妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含してよい。本発明は(1)スピニングカップシーケネーターを用いてN末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、又は、(2)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下のSDS−PAGEによる均質性となるように、ポリペプチドが精製されることを可能とする。単離されたポリペプチドは組み換え細胞内のインサイチュのポリペプチドを包含するが、その理由はPRO57290ポリペプチドの天然の環境の成分の少なくとも1つが存在しないためである。しかしながら通常は単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により製造される。
「単離された」PRO57290ポリペプチドコード核酸又は他のポリペプチドコード核酸はポリペプチドコード核酸の天然の原料において通常それが付随している夾雑核酸分子少なくとも1つから識別され、分離される核酸分子である。単離されたポリペプチドコード核酸分子は自然界にそれが存在する形態又は状態以外のものである。従って単離されたポリペプチドコード核酸分子は天然の細胞内にそれが存在する場合の特定のポリペプチドコード核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、例えば核酸分子が天然の細胞の場合とは異なる染色体位置にある場合に通常ポリペプチドを発現する細胞に含有されるポリペプチドコード核酸分子を包含する。
「制御配列」という用語は特定の宿主生物中の作動可能に連結したコーディング配列の発現の為に必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に適する制御配列はプロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することがわかっている。
核酸はそれが別の核酸配列との機能的関連性の内部におかれる場合に「作動可能に連結」されている。例えばプレ配列又は分泌リーダーに関わるDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白として発現される場合にはポリペプチドに関するDNAに作動可能に連結しており;プロモーター又はエンハンサーはそれが配列の転写に影響する場合にはコーディング配列に作動可能に連結しており;又は、リボソーム結合部位はそれが翻訳を促進するように位置付けられている場合にコーディング配列に作動可能に連結している。一般的に「作動可能に連結した」とは、連結されるDNA配列が隣接しており、そして、分泌リーダーの場合は隣接し、そして読み込み期にある。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の慣行に従って使用する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」とは当業者が容易に決定できるものであり、一般的にプローブ長、洗浄温度及び塩濃度に依存した実験的計算である。一般的により長いプローブほど適切なアニーリングのためにはより高温を必要とし、より短いプローブほどより低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般的には、相補鎖が環境中にその融点より低温で存在する場合は変性したDNAが再アニーリングする能力に依存している。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用できる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントとする傾向があり、より低い温度はその傾向が小さい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに関する追加的な詳細及び説明については、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular
Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照のこと。
Biology,Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照のこと。
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」とは、本明細書において定義する場合は、(1)低いイオン強度及び高い洗浄温度、例えば0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを50℃において使用するか;(2)ハイブリダイゼーションの間は変性剤、例えばホルムアミド、例えば50%(v/v)ホルムアミド+0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5+750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを42℃で用いるか;又は(3)50%ホルミアミド、5xSSC(0.75MNaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5xDenhardt溶液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS及び10%デキストランスルフェートを42℃で使用し、そして洗浄は42℃において0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)及び50%ホルムアミド中55℃、その後55℃におけるEDTA含有0.1xSSCよりなる高ストリンジェンシー洗浄条件を用いるものとして特定してよい。
「中等度にストリンジェントな条件」とは、Sambrook et al.,Molecular Cloning;A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989による説明として特定してよく、そして、上記したものより低ストリンジェントな洗浄溶液及びハイブリダイゼーションの条件(例えば温度、イオン強度及び%SDS)の使用を包含する。中等度にストリンジェントな条件の例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMNaCl、15mMクエン酸3ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%デキストランスルフェート及び20mg/ml変性攪拌サケ精子DNAを含む溶液中37℃での一夜のインキュベーション及びその後の約37〜50℃における1xSSC中フィルターの洗浄である。プローブ長等のようなファクターを適合させるために必要に応じて温度、イオン強度等を調節する方法は当業者の知る通りである。
「エピトープタグ付けされた」という用語は本明細書においては、「タグポリペプチド」に融合されたPRO57290ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは対応する抗体が作成できるエピトープを提供するために十分な残基を有し、かつ、融合相手のポリペプチドの活性を妨害しないように十分短い。タグポリペプチドは好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないほど高度にユニークなものである。適当なタグポリペプチドは一般的に少なくとも6アミノ酸残基、そして通常は約8〜50アミノ酸残基(好ましくは約10〜20アミノ酸残基)を有する。
「活性な」又は「活性」とは本明細書の目的のためにはネイティブ又は天然に存在するPRO57290ポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持しているPRO57290ポリペプチドの形態を指し、ここで、「生物学的」活性とは、ネイティブ又は天然に存在するPRO57290ポリペプチドにより保有される抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力以外のネイティブ又は天然に存在するPRO57290ポリペプチドにより誘発される生物学的機能(抑制性又は促進性の何れか)を指し、そして、「免疫学的」活性とは、ネイティブ又は天然に存在するPRO57290ポリペプチドにより保有される抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を指す。
「アンタゴニスト」という用語は[特段の記載が無い限り]最も広範な意味において使用され、そして本明細書に開示するネイティブのPRO57290ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、抑制又は中和する何れかの分子を包含する。同様に、「アゴニスト」という用語は[特段の記載が無い限り]最も広範な意味において使用され、そして本明細書に開示するネイティブのPRO57290ポリペプチドの生物学的活性を模倣する何れかの分子を包含する。適当なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特にネイティブのPRO57290ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小型有機分子等のアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体フラグメント、フラグメント又はアミノ酸配列変異体を包含する。PRO57290ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための方法はPRO57290ポリペプチドを候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子に接触させること、及び、PRO57290ポリペプチドに通常付随している1つ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含んでよい。
「治療する」又は「治療」又は「緩解」とは治療的な施療及び予防的又は予防的な手段の両方を指し、ここで目的は標的の病的状態又は障害を予防するか緩徐化(低減)することである。治療を必要とする被験体は既に疾患を有するか、又は、疾患に罹患し易いか、又は疾患を予防すべきものであってよい。
「長期」投与とは長期間に渡り初期の治療効果(活性)を維持するために短期の様式とは逆の持続的な様式における薬剤の投与を指す。「間歇的」投与は中断無く連続的に行われるのではなく、むしろ周期的な性質を有する治療である。
「哺乳類」とは治療の目的のためには、哺乳類に分類される何れかの動物、例えばヒト、げっ歯類、例えばラット又はマウス、家畜及び牧場動物及び動物園、競技用又は愛玩用の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
別の治療薬1つ以上と「組み合わせた」投与は同時(併用)及び何れかの順序の連続投与を包含する。
「担体」とは本明細書においては、使用する用量及び濃度において曝露対象となる細胞又は哺乳類に対して非毒性である製薬上許容しうる担体、賦形剤又は安定化剤を包含する。生理学的に許容される担体は水性のpH緩衝溶液である場合が多い。生理学的に許容される担体の例は緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン;単糖類、2糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストリン;キレート形成剤、例えばEDTA;糖アルコール、例えばマンニトール及びソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;及び/又はノニオン系界面活性剤、例えばTWEENTM、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICSTMを包含する。
「固相」とは本発明の抗体が接着できる非水性のマトリックスを意味する。本明細書において包含される固相の例はガラス(例えば制御細孔ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから部分的又は完全に形成されているものを包含する。文脈に応じて、固相は試験プレートのウエルを包含でき;他の場合は精製カラムである(例えばアフィニティークロマトグラフィーカラム)。この用語は又、米国特許第4,275,149号に記載されているもののような個々の粒子の不連続の固相を包含する。
「リポソーム」とは哺乳類への薬剤(例えばPRO57290ポリペプチド又はそれに対する抗体)の送達の為に有用な脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤の種々の型よりなる小型小胞である。リポソームの成分は生物学的膜の脂質の配置と同様に、二層の形成において共通して配置される。
「小分子」とは約500ダルトン未満の分子量を有するものとして本明細書においては定義する。
本明細書に開示するPRO57290ポリペプチド、抗PRO57290抗体、PRO57290結合オリゴペプチド、PRO57290結合有機分子又はこれ等のアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」とは、特に記載した目的を実施するために十分な量である。「有効量」は記載した目的との関係において実験的、そして日常的に決定してよい。
「治療有効量」という用語は、被験体又は哺乳類における疾患又は障害を「治療する」為に有効な抗PRO57290抗体、PRO57290ポリペプチド、PRO57290結合有機分子又は他の薬剤の量を指す。癌の場合は、薬剤の治療有効量は癌細胞の数を低減するか;腫瘍サイズを低減するか;末梢臓器への癌細胞の浸潤を抑制(即ちある程度まで緩徐化、好ましくは停止)するか;腫瘍の転移を抑制(即ちある程度まで緩徐化、好ましくは停止)するか;腫瘍の生育をある程度まで抑制するか;及び/又は癌に関わる症状1つ以上をある程度まで軽減し得る。「治療する」の本明細書における定義を参照のこと。薬剤が既存の癌細胞の成育を予防及び/又は殺傷する限り、それは細胞増殖抑制性及び/又は細胞毒性であってよい。
「心臓血管、内皮及び脈管形成の障害」、「心臓血管、内皮及び脈管形成の機能不全」、「心臓血管、内皮又は脈管形成の障害」及び「心臓血管、内皮又は脈管形成の機能不全」という表現は互換的に使用され、一つには血管に影響する全身性の障害、例えば真性糖尿病、並びに、動脈、毛細管、静脈及び/又はリンパのような脈管自体の疾患を指す。これには脈管形成及び/又は心臓脈管形成を刺激する適応症、及び、脈管形成及び/又は心臓脈管形成を抑制するものが包含される。このような障害は、例えば動脈疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、高血圧、炎症性血管炎、レイノー病及びレイノー現象、動脈瘤及び動脈再狭窄、静脈及びリンパの障害、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎及びリンパ浮腫、及び他の血管障害、例えば末梢血管疾患、癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫及びリンパ管肉腫、腫瘍脈管形成、外傷、例えば創傷、熱傷及び他の傷害組織、移植物固定、瘢痕、虚血再灌流傷害、関節リウマチ、脳血管疾患、腎疾患、例えば急性腎不全又は骨粗鬆症を包含する。これ等にはまたアンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大及び心不全、例えばCHFが包含される。
「肥大」とは本明細書においては、腫瘍形成の関与しない天然の成長とは無関係の臓器又は構造の嵩の増大として定義される。臓器又は組織の肥大は個々の細胞の嵩の増大(真の肥大)又は組織を構成している細胞の数の増大(過形成)の何れか、又は両方によるものである。心臓のような特定の臓器は出生後短期間で分裂する能力を失う。従って、「心臓肥大」とは成人において同時細胞分裂を伴わない心筋細胞のサイズ及び収縮性蛋白含有量の増大を特徴とする心臓の嵩の増大として定義される。肥大を刺激する原因となるストレスの特徴(例えば心筋梗塞の場合のような増大した前負荷、増大した後負荷、筋細胞の消失、又は収縮性の一次的減圧)が応答の性質を決定する場合に重要な役割を果たしていると考えられる。心臓肥大の早期の段階は通常は筋原線維の大きさ及びミトコンドリアの増大により、並びに、ミトコンドリア及び核の膨大により形態学的には特徴付けられる。この段階において、筋細胞は正常よりも大型となるが、細胞の組織は大半は温存されている。心臓肥大のより進行した段階においては特定の細胞内小器官、例えばミトコンドリアのサイズ又は数の優先的な増大が生じ、そして、新しい収縮エレメントが不規則に細胞の局所的領域に付加される。長時間持続する肥大に関与した細胞は細胞組織のより顕著な破壊を呈し、例えば高度に小葉化した膜を伴った顕著に膨大した核が隣接する筋原線維を排除し、正常なZ線の表示の崩壊をもたらす。「心臓肥大」という用語は伏在する心臓障害とは無関係に心筋の構造的損傷の種々の程度を特徴とするこの状態の進行の全ての段階を包含するために使用される。従って、用語は又、上昇した血圧、大動脈の狭窄又は心筋梗塞のような心臓肥大の発生に寄与する生理学的状態を包含する。
「心不全」とは代謝している組織の条件に対して必要とされる速度では心臓が血液を送液しない心臓機能の異常を指す。心不全は虚血性、先天性、リューマチ性又は特発性の形態を含む多くの要因により誘発され得る。
「鬱血性心不全」(CHF)は進行した病的状態であり、ここでは心臓が末梢組織に対し酸素付加された血液を送達するために十分な心拍出量(経時的に心臓により送液される血液の容量)を供給することがますます不可能になる。CHFが進行するに従い、構造的及び血行力学的な損傷が生じる。これ等の損傷は多様に顕在化するが、1つの特徴的症状は心室の肥大である。CHFは多くの種々の心臓障害の共通した最終結果である。
「心筋梗塞」は一般的に冠動脈のアテローム性動脈硬化症から生じ、混合型の冠動脈血栓を伴う場合が多い。これは2つの主要な型、即ち、心筋の壊死に心室壁の全厚みが関与している経壁梗塞、及び、壊死に心内膜下、壁内心筋、又は両方が関与しており、心室壁から心外膜に至る全行程への伸長を伴わない心内膜下(非経壁)梗塞に分類される。心筋梗塞は血行力学的作用の変化及び心臓の損傷部及び健常部における構造の改変の両方をもたらすことがわかっている。即ち、例えば、心筋梗塞は心臓の最大心拍出量及び一回拍出量を低下させる。更に又、心筋梗塞に付随しているものは間質において生じるDNA合成の刺激並びに罹患していない心臓の領域におけるコラーゲンの形成の増大である。
例えば増大した総末梢抵抗に起因する長期間の高血圧に付された心臓に対して与えられる増大したストレス又は緊張の結果として、心臓肥大には「高血圧」が長く関わっている。慢性的な圧力の過剰負荷の結果として肥大した心室の特徴は減損した拡張期の機能である。Fouad et al.,J.Am.Coll.Cardiol.,4:1500−1506(1984);Smith et al.,J.Am.Coll.Cardiol.,5:869−874(1985)。長期の左心室の弛緩は、正常又は過剰な収縮期機能にも関わらず、早期の本態性高血圧において検出されている。Hartford et al.,Hypertension,6:329−338(1984)。しかしながら、血圧のレベルと心臓肥大の間には緊密な平行性は無い。抗高血圧療法に応答した左心室機能の改善がヒトにおいて報告されているが、利尿剤(ヒドロクロロチアジド)、β−ブロッカー(プロプラノロール)又はカルシウムチャンネルブロッカー(ジルチアゼム)で多様に治療されている患者は拡張期機能の改善を伴わない左心室肥大の病態逆転を示している。Inouye et al.,Am.J.Cardiol.,53:1583−7(1984)。
心臓肥大に伴う別の複合的心臓疾患は「肥大性心筋症」である。この状態は非常に多様な形態学的、機能的及び臨床的な側面により特徴付けられ(Maron et al.,N.Engl.J.Med.,316:780−789(1987);Spirito et al.,N.Engl.J.Med.,320:749−755(1989);Louie and Edwards,Prog.Cardiovasc.Dis.,36:275−308(1994);Wigle et al.,Circulation,92:1680−1692(1995))、その不均質性はそれが全世代の患者に及んでいるという事実により強調されている。Spirito et al.,N.Engl.J.Med.,336:775−785(1997)。肥大性心筋症の原因もまた多様であり、殆ど解明されていない。一般的に筋節性の蛋白をコードする遺伝子における突然変異が肥大性心筋症に関連している。最近のデータによれば、β−ミオシンの重鎖の突然変異が家族性の肥大性心筋症の症例の約30〜40パーセントを占めることが示唆されている。Watkins et al.,N.Engl.J.Med.,326:1108−1114(1992);Schwartz et al.,Circulation,91:532−540(1995);Marian and Roberts,Circulation,92:1336−1347(1995);Thierfelder et
al.,Cell,77:701−712(1994);Watkins et al.,Nat.Gen.,11:434−437(1995)。β−ミオシン重鎖以外に、遺伝子突然変異の他の位置には心臓トロポニンT、アルファトポミオシン、心臓ミオシン結合蛋白C、必須ミオシン軽鎖及び調節ミオシン軽鎖が包含される。Malik and
Watkins,Curr.Opin.Cardiol.,12:295−302(1997)を参照のこと。
al.,Cell,77:701−712(1994);Watkins et al.,Nat.Gen.,11:434−437(1995)。β−ミオシン重鎖以外に、遺伝子突然変異の他の位置には心臓トロポニンT、アルファトポミオシン、心臓ミオシン結合蛋白C、必須ミオシン軽鎖及び調節ミオシン軽鎖が包含される。Malik and
Watkins,Curr.Opin.Cardiol.,12:295−302(1997)を参照のこと。
弁上部「大動脈狭窄症」は上行大動脈の狭窄を特徴とするが、他の動脈、例えば肺動脈も罹患する場合がある遺伝性の血管障害である。未治療の大動脈狭窄は心筋の肥大及び最終的には心不全及び死亡の原因となる上昇した心内圧力をもたらす場合がある。この障害の病因は完全には解明されていないが、内側平滑筋の肥大及び恐らくは過形成がこの障害の顕著な側面である。エラスチン遺伝子の分子変異体が大動脈狭窄の発症及び病因に関与していると報告されている。1997年7月22日発行の米国特許第5,650,282号。
「弁膜逆流」は心臓の弁の障害をもたらす心臓疾患の結果として生じる。種々の疾患、例えばリューマチ熱は弁のオリフィスの収縮又は引き離しをもたらす場合があるが、他の疾患は心内膜炎、心内膜又は房室オリフィスの内膜の炎症及び心臓手術の原因となる場合がある。弁狭窄部の狭小化および弁の閉鎖欠陥のような欠陥は心臓腔中の血液の蓄積又は弁を通過する血液の逆流をもたらす。是正しない場合、長期の弁の狭窄又は不全により心臓肥大及び関連する心筋の損傷がもたらされ、それにより最終的には弁の交換が必要となる場合がある。
「免疫関連疾患」という用語は哺乳類の免疫系の要素が哺乳類における罹患に対し、誘発、媒介又は他の態様で寄与する疾患を意味する。同様に包含されるものは免疫応答の刺激又は介入が疾患の進行に対して緩解作用を有する疾患である。この用語に包含されるものは免疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、新生物形成等である。
「T細胞媒介疾患」という用語はT細胞が哺乳類における罹患を直接又は間接的に媒介するか、他の態様において寄与する疾患を意味する。T細胞媒介疾患は細胞媒介作用、リンホカイン媒介作用等に関連し得、そしてB細胞が例えばT細胞の分泌したリンホカインにより刺激される場合にはB細胞関連作用にも関連している。
免疫関連及び一部は免疫又はT細胞媒介性である炎症性の疾患は、全身エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身硬化症(硬皮症)、特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症)、自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症)、甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパシー又はギラン−バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、肝胆疾患、例えば感染性肝炎(A、B、C、D、E型及び他の非肝向性のウィルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性結腸炎、クローン病)、グルテン感受性腸症及びホイップル病、自己免疫性又は免疫媒介性の皮膚疾患、例えば水疱性疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、又は移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主病を包含する。感染性疾患はウィルス疾患、例えばAIDS(HIV感染)、A、B、C、D及びE型肝炎、ヘルペス等、細菌感染症、カビ感染症、原虫感染症及び寄生虫感染症を包含する。
「自己免疫疾患」とは本明細書においては個体の自身の組織又は臓器又は同時分離物から生じるかそれを指向する疾患又は障害又はその顕在化又はそれより生じる状態である。これ等の自己免疫及び炎症性の障害の多くにおいて、多くの臨床上及び研究用のマーカーが存在し得、例えば限定しないが、高ガンマグロブリン血症、自己抗体高値、抗原−抗体複合体組織付着、コルチコステロイド又は免疫抑制剤治療の奏功、及び罹患組織におけるリンパ様細胞の凝集が挙げられる。B細胞媒介自己免疫疾患の何れの一理論にも制約されないが、B細胞は自己抗体生産、免疫複合体形成、樹状及びT細胞の活性化、サイトカイン合成、直接のケモカイン放出及び異所性のリンパ球新生のための病巣の提供を含む多くの機構的経路を介してヒトの自己免疫疾患において病原性作用を呈すると考えられる。これ等の経路の各々が自己免疫疾患の病理において多用な程度で関与していると考えられる。
「自己免疫疾患」は臓器特異的疾患であり得る(即ち、免疫応答が内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系のような臓器系に特異的に指向される)か、又は、複数の臓器系を罹患させることができる全身性の疾患(例えば全身エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、多発性筋炎等)であり得る。好ましいそのような疾患は自己免疫リウマチ学的障害(例えば慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、硬皮症、SLR及びループス腎炎のような狼瘡、多発性筋炎/皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群及び乾癬性関節炎)、自己免疫性の胃腸及び肝臓の障害(例えば炎症性腸疾患(例えば潰瘍性結腸炎及びクローン病)、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎及びセリアック病)、血管炎(例えばANCA関連血管炎、例えばチャーグ−ストラウス血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症及び多発性動脈炎)、自己免疫性神経障害(例えば多発性硬化症、眼球クローヌス筋クローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病及び自己免疫性多発ニューロパシー)、腎障害(例えば糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群及びバージャー病)、自己免疫性皮膚障害(例えば乾癬、蕁麻疹、膨疹、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡及び皮膚エリテマトーデス)、血液学的障害(例えば血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病及び自己免疫性溶血性貧血)、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例えば内耳疾患及び聴覚消失)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植及び自己免疫内分泌障害(例えば糖尿病関連自己免疫性疾患、例えばインスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患(例えばグレーブス病及び甲状腺炎))を包含する。より好ましいこのような疾患は例えば関節リウマチ、潰瘍性結腸炎、ANCA関連血管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、IDDM、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎を包含する。
場合により上記したものを包含する本明細書において定義する他の自己免疫疾患の特定の例は限定しないが、関節炎(急性及び慢性、関節リウマチ、例えば若年性発症型の関節リウマチ及びリューマチ様滑膜炎の段階、痛風又は痛風性関節炎、急性免疫学的関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、II型コラーゲン誘導関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、閉経期関節炎、エストロゲン枯渇関節炎及び強直性脊椎炎/リウマチ様脊椎炎)、自己免疫性リンパ増殖性疾患、炎症性増殖亢進性皮膚疾患、乾癬、例えばプラーク乾癬、液状乾癬、膿疱性乾癬及び爪の乾癬、アトピー、例えばアトピー性疾患、例えば花粉症及びジョブ症候群、皮膚炎、例えば接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、膨疹、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触性皮膚炎及びアトピー性皮膚炎、X連鎖高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例えば慢性自己免疫性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、毒性皮膚表皮壊死症、硬皮症(全身硬皮症を含む)、硬化症、例えば全身硬化症、多発性硬化症(MS)例えば脊髄視覚MS、一次性進行性MS(PPMS)及び回帰性弛張性MS(RRMS)、進行性全身硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎(NMO)、炎症性腸疾患(IBD)(例えばクローン病、自己免疫媒介胃腸疾患、胃腸炎症、結腸炎、例えば潰瘍性結腸炎、結腸潰瘍、微視的結腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、結腸ポリポーシス、壊死性腸炎及び経壁結腸炎、及び自己免疫性炎症性腸疾患)、腸炎症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群、例えば成人又は急性の呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、ブドウ膜の全体又は部分の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液学的障害、移植片対宿主病、血管性水腫、例えば遺伝性の血管性水腫、髄膜炎の場合等の脳神経損傷、妊娠性ヘルペス、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒、自己免疫性早発性卵巣不全、自己免疫状態による突然難聴、IgE媒介疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性及びアトピー性の鼻炎、脳炎、例えばラスムッセン脳炎及び辺縁及び/又は脳幹の脳炎、ブドウ膜炎、例えば前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫性ブドウ膜炎、腎症の症候群を伴うか伴わない糸球体腎炎(GN)、例えば慢性又は急性の糸球体腎炎、例えば一次性GN、免疫媒介GN、膜性GN(膜性腎症)、特発性膜性GN又は特発性膜性腎症、膜性又は膜増殖性のGN(MPGN)、例えばI型及びII型、及び急速進行性GN(RPGN)、増殖性腎炎、自己免疫性多内分泌腺不全、亀頭炎、例えば形質細胞亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状性苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前悪性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性の状態及び応答、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギー、稀少なアレルギー性障害、例えば肥満細胞症、アレルギー性反応、湿疹、例えばアレルギー性又はアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、発汗障害性湿疹及び水疱性掌蹠湿疹、喘息、例えば細気管支喘息、気管支喘息、及び自己免疫性喘息、T細胞の浸潤の関与する状態及び慢性の炎症応答、外来性抗原、例えば妊娠中の胎児A−B−O血液群に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全、狼瘡、例えばループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス及び円板状エリテマトーデス、脱毛性ループス、SLE、例えば皮膚SLE又は亜急性皮膚SLE、新生児ループス症候群(NLE)及び播種性エリテマトーデス、若年発症(I型)真性糖尿病、例えば小児IDDM、成人発症真性糖尿病(II型)、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、糖尿病性網膜炎、糖尿病性腎症、糖尿病性結腸炎、糖尿病性大動脈障害、サイトカイン及びTリンパ球により媒介される急性又は遅発型の過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばリンパ腫様肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎類、例えば血管炎、大型血管の血管炎(例えばリウマチ性多発性筋炎及び巨細胞性(高安)動脈炎)、中型血管の血管炎(川崎病及び結節性多発性動脈炎/結節性動脈周囲炎)、微視的多発性血管炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏症血管炎、壊死性血管炎、例えば全身性壊死性血管炎及びANCA関連血管炎、例えばチャーグ‐ストラウス血管炎又は症候群(CSS)及びANCA関連の小型血管の血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームズ陽性貧血、ダイアモンド‐ブラックファン貧血、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例えば自己免疫性溶血性貧血(AIHA)、悪性貧血(悪性の貧血)、アジソン病、先天性低形成貧血又は形成不良(PRCA)、第VIII因子欠損、A型血友病、自己免疫性好中球減少症、血球減少症、例えば汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出が関与する疾患、CNS炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多臓器傷害症候群、例えば敗血症、外傷又は出血に二次的なもの、抗原−抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、神経中膜炎、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡、天疱瘡(例えば尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、粘膜天疱瘡−膜類天疱瘡及び紅斑性天疱瘡)、自己免疫性多発性内分泌腺症、ライター病又は症候群、自己免疫性状態に起因する熱傷害、子癇前症、免疫複合体障害、例えば免疫複合体腎炎、抗体媒介腎炎、神経炎症性障害、多発性ニューロパシー、慢性ニューロパシー、例えばIgM多発性ニューロパシー又はIgM媒介ニューロパシー、血小板減少症(例えば心筋梗塞患者により発症)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、輸血後の紫斑病(PTP)ヘパリン誘導血小板減少症及び自己免疫性又は免疫媒介性の血小板減少症、例えば特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、例えば慢性又は急性のITP、強膜炎、例えば特発性角膜強膜炎、上強膜炎、精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、例えば自己免疫性精巣炎及び卵巣炎、一次性甲状腺機能低下症、上皮小体機能低下症、自己免疫性内分泌疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺症候群、例えば自己免疫性多腺症候群、例えばI型(又は多腺性内分泌障害症候群)、新生物随伴症候群、例えば神経学的新生物随伴症候群、例えばランバート−イートン筋無力症候群又はイートン−ランバート症候群、スティッフマン症候群、スティッフパーソン症候群、脳脊髄炎、例えばアレルギー性脳脊髄炎又はアレルギー性の脳脊髄炎および実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性、神経筋緊張症、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋クローヌス症候群(OMS)及び感覚神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫性慢性活動性肝炎、肺炎、例えばリンパ様間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)vsNSIP、ギラン‐バレー症候群、バージャー病(IgA腎症)、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱症、一過性棘細胞離開性皮膚症、硬変、例えば原発性胆汁性肝硬変及び肺硬変、自己免疫性腸症候群、セリアック病、セリアックスプルー(グルテン性腸症)、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、例えば混合型クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS;ルーゲーリック病)、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性聴覚消失、多発性軟骨炎、例えば難治性又は回帰後又は回帰性の多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、コーガン症候群/非梅毒性間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病/症候群、しゅさ自己免疫症、帯状疱疹関連疼痛、アミロイド症、非癌性リンパ球増加症、原発性リンパ球増加症、例えばモノクローナルB細胞リンパ球増加症(例えば良性のモノクローナル高ガンマグロブリン血症及び重大性不明のモノクローナル高ガンマグロブリン血症、MGUS)、末梢ニューロパシー、新生物随伴症候群、チャンネル症、例えば癲癇、偏頭痛、不整脈、筋肉障害、聴覚消失、視力消失、周期的片麻痺及びCNSのチャンネル症、自閉症、炎症性筋障害、巣状又は分節性又は巣状分節性の糸球体硬化症(FSGS)、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性血液学的障害、線維筋肉痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例えば自己免疫性脱髄性疾患及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道運動不全、強指症及び毛細血管拡張症)、例えば抗精子抗体による男性及び女性の自己免疫性不妊、混合型結合組織疾患、シャーガス病、リューマチ熱、再発性流産、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び線維形成性肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、らい病、マラリア、寄生虫疾患、例えばリーシュマニア症、トリパノソーマ症(kypanosomiasis)、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、キャプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、播種性間質性肺線維症、間質性肺線維症、線維形成性縦隔炎、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性又は慢性)又はフックス毛様体炎、ヘノッホ‐シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)感染症、SCID、後天性免疫不全症候群(AIDS)、エコーウィルス感染症、敗血症(全身炎症性応答症候群(SIRS))、内毒素血症、膵臓炎、サイロニン中毒、パルボウィルス感染症、風疹ウィルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バーウィルス感染症、おたふくかぜ、エバンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シドナム舞踏病、後連鎖球菌性腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄ろう、脈絡膜炎、巨細胞性多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、結膜炎、例えば春季カタル、乾性角結膜炎及び流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、最小変化腎症、良性家族性及び虚血再灌流性の傷害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道/肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害(脳血管不全)、例えば動脈硬化性の脳症及び動脈硬化性の網膜症、精液形成欠如、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リューマチ熱、ハマン−リッチ病、脊髄末梢神経聴覚消失、発作性ヘモグロビン尿症、性機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少症、感染性単核細胞症、横断脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、癒着性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵臓炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ド・ケルヴァン甲状腺炎、
後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、リンパ小節胸腺炎、白斑、毒性ショック症候群、食物中毒、T細胞浸潤の関与する状態、白血球接着不全、サイトカイン及びTリンパ球により媒介される急性又は遅発型の過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出の関与する疾患、多臓器傷害症候群、抗原−抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、自己免疫性多発性内分泌腺症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ病、混合型結合組織病、ネフローゼ症候群、インスリン炎、多内分泌腺不全、自己免疫性多腺症候群、例えばI型多腺症候群、成人発症性特発性上皮小体機能低下症(AOIH)、心筋症、例えば拡張性心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性の静脈洞炎、急性又は慢性の静脈洞炎、篩骨洞、前頭洞、上顎洞又は蝶形骨洞の洞炎、アレルギー性洞炎、好酸球関連障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤性好酸球増加症、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、局所的肺好酸球増加症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫又は好酸球含有肉芽腫、アナフィラキシー、脊椎関節症、セロネガティブ脊椎関節症、多内分泌腺自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性の粘膜皮膚カンジダ症、バートン症候群、幼児の一過性低ガンマグロブリン血症、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張、コラーゲン疾患に関連する自己免疫性障害、リューマチ、例えば慢性関節リウマチ、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能不全、組織傷害、心臓血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、大脳虚血及び脈管形成に伴う疾患、アレルギー性過敏障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性の炎症性要素を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系の炎症性障害、眼及び眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、睡眠発作、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内膜過形成、消化性潰瘍、心弁膜炎および子宮内膜症を包含する。
後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、リンパ小節胸腺炎、白斑、毒性ショック症候群、食物中毒、T細胞浸潤の関与する状態、白血球接着不全、サイトカイン及びTリンパ球により媒介される急性又は遅発型の過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出の関与する疾患、多臓器傷害症候群、抗原−抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、自己免疫性多発性内分泌腺症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ病、混合型結合組織病、ネフローゼ症候群、インスリン炎、多内分泌腺不全、自己免疫性多腺症候群、例えばI型多腺症候群、成人発症性特発性上皮小体機能低下症(AOIH)、心筋症、例えば拡張性心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性の静脈洞炎、急性又は慢性の静脈洞炎、篩骨洞、前頭洞、上顎洞又は蝶形骨洞の洞炎、アレルギー性洞炎、好酸球関連障害、例えば好酸球増加症、肺浸潤性好酸球増加症、好酸球増加症−筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、局所的肺好酸球増加症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫又は好酸球含有肉芽腫、アナフィラキシー、脊椎関節症、セロネガティブ脊椎関節症、多内分泌腺自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性の粘膜皮膚カンジダ症、バートン症候群、幼児の一過性低ガンマグロブリン血症、ヴィスコット‐オールドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張、コラーゲン疾患に関連する自己免疫性障害、リューマチ、例えば慢性関節リウマチ、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能不全、組織傷害、心臓血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、大脳虚血及び脈管形成に伴う疾患、アレルギー性過敏障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性の炎症性要素を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系の炎症性障害、眼及び眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導毒性、睡眠発作、急性重篤炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内膜過形成、消化性潰瘍、心弁膜炎および子宮内膜症を包含する。
抗PRO57290結合有機分子の「生育抑制量」とはインビトロ又はインビボのいずれかで細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の生育を抑制することができる量である。新生物細胞生育を抑制する目的のための抗PRO57290抗体、PRO57290ポリペプチド、PRO57290結合有機分子の「生育抑制量」は実験的に、そして日常的に決定してよい。
抗PRO57290抗体、PRO57290ポリペプチド、PRO57290結合オリゴペプチド又はPRO57290結合有機分子の「細胞毒性量」とはインビトロ又はインビボのいずれかで細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の破壊をもたらすことができる量である。新生物細胞生育を抑制する目的のための抗PRO57290抗体、PRO57290結合有機分子の「細胞毒性量」は実験的に、そして日常的に決定してよい。
「抗体」という用語は最も広範な意味において使用され、そして特に、例えば単一の抗PRO57290抗体モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を包含する)、多エピトープ性の特異性を有する抗PRO57290抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗PRO57290抗体、及び、所望の生物学的又は免疫学的活性を示す限り抗PRO57290抗体のフラグメント(後述)を包含する。「免疫グロブリン」(Ig)という用語は本明細書においては抗体と互換的に使用する。
「単離された抗体」とは、その天然の環境の成分中から同定及び分離及び/又は回収されているものを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、抗体の診断又は治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他の蛋白性又は非蛋白性の溶質を包含してよい。本発明は(1)Lowry法により測定した場合に抗体の95重量%超まで、最も好ましくは99重量%超まで、(2)スピニングカップシーケネーターを用いてN末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度まで、又は、(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下のSDS−PAGEによる均質性となるように、抗体が精製されることを可能とする。単離された抗体は組み換え細胞内のインサイチュの抗体を包含するが、その理由は抗体の天然の環境の成分少なくとも1つが存在しないためである。しかしながら通常は単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により製造される。
基本的な4鎖抗体単位は2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖よりなるヘテロ4量体の糖蛋白である(IgM抗体はJ鎖と呼ばれる追加的ポリペプチドと共に基本的なヘテロ4量体単位5つよりなり、従って、10抗原結合部位を含有するのに対し、分泌IgA抗体は重合してJ鎖と共に基本的4鎖単位2〜5つを含む多価の組立物を形成することができる)。IgGの場合は、4鎖単位は一般的に約150,000ダルトンである。各L鎖はジスルフィド共有結合1つによりH鎖に連結されているのに対し、2つのH鎖はH鎖のアイソタイプに応じてジスルフィド結合1つ以上により相互に連結されている。各H及びL鎖はまた規則的な間隔で鎖内ジスルフィド架橋を有する。各H鎖はN末端において可変ドメイン(VH)とその後の3つの定常ドメイン(CH)を各α及びγ鎖について、そして4つのCHドメインをμ及びεアイソタイプについて有している。各L鎖はN末端において可変ドメイン(VL)とその後の定常ドメイン(CL)をそのもう一端において有している。VLはVHとアラインされ、そしてCLは重鎖の最初の定常ドメイン(CH1)とアラインされる。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。VHとVLの対形成により単一の抗原結合部位が形成される。種々のクラスの抗体の構造及び特性については、例えばBasic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel
P.Stites, Abba I.Terr and Tristram G.Parslow (eds.),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,p.71, Chapter 6を参照のこと。
P.Stites, Abba I.Terr and Tristram G.Parslow (eds.),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,p.71, Chapter 6を参照のこと。
何れかの脊椎動物種に由来するL鎖をその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ及びラムダと称される2つの明確に異なった型の1つに割り付けることができる。その重鎖の定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラス又はアイソタイプに割り付けることができる。免疫グロブリンには5クラス、即ちIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと表記される重鎖を有する。γ及びαのクラスは更に、CH配列および機能の比較的小さい相違に基づいてサブクラスに分類され、例えばヒトは以下のサブクラス、即ち、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2を発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインの特定のセグメントは抗体の間で配列が広範に異なっているという事実を指す。Vドメインは抗原の結合を媒介し、そして、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を決定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの110アミノ酸スパンに渡って均一に分布していない。むしろ、V領域は各々が9〜12アミノ酸長の「超可変領域」と称される究極的な可変性のより短い領域によって分離された15〜30アミノ酸のフレームワーク領域(FR)と称される比較的不変のストレッチよりなる。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、βシート構造を連結する、そして一部の場合においてはその部分を形成するループを形成する3つの超可変領域により連結されたβシート配置を大半が採用している4つのFRを含む。各鎖の超可変領域はFRにより近接して保持され、そして、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)参照)。定常ドメインは抗原に対する抗体の結合に直接関与していないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞内細胞毒性(ADCC)への抗体の参加を示す。
「超可変領域」という用語は本明細書においては、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に「相補性決定領域」即ち「CDR」に由来するアミノ酸残基(例えばVL内の概ね残基24〜34(L1)、50〜56(L2)及び89〜97(L3)及びVH内の概ね1〜35(H1)、50〜65(H2)及び95〜102(H3);Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,Public
Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))及び/又は「超可変ループ」に由来する残基(例えばVL内の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)及び91〜96(L3)及びVH内の26〜32(H1)、53〜55(H2)及び96〜101(H3);Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901〜917(1987))からなる。
Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))及び/又は「超可変ループ」に由来する残基(例えばVL内の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)及び91〜96(L3)及びVH内の26〜32(H1)、53〜55(H2)及び96〜101(H3);Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901〜917(1987))からなる。
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は僅かな量において存在しえる可能な天然に存在する突然変異を除き同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に指向されている。更に又、さまざまな決定基(エピトープ)に対して指向されたさまざまな抗体を包含するポリクローナル抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向されている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の抗体の混在を伴うことなく合成される点において好都合である。修飾語の「モノクローナル」とは何れかの特定の方法による抗体の製造を必要とするものとみなしてはならない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体はKohler et al.,Nature,256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法により製造するか、又は、細菌、真核生物又は植物の細胞において組み換えDNA法を用いて作成してもよい(例えば米国特許第4,816,567号参照)。「モノクローナル抗体」は例えばClackson et al.,Nature,352:624−628(1991)及びMarks et al.,J.Mol.Biol.,222:581−597(1991)に記載の手法を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分は特定の種から誘導されるか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一又は相同であるが、鎖の残余部分は別の種から誘導されるか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに、所望の生物学的活性を示す限りにおいてそのような抗体のフラグメントを含む(米国特許第4,816,567号;及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855(1984)参照)。本明細書における目的のキメラ抗体は非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、類人猿)から誘導された可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を包含する。
「未損傷の」抗体とは、抗原結合部位並びにCL及び少なくとも重鎖定常ドメインCH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインはネイティブの配列の定常ドメイン(例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは未損傷の抗体は1つ以上のエフェクター機能を有する。
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の一部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変の領域を含む。抗体フラグメントの例はFab、Fab’、F(ab’)2及びFvフラグメント;ダイアボディ;線状抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2;Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057−1062[1995]参照);一本鎖抗体分子;及び抗体フラグメントから形成された多重特異性の抗体を包含する。
抗体のパパイン消化により「Fab」フラグメントと称される2つの同一の抗原結合フラグメント、及び、容易に結晶化する能力を反映した表記である残余の「Fc」フラグメントが形成される。FabフラグメントはH鎖の可変領域(VH)に沿った全L鎖及び1つの重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)よりなる。各Fabフラグメントは抗原結合に関しては1価であり、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により単一の大型のF(ab’)2フラグメントが生じ、これは2価の抗原結合活性を有する2つのジスルフィド結合したFabフラグメントに概ね相当し、そしてなお抗原に交差結合することができる。Fab’フラグメントは抗体のヒンジ領域に由来するシステインを1つ以上包含するCH1ドメインのカルボキシ末端の追加的な数残基を有することによりFabフラグメントとは異なっている。Fab’−SHは本明細書においては定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているFab’に対する表記である。F(ab’)2抗体フラグメントは当初は間にヒンジシステインを有するFab’フラグメントの対として製造された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
Fcフラグメントはジスルフィドで共に保持された両方のH鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はFc領域における配列により決定され、この領域は細胞の特定の型に存在するFc受容体(FcR)により認識される部分でもある。
「Fv」は完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは堅固な非共有結合の会合型としての1つの重鎖及び1つの軽鎖の可変領域ドメインの2量体よりなる。これ等の2ドメインの折り畳みにより、6つの超可変ループ(3ループは各々H及びL鎖由来)が生じ、これ等は抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、そして抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な僅か3つのCDRのみを含むFvの半分)であっても、全結合部位よりも低親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
「sFv」又は「scFv」とも略記される「一本鎖Fv」は、連結されて単一のポリペプチド鎖となっているVH及びVL抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、sFvポリペプチドは更に、抗原結合の為の望ましい構造をsFvが形成できるようにするVH及びVLドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。sFvに関する考察はPluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315(1994);Borrebaeck 1999,後出を参照のこと。
「ダイアボディ」という用語は、Vドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されることにより2価のフラグメント、即ち2つの抗原結合部位を有するフラグメントが生じるようにVHとVLの間により短いリンカー(約5〜10残基)と共にsFvフラグメント(前パラグラフ参照)を形成することにより製造される小型抗体フラグメントを指す。2重特異性のダイアボディは2つの「クロスオーバー」sFvフラグメントのヘテロ2量体であり、この場合、2つの抗体のVH及びVLドメインは異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは例えばEP404,097;WO93/11161;及びHollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)により詳細に記載されている。
非ヒト(例えばげっ歯類)抗体の「ヒト化」型は非ヒト抗体から誘導された最小の配列を含有するキメラ抗体である。大部分に関しては、ヒト化抗体はレシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の抗体の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)の残基が相当する非ヒト残基により置き換えられる。更に又、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含んでよい。これらの修飾は抗体の性能を更に精密化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、その場合、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてFRの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものとなる。ヒト化抗体は場合によりまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含むことになる。更に詳細な説明は、Jones et al.,Nature 321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593−596(1992)を参照のこと。
「種依存性抗体」、例えば哺乳類非ヒトIgE抗体は、第1の哺乳類動物種由来の抗原に対して、第2の哺乳類動物種由来のその抗原の相同体に対するよりも、より強力な結合親和性を有する抗体である。通常は、種依存性の抗体はヒト抗原に対して「特異的に結合する」(即ち、約1x10−7M以下、好ましくは約1x10−8M以下、そして最も好ましくは約1x10−9M以下の結合親和性(Kd)値を有する)が、第2の非ヒト哺乳類種由来の抗原の相同体に対しては、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも、少なくとも約50倍、又は少なくとも約500倍、又は少なくとも約1000倍弱い結合親和性を有する。種依存性抗体は上記した抗体の種々の型の何れかであることができるが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
「PRO57290結合オリゴペプチド」とは本明細書に記載したPRO57290ポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。PRO57290結合オリゴペプチドは知られたオリゴペプチド合成方法を用いて化学合成するか、又は、組み換え技術を用いて製造及び精製してよい。PRO57290結合オリゴペプチドは通常は約5アミノ酸長又はそれ以上、或いは約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100アミノ酸長又はそれ以上、又はそれより長く、ここでこのようなオリゴペプチドは本明細書に記載したPRO57290ポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができる。PRO57290結合オリゴペプチドはよく知られた手法を用いて予定外の実験を行うことなく同定してよい。この点に関し、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドを得るためにオリゴペプチドライブラリをスクリーニングするための手法は当該分野で良く知られている(例えば米国特許第5,556,762号、第5,750,373号、第4,708,871号、第4,833,092号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,689号、第5,663,143号;PCT公開WO84/03506及びWO84/03564;Geysen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81:3998−4002(1984);Geysen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82:178−182(1985);Geysen et al.,in Synthetic Peptides as Antigens,130−149(1986);Geysen et al.,J.Immunol.Meth.,102:259−274(1987);Schoofs et al.,J.Immunol.,140:611−616(1988),Cwirla,S.E.et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:6378;Lowman,H.B. et al.,(1991)Biochemistry,30:10832;Clackson,T.et al.,(1991)Nature,352:624;Marks,J.D.et al.,(1991),J.Mol.Biol.,222:581;Kang,A.S.et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363及びSmith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol.,2:668参照)。
「PRO57290結合有機分子」とは本明細書に記載するPRO57290ポリペプチドに好ましくは特異的に結合する本明細書に定義するオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。PRO57290結合有機分子は知られた方法を用いて同定及び化学合成してよい(例えばPCT公開WO00/00823及びWO00/39585参照)。PRO57290結合有機分子は通常は約2000ダルトン未満の大きさであるか、或いは、約1500、750、500、250又は200ダルトン未満の大きさであり、ここで本明細書に記載するPRO57290ポリペプチドに好ましくは特異的に結合することができるこのような有機分子はよく知られた手法を用いて予定外の実験を行うことなく同定してよい。この点に関し、ポリペプチド標的に結合できる分子を得るために有機分子ライブラリをスクリーニングする手法は当該分野で良く知られている(例えばPCT公開WO00/00823及びWO00/39585参照)。
目的の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的に「結合する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、好ましくは、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が抗原を発現している細胞又は組織をターゲティングする場合の診断薬及び/又は治療薬として有用であり、そして他の蛋白とは有意な交差反応を起こさないような十分な親和性で抗原に結合するものである。「非標的」蛋白への抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合の程度は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析又は放射免疫沈降(RIA)により測定した場合に、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子のその特定の標的蛋白への結合の約10%未満である。標的分子への抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合に関しては、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対して「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的である」という用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な相違がある結合を意味する。特異的結合は例えば、一般的には結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば特異的結合は、標的と同様の対照分子、例えば過剰量の非標識標的との競合により決定できる。この場合、プローブへの標識標的の結合が過剰な未標識標的により競合的に抑制された場合に、特異的結合が示されている。本明細書において使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対して「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的である」という用語は、例えば、少なくとも約10−4M、又は、少なくとも約10−5M、又は、少なくとも約10−6M、又は、少なくとも約10−7M、又は、少なくとも約10−8M、又は、少なくとも約10−9M、又は、少なくとも約10−10M、又は、少なくとも約10−11M、又は、少なくとも約10−12M以上の標的に対するKdを有する分子により示される。「特異的結合」という用語は、分子が何れかの他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。
「PRO57290」を発現する腫瘍細胞の成育を「抑制する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子又は「成長抑制性の」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は適切なPRO57290ポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の測定可能な成育抑制をもたらすものである。PRO57290ポリペプチドは癌細胞の表面上に発現された膜貫通ポリペプチドであってよく、又は、癌細胞により生産及び分泌されるポリペプチドであってよい。好ましい成長抑制性の抗PRO57290抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、適切な対照と比較して20%又はそれより高値、好ましくは約20%〜約50%、更に好ましくは50%又はそれより高値(例えば約50%〜約100%)でPRO57290−発現腫瘍細胞の成育を抑制し、ここで対照は典型的には試験すべき抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子で治療されない腫瘍細胞である。成長抑制は、細胞培養物中、約0.1〜30μg/ml又は約0.5nM〜200nMの抗体濃度において測定することができ、ここで成長抑制は抗体への腫瘍細胞の曝露から1〜10日後に決定される。インビボの腫瘍細胞の成長抑制は種々の方法で決定できる。抗体は約1μg/kg〜約100mg/kg体重において抗PRO57290抗体を投与した場合に抗体の初回投与から約5日〜3ヶ月以内、好ましくは約5〜30日以内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞の増殖の低減がもたらされる場合にインビボで成長抑制性となる。
「アポトーシスを誘導する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、アネキシンVの結合、DNAのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、及び/又は、膜小胞(アポトーシス体と称する)の形成により判断されるプログラムされた細胞死を誘導するものである。細胞は通常は,PRO57290ポリペプチドを過剰発現するものである。好ましくは、細胞は腫瘍細胞、例えば前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎臓、結腸、膀胱の細胞である。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために種々の方法が使用できる。例えば、ホスファチジルセリン(PS)転座は、アネキシン結合により測定でき;DNAフラグメント化はDNAラダー化を介して評価でき;そして、DNAフラグメント化に伴う核/クロマチン縮合は低二倍体細胞の何れかの増大により評価できる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子はアネキシン結合試験において未投与の細胞と相対比較してアネキシン結合の約2〜50倍、好ましくは約5〜50倍、そして最も好ましくは約10〜50倍の誘導をもたらすものである。
抗体の「エフェクター機能」は抗体のFc領域(ネイティブ配列のFc領域又はアミノ酸配列変異体のFc領域)に起因する生物学的活性を指し、そして、抗体アイソタイプと共に変動する。抗体エフェクター機能の例はC1q結合及び補体依存性細胞毒性;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC);貪食作用;細胞表面受容体(例えばB細胞受容体)のダウンレギュレーション;及びB細胞活性化を包含する。
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」即ち「ADCC」とは、特定の細胞毒性細胞(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)に結合している分泌Igにより、これ等の細胞毒性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、そしてその後、細胞毒素により標的細胞を殺傷することができるようになるという細胞毒性の形態を指す。抗体は細胞毒性細胞を「武装」させ、そしてそのような殺傷のために絶対に必要なものである。ADCCを媒介する主要な細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現はRavetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−92(1991)の464ページの表3に総括されている。目的の分子のADCC活性を試験するためには、米国特許第5,500,362号又は第5,821,337号に記載されているようなインビトロのADCC試験を実施してよい。このような試験のための有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞を包含する。代替又は追加的に、目的の分子のADCC活性は例えばClynes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:652−656(1998)に開示されているような動物モデルにおいてインビボで試験してよい。
「Fc受容体」即ち「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を説明する。好ましいFcRはネイティブ配列のヒトFcRである。更に又、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの(γ受容体)であり、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIのサブクラスの受容体を包含し、これ等の受容体のアレル変異体及びオルタナティブスプライス型も包含される。FcγRII受容体はFcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「抑制受容体」)を包含し、これ等はその細胞質ドメインにおいて主に異なっている同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(ITAM)を含有している。抑制受容体FcγRIIBはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ(ITIM)を含有している(Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203−234(1997)の考察M参照)。FcRはRavetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25−34(1994);及びde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330−41(1995)において考察されている。将来同定されるものを含む他のFcRは本明細書においては用語「FcR」に包含される。用語は又胎児への母体IgGの移行の原因となる新生児受容体、FcRnも包含する(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
「ヒトエフェクター細胞」は1つ以上のFcRを発現し、エフェクター機能を示す白血球である。好ましくは、細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、そしてADCCエフェクター機能を示す。ADCCを媒介するヒト白血球の例は末梢血単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞毒性T細胞及び好中球を包含し;PBMC及びNK細胞が好ましい。エフェクター細胞は天然の原料から、例えば血液から単離される。
「補体依存性細胞毒性」即ち「CDC」は補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は同種抗原に結合している(適切なサブクラスの)抗体への補体系の第1成分(C1q)の結合により開始される。補体活性化を試験するためには、例えばGazzano−Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)に記載されているもののようなCDC試験を実施してよい。
「癌」及び「癌性の」という用語は典型的には未調節の細胞の成長を特徴とする哺乳類における生理学的状態を指すか、それを説明するものである。癌の例は限定しないが癌腫、リンパ種、芽腫、肉腫及び白血病を包含する。このような癌のより特定的な例は、扁平上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌(胃腸癌を包含する)、膵臓癌、神経膠芽細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌種及び種々の型の頭部及び頚部の癌並びにB細胞リンパ腫(例えば低等級/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL);小リンパ球性(SL)NHL;中等級/濾胞性NHL;中等級の播種性NHL;高等級免疫芽球性NHL;高等級リンパ芽球性NHL;高等級小型非分割細胞NHL;バルキー疾患NHL;マントル細胞リンパ腫;AIDS関連リンパ腫;及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症);慢性リンパ球性白血病(CLL);急性リンパ芽球性白血病(ALL);ヘアリー細胞白血病;慢性骨髄芽球性白血病;及び移植後のリンパ増殖性障害(PTLD)を包含する。好ましくは、癌はIGF受容体を発現する腫瘍、より好ましくは乳癌、肺癌、結腸直腸癌又は前立腺癌、そして最も好ましくは乳癌又は前立腺癌を含む。
「化学療法剤」とは癌の治療において有用な化合物である。化学療法剤の例はアルキル化剤、例えばチオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド;アルキルスルホネート、例えばブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ;エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミン;アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン);カンプトテシン(例えば合成類似体トポテカン);ブリオスタチン;カリスタチン;CC−1065(例えばアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体);クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(例えば合成類似体、KW−2189及びCB1−TM1);エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチン;スポンジスタチン;窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムブシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチン;抗生物質、例えばエネジン抗生物質(例えばカリケミシン、特にカリケミシンガンマ1I及びカリケミシンオメガI1(例えばAgnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183−186(1994)参照);ジネマイシン、例えばジネマイシンA;ビスホスホネート、例えばクロドロネート;エスペラミシン;並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連の色素蛋白エネジン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(例えばモルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、マイコフェノール酸、ノガラマイシ、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU);葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロクスイジン;アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補給物、例えばフロリニック酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルホルニチン;エリプチニウムアセテート;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products,Eugene,OR);ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2”−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2毒素、ベラクリンA、ロリジンA及びアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ)、ABRAXANETMクレモフォー非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone−Poulenc Rorer、Antony,France);クロランブシル;GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセロダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えばレチン酸;カペシタビン;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体を包含する。
この定義に同様に包含されるものは、腫瘍に対するホルモンの作用を調節又は抑制する作用を有する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)、例えばタモキシフェン(例えばNOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びFARESTONトレミフェン;副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば4(5)−イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール;及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン;並びにトロキサシタビン(1,3−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばPKC−アルファ、Ralf及びH−Rasのような異常な細胞増殖に関与するとされるシグナリング経路における遺伝子の発現を抑制するもの;リボザイム、例えばVEGF発現阻害剤(例えばANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びHER2発現阻害剤;ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えば、ALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン;PROLEUKIN(登録商標)rIL−2;LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ1阻害剤、ABARELIX(登録商標)rmRH;及び上記の何れかの製薬上許容しうる塩、酸又は誘導体である。
「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語はある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。本発明の1つの局面において、細胞増殖性障害は癌である。
「腫瘍」とは本明細書においては、悪性良性に関わらず全ての新生物細胞の成長及び増殖、及び全ての前癌及び癌性の細胞及び組織を指す。
「細胞死を誘導する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は生存細胞を非生存性とするものである。細胞はPRO57290ポリペプチドを発現するもの、好ましくは同様の組織型の正常細胞と比較してPRO57290ポリペプチドは癌細胞表面に発現される膜貫通ポリペプチドであってよく、又は、癌細胞により生産され分泌されるポリペプチドであってよい。好ましくは、細胞は癌細胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓又は膀胱の細胞である。インビトロの細胞死は抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)又は補体依存性細胞毒性(CDC)により誘導された細胞死を識別するために補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下において決定してよい。即ち、細胞死に関する試験は熱不活性化血清を用いながら(即ち補体非存在下において)、そして免疫エフェクター細胞の非存在下において実施してよい。抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が細胞死を誘導することができるかどうかを決定するためには、ヨウ化プロピジウム(PI)、トリパンブルー(Moore et al.,Cytotechnology17:1−11(1995)参照)又は7AADの取り込みにより評価される膜一体性の消失を未投与細胞と相対比較しながら試験することができる。好ましい細胞死誘導性の抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子はBT474細胞におけるPI取り込み試験においてPI取り込みを誘導するものである。
本明細書においては、「免疫接着(immunoadhesion)」という用語は免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能に非相同蛋白の結合特異性(「接着」)を組み合わせる抗体様分子を表す。構造的には、免疫接着は抗体の抗原認識結合部位以外(即ち「非相同」)の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列及び免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。免疫接着分子の接着部分は典型的には、受容体又はリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接するアミノ酸配列である。免疫接着における免疫グロブリン定常ドメイン配列は何れかの免疫グロブリン、例えばIgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を包含する)、IgE、IgD又はIgMから得てよい。
「標識」という用語は本明細書においては、「標識された」抗体を作成するために抗体に直接又は間接的にコンジュゲートされた検出可能な化合物又は組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能である(例えば放射性同位体標識又は蛍光標識)か、又は、酵素標識の場合は、検出され得る基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒してよい。
「複製予防剤」とは、アポトーシス、脈管形成抑制、細胞増加、腫瘍殺傷、有糸分裂抑制、細胞周期進行遮断、細胞成長の停止、腫瘍への結合、細胞メディエーターとしての作用等の機序に関わらず、細胞の複製、機能及び/又は成長が抑制又は予防されるか、又は細胞が破壊される薬剤である。そのような薬剤は化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長抑制剤、又は抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン、抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(EP616812参照);又は抗アンドロゲン、例えばフルタミド、並びにアロミダーゼ阻害剤、又はホルモン剤、例えばアンドロゲンを包含する。
「細胞毒性剤」という用語は本明細書においては細胞の機能を抑制又は予防及び/又は細胞の破壊を誘発する物質を指す。用語は放射性同位体(例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位体)、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレーション剤、酵素及びそのフラグメント、例えば核溶解酵素、抗生物質及び毒素、例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素、及びこれ等のフラグメント及び/又は変異体、及び、後述する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を包含することを意図している。他の細胞毒性剤は後に記載する。腫瘍殺傷剤は腫瘍細胞の破壊をもたらす。
本明細書においてアンタゴニストと組み合わせて使用するための特定の腫瘍型に対する好ましい細胞毒性剤は以下の通りである。
1.前立腺癌:アンドロゲン、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ErbB2の細胞外ドメイン(例えばErbB2の概ね残基22〜概ね残基584の領域における残基の何れかの1つ以上)の領域に結合する2C4のようなErbB2ドメインに対する抗体(WO01/00245;ハイブリドーマATCCHB−12697)、AVASTINTM抗血管内皮細胞成長因子(VEGF)、TARCEVATMOSI−774(エルロチニブ)(Genenetech and
OSI Pharmaceuticals)又は他の表皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFRTKI)。
2.胃癌:5−フルオロウラシル(5FU)、XELODATMカペシタビン、メトトレキセート、エトポシド、シスプラチン/カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン及びCPT−11(カンプトテシン−11;イリノテカン、合衆国商標:CAMPTOSAR(登録商標))。
3.膵臓癌:ゲムシタビン、5FU、XELODATMカペシタビン、CPT−11、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI。
4.結腸直腸癌:5FU、XELODATMカペシタビン、CPT−11、オキサリプラチン、AVASTINTM抗VEGF、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI及びEGFRに結合し受容体活性化及び腫瘍へのシグナリングを開始するEGFの能力をブロックするERBITUXTM(旧称IMC−C225)ヒト:マウス−キメラ化モノクローナル抗体。
5.腎臓癌:IL−2、インターフェロンアルファ、AVASTINTM抗VEGF、MEGACETM(メゲストロールアセテート)プロゲスチン、ビンブラスチン、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI。
1.前立腺癌:アンドロゲン、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ErbB2の細胞外ドメイン(例えばErbB2の概ね残基22〜概ね残基584の領域における残基の何れかの1つ以上)の領域に結合する2C4のようなErbB2ドメインに対する抗体(WO01/00245;ハイブリドーマATCCHB−12697)、AVASTINTM抗血管内皮細胞成長因子(VEGF)、TARCEVATMOSI−774(エルロチニブ)(Genenetech and
OSI Pharmaceuticals)又は他の表皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFRTKI)。
2.胃癌:5−フルオロウラシル(5FU)、XELODATMカペシタビン、メトトレキセート、エトポシド、シスプラチン/カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン及びCPT−11(カンプトテシン−11;イリノテカン、合衆国商標:CAMPTOSAR(登録商標))。
3.膵臓癌:ゲムシタビン、5FU、XELODATMカペシタビン、CPT−11、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI。
4.結腸直腸癌:5FU、XELODATMカペシタビン、CPT−11、オキサリプラチン、AVASTINTM抗VEGF、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI及びEGFRに結合し受容体活性化及び腫瘍へのシグナリングを開始するEGFの能力をブロックするERBITUXTM(旧称IMC−C225)ヒト:マウス−キメラ化モノクローナル抗体。
5.腎臓癌:IL−2、インターフェロンアルファ、AVASTINTM抗VEGF、MEGACETM(メゲストロールアセテート)プロゲスチン、ビンブラスチン、TARCEVATMエルロチニブ及び他のEGFRTKI。
「成長抑制剤」とは本明細書においては細胞、特に、インビトロ又はインビボのPRO57290−発現癌細胞の成長を抑制する化合物又は組成物を指す。即ち、成長抑制剤はS期におけるPRO57290−発現細胞の比率を有意に低減するものであってよい。成長抑制剤の例は細胞周期の進行をブロックする(S期以外の位置において)薬剤、例えばG1停止及びM期停止を誘導する薬剤を包含する。伝統的なM期ブロッカーはビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを包含する。G1を停止させる薬剤、例えばDNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、デカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル及びara−CはS期停止にまでスピルオーバーする。更に詳細な情報はThe Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn
and Israel,eds.,Chapter 1,“Cell cycle regulation,oncogenes, and antineoplastic drugs”, Murakami et al.,(WB Saunders:Philadelphia,1995)の特に13ページに記載されている。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は共にイチイの木から誘導された抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer)はパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチューブリン2量体からの微小管の組立を促進し、そして、細胞の有糸分裂の抑制をもたらす脱重合の予防により微小管を安定化させる。
and Israel,eds.,Chapter 1,“Cell cycle regulation,oncogenes, and antineoplastic drugs”, Murakami et al.,(WB Saunders:Philadelphia,1995)の特に13ページに記載されている。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は共にイチイの木から誘導された抗癌剤である。ヨーロッパイチイから誘導されたドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer)はパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチューブリン2量体からの微小管の組立を促進し、そして、細胞の有糸分裂の抑制をもたらす脱重合の予防により微小管を安定化させる。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は(8S−シス)−10−[(3−アミノ−2,3,6−トリデオキシ−α−L−リキソ−ヘキサピラノシル)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−8−(ヒドロキシアセチル)−1−メトキシ−5,12−ナフタセンジオンである。
「サイトカイン」という用語はある細胞集団により放出され、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用する蛋白に関する総称である。このようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに属するものとしては、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;リラキシン;プロリラキシン;糖蛋白ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)及び黄体形成ホルモン(LH);肝成長因子;線維芽細胞成長因子;プロラクチン;胎盤ラクトーゲン;腫瘍壊死因子−α及び−β;ミューラー阻害物質;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);神経成長因子、例えばNGF−β;血小板成長因子;形質転換成長因子(TGF)、例えばTGF−α及びTGF−β;インスリン様成長因子−I及び−II;エリスロポエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β及び−γ;コロニー刺激因子(CSF)、例えばマクロファージ−CSF(M−CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF);及び顆粒球−CSF(G−CSF);インターロイキン(IL)、例えばIL−1、IL−1a、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12;腫瘍壊死因子、例えばTNF−α又はTNF−β;及び他のポリペプチド因子、例えばLIF及びキットリガンド(KL)が挙げられる。本明細書においては、サイトカインという用語は天然原料由来又は組み換え細胞培養物由来の蛋白、及び、ネイティブ配列のサイトカインの生物学的活性同等物を包含する。
「パッケージインサート」という用語は治療用製品の市販用パッケージ内に慣用的に包含される説明書を指すのに用いられ、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、禁忌及び/又は警告に関する情報を含んでいる。
「遺伝子」という用語は(a)本明細書に開示したDNA配列の少なくとも1つを含有する遺伝子;(b)本明細書に開示するDNA配列によりコードされるアミノ酸配列をコードする何れかのDNA配列、及び/又は、(c)本明細書に開示するコーディング配列の補体にハイブリダイズする何れかのDNA配列を指す。好ましくは、用語はコーディング並びに非コーディング領域を包含し、好ましくは正常な遺伝子発現に必要な全ての配列を包含する。
「遺伝子ターゲティング」という用語はゲノムDNAフラグメントが哺乳類細胞内に導入され、そしてそのフラグメントが内因性の相同配列を特定して組み換えを起こす場合に生じる相同組み換えの型を指す。相同組み換えによる遺伝子ターゲティングは特定のデザインの外因性DNAで特定のゲノム配列を置き換えるために組み換えDNA技術を使用する。
「相同組み換え」という用語は相同ヌクレオチド配列の部位における2つのDNA分子又は染色分体の間のDNAフラグメントの交換を指す。
「標的遺伝子」(或いは「標的遺伝子配列」又は「標的DNA配列」とも称する)という用語は、相同組み換えにより修飾すべき何れかの核酸分子、ポリヌクレオチド又は遺伝子を指す。標的配列は未損傷の遺伝子、エクソン又はイントロン、調節配列又は遺伝子間の何れかの領域を包含する。標的遺伝子は個々のゲノムDNAにおける特定の遺伝子又は遺伝子座の一部分を含んでよい。
PRO57290遺伝子の「破壊」はゲノムDNAフラグメントが内因性の相同配列を特定して組み換えを起こす場合に生じ、その場合、破壊とはネイティブの遺伝子又はその一部分の欠失であるか、又は、ネイティブの遺伝子の突然変異であるか、又は、破壊はネイティブの遺伝子の機能的不活性化である。或いは、配列の破壊は遺伝子トラップベクターを用いた非特異的な挿入性の不活性化により生じてもよい(即ちランダムに挿入されたトランスジーンを含有し、発現する非ヒトトランスジェニック動物;例えば2002年8月20日に発行された米国特許第6,436,707号参照)。これ等の配列の破壊又は修飾はDNA配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失又は置換又は置き換え、又はそれらの何れかの組合せを包含してよい。挿入は動物、植物、カビ、昆虫、原生動物又はウィルス起源のものであってよい全遺伝子の挿入を包含する。破壊は、例えば正常な遺伝子産物を、その生産を部分的又は完全に抑制することにより、又は、正常な遺伝子産物の活性を増強することにより、改変することができる。好ましくは、破壊はヌル破壊であり、その場合、PRO57290遺伝子の有意な発現はない。
「ネイティブの発現」という用語は野生型マウスにおいて存在する発現水準におけるPRO57290遺伝子によりコードされる完全長ポリペプチドの発現を指す。即ち、内因性PRO57290遺伝子の「ネイティブの発現が無い」破壊とは哺乳類の単一の細胞、選択された細胞又は全ての細胞の内因性PRO57290遺伝子によりコードされるポリペプチドの少なくとも一部分の発現の部分的又は完全な低減を指す。
「ノックアウト」という用語は、破壊によりネイティブの遺伝子の機能的不活性化;ネイティブ遺伝子又はその一部分の欠失;又はネイティブの遺伝子の突然変異がもたらされるPRO57290遺伝子の破壊を指す。
「ノックイン」という用語は特定のヒトPRO57290コード遺伝子又はその変異体の何れかをコードするヒトcDNAによるマウスオーソログ(又は他のマウス遺伝子)の置き換えを指す(即ち破壊はネイティブのマウス遺伝子のネイティブのヒト遺伝子による置き換えをもたらす)。
「コンストラクト」又は「ターゲティングコンストラクト」という用語は標的組織、細胞系統又は動物内に転移されるべき人工的に組み立てられたDNAセグメントを指す。典型的には、ターゲティングコンストラクトは特定の目的の遺伝子又は核酸配列、マーカー遺伝子及び適切な対照配列を包含することになる。本明細書においては、ターゲティングコンストラクトはPRO57290ターゲティングコンストラクトを含む。「PRO57290ターゲティングコンストラクト」は、PRO57290遺伝子の少なくとも一部分に相同なDNA配列を包含し、そして、宿主細胞内で、PRO57290遺伝子における破壊を生じさせることができる。
「トランスジェニック細胞」という用語は、そのゲノム内に、遺伝子ターゲティングの方法により完全に又は部分的に破壊、修飾、改変又は置き換えられているPRO57290遺伝子を含有する細胞を指す。
「トランスジェニック動物」という用語は本明細書に記載した方法又は当該分野で良く知られている他の方法により破壊又は他の態様で修飾又は突然変異されている特定の遺伝子をそのゲノム内に含有する動物を指す。好ましくは非ヒトトランスジェニック動物は哺乳類である。より好ましくは哺乳類はげっ歯類、例えばラット又はマウスである。更に又、「トランスジェニック動物」はヘテロ接合の動物(即ち1つの欠損対立遺伝子及び1つの野生型対立遺伝子)又はホモ接合の動物(即ち2つの欠損対立遺伝子)であってよい。胚は動物の定義内に属するとみなす。動物を準備することは子宮内に胚又は胎児を準備することを包含し、交配によるか、他の態様によるか、そして胚が在胎期満了するかどうかは問わない。
本明細書においては、「選択マーカー」及び「位置選択マーカー」という用語は、ある遺伝子を担持している細胞のみを特定の条件下に生存及び/又は成長させることができるような、ある産物をコードする遺伝子を指す。例えば、導入されたネオマイシン耐性(Neor)遺伝子を発現する植物及び動物細胞は化合物G418に耐性である。Neor遺伝子マーカーを担持しない細胞はG418により殺傷される。他の陽性選択マーカーは当業者の知る、又は推測できるものである。
「調節する」又は「調節」という用語は本明細書においては、PRO57290遺伝子の機能、発現、活性又はPRO57290遺伝子に関連する表現型の減少、抑制、低減、軽減、増大又は増強を指す。
「軽減する」又は「軽減」という用語は本明細書においては、状態、疾患、障害又は表現型、例えば異常又は症状の減少、低減又は排除を指す。
「異常」という用語はPRO57290の関与が示唆される何れかの疾患、障害、状態又は表現型を指し、病的状態及び挙動観察事例を包含する。
II.組成物及び本発明の方法
A.完全長PRO57290ポリペプチド
本発明は本出願においてPRO57290ポリペプチドと称するポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、種々のPRO57290ポリペプチドをコードするcDNAが後述する実施例において更に詳細に開示する通り同定され、単離された。別個の発現ラウンドにおいて生産される蛋白に異なるPRO番号を付与してよいが、UNQ番号は何れかの所定のDNA及びコードされる蛋白に対してユニークのものであり、変化することは無い。しかしながら、簡便のため、本明細書においては、本明細書に開示する完全長のネイティブの核酸分子によりコードされる蛋白並びにPROの前記した定義に包含される全ての他のネイティブの相同体及び変異体は、その起源又は製造様式に関わらず、「PRO/数」と称する。
A.完全長PRO57290ポリペプチド
本発明は本出願においてPRO57290ポリペプチドと称するポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、種々のPRO57290ポリペプチドをコードするcDNAが後述する実施例において更に詳細に開示する通り同定され、単離された。別個の発現ラウンドにおいて生産される蛋白に異なるPRO番号を付与してよいが、UNQ番号は何れかの所定のDNA及びコードされる蛋白に対してユニークのものであり、変化することは無い。しかしながら、簡便のため、本明細書においては、本明細書に開示する完全長のネイティブの核酸分子によりコードされる蛋白並びにPROの前記した定義に包含される全ての他のネイティブの相同体及び変異体は、その起源又は製造様式に関わらず、「PRO/数」と称する。
後述する実施例に開示する通り、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。当業者はこれ等のクローンの実際のヌクレオチド配列を当該分野の日常的方法を用いた寄託クローンの配列決定により容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は日常的技術を用いてヌクレオチド配列から決定できる。本明細書に記載するPRO57290ポリペプチド及びコードする核酸に関しては、出願人はその時点で使用可能な配列の情報を用いて最も同定可能であるリーディングフレームであると考えられるものを同定している。
B.PRO57290ポリペプチド変異体
本明細書に記載した完全長のネイティブ配列のPRO57290ポリペプチドに加えて、PRO57290変異体が製造可能であることが意図される。PRO57290変異体はPRO57290DNA内に適切なヌクレオチドの変化を導入することにより、及び/又は、所望のPRO57290ポリペプチドの合成により、製造できる。アミノ酸の変化はグリコシル化部位の数又は位置を変化させたり、又は、膜アンカリング特性を改変させたりするなどの、PRO57290ポリペプチドの翻訳後の過程を改変する場合があることは当業者の知る通りである。
本明細書に記載した完全長のネイティブ配列のPRO57290ポリペプチドに加えて、PRO57290変異体が製造可能であることが意図される。PRO57290変異体はPRO57290DNA内に適切なヌクレオチドの変化を導入することにより、及び/又は、所望のPRO57290ポリペプチドの合成により、製造できる。アミノ酸の変化はグリコシル化部位の数又は位置を変化させたり、又は、膜アンカリング特性を改変させたりするなどの、PRO57290ポリペプチドの翻訳後の過程を改変する場合があることは当業者の知る通りである。
ネイティブ完全長配列のPRO57290ポリペプチド又は本明細書に記載したPRO57290ポリペプチドの種々のドメインの変異は、例えば米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的突然変異に関する手法及び指針の何れかを用いて形成することができる。変異はネイティブ配列PRO57290ポリペプチドと比較した場合にPRO57290ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすPRO57290ポリペプチドをコードするコドン1つ以上の置換、欠失又は挿入であってよい。場合により、変異はPRO57290ポリペプチドのドメイン1つ以上における何れかの他のアミノ酸による少なくとも1つのアミノ酸の置換によるものである。所望の活性に悪影響を与えることなくどのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失させてよいかを決定する場合の指針はPRO57290ポリペプチドの配列を相同既知蛋白分子のものと比較すること、及び、高相同性の領域で起こるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることにより、発見してよい。アミノ酸置換はあるアミノ酸を同様の構造的及び/又は化学的特性を有するアミノ酸と置き換えること、例えばロイシンをセリンで置き換えること、即ち保存的なアミノ酸の置き換えの結果であることができる。挿入及び欠失は場合により約1〜5アミノ酸の範囲であってよい。許容される変異は配列におけるアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行うこと、及び、得られた変異体に完全長又は成熟ネイティブ配列により示される活性があるかどうか試験することにより決定してよい。
PRO57290ポリペプチドフラグメントが本明細書において提供される。そのようなフラグメントは例えば完全長のネイティブの蛋白と比較した場合にN末端又はC末端でトランケーションされているか、又は、内部残基を欠いていてよい。特定のフラグメントはPRO57290ポリペプチドの所望の生物学的活性の為に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO57290フラグメントは多くの従来の手法の何れかにより製造してよい。所望のペプチドフラグメントは化学合成してよい。代替法においては、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定義される部位において蛋白を切断することがわかっている酵素で蛋白を処理することにより、又は、適当な制限酵素でDNAを消化し、そして所望のフラグメントを単離することにより、PRO57290フラグメントを形成する。更に別の適当な手法では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により所望のポリペプチドフラグメントをコードするDNAフラグメントを単離して増幅する。DNAフラグメントの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドをPCRにおける5’及び3’プライマーとして使用する。好ましくは、PRO57290ポリペプチドフラグメントは本明細書に開示するネイティブのPRO57290ポリペプチドと、少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
目的の保存的置換は好ましい置換という見出しの下に表6に示す通りである。このような置換が生物学的活性における変化をもたらす場合、より実質的な変化、表6において例示される置換と称される置換、又はアミノ酸クラスに言及しながら後述において更に説明するものが好ましく導入され、生成物がスクリーニングされる。
(1)非極性;Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)未荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
となるように群分けしてよい。
或いは、天然に存在する残基は共通の側鎖の特性に基づいて以下の通り、即ち:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile:
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln:
(3)酸性:Asp、Glu
(4)塩基性:His、Lys、Arg
(5)鎖の方向に影響する残基:Gly、Pro
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe
となるように群分けしてよい。
非保存的置換はこれ等のクラスの1つのメンバーを他のクラスと交換することを包含する。そのような置換された残基はまた保存的置換部位内に、又はより好ましくは残余(非保存)の部位に導入されてよい。
変異はオリゴヌクレオチド媒介(部位指向性)突然変異誘発、アラニンスキャニング及びPCR突然変異誘発のような当該分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位指向性突然変異誘発[Carter et al.,Nucl.Acids Res.,13:4331(1986);Zoller et al.,Nucl.Acids Res.,10:6487(1987)]、カセット突然変異誘発[Wells et al.,Gene,34:315(1985)]、制限選択突然変異誘発[Wells et al.,Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986)]又は他の知られた手法をクローニングされたDNAに対して実施することによりPRO57290変異体DNAを製造することができる。
スキャニングアミノ酸分析もまた隣接する配列に沿ってアミノ酸1つ以上を同定するために使用できる。好ましいスキャニングアミノ酸には比較的小型の中性のアミノ酸が包含される。このようなアミノ酸はアラニン、グリシン、セリン及びシステインを包含する。アラニンは典型的には、それがベータ炭素を超えた側鎖を排除し、変異体の主鎖のコンホーメーションを改変する可能性が低いため、この群の中では好ましいスキャニングアミノ酸である[Cunningham and Wells,Science,244:1081−1085(1989)]。アラニンはまた典型的には、それが最も一般的なアミノ酸であることから好ましい。更に又それは頻繁に埋没及び曝露の位置の両方において存在する[Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体をもたらさない場合は、同配体アミノ酸を使用できる。
C.PRO57290ポリペプチドの修飾
PRO57290ポリペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。共有結合修飾の1つの型はPRO57290ポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端の残基と反応することができる有機誘導体形成剤とPRO57290ポリペプチドのターゲティングされたアミノ酸残基を反応させることを包含する。二官能性剤を用いた誘導体化は、例えば抗PRO57290抗体を精製するための方法において使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面にPRO57290ポリペプチドを交差結合するため、又はその逆のために有用である。一般的に使用される交差結合剤は例えば1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ2官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、2官能性マレイミド、例えばビス−N−マレイミド−1,8−オクタン及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような物質を包含する。
PRO57290ポリペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。共有結合修飾の1つの型はPRO57290ポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端の残基と反応することができる有機誘導体形成剤とPRO57290ポリペプチドのターゲティングされたアミノ酸残基を反応させることを包含する。二官能性剤を用いた誘導体化は、例えば抗PRO57290抗体を精製するための方法において使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面にPRO57290ポリペプチドを交差結合するため、又はその逆のために有用である。一般的に使用される交差結合剤は例えば1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ2官能性イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、2官能性マレイミド、例えばビス−N−マレイミド−1,8−オクタン及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような物質を包含する。
他の修飾にはグルタミニル及びアスパルギニル残基からそれぞれ相当するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のホスホリル化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79−86(1983)]、N末端アミンのアセチル化及び何れかのC末端カルボキシル基のアミド化が包含される。
本発明の範囲に包含されるPRO57290ポリペプチドの共有結合修飾の別の型はポリペプチドのネイティブのグリコシル化パターンを改変することを含む。「ネイティブのグリコシル化パターンを改変すること」とは、本明細書の目的のためには、ネイティブ配列PRO57290ポリペプチド内に存在する炭水化物部分1つ以上を欠失させること(伏在するグリコシル化部位を除去することによるか、又は、化学的及び/又は酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることによる)及び/又はネイティブ配列PRO57290ポリペプチド内に存在しないグリコシル化部位1つ以上を付加させることを意味する。更に又、この文言には存在する種々の炭化水素部分の性質及び比率の変化を含む、ネイティブ蛋白のグリコシル化の定性的変化を包含する。
PRO57290ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列を改変することにより達成してよい。改変は、例えばネイティブ配列のPRO57290へのセリン又はスレオニン残基1つ以上の付加又は置換により行ってよい(O連結グリコシル化部位の場合)。PRO57290アミノ酸配列は場合により、特に、所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが形成されるように予め選択された塩基においてPRO57290ポリペプチドをコードするDNAを突然変異することにより、DNAレベルの変化を介して改変してよい。
PRO57290ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増大させる別の手段はポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的なカップリングによるものである。そのような方法は当該分野において、例えば、1987年9月11日公開のWO87/05330及びAplin and Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,pp.259−306(1981)に記載されている。
PRO57290ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、又は、グリコシル化のための標的として機能するアミノ酸残基についてコードしているコドンの突然変異的置換により達成してよい。化学的脱グリコシル化手法は当該分野で知られており、そして例えばHakimuddin,et al.,Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)及びEdge et al.,Anal.Biochem.,118:131(1981)に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断はThotakura et al.,Meth.Enzymol.138:350(1987)に記載されている種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成できる。
PRO57290ポリペプチドの共有結合修飾の別の型は米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載されている態様における種々の非蛋白性の重合体、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの1つへのPRO57290ポリペプチドの連結を含む。
本発明のPRO57290ポリペプチドはまた別の非相同ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO57290ポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための態様において修飾してもよい。
このようなキメラ分子は抗タグ抗体が選択的に結合できる相手であるエピトープを与えるタグポリペプチドとのPRO57290ポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは一般的に、PRO57290ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置させる。PRO57290ポリペプチドのこのようなエピトープタグ付形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。又、エピトープタグを準備することで、PRO57290ポリペプチドは、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの別の型を用いたアフィニティー精製により容易に精製できるようになる。種々のタグポリペプチド及びその対応する抗体が当該分野で良く知られている。例としては、ポリヒスチジン(poly−his)又はポリヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;インフルエンザHAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field et al.,Mol.Cell Biol.,8:2159−2165(1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan et al.,Molecular and Cellular Biology,5:3610−3616(1985)];及び単純疱疹ウィルス糖蛋白D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547−553(1990)]が包含される。他のタグポリペプチドはFlag−ペプチド[Hopp et al.,BioTechnology,6:1204−1210(1988)];KT3エピトープペプチド[Martin et al.,Science,255:192−194(1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner et al.,J.Biol.Chem.,266:15163−15166(1991)];及びT7遺伝子10蛋白ペプチドタグ[Lutz−Freyermuth et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393−6397(1990)]を包含する。
キメラ分子は免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのPRO57290ポリペプチドの融合を含んでよい。キメラ分子の2価の形態(「イムノアドヘシン」とも称する)については、このような融合はIgG分子のFc領域に対するものであり得る。Ig融合は好ましくはIg分子内の可変領域少なくとも1つの代替としてのPRO57290ポリペプチドの可溶性(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態の置換を包含する。本発明の特に好ましい局面においては、免疫グロブリン融合はIgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3;又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を包含する。免疫グロブリン融合の作成については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号も参照のこと。
D.PRO57290ポリペプチドの製造
以下の説明は、PRO57290核酸を含有するベクターで形質転換又はトランスフェクトした細胞を培養することによるPRO57290ポリペプチドの製造に主に関するものである。当然ながら当該分野で良く知られている代替法を用いてPRO57290ポリペプチドを製造してもよいことを意図している。例えばPRO57290の配列又はその部分は固相法を用いた直接ペプチド合成により製造してよい[例えばStewart et al.,Solid−Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)を参照]。インビトロの蛋白合成を手動の手法又は自動により実施してよい。自動合成は例えばApplied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,CA)を用いて製造元の説明書により行ってよい。PRO57290ポリペプチドの種々の部分を別個に化学合成し、そして化学的又は酵素的な方法を用いて組み合わせることにより完全長PRO57290ポリペプチドを製造してよい。
以下の説明は、PRO57290核酸を含有するベクターで形質転換又はトランスフェクトした細胞を培養することによるPRO57290ポリペプチドの製造に主に関するものである。当然ながら当該分野で良く知られている代替法を用いてPRO57290ポリペプチドを製造してもよいことを意図している。例えばPRO57290の配列又はその部分は固相法を用いた直接ペプチド合成により製造してよい[例えばStewart et al.,Solid−Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)を参照]。インビトロの蛋白合成を手動の手法又は自動により実施してよい。自動合成は例えばApplied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,CA)を用いて製造元の説明書により行ってよい。PRO57290ポリペプチドの種々の部分を別個に化学合成し、そして化学的又は酵素的な方法を用いて組み合わせることにより完全長PRO57290ポリペプチドを製造してよい。
1.PRO57290ポリペプチドをコードするDNAの単離
PRO57290ポリペプチドをコードするDNAはPRO57290mRNAを保有し、そしてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製したcDNAライブラリから得てよい。従ってヒトPRO57290−DNAは実施例に記載するようなヒト組織から調製したcDNAライブラリから好都合に得ることができる。PRO57290−コード遺伝子もまた、ゲノムライブラリから、又は、知られた合成操作法(例えば自動核酸合成)により得てよい。
PRO57290ポリペプチドをコードするDNAはPRO57290mRNAを保有し、そしてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製したcDNAライブラリから得てよい。従ってヒトPRO57290−DNAは実施例に記載するようなヒト組織から調製したcDNAライブラリから好都合に得ることができる。PRO57290−コード遺伝子もまた、ゲノムライブラリから、又は、知られた合成操作法(例えば自動核酸合成)により得てよい。
ライブラリは目的の遺伝子又はそれによりコードされる蛋白を同定するように設計されたプローブ(例えばPRO57290ポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約20〜80塩基のオリゴヌクレオチド)を用いてスクリーニングできる。選択されたプローブを用いたcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングはSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)に記載されているもののような標準的な操作法を用いて実施してよい。PRO57290をコードする遺伝子を単離するための代替手段はPCR法を使用することである[Sambrook et al.,上出;Dieffenbach et al.,PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)]。
後述する実施例はcDNAライブラリをスクリーニングするための手法を説明するものである。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は擬陽性を最小限とするために十分な長さのものであり、そして十分明白なもので無ければならない。オリゴヌクレオチドは好ましくは、スクリーニングされるライブラリのDNAへのハイブリダイゼーション時にそれが検出できるように標識される。標識方法は当該分野で良く知られており、32P標識ATPのような放射性標識、ビオチニル化又は酵素標識の使用を包含する。ハイブリダイゼーション条件、例えば中ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーは上出のSambrook et al.に記載されている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、GenBankのような公的データベース又は他の私的配列データベースに寄託され入手可能である他の既知配列と比較し、アラインすることができる。分子の所定領域内又は完全長配列に渡る配列同一性(アミノ酸又はヌクレオチドレベルの何れか)は当該分野で知られた方法を用いて、そして、本明細書に記載する通り、決定することができる。
蛋白コーディング配列を有する核酸は、本明細書において初めて開示された推定アミノ酸配列を用いて、そして、必要に応じて、上出のSambrook et al.に記載されている従来のプライマー伸長操作法を用いて、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより前駆体を検出すること、及び、cDNAに逆転写されていないmRNAの中間体をプロセシングすることにより得てよい。
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞はPRO57290ポリペプチドの生産に関して本明細書に記載した発現又はクローニングベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅の為に適切であるように変性された従来の栄養培地中で培養する。培地、温度、pH等のような培養条件は予定外の実験を要することなく当業者が選択できる。一般的に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル及び実際の手法はMammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)及び上出Sambrook et al.に記載されている。
宿主細胞はPRO57290ポリペプチドの生産に関して本明細書に記載した発現又はクローニングベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換し、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅の為に適切であるように変性された従来の栄養培地中で培養する。培地、温度、pH等のような培養条件は予定外の実験を要することなく当業者が選択できる。一般的に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル及び実際の手法はMammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.Butler,ed.(IRL Press,1991)及び上出Sambrook et al.に記載されている。
真核生物細胞トランスフェクション及び原核生物細胞トランスフェクションの方法は、当業者に知られており、例えばCaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションである。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はその細胞に適切な標準的手法を用いて実施する。上出のSambrook et al.,に記載されているもののような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、又は、エレクトロポレーションが原核生物に対して一般的に使用される。Shaw et al.,Gene,23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859記載のような、特定の植物細胞の形質転換の為にアグロバクテリウム・ツメファシエンス感染が使用される。細胞壁を有しない哺乳類細胞に対してはGraham and van der Eb,Virology,52:456−457(1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用できる。哺乳類細胞宿主系トランスフェクションの一般的側面は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母への形質転換は典型的には、Van Solingen et al.,J.Bact.130:946(1977)及びHsiao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)の方法に従って実施する。しかしながら、細胞にDNAを導入する別の方法、例えば核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、未損傷細胞との細菌プロトプラスト融合又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンも使用してよい。哺乳類細胞を形質転換するための種々の手法についてはKeown et al.,Methods
in Enzymology,185:527−537(1990)及びMansour et al.,Nature,336:348−352(1988)を参照のこと。
in Enzymology,185:527−537(1990)及びMansour et al.,Nature,336:348−352(1988)を参照のこと。
本明細書におけるベクター内のDNAをクローニング又は発現するための適当な宿主細胞は原核生物、酵母又はより高等の真核生物の細胞を包含する。適当な原核生物は限定しないが、真正細菌目、例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば腸内細菌科、例えばE・コリを包含する。種々のE・コリ菌株が公的に入手でき、例えばE・コリK12菌株MM294(ATCC31,446);E・コリX1776(ATCC31,537);E・コリ菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)が挙げられる。他の適当な原核生物宿主細胞は腸内細菌科、例えばエシェリシア属、例えばE・コリ、エンテロバクター、エルウイニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス、及び、シゲラ並びにバチルス類、例えばB・サブチルス及びB・リシェニフォルミス(例えば1989年4月12日公開のDD266,710に開示されているB・リシェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えばP・アエルギノーサ及びストレプトマイセスを包含する。これ等の例は説明であって限定するものではない。菌株W3110は組み換えDNA産物の醗酵のための一般的な宿主菌株であることから1つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量の蛋白分解酵素を分泌する。例えば菌株W3110は宿主に内因性である蛋白をコードする遺伝子における遺伝子突然変異を起こすように修飾してよく、そのような宿主の例には、完全な遺伝子型tonAを有するE・コリW3110菌株1A2;完全な遺伝子型tonAptr3を有するE・コリW3110菌株9E4;完全な遺伝子型tonAptr3phoAE15(argF−lac)169degPompTkanr.を有するE・コリW3110菌株27C7(ATCC55,244);完全な遺伝子型tonAptr3phoAE15(argF−lac)169degPompTrbs7ilvGkanr.を有するE・コリW3110菌株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失突然変異を有する菌株37D6であるE・コリW3110菌株40B4;及び、1990年8月7日に発行された米国特許第4,946,783号に開示されている突然変異体のペリプラズムプロテアーゼを有するE・コリ菌株が包含される。或いは、クローニングのインビトロの方法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。
原核生物のほかに、真核生物の微生物、例えば線維状カビ又は酵母がPRO57290−コードベクターのための適当なクローニング又は発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシアエは一般的に使用されている下等な真核生物の宿主微生物である。他のものにはスキゾサッカロマイセス・ポンベ(Beach and Nurse,Nature,290:140[1981];1985年5月2日公開のEP139,383);クルイベロマイセス宿主(米国特許第4,943,529号;Fleer et al.,Bio/Technology,9:968−975(1991))、例えばK・ラクチス(MW98−8C,CBS683、CBS4574;Louvencourt et al.,J.Bacteriol.,154(2):737−742[1983])、K・フラジリス(ATCC12,424)、K・ブルガリクス(ATCC16,045)、K・ウイケラミ(ATCC24,178)、K・ワルチ(ATCC56,500)、K・ドロソフィラルム(ATCC36,906;Van den Berg et al.,Bio/Technology,8:135(1990))、K・サーモトレランス及びK・マルキシアヌス;ヤロウイア(EP402,226);ピシア・パストリス(EP183,070;Sreekrishna et al.,J.Basic Microbiol.28:265−278[1988]);カンジダ;トリコデルマ・リエシア(EP244,234);ニューロスポラ・クラッサ(Case et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259−5263[1979]);シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オシデンタリス(1990年10月31日公開のEP394,538);及び線維状カビ、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(1991年1月10日公開のWO91/00357)及びアスペルギルス宿主、例えばA・ニズランス(Ballance et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,112:284−289[1983];Tilburn et al.,Gene,26:205−221[1983];Yelton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470−1474[1984])及びA・ナイジャー(Kelly and Hynes,EMBOJ.,4:475−479[1985])が包含される。メチル向性の酵母が本発明において適しており、そして限定しないが、ハンセヌラ、カンジダ、クロエケラ、ピシア、サッカロマイセス、トルロプシス及びロドトルラよりなる属から選択されるメタノール上で生育できる酵母を包含する。このクラスの酵母の例となる特定の種のリストはC.Anthony,The Biochemistry
of Methylotrophs,269(1982)に記載されている。
of Methylotrophs,269(1982)に記載されている。
グリコシル化されたPRO57290ポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物の細胞の例は、昆虫細胞、例えばショウジョウバエS2及びヨトウSf9並びに植物細胞を包含する。有用な哺乳類宿主細胞系統の例はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を包含する。より特定した例は、SV40で形質転換したサル腎臓CV1系統(COS−7、ATCCCRL1651);ヒト胚性腎系統(293又は懸濁培地中の生育の為にサブクローニングされた293細胞、Graham et al.,J.Gen.Virol.,36:59(1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980));マウスセルトーリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.,23:243−251(1980));ヒト肺細胞(W138、ATCCCCL75);ヒト肝細胞(HepG2,HB8065);及びマウス乳癌(MMT060562、ATCCCCL51)を包含する。適切な宿主細胞の選択は当業者の知る通りである。
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PRO57290ポリペプチドをコードする核酸(例えばcDNA又はゲノムDNA)をクローニング(DNAの増幅)のため、又は、発現の為に、複製可能なベクター内に挿入してよい。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは例えばプラスミド、コスミド、ウィルス粒子、又はファージの形態であってよい。適切な核酸配列を種々の操作法でベクター内に挿入してよい。一般的に、DNAは当該分野で知られた手法を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分は一般的に限定しないが1つ以上のシグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終止配列を包含する。これ等の成分1つ以上を含有する適当なベクターの構築は当業者に知られた標準的なライゲーション手法を用いる。
PRO57290ポリペプチドをコードする核酸(例えばcDNA又はゲノムDNA)をクローニング(DNAの増幅)のため、又は、発現の為に、複製可能なベクター内に挿入してよい。種々のベクターが公的に入手可能である。ベクターは例えばプラスミド、コスミド、ウィルス粒子、又はファージの形態であってよい。適切な核酸配列を種々の操作法でベクター内に挿入してよい。一般的に、DNAは当該分野で知られた手法を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分は一般的に限定しないが1つ以上のシグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終止配列を包含する。これ等の成分1つ以上を含有する適当なベクターの構築は当業者に知られた標準的なライゲーション手法を用いる。
PRO57290ポリペプチドは組み換えにより、直接のみならず、シグナル配列又は成熟蛋白又はポリペプチドのN末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドであってよい非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして製造してよい。一般的に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、又は、それはベクターに挿入されたPRO57290−コードDNAの部分であってよい。シグナル配列は例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であってよい。酵母の分泌のためには、シグナル配列は例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロマイセス及びクルイベロマイセスのα−因子リーダーを包含、後者は米国特許第5,010,182号に記載)又は酸ホスファターゼリーダー、C・アルビカンスグルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362,179)又は1990年11月15日公開のWO90/13646に記載のシグナルであってよい。哺乳類細胞発現においては、同じか関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列のような哺乳類シグナル配列を用いて蛋白の分泌を誘導してよく、ウィルスの分泌リーダーも使用される。
発現及びクローニングベクターは両方とも1つ以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製可能とする核酸配列を含有する。そのような配列は種々の細菌、酵母及びウィルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点が大部分のグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミド起点は酵母に適しており、そして種々のウィルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウィルス、VSV又はBPV)は哺乳類細胞オにおけるクローニングベクターの為に有用である。
発現及びクローニングベクターは典型的には選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含有する。典型的な選択遺伝子は(a)抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与し、(b)栄養要求性の欠損を補償し、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養を供給する蛋白をコードしており、例えばバチルスのためのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
哺乳類細胞のための適当な選択可能なマーカーの例は、DHFR又はチミジンキナーゼのような、PRO57290−コード核酸の取り込み能力を有する細胞の同定を可能にするものである。野生型DHFRを使用する場合の適切な宿主細胞はUrlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)に記載の通り製造及び増殖させたDHFR活性欠損のCHO細胞である。酵母で使用するための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb et al.,Nature,282:39(1979);Kingsman et al.,Gene,7:141(1979);Tschemper et al.,Gene,10:157(1980)]。trp1遺伝子はトリプトファン中で生育する能力を欠いた酵母の突然変異株、例えばATCC44076又はPEP4−1のための選択マーカーを与える[Jones,Genetics,85:12(1977)]。
発現及びクローニングベクターは通常はmRNA合成を誘導するためにPRO57290−コード核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含有する。種々の潜在的宿主細胞により認識されるプロモーターはよく知られている。原核生物の宿主で使用するのに適するプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Chang et al.,Nature,275:615(1978);Goeddel et al.,Nature,281:544(1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980);EP36,776]及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21−25(1983)]を包含する。細菌系における使用のためのプロモーターもまたPRO57290ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結したShine−Dalgarno(S.D.)配列を含有する。
酵母宿主と共に使用するための適当なプロモーター配列の例は3−ホスホグリセレートキナーゼ[Hitzeman et al.,J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]又は他の糖分解酵素[Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターを包含する。
生育条件により制御される転写の追加的利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現において使用するための適当なベクター及びプロモーターはEP73,657においても記載されている。
哺乳類宿主細胞中におけるベクターからのPRO57290の転写は例えばポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びシミアンウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから、非相同哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、そして、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御されるが、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合しなければならない。
より高等な真核生物によるPRO57290ポリペプチドをコードするDNAの転写はベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大させてよい。エンハンサーは通常は約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントであり、これはプロモーターに対してその転写を増大させるように作用する。哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウィルス由来のエンハンサーを使用することになる。例としては複製起点の後期側上のSV40エンハンサー(bp100−270)、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが包含される。エンハンサーはPRO57290コーディング配列に対して5’又は3’の位置においてベクター内にスプライスしてよいが、好ましくはプロモーターから5’側の部位に位置する。
真核生物宿主細胞(酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞)中で使用する発現ベクターはまた転写の終止のため、及びmRNAの安定化のために必要な配列を含有する。そのような配列は真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5’側、場合によっては3’側の未翻訳の領域から一般的に得られる。これ等の領域はPRO57290ポリペプチドをコードするmRNAの未翻訳部分内のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
組み換え脊椎動物細胞培養物中のPRO57290ポリペプチドの合成に適合させるために適するさらに別の方法、ベクター及び宿主細胞はGething et al.,Nature,293:620−625(1981);Mantei et al.,Nature,281:40−46(1979);EP117,060;及びEP117,058に記載されている。
4.遺伝子の増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は例えばmRNAの転写を定量するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201−5205(1980)]、ドットブロッティング(DNA分析)、又はインサイチュハイブリダイゼーションにより、適切な標識プローブを用いて、本明細書において提供される配列に基づいて、直接試料中で測定してよい。或いは、DNAデュプレックス、RNAデュプレックス及びDNA−RNAハイブリッドデュプレックス又はDNA−蛋白デュプレックスを包含する特定のデュプレックスを認識できる抗体を使用してよい。そして抗体を標識し、表面上のデュプレックスの形成によりデュプレックスに結合した抗体の存在が検出できるようにデュプレックスが表面に結合した状態で試験を実施してよい。
遺伝子の増幅及び/又は発現は例えばmRNAの転写を定量するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201−5205(1980)]、ドットブロッティング(DNA分析)、又はインサイチュハイブリダイゼーションにより、適切な標識プローブを用いて、本明細書において提供される配列に基づいて、直接試料中で測定してよい。或いは、DNAデュプレックス、RNAデュプレックス及びDNA−RNAハイブリッドデュプレックス又はDNA−蛋白デュプレックスを包含する特定のデュプレックスを認識できる抗体を使用してよい。そして抗体を標識し、表面上のデュプレックスの形成によりデュプレックスに結合した抗体の存在が検出できるようにデュプレックスが表面に結合した状態で試験を実施してよい。
或いは遺伝子発現を細胞又は組織の切片の免疫組織化学的染色のような免疫学的方法及び細胞培養物又は体液の試験により測定することにより、遺伝子産物の発現を直接定量してよい。免疫学的染色及び/又は試料液体の試験の為に有用な抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れかであってよく、そして何れかの哺乳類において製造してよい。好都合には、抗体はネイティブ配列PRO57290ポリペプチドに対して、又は、本発明において提供されるDNA配列に基づいた合成ペプチドに対して、又は、PRO57290に融合され、そして特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対して作成してよい。
5.ポリペプチドの精製
PRO57290ポリペプチドの形態は培地から、又は宿主細胞溶解物から回収してよい。膜結合の場合は、適当な洗浄液(例えばTriton−X100)を用いるか、酵素的切断により、膜から遊離させることができる。PRO57290ポリペプチドの発現に使用される細胞は種々の物理的又は化学的手段、例えば凍結解凍の反復、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤等により破壊することができる。
PRO57290ポリペプチドの形態は培地から、又は宿主細胞溶解物から回収してよい。膜結合の場合は、適当な洗浄液(例えばTriton−X100)を用いるか、酵素的切断により、膜から遊離させることができる。PRO57290ポリペプチドの発現に使用される細胞は種々の物理的又は化学的手段、例えば凍結解凍の反復、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤等により破壊することができる。
組み換え細胞の蛋白又はポリペプチドからPRO57290ポリペプチドを精製することが望ましい場合がある。以下の操作法、即ち、イオン交換カラム上の分画;エタノール沈降;逆相HPLC;シリカ上又はカチオン交換樹脂、例えばDEAE上のクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈降法;例えばSephadexG−75を用いたゲル濾過;IgGのような夾雑物を除去するためのプロテインAセファロースカラム;及びPRO57290ポリペプチドのエピトープタグ付型を結合させるための金属キレートカラムが適当な精製の操作法の例である。蛋白精製の種々の方法を使用してよく、そしてそのような方法は当該分野で知られており、そして例えばDeutscher,Methods in Enzymology,182(1990);Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer−Verlag,New York(1982)に記載されている。選択される精製工程は、例えば使用される製造プロセスの性質及び製造される特定のPRO57290ポリペプチドに依存する。
E.PRO57290ポリペプチドの使用
PRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(又はその相補体)はハイブリダイゼーションプローブとしての使用を包含する分子生物学において、染色体及び遺伝子のマッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において、種々の用途を有している。PRO57290核酸はまた本明細書に記載する組み換え手法によるPRO57290ポリペプチドの製造の為に有用である。
PRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(又はその相補体)はハイブリダイゼーションプローブとしての使用を包含する分子生物学において、染色体及び遺伝子のマッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において、種々の用途を有している。PRO57290核酸はまた本明細書に記載する組み換え手法によるPRO57290ポリペプチドの製造の為に有用である。
完全長ネイティブ配列のPRO57290遺伝子又はその部分は完全長PRO57290cDNAを単離するため、又は本明細書に開示したネイティブPRO57290配列に対して所望の配列同一性を有する更に別のcDNA(例えばPRO57290ポリペプチドの天然に存在する変異体又は他の種に由来するPRO57290ポリペプチドをコードするもの)を単離するためのcDNAライブラリのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。場合により、プローブの長さは約20〜約50塩基となる。ハイブリダイゼーションプローブは完全長ネイティブヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域から誘導してよく、ここでそのような領域は予定外の実験をすることなく、又は、ネイティブ配列PRO57290のプロモーター、エンハンサーエレメント及びイントロンを包含するゲノム配列から決定してよい。例示すれば、スクリーニング方法は約40塩基の選択されたプローブを合成するために既知のDNA配列を用いてPRO57290遺伝子のコーディング領域を単離することを包含する。ハイブリダイゼーションプローブは種々の標識、例えば放射性核種、例えば32P又は35S、又は酵素標識、例えばアビジン/ビオチンカップリング系を介してプローブにカップリングされたアルカリホスファターゼにより標識してよい。本発明のPRO57290遺伝子のものと相補的な配列を有する標識されたプローブを用いてヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリをスクリーニングすることによりそのようなライブラリのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定することができる。ハイブリダイゼーションの手法は後述する実施例において更に詳細に説明する。
本出願に開示する何れかのEST配列を本明細書に開示する方法を用いてプローブとして同様に使用してよい。
PRO57290核酸の他の有用なフラグメントは標的のPRO57290mRNA(センス)又はPRO57290DNA(アンチセンス)配列への結合が可能な一本鎖核酸配列(RNA又はDNAの何れか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを包含する。本発明によればアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドはPRO57290DNAのコーディング領域のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは一般的に、少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14〜30ヌクレオチドを含む。所定の蛋白をコードするcDNA配列に基づいてアンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する能力は例えばStein and Cohen(Cancer Res.48:2659,1988)及びvan der Krol et al.(BioTechniques 6:958,1988)に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合により、増強されたデュプレックス分解、転写又は翻訳の早期の終了を含む幾つかの手段の1つによる、又は他の手段による、標的配列の転写又は翻訳をブロックするデュプレックスの形成がもたらされる。即ちアンチセンスオリゴヌクレオチドはPRO57290の発現をブロックするために使用してよい。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは更に修飾された糖ホスホジエステル骨格(又は他の糖連結部、例えばWO91/06629に記載のもの)を有するオリゴヌクレオチドを含み、その場合、そのような糖連結部は内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性である。抵抗性の糖連結物を有するそのようなオリゴヌクレオチドはインビボで安定である(即ち酵素による分解に抵抗することができる)が、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例はWO90/10048記載のような有機部分又はポリ−(L−リジン)のような標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを包含する。エリプチシンのような更に別のインターカレーション剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることにより標的核酸配列に対するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾することができる。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは何れかの遺伝子導入法、例えばCaPO4媒介DNAトランスフェクション、エレクトロポレーションにより、又は、エプスタイン・バーウィルスのような遺伝子導入ベクターを使用することにより標的核酸配列を含有する細胞内に導入してよい。好ましい操作法においては、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適当なレトロウィルスベクターに挿入する。標的核酸配列を含有する細胞を組み換えレトロウィルスベクターにインビボ又はエクスビボのいずれかで接触させる。適当なレトロウィルスベクターは限定しないが、マウスレトロウィルスM−MuLV、N2(M−MuLVから誘導されたレトロウィルス)から誘導されたもの、又は、DCT5A、DCT5B及びDCT5Cと表記されるダブルコピーを包含する(WO90/13641参照)。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはまたWO91/04753に記載の通りリガンド結合分子とのコンジュゲートの形成により標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入してよい。適当なリガンド結合分子は限定しないが細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドを包含する。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションはリガンド結合分子がその相当する分子又は受容体に結合する能力を大きく妨害したり、細胞内へのセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲート型の進入をブロックしたりすることはない。
或いは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはWO90/10448に記載の通りオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含有する細胞内に導入してよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で解離される。
アンチセンス又はセンスRNA又はDNA分子は一般的に少なくとも約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長又はそれより長い。
プローブは又緊密に関連するPRO57290コーディング配列の同定のための配列のプールを作成するためのPCR法において使用してよい。
PRO57290ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はまたPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子をマッピングするため、及び遺伝的疾患を有する個体の遺伝子的分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用できる。本明細書において提供されるヌクレオチド配列は既知の手法、例えばインサイチュハイブリダイゼーション、既知染色体マーカーに対するリンケージ分析及びライブラリを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて染色体及び染色体の特定の領域にマッピングしてよい。
PRO57290に関するコーディング配列が別の蛋白に結合する蛋白をコードする場合(例えばPRO57290が受容体である場合)は、PRO57290ポリペプチドは結合の相互作用に関与する他の蛋白又は分子を同定するための試験において使用できる。そのような方法により、受容体/リガンド結合相互作用の抑制を同定できる。そのような結合相互作用に関与する蛋白はまた、結合相互作用のペプチド又は小分子の阻害剤又はアゴニストを得るためのスクリーニングにおいて使用できる。又、受容体PRO57290は相関するリガンドを単離するために使用できる。スクリーニング試験はネイティブのPRO57290ポリペプチド又はPRO57290ポリペプチドに対する受容体の生物学的活性を模倣する鉛化合物を発見するために設計できる。そのようなスクリーニング試験は化学物質ライブラリの高スループットのスクリーニングに適した試験を包含し、小分子薬剤候補の同定の為に特に適するものとなっている。意図される小分子は合成の有機又は無機の化合物を包含する。試験は種々のフォーマット、例えば蛋白−蛋白結合試験、生化学的スクリーニング試験、免疫試験及び細胞系試験において実施でき、これ等は当該分野で良く特徴付けられている。
PRO57290ポリペプチドをコードする核酸又はその修飾された形態はまた、治療上有用な試薬の開発及びスクリーニングにおいて有用となるトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを作成するためにも使用できる。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)はトランスジーンを含有する細胞を有する動物であり、そのトランスジーンは出生前、例えば胚の段階において動物又は動物の先祖に導入されている。トランスジーンはトランスジェニック動物の発生の元となる細胞のゲノム内に組み込まれるDNAである。本発明はPRO57290ポリペプチドをコードするDNAを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を形成するために使用される確立された手法及びゲノム配列に従ってPRO57290ポリペプチドをコードするゲノムDNAをクローニングするために使用できるPRO57290ポリペプチドをコードするcDNAを提供する。当該分野で知られた何れかの手法を用いて標的遺伝子トランスジーンを動物に導入することによりトランスジェニック動物の始祖体を作成してよい。そのような手法は限定しないが前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号、第4,736,866号及び第4,870,009号);生殖細胞系統へのレトロウィルス媒介遺伝子導入(Van der Putten,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148−6152(1985));胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング(Thompson,et al.,Cell,56:313−321(1989));遺伝子トラップベクターを用いた非特異的挿入不活性化(米国特許第6,436,707号);胚のエレクトロポレーション(Lo,Mol.Cell.Biol.3:1803−1814(1983));及び精子媒介遺伝子導入(Lavitrano,et al.,Cell,57:717−723(1989);等を包含する。典型的には、特定の細胞は組織特異的エンハンサーを用いてPRO57290トランスジーン取り込みの為にターゲティングされる。胚の段階において動物の生殖細胞系統に導入されたPRO57290ポリペプチドをコードするトランスジーンのコピーを包含するトランスジェニック動物は、PRO57290ポリペプチドをコードするDNAの増大した発現の作用を調べるために使用できる。そのような動物は、例えば過剰発現に関連する病的状態からの保護を付与すると考えられる試薬を得るための供試動物として使用できる。本発明のこの側面によれば、試薬を動物に投与し、そして病的状態の発生率がトランスジーンを担持する未投与の動物と比較して低減していれば、病的状態に対する潜在的治療介入があったことを示す。或いは、PRO57290ポリペプチドをコードする内因性遺伝子と動物の胚性幹細胞内に導入されたPRO57290ポリペプチドをコードする改変されたゲノムDNAとの間の相同組み換えの結果としてのPRO57290蛋白をコードする欠損又は改変された遺伝子を有するPRO57290「ノックアウト」動物を構築するためにPRO57290ポリペプチドの非ヒト相同体を用いルことができる。好ましくは、ノックアウト動物は哺乳類である。より好ましくは、哺乳類はげっ歯類、例えばラット又はマウスである。例えば、PRO57290ポリペプチドをコードするcDNAは確立された手法に従ってPRO57290ポリペプチドをコードするゲノムDNAをクローニングするために使用できる。PRO57290ポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部分は、欠失させるか、又は、他の遺伝子、例えば組み込みをモニタリングするために使用できる選択可能なマーカーをコードする遺伝子と置き換えることができる。典型的には、未改変フランキングDNA(5’及び3’末端の両方)の数キロ塩基をベクター内に含める[相同組み換えベクターの説明については例えばThomas and Capecchi,Cell,51:503(1987)参照]。ベクターは胚性幹細胞系統内に導入(例えばエレクトロポレーションによる)し、そして導入されたDNAが内因性DNAと相同組み換えを起こしている細胞を選択する[例えばLi et al.,Cell,69:915(1992)参照]。次に選択された細胞を動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入し、凝集キメラを形成する[例えばBradley,Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.(IRL,Oxford,1987)pp.113−152参照]。次にキメラ胚を適当な擬似妊娠雌性里親動物内に移植し、胚を妊娠期間満了させ、「ノックアウト」動物を作成することができる。相同組み換えされたDNAをその生殖細胞に保有する子孫を標準的な手法で同定し、動物の全細胞が相同組み換えDNAを含有する動物を育種するために使用することができる。ノックアウト動物は、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の非存在に起因する、特定の病的状態に対するそれらの防御能力に関して、そして、病的状態のそれらの発症に関して、特徴付けることができる。
更に又、ノックアウトマウスは遺伝子の機能及び薬剤標的に関する薬学的利用性の発見において、並びに、所定の標的に関連する潜在的な標的上の副作用の測定において、高度な情報源となる。遺伝子の機能及び生理学的特徴はマウスとヒトとの間で十分保存されているが、その理由はそれらが共に哺乳類であり、同様の数の遺伝子を含有しており、それらが種間で高度に保存されているためである。例えばマウス染色体16上の遺伝子の98%がヒトオーソログを有することが最近十分に裏付けられた(Mural et al.,Science 296:1661−71(2002))。
肺性幹(ES)細胞における遺伝子ターゲティングはヒト疾患に関連する多くの遺伝子におけるヌル突然変異を有するマウスの構築を可能にしているが、遺伝子疾患の全てがヌル突然変異に起因するわけではない。マウスの遺伝子座を破壊し、突然変異を有するヒト対応物を導入する遺伝子の置き換え(ノックイン)のための方法を確立することによりヒト疾患の価値あるマウスモデルを設計できる。その後、ヒト蛋白をターゲティングするインビボの薬剤試験を実施できる(Kitamoto et al.,Biochemical and Biophysical Res.Commun.,222:742−47(1996))。
PRO57290ポリペプチドをコードする核酸は又遺伝子療法において使用してよい。遺伝子療法用途においては、例えば欠損遺伝子の置き換えの為に治療上有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために細胞内に遺伝子を導入する。「遺伝子療法」とは単回の投与により持続する作用が達成される従来の遺伝子療法及び治療上有効なDNA又はmRNAの一回又は反復投与を行う遺伝子治療薬の投与の両方を包含する。アンチセンスRNA及びDNAはインビボで特定の遺伝子の発現をブロックするための治療薬として使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に移入されてそこで細胞膜によるその限定された取り込みにより生じるその低値の細胞内濃度にも関わらず阻害剤として作用することができることが既に明らかになっている(Zamecnik et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143−4146[1986])。オリゴヌクレオチドは例えばその負荷電ホスホジエステル基を未荷電の基で置換することにより、その取り込みが増強されるように修飾できる。
生存細胞に核酸を導入するために使用できる種々の手法が存在する。手法は核酸を培養細胞中にインビトロで、又は意図する宿主の細胞内にインビボで転移させるかにより、変動する。インビトロの哺乳類細胞への核酸の転移に適する手法はリポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降法等を包含する。現時点で好ましいインビボの遺伝子導入の手法はウィルス(典型的にはレトロウィルス)ベクターによるトランスフェクション及びウィルス外皮蛋白−リポソーム媒介トランスフェクションを包含する(Dzau et al.,Trends in Biotechnoilogy 11,205−210[1993])。一部の状況においては、核酸原料に対し、標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜蛋白又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等を提供することが望ましい。リポソームを使用する場合は、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜蛋白に結合する蛋白をターゲティングのため及び/又は取り込みを促進するために使用してよく、そのようなものとしては例えば特定の細胞型に対して向性のキャプシド蛋白又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内在化を起こす蛋白に対する抗体、細胞内局在化をターゲティングして細胞内半減期を増大させる蛋白が挙げられる。受容体媒介エンドサイトーシスの手法は例えばWu et al.,J.Biol.Chem.262,4429−4432(1987);及びWagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,3410−3414(1990)に記載されている。遺伝子の作成及び遺伝子療法のプロトコルについての考察は、Anderson et al.,Science256,808−813(1992)を参照のこと。
本明細書に記載したPRO57290ポリペプチドはまた蛋白電気泳動目的のための分子量マーカーとして使用してよく、そして、単離された核酸配列はこれ等のマーカーを組み換え発現するために使用してよい。
本明細書に記載したPRO57290ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸分子は染色体の同定の為に有用である。この点に関し、実際の配列データに基づいた染色体マーカー試薬で現在使用できるものは比較的少ないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性がなお存在している。本発明のPRO57290核酸分子各々は染色体マーカーとして使用できる。
本発明のPRO57290ポリペプチド及び核酸分子はまた、本発明のPRO57290ポリペプチドが他のものと比較してある組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織と比較して疾患組織において、示差的に発現される場合に、組織タイピングの為に診断的に使用してよい。PRO57290核酸分子はPCR、ノーザン分析、サザン分析及びウエスタン分析のためのプローブの形成の為に使用される。
本明細書に記載したPRO57290ポリペプチドは又治療薬として使用してよい。本発明のPRO57290ポリペプチドは薬学的に有用な組成物を製造するための既知の方法に従って製剤することができ、これによりそのPRO57290製品は製薬上許容しうる担体ベヒクルとの混合物中に組み合わせられる。治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))と共に所望の純度を有する活性成分を混合することにより保存用に製造される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は使用される用量及び濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、そして、緩衝物質、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;蛋白、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン;単糖類、2糖類及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース又はデキストロース;キレート形成剤、例えばEDTA;糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;及び/又はノニオン性界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTM又はPEGを包含する。
インビボ投与の為に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは凍結乾燥及び再構成の前後に滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本明細書においては治療用組成物は一般的に滅菌取出し口を有する容器、例えば皮下注射用の針で穿刺可能である蓋を有する静脈用溶液バッグ又はバイアル内に投入する。
投与経路は既知の方法によるものであり、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は患部内の経路により注射又は注入を行うか、局所投与を行うか、又は、除放性の系による。
本発明の医薬組成物の用量及び所望の薬剤濃度は意図される特定の使用に応じて変動する。適切な用量又は投与経路の決定は通常の医師の技量の範囲内で十分に行える。動物実験はヒトの治療のための有効な用量の決定のための信頼できる指針を与える。有効用量の種間のスケーリングはMordenti,J.and Chappell,W.“The
use of interspecies scaling in toxicokinetics”,Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds.,Pergamon Press,New York 1989,pp.42−96に記載されている原則に従って実施できる。
use of interspecies scaling in toxicokinetics”,Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds.,Pergamon Press,New York 1989,pp.42−96に記載されている原則に従って実施できる。
PRO57290ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与を用いる場合は、通常の用量は投与経路に応じて一日当たり約10ng/kg〜100mg/kg哺乳類体重以上、好ましくは約1μg/kg/日〜10mg/kg/日であってよい。特定の用量及び送達方法に関する指針は文献に記載されており;例えば米国特許第4,657,760号;第5,206,344号;又は第5,225,212号に記載されている。異なる治療用化合物及び異なる障害に対しては異なる製剤が有効であることが予想され、ある臓器又は組織をターゲティングする投与は、例えば別の臓器又は組織の場合とは異なる態様の送達を必要とする場合がある。
PRO57290ポリペプチドの投与を必要とする何れかの疾患又は障害の治療の為に適する放出特性を有する製剤においてPRO57290ポリペプチドの除放性投与が望まれる場合は、PRO57290ポリペプチドのマイクロカプセル化が意図される。除放性放出のための組み換え蛋白のマイクロカプセル化はヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン(rhIFN)、インターロイキン−2及びMNrgp120を用いて良好に行われている。Johnson et al.,Nat.Med.,2:795−799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221−1223(1993);Hora et al.,Bio/Technology,8:755−758(1990);Cleland,“Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems”, Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds,(Plenum Press:New York,1995),pp.439−462;WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399;及び米国特許第5,654,010号。
これ等の蛋白の除放性製剤は生体適合性及び広範な生体分解性を有することからポリ乳酸グリコール酸(PLGA)重合体を用いて開発されている。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸はヒト身体内で迅速に浄化される。更に又、この重合体の分解性はその分子量及び組成に応じて数ヶ月〜数年に調節できる。Lewis,“Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer”,M.Chasin and R.Langer(Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker:New York,1990),pp.1−41。
本発明はPRO57290ポリペプチドを模倣(アゴニスト)又はPRO57290ポリペプチドの作用を予防(アンタゴニスト)するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を包含する。PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を自身のゲノムが含んでいる非ヒトトランスジェニック動物による所見に基づいて陰性表現型が観察される場合に特に治療上価値あるものとなる。PRO57290ポリペプチドの作用を予防するアンタゴニストは非ヒトトランスジェニックノックアウト動物による観察に基づいて陽性表現型が観察される場合に特に治療上価値あるものとなる。アンタゴニスト薬剤候補を得るためのスクリーニング試験は、本明細書において同定される遺伝子によりコードされるPRO57290ポリペプチドと結合又は複合体形成するか、又は、他の態様においてコードされたポリペプチドの他の細胞蛋白との相互作用を妨害する化合物を同定するために設計される。そのようなスクリーニング試験は化学物質ライブラリの高スループットのスクリーニングに適した試験を包含し、小分子薬剤候補の同定の為に特に適するものとなっている。
試験は種々のフォーマット、例えば蛋白−蛋白結合試験、生化学的スクリーニング試験、免疫試験及び細胞系試験において実施でき、これ等は当該分野で良く特徴付けられている。
アンタゴニストに関する全試験は、それらが、薬剤候補を本発明において同定される核酸によりコードされるPRO57290ポリペプチドと、これら2成分が相互作用できるような条件下において十分な時間に渡り、接触させることを要する点において、共通である。
結合試験においては、相互作用は結合であり、そして形成される複合体を単離するか、又は反応混合物中で検出することができる。本発明において同定される遺伝子によりコードされるPRO57290ポリペプチド又は薬剤候補を固相上、例えばマイクロタイタープレート上に、共有結合又は非共有結合により固定化する。非共有結合は一般的にPRO57290ポリペプチドの溶液で固対表面をコーティングし、そして乾燥することにより達成される。或いは、固定化すべきPRO57290ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を用いて固体表面にそれをアンカリングすることができる。試験は検出可能な標識で標識されていてよい非固定化成分を固定化成分、例えばアンカリングされた成分を含有するコーティングされた表面に添加することにより行う。反応終了後、非反応成分を例えば洗浄により除去し、そして固体表面にアンカリングした複合体を検出する。元来非固定化の成分が検出可能な標識を担持する場合は、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。元来非固定化の成分が標識を担持していない場合は、複合体形成は、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識された抗体を使用することにより検出できる。
候補化合物が本発明において同定される遺伝子によりコードされる特定のPRO57290ポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は蛋白−蛋白相互作用を検出するためのよく知られた方法により試験することができる。そのような試験は伝統的な方法、例えば交差結合、同時免疫沈降及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを介した同時精製を包含する。更に又、蛋白−蛋白相互作用はChevray and Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5789−5793(1991)により開示されている通り、Fields等により記載された酵母系の遺伝子系(Fields and Song、Nature(London),340:245−246(1989);Chien et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578−9582(1991))を用いてモニタリングできる。多くの転写活性化物質、例えば酵母GAL4は、2つの物理的に個別のモジュラードメイン、即ち1つはDNA結合ドメインに対して作用するもの、もう1つは転写活性化ドメインとして機能するものよりなる。上記文献に記載された酵母発現系(一般的に「ツーハイブリッド系」と称される)はこの性質を利用しており、そして、2つのハイブリッド蛋白を使用し、その1つにおいては標的蛋白がGAL4のDNA結合ドメインに融合しており、もう1つにおいては候補の活性化蛋白が活性化ドメインに融合している。GAL4活性化プロモーターの制御下のGAL1−lacZレポーター遺伝子の発現は蛋白−蛋白相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存している。相互作用ポリペプチドを含有するコロニーはβ−ガラクトシダーゼに対する発色基質を用いて検出する。ツーハイブリッド手法を用いて2つの特定の蛋白の間の蛋白−蛋白相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKERTM)はClontechから市販されている。この系はまた特定の蛋白相互作用に関与する蛋白ドメインをマッピングするため、並びに、これ等の相互作用に必須であるアミノ酸残基を限定するためにも応用できる。
本発明において同定されるPRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外の成分との相互作用を妨害する化合物の試験は以下の通り行い、即ち、通常は遺伝子産物と細胞内又は細部外成分を含有する反応混合物を、2生成物の相互作用と結合を可能にする条件下及び時間に渡り調製する。候補化合物が結合を抑制する能力を試験するためには反応を被験化合物の非存在下及び存在下において実施する。更に、プラセボを第3の反応混合物に添加し、陽性対照として使用する。被験化合物と混合物中に存在する細胞内又は細胞外成分の間の結合(複合体形成)は上記した通りモニタリングする。対照反応においては複合体が形成されるが被験化合物を含有する反応混合物では形成しないことは、被験化合物が被験化合物とその反応相手の相互作用を妨害することを示す。
アンタゴニストを試験するためには、PRO57290ポリペプチドを特定の活性に関してスクリーニングすべき化合物と共に細胞に添加し、そして、PRO57290ポリペプチドの存在下における目的の活性を抑制する化合物の能力は、その化合物がPRO57290ポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示している。或いは、アンタゴニストはPRO57290ポリペプチドと膜結合PRO57290ポリペプチド受容体又は組み換え受容体に対する潜在的アンタゴニストを競合的阻害試験のための適切な条件下に組み合わせることにより検出してよい。受容体に結合しているPRO57290ポリペプチド分子の数を用いて潜在的アンタゴニストの有効性を測定することができるように、PRO57290ポリペプチドを例えば放射能により標識することができる。受容体をコードする遺伝子は、当業者の知る多くの方法、例えばリガンドパニング及びFACSソーティングにより同定できる。Coligan et al.,Current Protocols in Immun.,1(2):Chapter5(1991)。好ましくは、PRO57290ポリペプチドに応答する細胞からポリアデニル化RNAを調製し、そしてこのRNAから作成したcDNAライブラリを幾つかのプールに分割し、COS細胞又はPRO57290ポリペプチドに応答しない他の細胞をトランスフェクトするために使用する発現クローニングが使用される。スライドガラス上に生育したトランスフェクトした細胞を標識されたPRO57290ポリペプチドに曝露する。PRO57290ポリペプチドはヨウ素化又は部位特異的蛋白キナーゼに対する認識部位を含ませることを包含する種々の手段により標識できる。固定化及びインキュベーションの後、スライドをオートラジオグラフ分析に付す。陽性のプールを同定し、サブプールを作成し、相互作用的なサブプール化及び再スクリーニングの過程を用いながら再トランスフェクトし、最終的に推定受容体をコードする単一のクローンを得る。
受容体の同定のための代替法として、標識されたPRO57290ポリペプチドを受容体分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性連結させることができる。交差結合した物質をPAGEで分割し、X線フィルムに曝露する。受容体を含有する標識された複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分割し、そして蛋白マイクロ配列決定に付すことができる。マイクロ配列決定から得られたアミノ酸配列を用いて、cDNAライブラリをスクリーニングするための変性オリゴヌクレオチドプローブのセットを設計することにより、推定受容体をコードする遺伝子を同定する。
PRO57290ポリペプチドに対するアンタゴニストの作用を試験する際の別の方法はPRO57290アンタゴニストを野生型マウスに投与することにより既知のノックアウト表現型を模倣することである。即ち、先ず目的のPRO57290遺伝子をノックアウトし、そしてPRO57290遺伝子のノックアウト又は破壊の結果として生じた表現型を観察する。その後、野生型マウスにPRO57290ポリペプチドに対するアンタゴニストを投与することによりPRO57290ポリペプチドに対するアンタゴニストの有効性を試験することができる。有効なアンタゴニストはノックアウト動物で最初に観察された表現型の作用を模倣すると予測される。
同様に、PRO57290ポリペプチドのアゴニストの作用は、既知陰性ノックアウト表現型を軽減するために非ヒトトランスジェニックマウスにPRO57290アゴニストを投与することにより試験することができる。即ち、先ず目的のPRO57290遺伝子をノックアウトし、そしてPRO57290遺伝子のノックアウト又は破壊の結果として生じた表現型を観察する。その後、非ヒトトランスジェニックマウスにPRO57290ポリペプチドのアゴニストを投与することによりPRO57290ポリペプチドのアゴニストの有効性を試験することができる。有効なアゴニストはノックアウト動物で最初に観察された陰性の表現型の作用を軽減すると予測される。
アンタゴニストに関する別の試験では、受容体を発現する哺乳類細胞又は膜の調製品を候補化合物の存在下に標識PRO57290ポリペプチドと共にインキュベートする。次にこの相互作用を増強又はブロックする化合物の能力を測定する。
潜在的アンタゴニストのより特定の例は、PRO57290ポリペプチドとの免疫グロブリンの融合物に結合するオリゴヌクレオチド、そして特に、抗体、例えば限定しないが、ポリ及びモノクローナル抗体及び抗体フラグメント、一本鎖抗体、抗イデオタイプ抗体、及び、そのような抗体又はフラグメントのキメラ又はヒト化型、並びにヒト抗体及び抗体フラグメントを包含する。或いは潜在的アンタゴニストは緊密に関連する蛋白、例えば受容体を認識するが作用をもたらさないため、PRO57290ポリペプチドの作用を競合的に阻害するPRO57290ポリペプチドの突然変異した形態であってよい。
別の潜在的PRO57290ポリペプチドアンタゴニストは、例えばアンチセンスRNA又はDNA分子が標的mRNAにハイブリダイズし、蛋白翻訳を予防することによりmRNAの翻訳を直接ブロックする作用を示す、アンチセンス技術を用いて製造されたアンチセンスRNA又はDNA構築物である。アンチセンス技術は三重螺旋形成又はアンチセンスDNA又はRNAを介して遺伝子発現を制御するために使用でき、これ等の方法は両方ともDNA又はRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟PRO57290ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5’コーディング部分を用いて約10〜40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補であるように設計(三重螺旋−Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al.,Science,241:456(1988);Dervan et al.,Science,251:1360(1991))することによりPRO57290ポリペプチドの転写及び生産を予防することができる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてmRNA分子のPRO57290ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Okano,Neurochem.,56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press:Boca Raton,FL,1988))。上記したオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA又はDNAがインビボで発現され、PRO57290ポリペプチドの生産を抑制するように、細胞に送達することもできる。アンチセンスDNAを使用する場合は、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−10〜+10位の間の翻訳開始部位から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
潜在的アンタゴニストはPRO57290ポリペプチドの活性部位、受容体結合部位又は成長因子又は他の関連する結合部位に結合することによりPRO57290ポリペプチドの正常な生物学的活性をブロックする小分子を包含する。小分子の例は限定しないが小型のペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド及び合成の非ペプチジル有機又は無機化合物を包含する。
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイムは相補標的RNAへの配列特異的ハイブリダイズとその後のエンドヌクレアーゼ的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は既知の手法により同定できる。更に詳細な説明については例えばRossi,Current Biology,4:469−471(1994)及びPCT公開WO97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
転写を抑制するために使用される三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でありデオキシヌクレオチドよりなるものでなければならない。これ等のオリゴヌクレオチドの塩基の組成は、Hoogsteenの塩基対形成の規則を介して三重螺旋形成を促進するように設計され、それには一般的に二重らせんの一方の鎖の上にプリン又はピリミジンのかなりの大きさのストレッチが必要である。更に詳細な説明は上出のPCT公開WO97/33551を参照のこと。
これ等の小分子は上記したスクリーニング試験の何れかの1つ以上により、及び/又は、当業者に良く知られている他のスクリーニング手法により、同定することができる。
本明細書に開示した分子の診断及び治療上の使用はまた後に開示及び説明する正の機能の試験のヒットに基づいてもよい。
F.抗PRO57290抗体
本発明は本発明において治療薬及び/又は診断薬として使用してよい抗PRO57290抗体を提供する。例示される抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体を包含する。
本発明は本発明において治療薬及び/又は診断薬として使用してよい抗PRO57290抗体を提供する。例示される抗体はポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体を包含する。
1.ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は好ましくは関連する抗原及びアジュバントの多数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により動物中で形成させる。関連する抗原は(特に合成ペプチドを使用する場合)免疫化すべき種において免疫原となる蛋白にコンジュゲートすることが有用である。例えば抗原は二官能性又は誘導体形成性の物質、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又は、R1N=C=NR(ただしR及びR1は異なるアルキル基である)を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートできる。
ポリクローナル抗体は好ましくは関連する抗原及びアジュバントの多数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により動物中で形成させる。関連する抗原は(特に合成ペプチドを使用する場合)免疫化すべき種において免疫原となる蛋白にコンジュゲートすることが有用である。例えば抗原は二官能性又は誘導体形成性の物質、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又は、R1N=C=NR(ただしR及びR1は異なるアルキル基である)を用いて、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートできる。
例えば100μg又は5μgの蛋白又はコンジュゲート(それぞれウサギ又はマウスの場合)を3容量のフロイント完全アジュバントと混合し、溶液を複数部位に皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して動物を免疫化する。一ヵ月後、複数部位への皮下注射によりフロイント完全アジュバント中ペプチド又はコンジュゲートの元の量の1/5〜1/10を用いて動物をブーストする。7〜14日後、動物から採血し、血清の抗体力価を試験する。力価が平衡に達するまで動物をブーストする。コンジュゲートは蛋白融合物として組み換え細胞培養物中に作成することもできる。更に又、ミョウバンのような凝集剤を適宜使用して免疫応答を増強する。
2.モノクローナル抗体
モノクローナル抗体はKohler et al.,Nature,256:495(1975)によりはじめて記載されたハイブリドーマ法を用いて作成してよく、又は、組み換えDNA法(米国特許第4,816,567号)により作成してもよい。
モノクローナル抗体はKohler et al.,Nature,256:495(1975)によりはじめて記載されたハイブリドーマ法を用いて作成してよく、又は、組み換えDNA法(米国特許第4,816,567号)により作成してもよい。
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適切な宿主動物、例えばハムスターを上記した通り免疫化することにより、免疫化に使用する蛋白に特異的に結合する抗体を生産する又は生産可能であるリンパ球を発生させる。或いはリンパ球はインビトロで免疫化してよい。免疫化の後、リンパ球を単離し、次に適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞系統に融合することによりハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies,Principles and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))。
このように製造されたハイブリドーマ細胞を適当な培地中に播種して成育させるが、その培地は好ましくは未融合の親ミエローマ細胞(融合相手とも称する)の生育又は生存を抑制する物質1つ以上を含有するものである。例えば親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失している場合は、ハイブリドーマに対する選択培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はHGPRT欠損細胞の成育を予防する。
好ましい融合相手のミエローマ細胞は効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高水準生産を支援し、そして未融合親細胞に対抗して選択する選択培地に対して感受性であるものである。好ましいミエローマ細胞系統は、マウスミエローマ系統、例えばSalk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USAより入手可能なMOPC−21及びMPC−11マウス腫瘍より誘導されるもの、及び、American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USAより入手可能なSP−2及び誘導体、例えばX63−Ag8−653細胞である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞系統もまたヒトモノクローナル抗体の生産に関して記載されている(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);及びBrodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51−63(Marcel Dekker,Inc.New York,1987))。
ハイブリドーマ細胞を成育させる培地は抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の生産に関して試験する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降により、又は、インビトロの結合試験、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着試験(ELISA)により、測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は例えばMunson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)に記載のスカッチャード分析により測定できる。
所望の特異性、親和性及び/又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によりクローンをサブクローニングし、標準的な方法により生育させる(Goding,Monoclonal Antibodies,Principles
and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))。この目的のための適当な培地は例えばD−MEM又はRPMI−1640培地を包含する。更に又、ハイブリドーマ細胞は例えばマウスへの細胞の腹腔内注射により、動物における腹水腫瘍としてインビボで生育させてよい。
and Practice,pp.59−103(Academic Press,1986))。この目的のための適当な培地は例えばD−MEM又はRPMI−1640培地を包含する。更に又、ハイブリドーマ細胞は例えばマウスへの細胞の腹腔内注射により、動物における腹水腫瘍としてインビボで生育させてよい。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は従来の抗体精製操作法、例えばアフィニティークロマトグラフィー(例えばプロテインA又はプロテインG−セファロースを使用)又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等により、培地、腹水又は血清から適宜分離する。
モノクローナル抗体をコードするDNAは従来の操作法を用いて(例えばマウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい原料となる。単離後、DNAを発現ベクター内に入れ、これを次に他の態様では抗体蛋白を生産しないE・コリ細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトすることにより組み換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を行う。抗体をコードするDNAの細菌における組み換え発現に関する考察はSkerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256−262(1993)及びPluckthun,Immunol.Revs.130:151−188(1992)を包含する。
モノクローナル抗体又は抗体フラグメントはMcCafferty et al.,Nature 348:552−554(1990)に記載の手法を用いて作成した抗体ファージライブラリから単離できる。Clackson et al.,Nature,352:624−628(1991)及びMarks et al.,J.Mol.Biol.,222:581−597(1991)はファージライブラリを用いたそれぞれマウス及びヒトの抗体の単離を記載している。その後の出版物は鎖シャフリングによる高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生産(Marks et al.,Bio/Technology,10:779−783(1992))並びに極めて大型のファージライブラリを構築するための方策としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組み換え(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265−2266(1993))を記載している。即ち、これ等の手法はモノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法の実行可能な代替法である。
抗体をコードするDNAは例えば相同マウス配列に対してヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(CH及びCL)配列を置換することにより(米国特許第4,816,567号;及びMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))、又は、非免疫グロブリンポリペプチド(非相同ポリペプチド)に対するコーディング配列の全て又は部分に免疫グロブリンコーディング配列を融合することにより、キメラ又は融合抗体のポリペプチドが生産されるように修飾してよい。非免疫グロブリンポリペプチド配列は抗体の定常ドメインに対して置換するか、又は、それらは抗体の1つの抗原複合化部位の可変ドメインに対して置換することにより、抗原に対する特異性を有する1つの抗原複合化部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原複合化部位を含むキメラ2価抗体を生成する。
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗PRO57290抗体は更にヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2又は抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を包含し、これにおいては、レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基で置き換えられている。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が相当する非ヒト残基により置き換えられている。ヒト化抗体は又レシピエント抗体及び移入されたCDR又はフレームワーク配列の何れにも存在しない残基を含んでよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、これにおいてはCDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてFR領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は場合により更に免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む[Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)]。
本発明の抗PRO57290抗体は更にヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化型は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2又は抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を包含し、これにおいては、レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDRに由来する残基で置き換えられている。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が相当する非ヒト残基により置き換えられている。ヒト化抗体は又レシピエント抗体及び移入されたCDR又はフレームワーク配列の何れにも存在しない残基を含んでよい。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、そして典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、これにおいてはCDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてFR領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は場合により更に免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む[Jones et al.,Nature,321:522−525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323−329(1988);及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)]。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該分野で良く知られている。一般的にヒト化抗体は非ヒトである原料からそれに導入されたアミノ酸残基1つ以上を有する。これ等の非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と称され、これ等は典型的には「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は本質的にはげっ歯類のCDR又はCDR配列とヒト抗体の相当する配列を置換することにより、Winter等の方法に従って実施することができる(Jones et al.Nature321:522−525(1986);Riechmann et al.Nature 332:323−327(1988);Verhoeyen et al.Science 239:1534−1536(1988))に従って実施することができる。従ってそのような「ヒト化」抗体は、未損傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種の相当する配列により置換されているキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際、ヒト化抗体は典型的には、一部のCDR残基及び恐らくは一部のFR残基がげっ歯類抗体における類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作成において使用すべき軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性及び抗体がヒトの治療上の使用を意図している場合はHAMA応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従えば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。げっ歯類のものに最も近似しているヒトVドメイン配列を同定し、そして、その内部にあるヒトフレームワーク領域(FR)をヒト化抗体として許容する(Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993);Chothia et al.J.Mol.Biol.196:901(1987))。別の方法は軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から誘導した特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に対して使用してよい(Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta et al.J.Imunol.,151:2623(1993))。
抗原に対する高い結合親和性及び他の望ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化させることが更に重要である。この目標を達成するためには、好ましい方法によれば、親配列及び種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いながら、ヒト化抗体を製造する。三次元の免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者のよく知るものである。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンホーメーション構造を説明してディスプレイするコンピュータプログラムが使用できる。これらのディスプレイを精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の推定される役割の分析、即ち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、FR残基を選択肢、レシピエント及びインポート配列から、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように組み合わせることができる。一般的に超可変領域残基は、抗原結合への影響においては直接、そして最も大きく関与している。
種々の形態のヒト化抗PRO57290抗体が意図される。例えばヒト化抗体は抗体フラグメント、例えばFabであってよく、これは場合によりイムノコンジュゲートを形成するために細胞毒性剤1つ以上にコンジュゲートされる。或いは、ヒト化抗体は未損傷の抗体、例えば未損傷のIgG1抗体であってよい。
ヒト化の代替として、ヒト抗体を形成することができる。例えば免疫化により内因性免疫グロブリン生産の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを作成することができるトランスジェニック動物(例えばマウス)を作成することが現在可能である。例えばキメラ及び生殖細胞系統の突然変異体マウスにおける抗体重鎖連関領域(JH)遺伝子のホモ接合性の欠失が内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが報告されている。ヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖細胞系統突然変異体マウスへの転移は抗原攻撃時のヒト抗体の生産をもたらすことになる。例えばJakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature,362:255−258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immuno.7:33(1993);米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号(全てGenPharm);第5,545,807号;及びWO97/17852を参照のこと。
或いは、ファージディスプレイ技術(McCafferty et al.,Nature 348:552−553[1990])を用いることにより未免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体フラグメントをインビトロで製造することができる。この手法によれば、抗体Vドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージ、例えばM13又はfdの主要な又は副次的な外皮蛋白遺伝子の何れかにインフレームにクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとしてディスプレイさせる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有しているため、抗体の機能的特性に基づいた選択もまたこれ等の特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。即ち、ファージはB細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは例えばJohnson,Kevin S. and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology, 3:564−571(1993)において考察されている種々のフォーマットで実施できる。V遺伝子セグメントの幾つかの原料をファージディスプレイの為に使用できる。Clackson et al.,Nature,352:624−628(1991)は免疫化マウスの脾臓から誘導されたV遺伝子の小型の無作為のコンビナトリアルなライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。本質的にMarks et al.,J.Mol.Biol.222:581−597(1991)又はGriffith et al.,EMBOJ,12:725−734(1993)により記載された手法に従って、未免疫化ヒトドナーのV遺伝子のレパートリーを構築することができ、そして抗原の多様なアレイ(自己抗原を包含)に対する抗体を単離することができる。米国特許第5,565,332号及び第5,573,905号も参照のこと。
上記した通り、ヒト抗体は又、インビトロの活性化B細胞により形成してもよい(米国特許第5,567,610号及び第5,229,275号参照)。
4.抗体フラグメント
特定の状況において、全抗体よりも抗体フラグメントを使用するほうが有利である。より小さいサイズのフラグメントは急速なクリアランスを可能にし、そして固形腫瘍への向上した接触をもたらすと考えられる。
特定の状況において、全抗体よりも抗体フラグメントを使用するほうが有利である。より小さいサイズのフラグメントは急速なクリアランスを可能にし、そして固形腫瘍への向上した接触をもたらすと考えられる。
抗体フラグメントの製造のためには種々の手法が開発されている。伝統的には、これ等のフラグメントは未損傷の抗体の蛋白分解的消化を介して誘導されている(例えばMorimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1192);及びBrennan et al.,Science,229:81(1985)参照)。しかしながら、これ等のフラグメントは現在組み換え宿主細胞により直接製造することができる。Fab、Fv及びScFv抗体フラグメントは全てE・コリにおいて発現させ、これより分泌させることができ、これにより、これ等のフラグメントの大量を効率的に生産できる。抗体フラグメントは上記した抗体ファージライブラリから単離できる。或いは、Fab’−SHフラグメントを直接E・コリから回収し、化学的にカップリングしてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992)。別の方法によれば、F(ab’)2フラグメントは組み換え宿主細胞培養物から直接単離できる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の延長されたFab及びF(ab’)2フラグメントは米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体フラグメントの生産のための他の手法は当業者の知る通りである。選択された抗体は一重鎖Fvフラグメント(scFv)である。WO93/16185;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Fv及びsFvは定常領域を欠いた未損傷の複合化部位を有する限定的種であり;即ち、それらはインビボ使用時の低下した非特異的結合の為に適している。sFv融合蛋白を構築することによりsFvのアミノ又はカルボキシ末端の何れかにエフェクター蛋白を融合させてよい。Antibody Engineering,ed.Borrebaeck,上出を参照のこと。抗体フラグメントは又例えば米国特許第5,641,870号に記載の「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは単一特異性又は二重特異性であってよい。
5.二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示される二重特異性抗体は本明細書に記載するPRO57290蛋白の2つの異なるエピトープに結合してよい。他のそのような抗体はPRO57290の結合部位を他の蛋白に対する結合部位と組み合わせてよい。或いは、PRO57290アームを白血球上のトリガリング分子、例えばT細胞受容体分子(例えばCD3)又はIgGに対するFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)に結合するアームと組み合わせることにより、PRO57290発現細胞に対して細胞防御機序を集中及び局在化させてよい。二重特異性抗体はまたPRO57290ポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させるために使用してよい。これ等の抗体はPRO57290−結合アーム及び細胞毒性剤(例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)に結合するアームを保有している。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント(例えばF(ab’)2二重特異性抗体)として製造できる。
二重特異性抗体は少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示される二重特異性抗体は本明細書に記載するPRO57290蛋白の2つの異なるエピトープに結合してよい。他のそのような抗体はPRO57290の結合部位を他の蛋白に対する結合部位と組み合わせてよい。或いは、PRO57290アームを白血球上のトリガリング分子、例えばT細胞受容体分子(例えばCD3)又はIgGに対するFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)に結合するアームと組み合わせることにより、PRO57290発現細胞に対して細胞防御機序を集中及び局在化させてよい。二重特異性抗体はまたPRO57290ポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させるために使用してよい。これ等の抗体はPRO57290−結合アーム及び細胞毒性剤(例えばサポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)に結合するアームを保有している。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント(例えばF(ab’)2二重特異性抗体)として製造できる。
WO96/16673は二重特異性抗ErbB2/抗−FcγRIII抗体を記載しており、そして米国特許第5,837,234号は二重特異性抗ErbB2/抗−FcγRI抗体を開示している。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体はWO98/02463に示されている。米国特許第5,821,377号は二重特異性抗ErbB2/抗−CD3抗体を教示している。
二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。完全長に重篤異性抗体の伝統的製造は2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、その場合、2つの鎖は異なる特異性を有する(Millstein et al.,Nature 305:537−539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為の取合せのため、これ等のハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、そのうち僅か1種のみが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は面倒であり、そして生成物収率は低値である。同様の操作法がWO93/08829及びTraunecker et al.,EMBOJ,10:3655−3659(1991)に開示されている。
異なる方法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体−抗原複合化部位)を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。好ましくは、融合は少なくとも一部のヒンジ、CH2及びCH3領域を含むIg重鎖定常ドメインと行う。融合の少なくとも1つにおいて存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第1の重鎖定常領域(CH1)を有することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合物及び所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別個の発現ベクターに挿入し安定な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、構築において使用した3種のポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす場合の3種のポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する場合に大きい柔軟性をもたらす。しかしながら、等しい比率における少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、又は、比率が所望の鎖の組合せの収率に有意に影響しない場合は、単一の発現ベクター内に2つ又は3つ全てのポリペプチド鎖に関するコーディング配列を挿入することが可能である。
本発明は一方のアームにおける第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖及び他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対(第2の結合特異性をもたらす)よりなる二重特異性抗体を提供する。この非対称の構造は、二重特異性分子の半片方にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することは分離の効率的方法となるため、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることがわかっている。この方法はWO94/04690に開示されている。二重特異性抗体の形成の更に詳細な説明は例えばSuresh et al.,Methods in Enzymology121:210(1986)を参照のこと。
米国特許第5,731,168号に記載の別の方法によれば、抗体分子対の間の界面を操作することにより組み換え細胞培養から回収されるヘテロ2量体の割合を最大限にすることができる。好ましい界面はCH3ドメインの少なくとも部分を含む。この方法においては、第1の抗体分子の界面に由来する小型アミノ酸側鎖1つ以上をより大きい鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)で置き換える。大型のアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面上には同一又は同様のサイズと大型の側鎖との差を補償する「空洞」が第2の抗体分子の界面上に形成される。これはホモ2量体のような他の望ましくない最終生成物を超えてヘテロ2量体の収率を増大させるための機序を与える。
二重特異性抗体は交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を包含する。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンに、そして他方をビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療のため(WO91/00360、WO92/200373及びEP03089)に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は何れかの好都合な交差結合法を用いて作成してよい。適当な交差結合剤は当該分野で良く知られており、そして多くの交差結合の手法と共に米国特許第4,676,980号に開示されている。
抗体フラグメントから二重特異性抗体を形成するための手法もまた文献に記載されている。例えば二重特異性抗体はキメラ連結を用いて製造できる。Brennan et al.,Science229:81(1985)はF(ab’)2フラグメントを形成するために未損傷の抗体を蛋白分解的に切断する操作法を記載している。これ等のフラグメントをジチオール複合体形成剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元することにより、隣接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィドの形成を予防する。次に形成されたFab’フラグメントをチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。Fab’−TNB誘導体の1つは次にメルカプトエチルアミンで還元することによりFab’−チオールに再変換し、等モル量の他のFab’−TNB誘導体と混合することにより二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための試薬として使用できる。
最近の進歩により、化学的にカップリングすることにより二重特異性抗体を形成できるE・コリからのFab’−SHフラグメントの直接の回収が容易になった。Shalaby et al.,J.Exp.Med.175:217−225(1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記載している。各Fab’フラグメントを別個にE・コリから分泌させ、インビトロの指向性化学カップリングに付すことにより、二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体はErbB2受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合することができ、同時にヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができる。組み換え細胞培養物より直接二重特異性抗体フラグメントを作成して単離する種々の手法も報告されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて製造されている。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547−1553(1992)。Fos及びJun蛋白由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により2種の異なる抗体のFab’部分に連結している。抗体のホモ2量体をヒンジ領域で還元することによりモノマーを形成し、次に、再酸化して抗体ヘテロ2量体を形成している。この方法は又抗体ホモ2量体の製造の為にも利用できる。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444−6448(1993)に記載の「ダイアボディー」手法は二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替機序を与えている。フラグメントは同じ鎖の2ドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーによりVLに連結されたVHを含む。従って、1つのフラグメントのVH及びVLドメインが別のフラグメントの相補VL及びVHドメインに強制的に対形成させられ、これにより2つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Fv(sFv)2量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを作成するための別の方策も報告されている。Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)を参照のこと。
2価より多価の抗体も意図される。例えば3重特異性抗体を作成できる。Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。
6.ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は2つの共有結合した抗体よりなる。このような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のため[WO91/00360、WO92/200373及びEP03089]に提案されている。抗体は交差結合剤を用いる方法を包含する合成蛋白化学における既知の方法を用いてインビトロで製造してよいことを意図している。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、又は、チオエーテル結合の形成により構築してよい。この目的のための適当な試薬の例はイミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチルイミデート及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものを包含する。
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は2つの共有結合した抗体よりなる。このような抗体は例えば望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のため[WO91/00360、WO92/200373及びEP03089]に提案されている。抗体は交差結合剤を用いる方法を包含する合成蛋白化学における既知の方法を用いてインビトロで製造してよいことを意図している。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を用いて、又は、チオエーテル結合の形成により構築してよい。この目的のための適当な試薬の例はイミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチルイミデート及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものを包含する。
7.多価抗体
多価抗体は抗体が結合する相手の抗原を発現する細胞により、2価抗体より急速に内在化(及び/又は異化)される場合がある。本発明の抗体は3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外である)(例えば4価抗体)であることができ、これは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現により容易に製造できる。多価抗体は2量化ドメイン及び3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい2量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を含む(又はそれよりなる)。この設定においては、抗体はFc領域及びFc領域に対してアミノ末端側に3つ以上の抗原結合部位を含むことになる。好ましい多価抗体は本発明においては、3〜約8個、好ましくは4個の抗原結合部位を含む(又はそれよりなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、ここでポリペプチド鎖は2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを含んでよく、式中VD1は第1の可変ドメイン、VD2は第2の可変ドメイン、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1およびX2はアミノ酸又はポリペプチドを示し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖はVH−CH1−フレキシブルリンカー−VH−CH1−Fc領域鎖;又はVH−CH1−VH−CH1−Fc領域鎖を含んでよい。本発明の多価抗体は好ましくは更に少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。本発明の多価抗体は例えば約2〜約8つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書において意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、そして場合により更にCLドメインを含む。
多価抗体は抗体が結合する相手の抗原を発現する細胞により、2価抗体より急速に内在化(及び/又は異化)される場合がある。本発明の抗体は3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外である)(例えば4価抗体)であることができ、これは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組み換え発現により容易に製造できる。多価抗体は2量化ドメイン及び3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい2量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を含む(又はそれよりなる)。この設定においては、抗体はFc領域及びFc領域に対してアミノ末端側に3つ以上の抗原結合部位を含むことになる。好ましい多価抗体は本発明においては、3〜約8個、好ましくは4個の抗原結合部位を含む(又はそれよりなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、ここでポリペプチド鎖は2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを含んでよく、式中VD1は第1の可変ドメイン、VD2は第2の可変ドメイン、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1およびX2はアミノ酸又はポリペプチドを示し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖はVH−CH1−フレキシブルリンカー−VH−CH1−Fc領域鎖;又はVH−CH1−VH−CH1−Fc領域鎖を含んでよい。本発明の多価抗体は好ましくは更に少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。本発明の多価抗体は例えば約2〜約8つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書において意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、そして場合により更にCLドメインを含む。
8.エフェクター機能操作
抗体の抗原依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞毒性(CDC)を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは1つ以上アミノ酸置換を抗体のFc領域に導入することにより達成してよい。代替又は追加として、システイン残基をFc領域に導入することにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合の形成を可能としてよい。このように形成されたホモ2量体抗体は向上した内在化能力及び/又は増大した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有する場合がある。Caron et al.,J.Exp.Med.,176:1191−1195(1992)及びShopes,B.J.Immunol.148:2918−2922(1992)を参照のこと。増強した抗腫瘍活性を有するホモ2量体抗体はまたWolff et al.,Cancer Research53:2560−2565(1993)に記載のヘテロ2官能性交差リンカーを用いて製造してもよい。或いは、二重にFc領域を有するため増強した補体溶解及びADCC能力を有する抗体を製作することもできる。Stevenson et al.,Anti−Cancer Drug Design3:219−230(1989)を参照のこと。抗体の血清中半減期を延長するためには、例えば米国特許第5,739,277号に記載の通り抗体(特に抗体フラグメント)中にサルベージ受容体結合エピトープを取り込んでよい。本明細書においては、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語はIgG分子のインビボの血清中半減期を延長する原因となるIgG分子(例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4)のFc領域のエピトープを指す。
抗体の抗原依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)及び/又は補体依存性細胞毒性(CDC)を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは1つ以上アミノ酸置換を抗体のFc領域に導入することにより達成してよい。代替又は追加として、システイン残基をFc領域に導入することにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合の形成を可能としてよい。このように形成されたホモ2量体抗体は向上した内在化能力及び/又は増大した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有する場合がある。Caron et al.,J.Exp.Med.,176:1191−1195(1992)及びShopes,B.J.Immunol.148:2918−2922(1992)を参照のこと。増強した抗腫瘍活性を有するホモ2量体抗体はまたWolff et al.,Cancer Research53:2560−2565(1993)に記載のヘテロ2官能性交差リンカーを用いて製造してもよい。或いは、二重にFc領域を有するため増強した補体溶解及びADCC能力を有する抗体を製作することもできる。Stevenson et al.,Anti−Cancer Drug Design3:219−230(1989)を参照のこと。抗体の血清中半減期を延長するためには、例えば米国特許第5,739,277号に記載の通り抗体(特に抗体フラグメント)中にサルベージ受容体結合エピトープを取り込んでよい。本明細書においては、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語はIgG分子のインビボの血清中半減期を延長する原因となるIgG分子(例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4)のFc領域のエピトープを指す。
9.イムノコンジュゲート
本発明はまた細胞毒性剤、例えば化学療法剤、成長抑制剤、毒素(例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント)又は放射性同位体(例えば放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。
本発明はまた細胞毒性剤、例えば化学療法剤、成長抑制剤、毒素(例えば細菌、カビ、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント)又は放射性同位体(例えば放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。
このような免疫コンジュゲートの形成において有用な化学療法剤は上記の通りである。使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントはジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンA鎖(シュードモナス・アエルギノーサ由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites Fordii蛋白、ジアンシン蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII及びPAP−S)、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の製造のために使用できる。例は212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを包含する。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の2官能性蛋白カップリング剤、例えばN−スクシンイミジル3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの2官能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(例えばジスクシンイミジルズベレート)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えばビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(例えばビス(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトリエン2,6−ジイソシアネート)及びビス活性フッ素化合物(例えば1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンはVitetta et al.,Science,238:1098(1987)に記載の通り製造できる。炭素−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX−DTPA)は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。
抗体及び1つ以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン及びCC1065及び毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体のコンジュゲートもまた本発明において意図している。
マイタンシン及びマイタンシノイド
本発明はマイタンシノイド分子1つ以上にコンジュゲートした抗PRO57290抗体(完全長又はフラグメント)を提供する。
本発明はマイタンシノイド分子1つ以上にコンジュゲートした抗PRO57290抗体(完全長又はフラグメント)を提供する。
マイタンシノイドはチュブリン重合を抑制することにより機能する有糸分裂抑制剤である。マイタンシンは東アフリカの潅木であるMaytenus serrataから最初に単離された(米国特許第3,896,111号)。その後、特定の微生物もまたマイタンシノイド、例えばマイタンシノール及びC−3マイタンシノールエステルを生産することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成のマイタンシノール及びその誘導体及び類似体は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,137,230号;第4,248,870号;第4,256,746号;第4,260,608号;第4,265,814号;第4,294,757号;第4,307,016号;第4,308,268号;第4,308,269号;第4,309,428号;第4,313,946号;第4,315,929号;第4,317,821号;第4,322,348号;第4,331,598号;第4,361,650号;第4,364,866号;第4,424,219号;第4,450,254号;第4,362,663号;および第4,371,533号に開示されている。
マイタンシノイド−抗体コンジュゲート
その治療指数を向上させる試みにおいて、マイタンシン及びマイタンシノイドは腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされている。マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びその治療用途は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,208,020号、第5,416,064号及び欧州特許EP0425235B1に開示されている。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618−8623(1996)はヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体C242に連結したDM1と指名されたマイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対しては高度に細胞毒性であることがわかり、そしてインビボの腫瘍生育試験において抗腫瘍活性を示している。Chari et al.,Cancer Research52:127−131(1992)はヒト結腸癌細胞系統上の抗原に結合するマウス抗体A7に、又は、HER−2/neu癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体TA.1にジスルフィドリンカーを介してマイタンシノイドをコンジュゲートしている免疫コンジュゲートを記載している。TA.1−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は細胞当たり3x105HER−2表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系統SK−BR−3に対してインビトロで試験されている。薬剤コンジュゲートは遊離のマイタンシノイド薬剤と同様の細胞毒性の程度を達成しており、これは抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大させることができた。A7−マイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
その治療指数を向上させる試みにおいて、マイタンシン及びマイタンシノイドは腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートされている。マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びその治療用途は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,208,020号、第5,416,064号及び欧州特許EP0425235B1に開示されている。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618−8623(1996)はヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体C242に連結したDM1と指名されたマイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対しては高度に細胞毒性であることがわかり、そしてインビボの腫瘍生育試験において抗腫瘍活性を示している。Chari et al.,Cancer Research52:127−131(1992)はヒト結腸癌細胞系統上の抗原に結合するマウス抗体A7に、又は、HER−2/neu癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体TA.1にジスルフィドリンカーを介してマイタンシノイドをコンジュゲートしている免疫コンジュゲートを記載している。TA.1−マイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性は細胞当たり3x105HER−2表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系統SK−BR−3に対してインビトロで試験されている。薬剤コンジュゲートは遊離のマイタンシノイド薬剤と同様の細胞毒性の程度を達成しており、これは抗体分子当たりのマイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大させることができた。A7−マイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
抗PRO57290抗体−マイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗PRO57290抗体マイタンシノイドコンジュゲートは抗体又はマイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低下させること無くマイタンシノイド分子に抗PRO57290抗体を化学的に連結することにより製造する。抗体分子当たり平均3〜4個のマイタンシノイド分子をコンジュゲートすると抗体の機能又は溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する場合に有効であることがわかっているが、1分子毒素/抗体であっても抗体単独の使用よりも細胞毒性を増強できることが期待される。マイタンシノイドは当該分野でよく知られており、そして既知の手法により合成するか、又は、天然原料から単離することができる。適当なマイタンシノイドは例えば米国特許第5,208,020号に、そして、上記した他の特許又は非特許の公開物に開示されている。好ましいマイタンシノイドはマイタンシノール及び芳香環において、又は、マインタンシノール分子の他の位置において修飾されているマインタンシノール類似体、例えば種々のマインタンシノールエステルである。
抗PRO57290抗体マイタンシノイドコンジュゲートは抗体又はマイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低下させること無くマイタンシノイド分子に抗PRO57290抗体を化学的に連結することにより製造する。抗体分子当たり平均3〜4個のマイタンシノイド分子をコンジュゲートすると抗体の機能又は溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性を増強する場合に有効であることがわかっているが、1分子毒素/抗体であっても抗体単独の使用よりも細胞毒性を増強できることが期待される。マイタンシノイドは当該分野でよく知られており、そして既知の手法により合成するか、又は、天然原料から単離することができる。適当なマイタンシノイドは例えば米国特許第5,208,020号に、そして、上記した他の特許又は非特許の公開物に開示されている。好ましいマイタンシノイドはマイタンシノール及び芳香環において、又は、マインタンシノール分子の他の位置において修飾されているマインタンシノール類似体、例えば種々のマインタンシノールエステルである。
抗体−マイタンシノイドコンジュゲートを作成するための当該分野で知られた連結基は多数存在し、例えば米国特許第5,208,020号又は欧州特許EP0425235B1及びChari et al.,Cancer Research52:127−131(1992)に開示されているもの等が挙げられる。連結基は上記特許に開示されている通りジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基を包含するが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とマイタンシノイドのコンジュゲートは種々の2官能性蛋白カップリング剤、例えばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの2官能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(例えばジスクシンイミジルズベレート)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えばビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(例えばビス(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン2,6−ジイソシアネート)及びビス活性フッ素化合物(例えば1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を用いて作成してよい。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合を与えるためのN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)(Carlsson et al.,Biochem.J.,173,723−737(1978))及びN−スクシンイミジル−4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)を包含する。
リンカーは連結部の型に応じて種々の位置においてマイタンシノイド分子に結合してよい。例えば、エステル結合は従来のカップリング手法を用いてヒドロキシル基との反応により形成してよい。反応はヒドロキシル基を有するC3位、ヒロドキシメチルで修飾されたC14位、ヒドロキシル基で修飾されたC15位及びヒドロキシル基を有するC20位において起こってよい。連結はマイタンシノール又はマイタンシノール類似体のC3位において形成される。
カリケアマイシン
目的の免疫コンジュゲートの別のものはカリケアマイシン分子1つ以上にコンジュゲートした抗PRO57290抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度にいおいて2本鎖DNA切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの製造に関しては米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、第5,877,296号を参照のこと(全てAmerican Cyanamid Company)。使用してよいカリケアマイシンの構造的類似体は例えばγ1 I、α2 I、α3 I、N−アセチル−γ1 I、PSAG及びθI l(Himman et al.,Cancer Research53:3336−3342(1993)、Lode et al.,Cancer Research 58:2925−2928(1998)及び上記したAmerican Cyanamidへの米国特許)であるが、これらに限定されない。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍剤は抗葉酸エステルであるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介内在を介したこれらの薬剤の細胞内取り込みはその細胞毒性作用を大きく増大させる。
目的の免疫コンジュゲートの別のものはカリケアマイシン分子1つ以上にコンジュゲートした抗PRO57290抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはピコモル未満の濃度にいおいて2本鎖DNA切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの製造に関しては米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、第5,877,296号を参照のこと(全てAmerican Cyanamid Company)。使用してよいカリケアマイシンの構造的類似体は例えばγ1 I、α2 I、α3 I、N−アセチル−γ1 I、PSAG及びθI l(Himman et al.,Cancer Research53:3336−3342(1993)、Lode et al.,Cancer Research 58:2925−2928(1998)及び上記したAmerican Cyanamidへの米国特許)であるが、これらに限定されない。抗体をコンジュゲートできる別の抗腫瘍剤は抗葉酸エステルであるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは両方とも細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介内在を介したこれらの薬剤の細胞内取り込みはその細胞毒性作用を大きく増大させる。
他の細胞毒性剤
本発明の抗PRO57290抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤はBCNU、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び5−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、第5,770,710に号記載の総称LL−E33288複合体として知られる薬剤ファミリー、並びに、エスペラマイシン(米国特許第5,877,296号)を包含する。
本発明の抗PRO57290抗体にコンジュゲートできる他の抗腫瘍剤はBCNU、ストレプトゾシン、ビンクリスチン及び5−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、第5,770,710に号記載の総称LL−E33288複合体として知られる薬剤ファミリー、並びに、エスペラマイシン(米国特許第5,877,296号)を包含する。
使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エキソトキシンA鎖(シュードモナス・アエルギノーサ由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites Fordii蛋白、ジアンシン蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII及びPAP−S)、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。例えば1993年10月28日に公開されたWO93/21232を参照のこと。
本発明は更に抗体と核溶解活性を有する化合物との間に形成される免疫コンジュゲートを意図している(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNase)。
腫瘍の選択的破壊のためには、抗体は高度に放射性の原子を含んでよい。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗PRO57290抗体の製造のために使用される。例示されるものはAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体を包含する。検出のためにコンジュゲートを使用する場合は、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)画像化(磁気共鳴画像化MRIとしても知られている)のためのスピン標識、例えばヨウ素−123、更にヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
放射標識又は他の標識を既知の方法でコンジュゲートに取り込ませてよい。例えば、水素の代わりにフッ素−19を含む適当なアミノ酸前駆体を用いて、ペプチドを生合成するか、又はアミノ酸化学合成法により合成してよい。tc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111のような標識をペプチド内のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−90はリジン残基を介して結合できる。IODOGEN法(Fraker et al(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49−57)を用いてヨウ素−123を取り込むことができる。Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(Chatal,CRC Press 1989)は他の方法を詳細に説明している。
抗体と細胞毒性剤のコンジュゲートは種々の2官能性の蛋白カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの2官能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(例えばジスクシンイミジルズベレート)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えばビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビスジアゾニウム誘導体(例えばビス(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトリエン2,6−ジイソシアネート)及びビス活性フッ素化合物(例えば1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を用いて作成してよい。例えば、リシンイムノトキシンはVitetta et al.,Science,238:1098(1987)に記載の通り製造できる。炭素−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX−DTPA)は抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示されるキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは細胞内での細胞毒性剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al.,Cancer Research52:127−131(1992);米国特許第5,208,020号)を使用してよい。
或いは、抗PRO57290抗体及び細胞毒性剤を含む融合蛋白は例えば組み換え手法又はペプチド合成により作成してよい。DNAの長さは相互に隣接するかコンジュゲートの所望の特性を損なわないリンカーペプチドをコードする領域により分離されているコンジュゲートの2つの部分をコードするそれぞれの領域を含んでよい。
本発明によれば、抗体は、抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、その後浄化剤を用いて循環系より未結合コンジュゲートを除去し、そして次に細胞毒性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートした「リガンド」(例えばアビジン)を投与する腫瘍の予備ターゲティングにおいて利用するための「受容体」(例えばストレプトアビジン)にコンジュゲートしてよい。
10.免疫リポソーム
本明細書に開示した抗PRO57290抗体はまた免疫リポソームとして製剤してよい。「リポソーム」は哺乳類における薬剤の送達のために有用な脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤の種々の型よりなる小型の小胞である。リポソームの成分は一般的には生物学的な膜の脂質の配置と同様に二層形態に配置している。抗体を含有するリポソームは例えばEpstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980);米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号;及び1997年10月23日に公開されたWO97/38731に記載されているような当該分野で知られた方法により製造される。長期の循環時間を有するリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
本明細書に開示した抗PRO57290抗体はまた免疫リポソームとして製剤してよい。「リポソーム」は哺乳類における薬剤の送達のために有用な脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤の種々の型よりなる小型の小胞である。リポソームの成分は一般的には生物学的な膜の脂質の配置と同様に二層形態に配置している。抗体を含有するリポソームは例えばEpstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030(1980);米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号;及び1997年10月23日に公開されたWO97/38731に記載されているような当該分野で知られた方法により製造される。長期の循環時間を有するリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により形成することができる。リポソームを所定の孔径のフィルターを通して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のFab’フラグメントはジスルフィド相互交換反応によりMartin et al.,J.Biol.Chem.257:286−288(1982)に記載の通りリポソームにコンジュゲートできる。化学療法剤を場合によりリポソーム内に含有させる。Gabizon et al.,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)を参照のこと。
11.抗体の医薬組成物
本発明により同定されるPRO57290ポリペプチド並びに前述したスクリーニング試験により同定される他の分子に特異的に結合する抗体を医薬組成物の形態において種々の障害の治療のために投与できる。
本発明により同定されるPRO57290ポリペプチド並びに前述したスクリーニング試験により同定される他の分子に特異的に結合する抗体を医薬組成物の形態において種々の障害の治療のために投与できる。
PRO57290ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体を阻害剤として使用する場合は、内在化抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクション又はリポソームはまた抗体又は抗体フラグメントを細胞に送達するためにも使用できる。抗体フラグメントを用いる場合は、標的蛋白の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的蛋白配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計できる。そのようなペプチドは化学合成及び/又は組み換えDNA技術による製造が可能である。例えばMarasco et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889−7893(1993)を参照のこと。本発明の製剤は又、治療すべき特定の適応症のために必要に応じて1つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補足的な活性を有するものを含有してよい。代替として、又は追加的に、組成物はその機能を増強する薬剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤又は成長抑制剤を含んでよい。このような分子は意図する目的のために有効である量における組み合わせにおいて適宜存在する。
活性成分はまた例えばコアセルベーション法によるか、又は、界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマクロエマルジョン中に捕獲させてもよい。このような手法は上出のRemington’s Pharmaceuical Sciencesに開示されている。
インビボ投与のために使用されるべき製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過メンブレンを通過する濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を製造してよい。持続放出製剤の適当な例は抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスを包含し、そのようなマトリックスは形状付与された物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸及びγエチル−L−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能な微小球)及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のような重合体は100日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間に蛋白を放出する。カプセル化抗体が身体内に長時間残存する場合、それらは、37℃の水分への曝露の結果として、変性するか凝集し、生物学的活性を消失するか、又は、免疫原性が変化する可能性がある。合理的な方策は関与する機序に応じて安定化のために考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ−ジスルフィド交換を介した分子間S−S結合の形成であることが発見されれば、スルフィドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、及び、特定の重合体マトリックス組成物の開発により安定化を達成してよい。
G.抗PRO57290抗体の使用
本発明の抗PRO57290抗体は神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;胚発生の障害又は致死性又は代謝異常に関する種々の治療上及び/又は診断上の有用性を有する。例えば、抗PRO57290抗体は抗PRO57290に関する診断試験、例えば特定の細胞、組織又は血清におけるその発現(及び一部の場合は示差的発現)を検出することにおいて使用してよい。当該分野で知られた種々の診断試験の手法、例えば競合的結合試験、直接又は間接のサンドイッチ試験及び不均質又は均質な相の何れかにおいて行う免疫沈降試験を使用してよい[Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)pp.147−158]。診断試験において使用される抗体は検出可能な部分で標識できる。検出可能な部分は直接又は間接的に検出可能なシグナルを生成することができるものでなければならない。例えば検出可能な部分は放射性同位体、例えば3H、14C、32P、35S又は125I、蛍光又はケミルミネセント化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン、又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビパーオキシダーゼであってよい。検出可能な部分に抗体をコンジュゲートするための当該分野で知られた何れかの知られた方法、例えばHunter et al.,Nature,144:945(1962);David et al.,Biochemistry,13:1014(1974);Pain et al.,J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygren,J.Histochem. and Cytochem.,30:407(1982)に記載のものを使用してよい。
本発明の抗PRO57290抗体は神経障害;心臓血管、内皮又は脈管形成の障害;免疫不全;腫瘍学的障害;胚発生の障害又は致死性又は代謝異常に関する種々の治療上及び/又は診断上の有用性を有する。例えば、抗PRO57290抗体は抗PRO57290に関する診断試験、例えば特定の細胞、組織又は血清におけるその発現(及び一部の場合は示差的発現)を検出することにおいて使用してよい。当該分野で知られた種々の診断試験の手法、例えば競合的結合試験、直接又は間接のサンドイッチ試験及び不均質又は均質な相の何れかにおいて行う免疫沈降試験を使用してよい[Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)pp.147−158]。診断試験において使用される抗体は検出可能な部分で標識できる。検出可能な部分は直接又は間接的に検出可能なシグナルを生成することができるものでなければならない。例えば検出可能な部分は放射性同位体、例えば3H、14C、32P、35S又は125I、蛍光又はケミルミネセント化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン、又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビパーオキシダーゼであってよい。検出可能な部分に抗体をコンジュゲートするための当該分野で知られた何れかの知られた方法、例えばHunter et al.,Nature,144:945(1962);David et al.,Biochemistry,13:1014(1974);Pain et al.,J.Immunol.Meth.,40:219(1981);及びNygren,J.Histochem. and Cytochem.,30:407(1982)に記載のものを使用してよい。
抗PRO57290抗体は又組み換え細胞培養物又は天然原料からのPRO57290ポリペプチドのアフィニティー精製の為にも有用である。この過程においてはPRO57290ポリペプチドに対する抗体を当該分野で良く知られている方法を用いてセファデックス樹脂又は濾紙のような適当な支持体上に固定化する。次に固定化された抗体を精製すべきPRO57290ポリペプチドを含有する試料と接触させ、その後、固定化抗体に結合しているPRO57290ポリペプチドを除き試料中の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に抗体からPRO57290ポリペプチドを遊離させる別の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は説明のみを目的としており、本発明の範囲を如何なる面でも限定する意図はない。
本明細書において引用した全ての特許及び文献の参考資料は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
実施例において言及される市販の試薬は、他に指示がない限り、製造者の指示書に従って使用した。以下の実施例において、また本明細書を通して、ATCCアクセッション番号によって同定される細胞の起源は、American Type Culture Collection,Manassas,VAである。
(実施例1:新規のポリペプチドおよびそれらをコードするcDNAを同定するための細胞外ドメインホモロジースクリーニング)
Swiss−Prot公的データベースからの約950個の既知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(もしあれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースを検索するために使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)および企業のデータベース(例えば、LIFESEQTM,Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を含んだ。検索は、コンピュータプログラムBLASTまたはBLAST−2(Altschul et al.,Methods in Enzymology,266:460−480(1996))を使用して、ECDタンパク質配列の、EST配列の6フレーム翻訳との比較として実施された。既知のタンパク質をコードしなかった、BLASTスコアが70(またはいくつかの場合においては90)またはそれ以上の比較結果を、クラスター化し、そしてプログラム「phrap」(Phil Green,University of Washington,Seattle,WA)を用いてコンセンサスDNA配列を構築した。
Swiss−Prot公的データベースからの約950個の既知の分泌タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列(もしあれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースを検索するために使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)および企業のデータベース(例えば、LIFESEQTM,Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を含んだ。検索は、コンピュータプログラムBLASTまたはBLAST−2(Altschul et al.,Methods in Enzymology,266:460−480(1996))を使用して、ECDタンパク質配列の、EST配列の6フレーム翻訳との比較として実施された。既知のタンパク質をコードしなかった、BLASTスコアが70(またはいくつかの場合においては90)またはそれ以上の比較結果を、クラスター化し、そしてプログラム「phrap」(Phil Green,University of Washington,Seattle,WA)を用いてコンセンサスDNA配列を構築した。
この細胞外ドメインホモロジースクリーニングを使用して、コンセンサスDNA配列を、phrapを使用して他の同定されているEST配列に対して構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(必ずしもそうではないが)BLASTまたはBLAST−2およびphrapの繰り返しサイクルを使用して、伸長することにより、上に記載したEST配列の起源を使用してできる限りコンセンサス配列を伸長した。
上に記載したように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを、目的の配列を含むcDNAライブラリをPCRによって同定するためおよびPROポリペプチドについての完全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために合成し、使用した。順方向および逆方向PCRプライマーは、一般に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、約100〜1000bp長のPCR産物が得られるように設計されることが多い。プローブ配列は、代表的には40〜55bp長である。いくつかの場合において、コンセンサス配列が約l〜1.5kbpより大きいとき、さらなるオリゴヌクレオチドを合成する。完全長クローンについていくつかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリ由来のDNAを、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biologyのように、PCRプライマー対を用いてPCR増幅によってスクリーニングした。次いで、陽性のライブラリを使用して、プローブオリゴヌクレオチドおよびプライマー対の一方を用いて目的の遺伝子をコードするクローンを単離した。
cDNAクローンを単離するために使用したcDNAライブラリを、Invitrogen,San Diego,CAの試薬などの市販の試薬を使用して標準的な方法によって構築した。cDNAを、NotI部位を含むオリゴdTをプライマーとし、SalIヘミキナーゼ処理された(hemikinased)アダプターに平滑末端で連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動によって適切にサイズ分離し、適当なクローニングベクター(例えば、pRKBまたはpRKD);pRK5Bは、SfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes et al.,Science,253:1278−1280(1991)を参照のこと)に所定の方向で独特のXhoI部位およびNotI部位においてクローニングした。
(実施例2:アミラーゼスクリーニングによるcDNAクローンの単離) (1.オリゴdTをプライマーとするcDNAライブラリの調製)
mRNAを、Invitrogen,San Diego,CA(Fast Track2)の試薬およびプロトコルを使用して目的のヒト組織から単離した。このRNAを使用し、Life Technologies,Gaithersburg,MD(Super Script Plasmid System)の試薬およびプロトコルを使用して、ベクターpRK5Dに、オリゴdTをプライマーとするcDNAライブラリを生成した。この手順において、二本鎖cDNAのうち、1000bpより大きいものを分離し、SalI/NotIリンカー付加されたcDNAを、XhoI/NotI切断されたベクターにクローニングした。pRK5Dは、XhoI/NotI cDNAクローニング部位の前に、sp6転写開始部位、SfiI制限酵素部位の順でそれらを有するクローニングベクターである。
mRNAを、Invitrogen,San Diego,CA(Fast Track2)の試薬およびプロトコルを使用して目的のヒト組織から単離した。このRNAを使用し、Life Technologies,Gaithersburg,MD(Super Script Plasmid System)の試薬およびプロトコルを使用して、ベクターpRK5Dに、オリゴdTをプライマーとするcDNAライブラリを生成した。この手順において、二本鎖cDNAのうち、1000bpより大きいものを分離し、SalI/NotIリンカー付加されたcDNAを、XhoI/NotI切断されたベクターにクローニングした。pRK5Dは、XhoI/NotI cDNAクローニング部位の前に、sp6転写開始部位、SfiI制限酵素部位の順でそれらを有するクローニングベクターである。
(2.ランダムプライマーをプライマーとするcDNAライブラリの調製)
1次cDNAクローンの5’末端を優先的に表すために、2次cDNAライブラリを構築した。Sp6RNAを1次ライブラリ(上記)から生成し、このRNAを使用し、Life Technologies(Super Script Plasmid System,上を参照のこと)の試薬およびプロトコルを使用して、ランダムプライマーをプライマーとするcDNAライブラリをベクターpSST−AMY.0に構築した。この手順において、二本鎖cDNAを、500〜1000bpに分離し、NotIアダプターに平滑末端でリンカー付加し、SfiIで切断し、そしてSfiI/NotIで切断されたベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位およびマウスアミラーゼ配列の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(分泌シグナルなしの成熟配列)、続いて、クローニング部位の後に酵母アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターを有するクローニングベクターである。このようにして、アミラーゼ配列とインフレームで融合されたこのベクターにクローニングされたcDNAは、適切にトランスフェクトされた酵母コロニーからアミラーゼを分泌するようになる。
1次cDNAクローンの5’末端を優先的に表すために、2次cDNAライブラリを構築した。Sp6RNAを1次ライブラリ(上記)から生成し、このRNAを使用し、Life Technologies(Super Script Plasmid System,上を参照のこと)の試薬およびプロトコルを使用して、ランダムプライマーをプライマーとするcDNAライブラリをベクターpSST−AMY.0に構築した。この手順において、二本鎖cDNAを、500〜1000bpに分離し、NotIアダプターに平滑末端でリンカー付加し、SfiIで切断し、そしてSfiI/NotIで切断されたベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位およびマウスアミラーゼ配列の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(分泌シグナルなしの成熟配列)、続いて、クローニング部位の後に酵母アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターを有するクローニングベクターである。このようにして、アミラーゼ配列とインフレームで融合されたこのベクターにクローニングされたcDNAは、適切にトランスフェクトされた酵母コロニーからアミラーゼを分泌するようになる。
(3.形質転換および検出)
上の段落2に記載したライブラリ由来のDNAを氷上で冷やし、エレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technologies,20ml)に加えた。次いで細菌およびベクター混合物を、製造者によって推奨されているように電気穿孔処理した。続いて、SOC培地(Life Technologies,1ml)を加えて、混合物を37℃で30分間インキュベートした。次いで、形質転換体をアンピシリンを含む標準的な150mmLBプレート20枚に播き、16時間インキュベートした(37℃)。陽性のコロニーをプレートから拾い、そのDNAを標準的なプロトコル、例えば、CsCl勾配を使用して細菌のペレットから単離した。次いで、精製されたDNAを以下の酵母プロトコルに用いた。
上の段落2に記載したライブラリ由来のDNAを氷上で冷やし、エレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technologies,20ml)に加えた。次いで細菌およびベクター混合物を、製造者によって推奨されているように電気穿孔処理した。続いて、SOC培地(Life Technologies,1ml)を加えて、混合物を37℃で30分間インキュベートした。次いで、形質転換体をアンピシリンを含む標準的な150mmLBプレート20枚に播き、16時間インキュベートした(37℃)。陽性のコロニーをプレートから拾い、そのDNAを標準的なプロトコル、例えば、CsCl勾配を使用して細菌のペレットから単離した。次いで、精製されたDNAを以下の酵母プロトコルに用いた。
酵母法は、3つのカテゴリーに分けられる:(1)プラスミド/cDNA結合ベクターによる酵母の形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出および単離;ならびに(3)酵母コロニーからの直接の挿入断片のPCR増幅ならびに配列決定およびさらなる解析のためのそのDNAの精製。
使用した酵母株は、HD56−5A(ATCC−90785)であった。この株は、以下の遺伝子型:MATアルファ、ura3−52、leu2−3、leu2−112、his3−11、his3−15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、翻訳後経路を欠く酵母変異体が、使用され得る。このような変異体は、sec71、sec72、sec62において転座不全(translocation deficient)対立遺伝子を有し得、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な作用を干渉するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチドおよび/またはリガンドを含む)、この翻訳後経路に関連する他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1pまたはSSA1p−4p)またはこれらのタンパク質の複合体形成物もまた、好ましくは、アミラーゼを発現する酵母と組み合わせて使用され得る。
形質転換は、Gietz et al.,Nucl.Acid.Res.,20:1425(1992)によって概説されているプロトコルに基づいて行われた。次いで、形質転換された細胞を寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に接種し、30℃で一晩生育した。YEPDブロスを、Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,p.207(1994)に記載されているように調製した。次いで、一晩培養したものを、新鮮YEPDブロス(500ml)に約2×106細胞/ml(およそOD600=0.1)に希釈し、1×107細胞/ml(およそOD600=0.4〜0.5)まで再び生育した。
次いで、細胞を回収し、形質転換に向けて調製し、GS3ローター瓶に移し、Sorval GS3ローターにて5,000rpmで5分間、遠心分離し、上清を廃棄し、次いで、滅菌水に再懸濁し、Beckman GS−6KR遠心機において、50mlファルコンチューブにて3,500rpmで再度遠心分離した。その上清を廃棄し、続いて細胞をLiAc/TE(10ml,10mM Tris−HCl,1mM EDTA pH7.5,100mM Li2OOCCH3)で洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)に再懸濁した。
微量遠心チューブ内で、調製した細胞(100μl)と、新たに変性された一本鎖サケ精巣DNA(Lofstrand Labs,Gaithersburg,MD)と形質転換DNA(1μg、10μl未満の体積)とを混合することによって形質転換を起こした。混合物をボルテックスにより手短に混合し、次いで、40%PEG/TE(600μl,40%ポリエチレングリコール−4000,10mM Tris−HCl,1mM EDTA,100mM Li2OOCCH3,pH7.5)を加えた。この混合物を穏やかに混合し、30分間、撹拌しながら30℃でインキュベートした。次いで、細胞を15分間、42℃の熱ショックにかけ、反応容器を12,000rpmで5〜10秒間微量遠心し、デカントし、そしてTE(500μl,10mM Tris−HCl,1mM EDTA pH7.5)に再懸濁した後、再度遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)に希釈し、アリコート(200μl)を、150mm増殖プレート(VWR)に予め調製された選択培地に播いた。
あるいは、多数の少量反応の代わりに、形質転換を、単一の大規模反応を使用して実施し、ここで試薬の量は、それに合うようにスケールアップした。
使用した選択培地は、Kaiser et al.,Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Press,Cold
Spring Harbor,NY,p.208−210(1994)に記載されているように調製されたウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体を、30℃にて2〜3日間生育した。
Spring Harbor,NY,p.208−210(1994)に記載されているように調製されたウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体を、30℃にて2〜3日間生育した。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出を、選択増殖培地中に赤デンプン(red starch)を含ませることによって行った。Biely et al.,Anal. Biochem.,172:176−179(1988)によって報告されている手順により、デンプンを赤色色素(Reactive Red−120,Sigma)に結合させた。結合したデンプンを、最終濃度0.15%(w/v)でSCD−Ura寒天プレートに取り込ませ、リン酸カリウムを用いてpH7.0(50〜100mMの最終濃度)まで緩衝した。
十分に分離し、同定可能な単一のコロニーを得るために、陽性のコロニーを拾い、新鮮選択培地(150mmプレート上)に画線した。アミラーゼ分泌が陽性の十分に分離した単一のコロニーを、緩衝SCD−Ura寒天に赤デンプンを直接取り込むことによって検出した。陽性のコロニーを、デンプンを分解して、陽性のコロニーの周辺に直接可視化されるクリアなハローを生じる能力によって判定した。
(4.PCR増幅によるDNAの単離)
陽性のコロニーを単離したら、その一部をつま楊枝で拾い、96ウェルプレート内の滅菌水(30μl)に希釈した。このとき、陽性のコロニーを、凍結して次の解析のために保存するか、またはすぐに増幅した。細胞のアリコート(5μl)を、25μl容量中、以下:0.5μlのKlentaq(Clontech,Palo Alto,CA);4.0μlの10mM dNTP’s(Perkin Elmer−Cetus);2.5μlのKentaq緩衝液(Clontech);0.25μlの順方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含むPCR反応用の鋳型として使用した。
陽性のコロニーを単離したら、その一部をつま楊枝で拾い、96ウェルプレート内の滅菌水(30μl)に希釈した。このとき、陽性のコロニーを、凍結して次の解析のために保存するか、またはすぐに増幅した。細胞のアリコート(5μl)を、25μl容量中、以下:0.5μlのKlentaq(Clontech,Palo Alto,CA);4.0μlの10mM dNTP’s(Perkin Elmer−Cetus);2.5μlのKentaq緩衝液(Clontech);0.25μlの順方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含むPCR反応用の鋳型として使用した。
順方向オリゴヌクレオチド1の配列は:
5’−TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT−3’ (配列番号3)であった。
5’−TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT−3’ (配列番号3)であった。
逆方向オリゴヌクレオチド2の配列は:
5’−CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT−3’ (配列番号4)であった。
5’−CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT−3’ (配列番号4)であった。
次いで、PCRを以下のとおりに行った:
a.変性 92℃、5分
b.変性 92℃、30秒
アニーリング 59℃、30秒
伸長 72℃、60秒を3サイクル
c.変性 92℃、30秒
アニーリング 57℃、30秒
伸長 72℃、60秒を3サイクル
d.変性 92℃,30秒
アニーリング 55℃,30秒
伸長 72℃,60秒を25サイクル
e.4℃保持。
a.変性 92℃、5分
b.変性 92℃、30秒
アニーリング 59℃、30秒
伸長 72℃、60秒を3サイクル
c.変性 92℃、30秒
アニーリング 57℃、30秒
伸長 72℃、60秒を3サイクル
d.変性 92℃,30秒
アニーリング 55℃,30秒
伸長 72℃,60秒を25サイクル
e.4℃保持。
オリゴヌクレオチドの下線を引いた領域を、それぞれ、ADHプロモーター領域およびアミラーゼ領域にアニーリングさせ、挿入断片が存在しないとき、ベクターpSST−AMY.0から307bpの領域を増幅した。代表的には、これらのオリゴヌクレオチドの5’末端の最初の18ヌクレオチドは、配列決定プライマー用のアニーリング部位を含んでいた。従って、空のベクターからのPCR反応の総産物は、343bpであった。しかしながら、シグナル配列融合cDNAは、かなり長いヌクレオチド配列を生じた。
PCRの後、反応物(5μl)のアリコートを、Sambrook et al.,前出に記載されているようなTris−ホウ酸塩−EDTA(TBE)緩衝液系を使用した1%アガロースゲルのアガロースゲル電気泳動にかけた。400bpより長い単一の強力なPCR産物を生じたクローンを、96Qiaquick PCR精製カラム(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)で精製後、DNA配列決定によってさらに解析した。
実施例3:シグナルアルゴリズム解析を使用したcDNAクローンの単離
様々なポリペプチドをコードする核酸配列を、Genentech,Inc.(South San Francisco,CA)によって開発された、ESTに基づく企業のシグナル配列探索アルゴリズムを適用することによって同定するだけでなく、クラスター化し、公的データベース(例えば、GenBank)および/または民間データベース(LIFESEQ(登録商標),Incyte Pharmaceuticals,Inc.,Palo Alto,CA)からESTフラグメントを構築した。シグナル配列アルゴリズムは、目的の配列または配列フラグメントの5’−末端の第1および必要に応じて第2のメチオニンコドン(ATG)周辺のDNAヌクレオチドの特徴に基づいて、分泌シグナルスコアを計算する。1番目のATGの後のヌクレオチドは、いかなる終止コドンも有しない少なくとも35個の明確なアミノ酸をコードしなければならない。1番目のATGが必要なアミノ酸を有する場合、2番目のATGは、試験されない。どちらも必要条件を満たさない場合、候補配列はスコア付けされない。EST配列が確実なシグナル配列を含むか否かを判定するために、ATGコドンの周辺のDNA配列および対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)のセットを使用してスコア付けする。アルゴリズムの使用により、数多くのポリペプチドをコードする核酸配列が同定された。
様々なポリペプチドをコードする核酸配列を、Genentech,Inc.(South San Francisco,CA)によって開発された、ESTに基づく企業のシグナル配列探索アルゴリズムを適用することによって同定するだけでなく、クラスター化し、公的データベース(例えば、GenBank)および/または民間データベース(LIFESEQ(登録商標),Incyte Pharmaceuticals,Inc.,Palo Alto,CA)からESTフラグメントを構築した。シグナル配列アルゴリズムは、目的の配列または配列フラグメントの5’−末端の第1および必要に応じて第2のメチオニンコドン(ATG)周辺のDNAヌクレオチドの特徴に基づいて、分泌シグナルスコアを計算する。1番目のATGの後のヌクレオチドは、いかなる終止コドンも有しない少なくとも35個の明確なアミノ酸をコードしなければならない。1番目のATGが必要なアミノ酸を有する場合、2番目のATGは、試験されない。どちらも必要条件を満たさない場合、候補配列はスコア付けされない。EST配列が確実なシグナル配列を含むか否かを判定するために、ATGコドンの周辺のDNA配列および対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)のセットを使用してスコア付けする。アルゴリズムの使用により、数多くのポリペプチドをコードする核酸配列が同定された。
PRO57290ポリペプチドをコードするDNA269238の配列をGenBank受託番号NM 031310から同定した。
実施例4:PRO57290遺伝子が破壊されたマウスの作製および解析
PRO57290ポリペプチドの役割を調べるため、PRO57290遺伝子の破壊を、相同組換えまたはレトロウイルス挿入技術によって行った。具体的には、PRO57290遺伝子が破壊されたトランスジェニックマウス(すなわち、ノックアウトマウス)を、遺伝子ターゲティングまたは遺伝子トラッピングのいずれかによって作製した。サザンブロット解析で変異を確認することにより、5’末端と3’末端の両方における正確なターゲティングを確認した。挿入部位に隣接するエキソンにアニーリングするプライマーを使用するRT−PCRによって実証されるように、遺伝子特異的な遺伝子型解析もまたゲノムPCR(genomic PCR)によって行い、内在性の天然の転写物が失われていることを確認した。ターゲティングベクターを129系統のES細胞に電気穿孔し、標的クローンを同定した。標的クローンを宿主胚盤胞に微量注入することにより、キメラを作製した。キメラをC57動物と交雑し、F1ヘテロ接合体を作製した。ヘテロ接合体を交雑受精することにより、F2野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体のコホートを作製し、表現型解析に使用した。まれに、F1ヘテロ接合体が十分に作製されない場合に、そのF1へテロ接合体(het)を野生型C57マウスと交雑することにより、十分なヘテロ接合体を得て、表現型の解析用のコホートのために交雑した。すべての表現型解析を生後12〜16週から実施した。
PRO57290ポリペプチドの役割を調べるため、PRO57290遺伝子の破壊を、相同組換えまたはレトロウイルス挿入技術によって行った。具体的には、PRO57290遺伝子が破壊されたトランスジェニックマウス(すなわち、ノックアウトマウス)を、遺伝子ターゲティングまたは遺伝子トラッピングのいずれかによって作製した。サザンブロット解析で変異を確認することにより、5’末端と3’末端の両方における正確なターゲティングを確認した。挿入部位に隣接するエキソンにアニーリングするプライマーを使用するRT−PCRによって実証されるように、遺伝子特異的な遺伝子型解析もまたゲノムPCR(genomic PCR)によって行い、内在性の天然の転写物が失われていることを確認した。ターゲティングベクターを129系統のES細胞に電気穿孔し、標的クローンを同定した。標的クローンを宿主胚盤胞に微量注入することにより、キメラを作製した。キメラをC57動物と交雑し、F1ヘテロ接合体を作製した。ヘテロ接合体を交雑受精することにより、F2野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体のコホートを作製し、表現型解析に使用した。まれに、F1ヘテロ接合体が十分に作製されない場合に、そのF1へテロ接合体(het)を野生型C57マウスと交雑することにより、十分なヘテロ接合体を得て、表現型の解析用のコホートのために交雑した。すべての表現型解析を生後12〜16週から実施した。
表現型の結果の全体的な概要:
4.1 DNA269238(UNQ8782)遺伝子が破壊されたマウスの作製および解析
これらのノックアウト実験において、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子(DNA269238と命名)(UNQ8728)を破壊した。これらの研究のための遺伝子特異的情報を以下に示す:変異マウスの遺伝子は参照ヌクレオチドに対応する:NM_032398アクセッション(ACCESSION):NM_032398 NID:gi 14161697ref NM_032398.1ハツカネズミ属筋(Mus musculus)細胞膜小胞(plasmalemma vesicle)関連タンパク質(Plvap);参照タンパク質:Q99JB1アクセッション:Q99JB1NID:ハツカネズミ属筋(マウス)。PV1タンパク質;参照ヒト遺伝子配列:NM_031310アクセッション:NM_031310NID:gi 13775237 ref NM_031310.1ホモサピエンス細胞膜小胞関連タンパク質(PLVAP);ヒトタンパク質配列は、次の参照に対応する:Q9BX97アクセッション:Q9BX97 NID:ホモサピエンス(ヒト)。PV1タンパク質。
目的の遺伝子は、ヒトPLVAPのオルソログであるマウスPlvap(細胞膜小胞関連タンパク質)である。別名としては、PV−1、MECA32、PV1、FELS、gp68および有窓内皮結合(fenestrated−endotherial linked)構造タンパク質が挙げられる。
PLVAPは、内皮小胞(caveola)の有窓隔膜(fenestral diaphragm)および小孔隔膜(stomatal diaphragm)に関連するII型内在性細胞膜(plasma membrane)タンパク質である(Hnaskoら、J Endocrinol 175:649−61(2002);Stanら、Genomics 72:304−13(2001))。該タンパク質は、溶質に対して選択性のある隔壁として機能するこれら隔膜の形成および構造において役割を果たす可能性がある(Stan,Am J Physiol Heart Circ Physiol 286:H1347−53(2004))。PLVAPは、血液脳関門発達、微小血管透過性(Hallmannら、Dev Dyn 202:325−32(1995);Stanら、Genomics 72:304−13(2001);Stan,Am J Physiol Heart Circ Physiol 286:H1347−53(2004))、および脳腫瘍新脈管形成(Carson−Walterら、Clin Cancer Res 11:7643−50(2005))などの過程において役割を果たし得る。PLVAPはまた、様々な内分泌細胞および非内分泌細胞、例えば膵ランゲルハンス島デルタ細胞、下垂体神経葉細胞(neural lobe pituicytes)、黄体細胞、成人精細管内の生殖細胞、新生仔精巣の間質細胞、および発育卵胞の莢膜細胞層(thecal cell layer)などにおいても発現する(Hnaskoら、J Endocrinol 175:649−61(2002))。
ターゲティングされたか遺伝子トラップされた変異を、系統129SvEvBrd由来の胚性幹(ES)細胞で作製する。キメラマウスを、C57BL/6Jアルビノマウスと交配してF1ヘテロ接合性動物を作製する。これらの子孫を交雑受精してF2野生型子孫、ヘテロ接合性変異体子孫、およびホモ接合性変異体子孫を作製する。まれに、例えば、F1マウスがキメラからほとんど得られない場合、F1ヘテロ接合性マウスを129SvEvBrd/C57ハイブリッドマウスと交雑することにより、交雑受精用のさらなるヘテロ接合性動物を得て、F2マウスを作製する。この世代からのマウスに対してレベルI表現型解析を行う。
野生型 ヘテロ ホモ 合計
実測値 14 27 5 46
予測値 11.5 23 11.5 46
カイ二乗値=20.63 有意= 3.313238E−5(hom/n)=0.1 平均同腹仔数=6
変異情報
変異型:相同組換え(標準)
説明:この遺伝子は6個のエキソンからなり、エキソン1に開始コドンを有する(NCBIアクセッションNM_032398.1)。エキソン1をターゲティングした。
1.野生型発現パネル:RT−PCRによって試験された、胚性幹(ES)細胞および13のすべての成体組織サンプル(骨以外)において、標的遺伝子の発現を検出した。
2.QC発現:標的遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーション解析によって確認した。
実測値 14 27 5 46
予測値 11.5 23 11.5 46
カイ二乗値=20.63 有意= 3.313238E−5(hom/n)=0.1 平均同腹仔数=6
変異情報
変異型:相同組換え(標準)
説明:この遺伝子は6個のエキソンからなり、エキソン1に開始コドンを有する(NCBIアクセッションNM_032398.1)。エキソン1をターゲティングした。
1.野生型発現パネル:RT−PCRによって試験された、胚性幹(ES)細胞および13のすべての成体組織サンプル(骨以外)において、標的遺伝子の発現を検出した。
2.QC発現:標的遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーション解析によって確認した。
4.1.1. 表現型解析(破壊遺伝子:DNA269238(UNQ8782)
(a)全体的な表現型の概要:
遺伝子データは、この変異がホモ接合性変異体の生存能力の低下をもたらすことを示した。顕微鏡解析により、解析のために入手可能な変異体における幅広い病変、例えば糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、ならびに肝腫大が明らかとなった。ヘテロ接合性マウスにおいて目立った表現型は観察されなかった。標的遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーション解析によって確認した。
(a)全体的な表現型の概要:
遺伝子データは、この変異がホモ接合性変異体の生存能力の低下をもたらすことを示した。顕微鏡解析により、解析のために入手可能な変異体における幅広い病変、例えば糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、ならびに肝腫大が明らかとなった。ヘテロ接合性マウスにおいて目立った表現型は観察されなかった。標的遺伝子の破壊をサザンハイブリダイゼーション解析によって確認した。
(b)病理学
顕微鏡的:解析のために入手可能な3匹の(−/−)マウスは、中央部分の(midzonal)肝細胞形成不全および細胞過形成(hypercellularity)によって特徴づけられる肝腫大、心臓での血栓形成、骨髄および脾臓における巨核球増多症、乳腺の重篤な形成不全、赤血球不同および多染性、糸球体症および水腎症、ならびに脈絡叢のリンパ形質細胞性炎症を示した。腎臓での糸球体病変は、尿におけるタンパク質レベルの上昇および組織浮腫によって示されるタンパク質損失の原因となる。肝臓の組織学的外観は、通常よりもさらに小さい中央部分の肝細胞によって特徴付けられた。1/3の変異体マウスにおいて、中央部分の肝細胞は、好酸性細胞質内封入(eosinophilic cytoplasmic inclusion)を含有していた。中央部分の肝細胞は小さいが、その数の著しい増加は、粗大な肝腫大をもたらした。心臓および肺の血管における大きな血栓は、恐らく骨髄および脾臓で述べた巨核球増多症に関係している。2匹の雌変異体において、乳腺はどの部分にも存在しておらず、著しい形成不全または発達障害を示した。赤血球異常もまた、その変異体に存在した。
顕微鏡的:解析のために入手可能な3匹の(−/−)マウスは、中央部分の(midzonal)肝細胞形成不全および細胞過形成(hypercellularity)によって特徴づけられる肝腫大、心臓での血栓形成、骨髄および脾臓における巨核球増多症、乳腺の重篤な形成不全、赤血球不同および多染性、糸球体症および水腎症、ならびに脈絡叢のリンパ形質細胞性炎症を示した。腎臓での糸球体病変は、尿におけるタンパク質レベルの上昇および組織浮腫によって示されるタンパク質損失の原因となる。肝臓の組織学的外観は、通常よりもさらに小さい中央部分の肝細胞によって特徴付けられた。1/3の変異体マウスにおいて、中央部分の肝細胞は、好酸性細胞質内封入(eosinophilic cytoplasmic inclusion)を含有していた。中央部分の肝細胞は小さいが、その数の著しい増加は、粗大な肝腫大をもたらした。心臓および肺の血管における大きな血栓は、恐らく骨髄および脾臓で述べた巨核球増多症に関係している。2匹の雌変異体において、乳腺はどの部分にも存在しておらず、著しい形成不全または発達障害を示した。赤血球異常もまた、その変異体に存在した。
(c)骨代謝および全身診断学
(1)組織量(tissue mass)および除脂肪体重の測定−Dexa
Dexa解析−試験の説明:
手順:4匹の野生型マウス、4匹のヘテロ接合性マウス及び8匹のホモ接合性マウスのコホートをこのアッセイで試験した。二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)をうまく使用して、総組織量(TTM)の変化を同定した。
(1)組織量(tissue mass)および除脂肪体重の測定−Dexa
Dexa解析−試験の説明:
手順:4匹の野生型マウス、4匹のヘテロ接合性マウス及び8匹のホモ接合性マウスのコホートをこのアッセイで試験した。二重エネルギーX線吸収測定法(DEXA)をうまく使用して、総組織量(TTM)の変化を同定した。
Avertin(1.25%2,2,2,−トリブロモエタノール、20ml/kg体重)をマウスに腹腔内注射することにより麻酔し、体長および体重を測定し、次いで、マウスをDEXAスキャンのためにPIXImusTMデンシトメーター(Lunar Inc.)のプラットフォーム上に腹臥位にした。Lunar PIXImusソフトウェアを使用して、目的の領域(ROI、すなわち全身、椎骨および両大腿骨)の骨密度(BMD)および脂肪組成(%脂肪)および総組織量(TTM)を測定した。
身体測定(体長および体重):
身体測定:約16週齢で体長および体重の測定を行った。
身体測定:約16週齢で体長および体重の測定を行った。
結果:
明らかな概要:(−/−)マウスは小さく、いくつかの(−/−)仔マウスは非常に早い時期に死亡した。3匹の(−/−)マウスのみが9週齢まで生存し、その健康障害および肥大した腹部のために病理へ送られた。いくつかの変異体は短尾または尾の欠損を示した。
明らかな概要:(−/−)マウスは小さく、いくつかの(−/−)仔マウスは非常に早い時期に死亡した。3匹の(−/−)マウスのみが9週齢まで生存し、その健康障害および肥大した腹部のために病理へ送られた。いくつかの変異体は短尾または尾の欠損を示した。
体重:(−/−)マウスは、その性別一致野生型同腹仔(+/+)および歴史的平均と比べ、6週間の測定を通して平均体重の減少を示した。
実施例5:ハイブリダイゼーションプローブとしてのPRO57290の使用
下記の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのPRO57290をコードするヌクレオチド配列の使用を記載したものである。
下記の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのPRO57290をコードするヌクレオチド配列の使用を記載したものである。
本明細書に開示した完全長または成熟PRO57290ポリペプチドのコード配列を含むDNAを、ヒト組織cDNAライブラリまたはヒト組織ゲノムライブラリにおいて相同なDNA(例えば、PRO57290ポリペプチドの天然に存在するバリアントをコードするものなど)をスクリーニングするためのプローブとして使用する。
いずれかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、下記の高ストリンジェンシー条件下で行なう。放射能標識されたPRO57290−由来プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、5×SSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2×デンハルト溶液および10%硫酸デキストランの溶液中、42℃で20時間行なわれる。フィルターの洗浄は、0.1×SSCおよび0.1%SDSの水溶液中、42℃で行なう。
次いで、完全長の天然配列PRO57290ポリペプチドをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAを、当該技術分野で知られた標準的は手法を用いて同定し得る。
実施例6:大腸菌におけるPRO57290の発現
この実施例は、大腸菌内での組換え発現によるPRO57290ポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を示す。
この実施例は、大腸菌内での組換え発現によるPRO57290ポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を示す。
最初に、PRO57290ポリペプチドをコードするDNA配列を、選択したPCRプライマーを用いて増幅する。プライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含む必要がある。さまざまな発現ベクターを使用し得る。好適なベクターの一例は、アンピリシンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら,Gene.2:95(1977)を参照)である。ベクターを制限酵素で消化し、脱ホスホリル化する。PCR増幅された配列を、次いで、ベクター内にライゲートする。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列およびエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PRO57290コード領域、λ転写ターミネータ、ならびにargU遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、ライゲーション混合物を用い、選択した大腸菌系統をSambrookら(前掲)に記載の方法を用いて形質転換する。形質転換体を、LBプレート上でのその生育能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを、制限解析によって単離し、DNA配列決定によって確認し得る。
選択されたクローンは、液体培養培地(例えば、抗生物質を加えたLBブイヨンなど)中で一晩培養し得る。一晩培養物は、続いて大規模培養物にイノキュレートするために使用され得る。次いで、細胞を所望の光学密度まで培養し、この間に発現プロモーターが作動する。
細胞をさらに数時間培養した後、細胞を、遠心分離によって回収し得る。遠心分離によって得られた細胞ペレットを、当該技術分野で知られた種々の薬剤を用いて可溶化し得、可溶化されたPRO57290タンパク質を、次いで、金属キレートカラムを用い、タンパク質の強固な結合を可能にする条件下で精製し得る。
PRO57290は大腸菌においてポリ−Hisタグ化された形態で、下記の手順を用いて発現させ得る。最初に、PRO57290をコードするDNAを、選択したPCRプライマーを用いて増幅する。プライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、ならびに効率的で信頼性のある翻訳の開始、金属キレートカラム上での速やかな精製およびエンテロキナーゼによるタンパク質分解的除去をもたらすのに有用な他の配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ−Hisタグ化配列を発現ベクター内にライゲートし、これを用いて菌株52(W3110fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(laIq)系の大腸菌宿主を形質転換する。形質転換体を、まず、50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中にて30℃で、振とうさせながら3〜5のO.D.600が達成されるまで培養する。次いで、培養物をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco製酵母抽出物、5.36gのSheffield hycase SF(500mLの水中)、ならびに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコースおよび7mMのMgSO4を混合することにより調製)中で50〜100倍に希釈し、およそ20〜30時間30℃で、振とうさせながら培養する。試料を取り出し、SDS−PAGE解析によって発現を確認し、バルク培養物を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットは、精製およびリフォールディングまで凍結しておく。
0.5〜1Lの発酵物からの大腸菌ペースト(6〜10gのペレット)を10容量(w/v)で7Mグアニジン、20mM Tris(pH8)バッファー中に再懸濁する。固形亜硫酸ナトリウムおよび四チオン酸ナトリウムを、それぞれ、終濃度が0.1Mおよび0.02Mとなるように添加し、溶液を一晩4℃で攪拌する。この工程により、すべてのシステイン残基がスルフィトリル化(sulfitolization)によってブロックされた変性タンパク質がもたらされる。この溶液を40,000rpmで、Beckman超遠心分離機にて30分間遠心分離する。上清みを3〜5容量の金属キレートカラムバッファー(6Mグアニジン、20mM Tris、pH7.4)で希釈し、0.22ミクロンフィルターに通して濾過して清澄化する。清澄化された抽出物を、金属キレートカラムバッファー中で平衡化した5ml容Qiagen Ni−NTA金属キレートカラム上に負荷する。カラムを50mMイミダゾール(Calbiochem,Utrolグレード)を含有するさらなるバッファー(pH7.4)で洗浄する。タンパク質を、250mMイミダゾールを含有するバッファーで溶出する。所望のタンパク質を含む画分をプールし、4℃で保存する。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算された消衰係数を用い、280nmにおけるその吸光度によって推定する。
タンパク質を、20mM Tris(pH8.6)、0.3M NaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシンおよび1mM EDTAからなる新たに調製したリフォールディングバッファー中に試料をゆっくり希釈することによりリフォールディングさせる。リフォールディング容量は、最終タンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択される。リフォールディング溶液は、12〜36時間4℃で穏やかに攪拌する。リフォールディング反応を、終濃度0.4%(およそ3のpH)までTFAを添加することによってクエンチする。タンパク質のさらなる精製の前に、溶液を0.22ミクロンフィルターに通して濾過し、アセトニトリルを2〜10%の終濃度まで添加する。リフォールディングさせたタンパク質をPoros R1/H逆相カラム上で、0.1%TFAの移動相バッファーを用い、10〜80%のアセトニトリルの勾配での溶出を伴ってクロマトグラフィー処理する。A280吸光度を有する画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲル上で解析し、均質なリフォールディングタンパク質を含む画分をプールする。一般的に、大部分のタンパク質が適正にリフォールディングされた種は、その疎水性内部が最も緻密であり、逆相樹脂との相互作用から遮断されるため、最低濃度のアセトニトリルで溶出される。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶出される。ミスフォールド形態のタンパク質を所望の形態から分離することに加え、逆相工程ではまた、内毒素を試料から除去する。
フォールドされた所望のPRO57290ポリペプチドを含む画分をプールし、アセトニトリルを、溶液に指向した穏やかな窒素流を用いて除去する。透析によって、または構築バッファー中で平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂を用いたゲル濾過によって、0.14Mの塩化ナトリウムおよび4%マンニトールを含む20mM Hepes(pH6.8)中にタンパク質を構築し、滅菌濾過する。
実施例7:哺乳動物細胞におけるPRO57290の発現
この実施例は、哺乳動物細胞内での組換え発現によるPRO57290ポリペプチドの潜在的にグリコシル化された形態の調製を示す。
この実施例は、哺乳動物細胞内での組換え発現によるPRO57290ポリペプチドの潜在的にグリコシル化された形態の調製を示す。
ベクターpRK5(EP307,247(1989年3月15日公開)を参照のこと)を発現ベクターとして使用する。任意選択で、PRO57290DNAをpRK5内に、選択した制限酵素を用いてライゲートし、Sambrookら(前掲)に記載のものなどのライゲーション方法を用いてPRO57290DNAの挿入を可能にする。得られたベクターをpRK5−PRO57290とよぶ。
選択される宿主細胞は293細胞であり得る。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)を組織培養プレート内で、ウシ胎仔血清ならびに任意選択で栄養成分および/または抗生物質を補給したDMEMなどの培地中でコンフルエンスまで培養する。約10μgのpRK5−PRO57290をVA RNA遺伝子[Thimmappayaら,Cell,31:543(1982)]をコードするDNA約1μgと混合し、500μlの1mM Tris−HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中に溶解する。この混合物に、500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM
NaPO4を滴下し、25℃で10分間、沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁して293細胞に添加し、37℃で約4時間沈降させる。培養培地を吸引除去し、2mlの20%グリセロール含有PBSを30秒間添加する。次いで、293細胞を血清無含有培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
NaPO4を滴下し、25℃で10分間、沈殿物を形成させる。沈殿物を懸濁して293細胞に添加し、37℃で約4時間沈降させる。培養培地を吸引除去し、2mlの20%グリセロール含有PBSを30秒間添加する。次いで、293細胞を血清無含有培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
トランスフェクションのおよそ24時間後、培養培地を除去し、培養培地(単独)または200μCi/mlの35S−システインおよび200μCi/mlの35S−メチオニンを含有する培養培地と交換する。12時間のインキュベーション後、ならし培地を回収し、スピンフィルターにて濃縮し、15%SDSゲル上に負荷する。加工処理したゲルは、乾燥させ、選択した時間フィルムに露光し、PRO57290ポリペプチドの存在を顕現させ得る。トランスフェクト細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーション(血清無含有培地中)に供してもよく、培地を、選択したバイオアッセイにおいて試験する。
択一的な手法において、PRO57290を、Somparyracら,Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)に記載された硫酸デキストラン法を用い、一過的に293細胞内に導入してもよい。293細胞をスピナーフラスコ内で最大密度まで培養し、700μgのpRK5−PRO57290を添加する。該細胞を、まず、スピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインスリンおよび0.1μg/mlウシトランスフェリンを入れたスピナーフラスコ内に再導入する。約4日後、ならし培地を遠心分離し、濾過して細胞および残屑を除去する。発現されたPRO57290を含む試料を、次いで、選択した任意の方法、例えば、透析および/またはカラムクロマトグラフィーなどによって濃縮および精製し得る。
PRO57290は、CHO細胞において発現させ得る。pRK5−PRO57290をCHO細胞内に、CaPO4またはDEAE−デキストランなどの既知の試薬を用いてトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベートすることができ、培地は培養培地(単独)または35S−メチオニンなどの放射能標識を含有する培地と交換することができる。PRO57290ポリペプチドの存在を調べた後、培養培地を血清無含有培地と交換してもよい。好ましくは、培養物を約6日間インキュベートし、次いで、ならし培地を回収する。発現されたPRO57290を含有する培地を、次いで、選択した任意の方法によって濃縮および精製し得る。
また、エピトープタグ化したPRO57290を宿主CHO細胞において発現させてもよい。PRO57290を、pRK5ベクターにサブクローニングし得る。サブクローン挿入物はPCRに供し、インフレームで、選択したエピトープタグ(例えば、ポリ−Hisタグなど)とともにバキュロウイルス発現ベクター内に融合させ得る。ポリ−Hisタグ化PRO57290挿入物を、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR選択マーカーを含有するSV40駆動ベクター内にサブクローニングし得る。最後に、CHO細胞にSV40駆動ベクターをトランスフェクトさせ得る(上記のようにして)。標識化は、上記のように、発現を確認するために行ない得る。発現されたポリ−Hisタグ化PRO57290を含有する培養培地を、次いで、選択した任意の方法、例えば、Ni2+キレートアフィニティクロマトグラフィーなどによって濃縮および精製し得る。
PRO57290はまた、CHOおよび/またはCOS細胞において一過性発現手順によって、あるいはCHO細胞において別の安定な発現手順によって発現させ得る。
CHO細胞における安定な発現は、下記の手順を用いて行なわれる。タンパク質はIgG構築物(イムノアドヘシン)として発現させ、それぞれのタンパク質の可溶性形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)を、ヒンジ、CH2およびCH2ドメインを含有するIgG1定常領域配列と融合させる、および/またはポリ−Hisタグ化された形態である。
PCR増幅後、それぞれのDNAを、CHO発現ベクター内に、Ausubelら,Current Protocols of Molecular Biology,Unit 3.16,John Wiley and Sons(1997)に記載のような標準的は手法を用いてサブクローニングする。CHO発現ベクターは、cDNAの簡便なシャトリングが可能となるように目的のDNAの5’および3’側に適合性の制限部位を有するように構築する。CHO細胞における発現に使用されるベクターは、Lucasら,Nucl.Acids Res.24:9(1774−1779(1996)に記載されているとおりであり、対象のcDNAおよびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の発現を駆動するためのSV40初期プロモーター/エンハンサーを使用する。DHFR発現により、トランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のための選択が可能になる。
12マイクログラムの所望のプラスミドDNAを、およそ10000000個のCHO細胞内に、市販のトランスフェクション試薬Superfect(登録商標)(Qiagen)、Dosper(登録商標)またはFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)を用いて導入する。細胞を、Lucasら(前掲)に記載のようにして培養する。およそ3×107細胞を、下記のようなさらなる培養および生成のために、アンプル内で凍結させる。
プラスミドDNAの入ったアンプルを、水浴内への配置によって解凍し、ボルテックスによって混合する。内容物を、10mLの培地を入れた遠心分離チューブ内にピペッティングし、1000rpmで5分間遠心分離する。上清みを吸引し、細胞を10mLの選択培地(5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清含有0.2μm濾過PS20)中に再懸濁する。次いで、細胞のアリコートを、90mLの選択培地を入れた100mL容量のスピナー内に採取する。1〜2日後、細胞を、150mLの選択培養培地で満たした250mL容量のスピナー内に移し、37℃でインキュベートする。さらに2〜3日後、250mL、500mLおよび2000mL容量のスピナーに3×105細胞/mLを播種する。細胞培地を新たな培地と、遠心分離および生産培地中への再懸濁によって交換する。任意の適当なCHO培地を使用し得るが、米国特許第5,122,469号(1992年6月16日発行)に記載の生産培地を実際に使用することができる。3L容量の生産用スピナーに1.2×106細胞/mLで播種する。第0日目、細胞数 pHを測定する(ie determined)。第1日目、スピナーから試料を採取し、濾過空気でのスパージングを開始する。第2日目、スピナーから試料を採取し、温度を33℃にシフトし、30mLの500g/Lグルコースおよび0.6mLの10%消泡剤(例えば、35%ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Dow Corning 365医薬グレードEmulsion)を採用する。作製全体を通して、pHは、7.2前後に維持されるように必要に応じて調整する。10日後、またはバイアビリティが70%未満に低下したときまで、細胞培養物を、遠心分離および0.22μmフィルターに通す濾過によって回収する。濾液は、4℃で保存するか、または直接、精製用カラム上に負荷するかのいずれかとした。
ポリ−Hisタグ化構築物に関して、タンパク質は、Ni−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製前、イミダゾールをならし培地に5mMの濃度まで添加する。ならし培地を、20mM Hepes(pH7.4)0.3M NaClおよび5mMイミダゾール含有バッファー中で平衡化した6ml容量のNi−NTAカラム上に、4〜5ml/分の流速で4℃にてポンピングする。負荷後、カラムをさらなる平衡化バッファーで洗浄し、タンパク質を、0.25Mイミダゾールを含有する平衡化バッファーで溶出させる。高度に精製されたタンパク質を、続いて、25ml容量のG25 Superfine(Pharmacia)カラムを用い、10mM Hepes、0.14M NaClおよび4%マンニトール(pH6.8)を含有する保存バッファー中にて脱塩し、−80℃で保存する。
イムノアドヘシン(Fc含有)構築物をならし培地から、以下のようにして精製する。ならし培地を、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.8)中で平衡化しておいた5ml容量のタンパク質Aカラム(Pharmacia)上にポンピングする。負荷後、100mMクエン酸(pH3.5)で溶出する前に、カラムを平衡化バッファーで徹底的に洗浄する。溶出させたタンパク質は、1mlずつの画分を、275μLの1M Trisバッファー(pH9)を入れたチューブ内に収集することにより直ちに中和する。高度に精製されたタンパク質を、続いて、ポリ−Hisタグ化タンパク質について上記の保存バッファー中にて脱塩する。均質性を、SDSポリアクリルアミドゲルおよびエドマン分解によるN末端アミノ酸配列決定によって評価する。
実施例8:酵母におけるPRO57290の発現
下記の方法は、酵母におけるPRO57290の組換え発現を記載したものである。
下記の方法は、酵母におけるPRO57290の組換え発現を記載したものである。
まず、ADH2/GAPDHプロモーターからのPRO57290の細胞内での産生または分泌のための酵母発現ベクターを構築する。PRO57290およびプロモーターをコードするDNAを、PRO57290の細胞内発現を指向させるために選択したプラスミド内の適当な制限酵素部位に挿入する。分泌のため、PRO57290をコードするDNAは、選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーター、天然PRO57290シグナルペプチドもしくは他の哺乳動物用シグナルペプチド、または例えば、酵母のα因子もしくはインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、およびPRO57290の発現のためのリンカー配列(必要であれば)をコードするDNAとともにクローニングし得る。
次いで、酵母細胞(例えば、酵母系統AB110など)を上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地中で培養し得る。形質転換された酵母の上清みを、10%トリクロロ酢酸を用いた沈殿によって解析し、SDS−PAGEによって分離した後、ゲルをクマシーブルー染色で染色し得る。
続いて、組換えPRO57290を、酵母細胞を発酵培地から遠心分離によって除去し、次いで、選択したカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することにより単離および精製し得る。PRO57290を含む濃縮物を、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製し得る。
実施例9:バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるPRO57290の発現
下記の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるPRO57290の組換え発現を記載したものである。
下記の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるPRO57290の組換え発現を記載したものである。
PRO57290をコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクター内に含有されるエピトープタグの上流と融合させる。かかるエピトープタグとしては、ポリ−Hisタグおよび免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)が挙げられる。さまざまなプラスミド、例えば、市販のプラスミド(例えば、pVL1393(Novagen)など)から誘導されるプラスミドを使用し得る。簡単には、PRO57290をコードする配列またはPRO57290のコード配列の所望の部分、例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、またはタンパク質が細胞外のものである場合はその成熟タンパク質をコードする配列などを、5’および3’領域に相補的なプライマーを用いたPCRによって増幅する。5’プライマーは、(選択した)フランキング制限酵素部位を組み込んでいてよい。次いで、産物を、選択した制限酵素で消化し、発現ベクター内にサブクローニングする。
組換えバキュロウイルスを、上記のプラスミドおよびBaculoGold(商標)ウイルスDNA(Pharmingen)をSpodoptera fmgiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)内に、リポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いてコトランスフェクトすることにより作製する。28℃で4〜5日間のインキュベーション後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅に用いる。ウイルス感染およびタンパク質発現は、O’Reilleyら,Baculovirus expression vectors:A Laboratory Manual,Oxford:Oxford University Press(1994)に記載のように行なう。
発現されたポリ−Hisタグ化PRO57290は、次いで、例えば、Ni2+キレートアフィニティクロマトグラフィーによって以下のようにして精製し得る。抽出物は、組換えウイルス感染Sf9細胞から、Rupertら,Nature,362:175−179(1993)に記載のように調製する。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、音波破砕バッファー(25mL Hepes、pH7.9;12.5mM MgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%NP−40;0.4M KCl)中に再懸濁し、氷上で20秒間、2回音波破砕する。音波破砕物を遠心分離によって清澄化し、上清みを、負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mM NaCl、10%グリセロール、pH7.8)中で50倍に希釈し、0.45μmフィルターに通して濾過する。Ni2+NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mL容量の床を用いて調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡化する。濾過した細胞抽出物をカラム上に0.5mL/分で負荷する。カラムをベースラインA280まで負荷バッファーで洗浄し、この時点で、画分収集を開始する。次に、カラムを二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mM NaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄し、これにより、非特異的結合タンパク質を溶出する。再度A280ベースラインに達した後、カラムを二次洗浄バッファー中0〜500mMイミダゾールの勾配で展開させる。1mLずつの画分を収集し、SDS−PAGEおよび銀染色またはNi2+−NTAコンジュゲートアルカリホスファターゼ(Qiagen)を用いたウエスタンブロットによって解析する。溶出されたHis10タグ化PRO57290を含有する画分をプールし、負荷バッファーに対して透析する。
あるいはまた、IgGタグ化(またはFcタグ化)PRO57290の精製が、既知のクロマトグラフィー手法、例えば、タンパク質Aまたはタンパク質Gカラムクロマトグラフィーなどを用いて行なわれ得る。
実施例10:インサイチューハイブリダイゼーション
インサイチューハイブリダイゼーションは、細胞または組織の調製物内の核酸配列の検出および位置特定のための強力で多用途の手法である。これは、例えば、遺伝子の発現部位を同定するため、転写の組織分布を解析するため、ウイルス感染を同定および位置特定するため、特定のmRNA合成における変化を追跡するため、ならびに染色体マッピングを補助するために有用であり得る。
インサイチューハイブリダイゼーションは、細胞または組織の調製物内の核酸配列の検出および位置特定のための強力で多用途の手法である。これは、例えば、遺伝子の発現部位を同定するため、転写の組織分布を解析するため、ウイルス感染を同定および位置特定するため、特定のmRNA合成における変化を追跡するため、ならびに染色体マッピングを補助するために有用であり得る。
インサイチューハイブリダイゼーションを、LuおよびGillett,Cell Vision 1:169−176(1994)の最適化された型のプロトコルに従い、PCR生成33P標識リボプローブを用いて行なった。簡単には、ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト組織を切片化し、脱パラフィン化し、プロテイナーゼK(20g/ml)中で15分間37℃にてタンパク質除去し、LuおよびGillett(前掲)に記載のようにインサイチューハイブリダイゼーション用にさらに加工処理した。[33P]UTP標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から作製し、55℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドをKodak NTB2核トラック乳剤中に浸漬し、4週間露光した。
33Pリボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002、SA<2000Ci/mmol)を高速真空乾燥した。乾燥33P−UTPを入れた各チューブに、以下の成分を加えた:
2.0μlの5×転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTPミックス(2.5mM:10μ;各々10mMのGTP、CTPおよびATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRnasin
1.0μlのDNA鋳型(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポリメラーゼ(PCR産物用、T3=AS、T7=S、通常)。
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002、SA<2000Ci/mmol)を高速真空乾燥した。乾燥33P−UTPを入れた各チューブに、以下の成分を加えた:
2.0μlの5×転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTPミックス(2.5mM:10μ;各々10mMのGTP、CTPおよびATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRnasin
1.0μlのDNA鋳型(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポリメラーゼ(PCR産物用、T3=AS、T7=S、通常)。
チューブを37℃で1時間インキュベートした。1.0μlのRQ1 DNアーゼを添加した後、37℃で15分間インキュベーションを行なった。90μlのTE(10mM
Tris pH7.6/1mM EDTA pH8.0)を添加し、混合物をDE81紙上にピペッティングした。残った溶液をMicrocon−50限外濾過ユニット内に負荷し、プログラム10を用いてスピンした(6分間)。濾過ユニットを第2のチューブ上に反転し、プログラム2を用いてスピンした(3分間)。最終の回収スピン後、100μlのTEを添加した。1μlの最終産物をDE81紙上にピペッティングし、6mlのBiofluor II中で計数した。
Tris pH7.6/1mM EDTA pH8.0)を添加し、混合物をDE81紙上にピペッティングした。残った溶液をMicrocon−50限外濾過ユニット内に負荷し、プログラム10を用いてスピンした(6分間)。濾過ユニットを第2のチューブ上に反転し、プログラム2を用いてスピンした(3分間)。最終の回収スピン後、100μlのTEを添加した。1μlの最終産物をDE81紙上にピペッティングし、6mlのBiofluor II中で計数した。
プローブをTBE/尿素ゲル上で泳動させた。1〜3μlのプローブまたは5μlのRNA Mrk IIIを3μlの負荷バッファーに添加した。95℃のヒートブロック上で3分間加熱後、プローブを直接、氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュ洗浄し、試料を負荷し、180〜250ボルトで45分間泳動させた。ゲルをサランラップでラップし、増感紙を有するXARフィルムに、−70℃のフリーザー内で1時間から一晩露光した。
33P−ハイブリダイゼーション
A.凍結切片の前処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベーター内に5分間配置し、結露を低減させた。スライドを、ヒュームフード内で氷上の4%パラホルムアルデヒド中に10分間固定し、0.5×SSC中で5分間、室温にて洗浄した(25ml 20×SSC+975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼK中、10分間37℃でのタンパク質除去(250mlの予備加温RNアーゼ無含有RNアーゼバッファー中、12.5μlの10mg/mlストック)後、切片を0.5×SSC中で10分間、室温にて洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中で各々2分間脱水した。
A.凍結切片の前処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイ上に置き、室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベーター内に5分間配置し、結露を低減させた。スライドを、ヒュームフード内で氷上の4%パラホルムアルデヒド中に10分間固定し、0.5×SSC中で5分間、室温にて洗浄した(25ml 20×SSC+975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼK中、10分間37℃でのタンパク質除去(250mlの予備加温RNアーゼ無含有RNアーゼバッファー中、12.5μlの10mg/mlストック)後、切片を0.5×SSC中で10分間、室温にて洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中で各々2分間脱水した。
B.パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィン処理し、SQ H2O中に入れ、2×SSC中で2回、室温で各回5分間リンス処理した。切片を、20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNアーゼ無含有RNアーゼバッファー中10mg/mlで500μl;37℃、15分間)(ヒト胚)、または8×プロテイナーゼK(250mlのRnアーゼバッファー中100μl、37℃、30分間)(ホルマリン組織)中でタンパク質除去処理した。続いて、0.5×SSC中でのリンス処理および脱水を、上記のようにして行なった。
スライドを脱パラフィン処理し、SQ H2O中に入れ、2×SSC中で2回、室温で各回5分間リンス処理した。切片を、20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNアーゼ無含有RNアーゼバッファー中10mg/mlで500μl;37℃、15分間)(ヒト胚)、または8×プロテイナーゼK(250mlのRnアーゼバッファー中100μl、37℃、30分間)(ホルマリン組織)中でタンパク質除去処理した。続いて、0.5×SSC中でのリンス処理および脱水を、上記のようにして行なった。
C.プレハイブリダイゼーション
スライドを、Boxバッファー(4×SSC、50%ホルムアミド)を飽和させた濾紙を内側に貼り付けたプラスチックボックス内に並べた。
スライドを、Boxバッファー(4×SSC、50%ホルムアミド)を飽和させた濾紙を内側に貼り付けたプラスチックボックス内に並べた。
D.ハイブリダイゼーション
スライド1.0×106cpmのプローブおよび1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド1枚あたり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスした後、50μlの33Pミックスを、スライド上の50μlのプレハイブリダイゼーション液に添加した。スライドを一晩55℃でインキュベートした。
スライド1.0×106cpmのプローブおよび1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド1枚あたり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスした後、50μlの33Pミックスを、スライド上の50μlのプレハイブリダイゼーション液に添加した。スライドを一晩55℃でインキュベートした。
E.洗浄
洗浄は、室温で、2×SSC、EDTAを用いて10分間を2回行なった(400mlの20×SSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)後、RNアーゼA処理を37℃で30分間行なった(250mlのRnアーゼバッファー中10mg/ml=20μg/mで500μl)。スライドを室温で2×SSC、EDTAにて10分間、2回洗浄した。ストリンジェンシー洗浄条件は、以下の通り:55℃で2時間、0.1×SSC、EDTA(20mlの20×SSC+16ml EDTA、Vf=4L)とした。
洗浄は、室温で、2×SSC、EDTAを用いて10分間を2回行なった(400mlの20×SSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)後、RNアーゼA処理を37℃で30分間行なった(250mlのRnアーゼバッファー中10mg/ml=20μg/mで500μl)。スライドを室温で2×SSC、EDTAにて10分間、2回洗浄した。ストリンジェンシー洗浄条件は、以下の通り:55℃で2時間、0.1×SSC、EDTA(20mlの20×SSC+16ml EDTA、Vf=4L)とした。
F.オリゴヌクレオチド
インサイチュー解析を、本明細書に開示したさまざまなDNA配列において行なった。これらの解析に用いたオリゴヌクレオチドは、添付の図面に示した核酸(またはその相補配列)に相補的となるように得た。
インサイチュー解析を、本明細書に開示したさまざまなDNA配列において行なった。これらの解析に用いたオリゴヌクレオチドは、添付の図面に示した核酸(またはその相補配列)に相補的となるように得た。
実施例11:PRO57290に結合する抗体の調製
この実施例は、PRO57290に特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を示す。
この実施例は、PRO57290に特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を示す。
モノクローナル抗体を作製するための手法は当該技術分野で知られており、例えば、Goding(前掲)に記載されている。使用され得る免疫原としては、精製されたPRO57290ポリペプチド、PRO57290ポリペプチドを含有する融合タンパク質、および組換えPRO57290ポリペプチドを細胞表面上に発現する細胞が挙げられる。免疫原の選択は、当業者が必要以上に実験を行なうことなく行ない得る。
Balb/cなどのマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化させたPRO57290免疫原で免疫処置し、1〜100マイクログラムの量で皮下または腹腔内注射する。あるいはまた、免疫原を、MPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Research,Hamilton,MT)中に乳化させ、動物の後肢支脚皿に注射する。次いで、免疫処置されたマウスを10〜12日後、選択したアジュバント中に乳化させたさらなる免疫原で追加免疫刺激する。その後、数週間、マウスにさらなる免疫処置注射により追加免疫刺激してもよい。血清試料を、定期的にマウスから後眼窩採血によって採取し、抗PRO57290抗体を検出するELISAアッセイにおいて試験し得る。
適当な抗体力価が検出された後、抗体について「陽性」の動物に、PRO57290の最終の静脈内注射が注射され得る。3〜4日後、マウスを犠牲死させ、脾臓細胞を回収する。次いで、脾臓細胞を、選択したマウス骨髄腫細胞株(例えば、ATCC番号CRL 1597から入手可能なP3X63AgU.1など)と融合させる(35%ポリエチレングリコールを使用)。融合によりハイブリドーマ細胞を作製し、次いで、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)培地を入れた96ウェル組織培養プレート内にプレーティングし得る。
ハイブリドーマ細胞は、ELISAにおいてPRO57290に対する反応性についてスクリーニングする。PRO57290に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当該技術分野の技量の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系Balb/cマウスに腹腔内注射し、抗PRO57290モノクローナル抗体を含有する腹水を生成し得る。あるいはまた、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル内で培養してもよい。腹水内に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈殿の後ゲル排除クロマトグラフィーを用いて行ない得る。あるいはまた、タンパク質Aまたはタンパク質Gに対する抗体の結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを使用し得る。
実施例12:特異的抗体を用いたPRO57290ポリペプチドの精製
天然または組換えPRO57290ポリペプチドを、タンパク質精製の分野におけるさまざまな標準的な手法によって精製し得る。例えば、pro−PRO57290ポリペプチド、成熟PRO57290ポリペプチドまたはpre−PRO57290ポリペプチドを、対象のPRO57290ポリペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。一般に、イムノアフィニティカラムは、抗PRO57290ポリペプチド抗体を活性化したクロマトグラフィー樹脂に共有結合によってカップリングさせることにより構成されている。
天然または組換えPRO57290ポリペプチドを、タンパク質精製の分野におけるさまざまな標準的な手法によって精製し得る。例えば、pro−PRO57290ポリペプチド、成熟PRO57290ポリペプチドまたはpre−PRO57290ポリペプチドを、対象のPRO57290ポリペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。一般に、イムノアフィニティカラムは、抗PRO57290ポリペプチド抗体を活性化したクロマトグラフィー樹脂に共有結合によってカップリングさせることにより構成されている。
ポリクローナル免疫グロブリンを、免疫血清から、硫酸アンモニウムでの沈殿、または固定化したタンパク質A(Pharmacia LKB Biotechnology,Piscataway,N.J.)上での精製のいずれかによって調製する。同様に、モノクローナル抗体を、マウス腹水から、硫酸アンモニウム沈殿または固定化したタンパク質A上でのクロマトグラフィーによって調製する。部分精製された免疫グロブリンを、CnBr活性化SEPHAROSE(商標)(Pharmacia LKB Biotechnology)などのクロマトグラフィー樹脂に共有結合させる。抗体を樹脂にカップリングさせ、樹脂をブロックし、誘導体樹脂を、製造業者の使用説明書に従って洗浄する。
かかるイムノアフィニティカラムは、可溶性形態のPRO57290ポリペプチドを含む細胞由来の画分を調製することにより、PRO57290ポリペプチドの精製に利用する。この調製物を、デタージェントの添加による分画遠心分離により得られた完全体細胞または亜細胞画分の可溶化によって、または当該技術分野でよく知られた他の方法によって誘導する。あるいはまた、シグナル配列を含む可溶性ポリペプチドを、有用な量で、該細胞を培養している培地中に分泌し得る。
可溶性PRO57290ポリペプチド含有調製物をイムノアフィニティカラムに通し、カラムを、PRO57290ポリペプチドの優先的吸収を可能にする条件下(例えば、デタージェントの存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄する。次いで、カラムを、抗体/PRO57290ポリペプチド結合を破壊する条件下(例えば、低pHバッファー(例えば、およそpH2〜3など)または高濃度のカオトロピック薬剤(例えば、尿素またはチオシアネートイオンなど))で溶出させ、PRO57290ポリペプチドを収集する。
実施例13:薬物スクリーニング
本発明は、さまざまな薬物スクリーニング手法のいずれかにおいて、PRO57290ポリペプチドまたはその結合断片を用いることによる化合物のスクリーニングに特に有用である。かかる試験に使用されるPRO57290ポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離、固相支持体に固定、細胞表面上に担持、または細胞内に局在のいずれかであり得る。薬物スクリーニング方法の一例では、組換え核酸で安定に形質転換された、PRO57290ポリペプチドまたは断片を発現する真核生物または原核生物の宿主細胞を用いる。薬物は、競合的結合アッセイで、かかる形質転換細胞に対してスクリーニングする。かかる細胞は、バイアブルな状態または固定された形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、PRO57290ポリペプチドまたは断片と試験対象の薬剤との複合体の形成を測定できる。あるいはまた、試験される薬剤によって引き起こされるPRO57290ポリペプチドとその標的細胞または標的受容体との複合体形成の減少を検査できる。
本発明は、さまざまな薬物スクリーニング手法のいずれかにおいて、PRO57290ポリペプチドまたはその結合断片を用いることによる化合物のスクリーニングに特に有用である。かかる試験に使用されるPRO57290ポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離、固相支持体に固定、細胞表面上に担持、または細胞内に局在のいずれかであり得る。薬物スクリーニング方法の一例では、組換え核酸で安定に形質転換された、PRO57290ポリペプチドまたは断片を発現する真核生物または原核生物の宿主細胞を用いる。薬物は、競合的結合アッセイで、かかる形質転換細胞に対してスクリーニングする。かかる細胞は、バイアブルな状態または固定された形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、PRO57290ポリペプチドまたは断片と試験対象の薬剤との複合体の形成を測定できる。あるいはまた、試験される薬剤によって引き起こされるPRO57290ポリペプチドとその標的細胞または標的受容体との複合体形成の減少を検査できる。
したがって、本発明は、薬物またはPRO57290ポリペプチド関連の疾患または障害に影響を及ぼし得る任意の他の薬剤のスクリーニング方法を提供する。このような方法は、かかる薬剤をPRO57290ポリペプチドまたはその断片と接触させること、および(I)該薬剤とPRO57290ポリペプチドもしくは断片との複合体の存在について、または(ii)PRO57290ポリペプチドもしくは断片を細胞との複合体の存在について、当該技術分野でよく知られた方法によってアッセイすることを含む。かかる競合的結合アッセイでは、PRO57290または断片を、典型的には標識する。適当なインキュベーション後、遊離PRO57290ポリペプチドまたは断片を、結合された形態で存在するものから分離し、遊離または非複合体形成標識の量を、その特定の薬剤がPRO57290ポリペプチドに結合する能力またはPRO57290ポリペプチド/細胞複合体に干渉する能力の尺度とする。
薬物スクリーニングのための別の手法は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供し、WO84/03564(1984年9月13日に公開)に詳細に記載されている。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたはいずれかの他の表面などの固相基材上で合成する。PRO57290ポリペプチドに適用し、ペプチド試験化合物をPRO57290ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合されたPRO57290ポリペプチドは、当該技術分野でよく知られた方法によって検出する。また、精製したPRO57290ポリペプチドを、前述の薬物スクリーニング手法における使用のために、直接プレート上にコートしてもよい。また、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固相支持体上に固定化してもよい。
本発明ではまた、PRO57290ポリペプチドに結合できる中和抗体が、試験化合物と、PRO57290ポリペプチドまたはその断片に対する結合に関して特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用が想定される。このようにして、該抗体は、PRO57290ポリペプチドと1つ以上の抗原性決定基とを共有する任意のペプチドの存在を検出するために使用できる。
実施例14:合理的な薬物設計
合理的な薬物設計の目的は、目的の生物学的に活性なポリペプチド(すなわち、PRO57290ポリペプチド)または該ポリペプチドと相互作用する小分子、例えば、アゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターの構造的類縁体を作製することである。これらの例のいずれかを用い、PRO57290ポリペプチドのより活性または安定な形態である薬物またはPRO57290ポリペプチドの機能をインビボで増強もしくは干渉する薬物を創出し得る(Hodgson,Bio/Technology,9:19−21(1991)を参照)。
合理的な薬物設計の目的は、目的の生物学的に活性なポリペプチド(すなわち、PRO57290ポリペプチド)または該ポリペプチドと相互作用する小分子、例えば、アゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターの構造的類縁体を作製することである。これらの例のいずれかを用い、PRO57290ポリペプチドのより活性または安定な形態である薬物またはPRO57290ポリペプチドの機能をインビボで増強もしくは干渉する薬物を創出し得る(Hodgson,Bio/Technology,9:19−21(1991)を参照)。
アプローチの一例において、PRO57290ポリペプチド−インヒビター複合体の3次元構造を、x線結晶学、コンピュータモデル設計または、最も典型的には、この2つのアプローチの組合せによって決定する。該分子の構造を解明するため、および活性部位(1つまたは複数)を決定するためには、PRO57290ポリペプチドの形状および電荷の両方が確認されなければならない。頻度は低いが、PRO57290ポリペプチドの構造に関する有用な情報を、相同タンパク質の構造に基づいたモデル設計によって得ることができる。両方の場合において、関連する構造的情報は、類縁PRO57290ポリペプチド様分子を設計するため、または効率的なインヒビターを同定するために使用する。合理的な薬物設計の有用な例としては、BraxtonおよびWells,Biochemistry,31:7796−7801(1992)に示されたような改善された活性もしくは安定性を有する分子、またはAthaudaら,J.Biochem.,113:742−746(1993)に示されたような天然ペプチドのインヒビター、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する分子が挙げられ得る。
また、上記のようにして機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解明することも可能である。このアプローチは、原理的には、その後の薬物設計の基礎となり得るファーマコアをもたらす。タンパク質結晶学は、機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗イデオタイプ抗体(抗id)を作製することにより、全く回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗idの結合部位は、元の受容体の類縁体であることが予測され得る。次いで、抗idを、化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離するために使用できる。次いで、単離されたペプチドは、ファーマコアとしての役目を果たし得る。
本発明のおかげで、X線結晶学などの解析的研究を行なうのに充分な量のPRO57290ポリペプチドが利用可能となり得る。また、本明細書に提供されたPRO57290ポリペプチドアミノ酸配列の知得により、x線結晶学の代わり、またはこれに加えてにコンピュータモデル設計手法が使用されるものに対する手引きが提供される。
Claims (72)
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;および
(c)測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程
を含み、
ここで、野生型動物の生理学的特徴と異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、方法。 - 前記非ヒトトランスジェニック動物が、PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊についてヘテロ接合性である、請求項1に記載の方法。
- 性別一致野生型同腹仔と比較した場合、前記非ヒトトランスジェニック動物によって示される表現型が、以下:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つである、請求項1に記載の方法。
- 前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、請求項3に記載の方法。
- 前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー(idiopathic demyelinating polyneuropathy)またはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、請求項3に記載の方法。
- 前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、請求項3に記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、請求項1に記載の方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物に由来する単離細胞。
- 単離細胞がマウス細胞である、請求項9に記載の単離細胞。
- 前記マウス細胞が胚性幹細胞である、請求項10に記載の単離細胞。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の表現型:心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常の少なくとも1つを示す、請求項9に記載の単離細胞。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる表現型として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊と関連する同定された表現型を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。 - 前記遺伝子破壊と関連する前記表現型が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、請求項14に記載の方法。
- 前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、請求項14に記載の方法。
- 前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、請求項14に記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、請求項13に記載の方法。
- 請求項13に記載の方法によって同定される薬剤。
- PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項20に記載の薬剤。
- 前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項21に記載の薬剤。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項21に記載の薬剤。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物によって示される生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物によって示される生理学的特徴を、遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)遺伝子破壊と関連する生理学的特徴が調節されているか否かを判定する工程
を含む、方法。 - 前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、請求項24に記載の方法。
- 請求項24に記載の方法によって同定される薬剤。
- PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項26に記載の薬剤。
- 前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項27に記載の薬剤。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項27に記載の薬剤。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)該非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(c)該試験薬剤が、該非ヒトトランスジェニック動物において、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常を寛解または調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。 - 前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大、および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、請求項30に記載の方法。
- 前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、請求項30に記載の方法。
- 前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、請求項30に記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物が、性別一致野生型同腹仔と比較して、以下の生理学的特徴:生存能力の低下および体重減少;糸球体症および水腎症、骨髄および脾臓における巨核球増多症、肝腫大、または胚性致死などの発達疾患を含む病変の少なくとも1つを示す、請求項30に記載の方法。
- 請求項30に記載の方法によって同定される薬剤。
- PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項36に記載の薬剤。
- 前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項37に記載の薬剤。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項37に記載の薬剤。
- 請求項30に記載の方法によって同定される治療薬。
- PRO57290ポリペプチドの発現を調節する薬剤を同定する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞を試験薬剤と接触させる工程;および
(b)該試験薬剤が、該宿主細胞による該PRO57290ポリペプチドの発現を調節するか否かを判定する工程
を含む、方法。 - 請求項41に記載の方法によって同定される薬剤。
- PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項42に記載の薬剤。
- 前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項43に記載の薬剤。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項43に記載の薬剤。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態に影響を及ぼし得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)前記PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態として同定する、工程;
(d)(a)の非ヒトトランスジェニック動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する同定された状態に対して該試験薬剤の作用を評価する工程
を含む、方法。 - 前記状態が、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または発達異常である、請求項46に記載の方法。
- 請求項46に記載の方法によって同定される治療薬。
- PRO57290ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項48に記載の治療薬。
- 前記アゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項49に記載の治療薬。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項49に記載の治療薬。
- 請求項48に記載の治療薬を含む医薬組成物。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する、心臓血管、内皮もしくは脈管形成の障害;免疫学的障害;腫瘍学的障害;骨代謝の異常もしくは障害;または胚性致死を処置または予防または寛解する方法であって、該方法は、該障害をすでに有し得るか、または該障害を有する傾向にあり得るか、または該障害を予防する状態であり得る、そのような処置が必要な被験体に対して、治療有効量の請求項40に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該障害を効果的に処置または予防または寛解する、方法。
- 前記発達異常が、胚性致死または生存能力の低下を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記心臓血管、内皮または脈管形成の障害が、動脈疾患、例えば、真性糖尿病;乳頭浮腫;視神経萎縮;アテローム性動脈硬化症;アンギナ;急性心筋梗塞などの心筋梗塞、心臓肥大および鬱血性心不全などの心不全;高血圧症;炎症性血管炎;レイノー病およびレイノー現象;動脈瘤ならびに動脈再狭窄;静脈およびリンパの障害、例えば、血栓静脈炎、リンパ管炎およびリンパ浮腫;末梢血管疾患;癌、例えば、血管腫瘍、例えば、血管腫(毛細管および海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫;腫瘍新脈管形成;外傷、例えば、創傷、熱傷および他の組織の傷害、移植片固定、瘢痕;虚血再灌流傷害;関節リウマチ;脳血管疾患;急性腎不全などの腎疾患、または骨粗鬆症である、請求項53に記載の方法。
- 前記免疫学的障害が、全身性エリテマトーデス;関節リウマチ;若年性慢性関節炎;脊椎関節症;全身性硬化症(強皮症);特発性炎症性筋障害(皮膚筋炎、多発性筋炎);シェーグレン症候群;全身性血管炎;サルコイドーシス;自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症);自己免疫性血小板減少症(特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症);甲状腺炎(グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎);真性糖尿病;免疫媒介性腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎);中枢および末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチーまたはギラン・バレー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー;肝胆疾患、例えば、感染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎および他の非肝向性のウイルスによる肝炎)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎および硬化性胆管炎;炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎:クローン病);グルテン過敏性腸症およびホイップル病;水疱性皮膚疾患、多形性紅斑および接触性皮膚炎を含む自己免疫性または免疫媒介性の皮膚疾患、乾癬;アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症および蕁麻疹;肺の免疫学的疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺炎;または移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患である、請求項53に記載の方法。
- 前記骨代謝の異常または障害が、関節炎、骨粗鬆症または大理石骨病である、請求項53に記載の方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を調節する方法であって、該方法は、該表現型をすでに有し得るか、または該表現型を有する傾向にあり得るか、または該表現型を予防する状態にあり得る被験体に、有効量の請求項20に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該表現型を効果的に調節する、方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を調節する方法であって、該方法は、該生理学的特徴をすでに示し得るか、または該生理学的特徴を示す傾向にあり得るか、または該生理学的特徴を予防する状態であり得る被験体に、有効量の請求項26に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該生理学的特徴を効果的に調節する、方法。
- PRO57290ポリペプチドの発現を調節する方法であって、該方法は、該PRO57290ポリペプチドを発現している宿主細胞に、有効量の請求項42に記載の薬剤またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該ポリペプチドの発現を効果的に調節する、方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態を調節する方法であって、該方法は、該状態を有し得るか、または該状態を有する傾向にあり得るか、または該状態を予防する状態であり得る被験体に、治療有効量の請求項48に記載の治療薬、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を含み、それによって該状態を効果的に調節する、方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣する薬剤を同定する方法であって、該方法は;
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤が該非ヒトトランスジェニック動物において初期に観察される状態または表現型を模倣するか否かを判定する工程
を含む、方法。 - 請求項62に記載の方法によって同定される薬剤。
- PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、請求項63に記載の薬剤。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項63に記載の薬剤。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型を模倣する状態であり得る被験体に、有効量の請求項63に記載の薬剤、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊に関連する状態または表現型を模倣し得る治療薬を評価する方法であって、該方法は:
(a)PRO57290ポリペプチドをコードするヒト遺伝子のオルソログである遺伝子が破壊されたゲノムを有する非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程;
(b)(a)の非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定する工程;
(c)(b)の測定された生理学的特徴を性別一致野生型動物の生理学的特徴と比較する工程であって、ここで、該性別一致野生型動物の生理学的特徴と異なる該非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を、該非ヒトトランスジェニック動物における該遺伝子の破壊から生じる状態または表現型と同定する、工程;
(d)(c)の該性別一致野生型動物に試験薬剤を投与する工程;および
(e)該試験薬剤の該非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する該状態または表現型を模倣する能力を評価する工程
を含む、方法。 - 請求項67に記載の方法によって同定される治療薬。
- PRO57290ポリペプチドのアンタゴニストである、請求項68に記載の治療薬。
- 前記アンタゴニストが抗PRO57290抗体である、請求項68に記載の治療薬。
- 請求項68に記載の治療薬を含む医薬組成物。
- PRO57290ポリペプチドをコードする遺伝子の破壊と関連する状態または表現型を模倣する方法であって、該方法は、該状態または表現型障害を模倣する状態であり得る被験体に、治療有効量の請求項68に記載の治療薬、またはPRO57290ポリペプチドのアンタゴニストを投与する工程を含み、それにより該状態または表現型を効果的に模倣する、方法。
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