KR100443426B1 - Ｓｒｇ3 단백질을 ｔ 세포 특이적으로 발현하는 형질전환동물 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SRG3 단백질을 T 세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 T 세포 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 인간 CD2 프로모터(hCD2 promoter)와 폴리A 서열(polyA sequence)을 가지는 LCR(locus control region) 사이에 삽입된 생쥐 SRG3 cDNA를 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트(construct), 이를 함유하여 SRG3 단백질을 과발현시킬 수 있는 발현벡터, 상기 벡터중 융합 유전자 컨스트럭트가 미세주입된 수정란, 이로부터 얻은 형질전환 동물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 동물은 T 세포 계열에서 SRG3 단백질이 과발현되어 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드(glucocorticoids)에 의한 성숙한 T 세포의 아폽토시스를 유도하는 SRG3의 발현이 증가됨으로써 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스 민감성이 증가된 성숙한 T 세포를 가지고 있어서, 스트레스에 의한 면역기능의 조절기작을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 SRG3 단백질을 T 세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 T 세포 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 인간 CD2 프로모터(hCD2 promoter)와 폴리A 서열(polyA sequence)을 가지는 LCR(locus control region) 사이에 삽입된 생쥐 SRG3 cDNA를 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트(construct), 이를 함유하여 SRG3 단백질을 과발현시킬 수 있는 발현벡터, 상기 벡터중 융합 유전자 컨스트럭트가 미세주입된 수정란, 이로부터 얻은 형질전환 동물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
미성숙한 흉선세포(immature thymus cell)는 흉선에서 정교한 분화과정을 통하여 항원 인식에 필요한 자가 MHC(major histocompatibility complex) 제한 및 자가 관용(self tolerance)을 가지는 성숙한 흉선세포(mature thymus cell)로 분화된다(Von Boehmer H.et al., Cell76, 219-228, 1994). MHC란 면역 보조세포 또는 B 세포(Bone marrow cell)가 펩티드 항원을 흉선세포에 인식시키기 위하여 상기 펩티드 항원과 함께 세포표면에 발현하는 단백질 콤플렉스(complex)로서 흉선세포의 수용체(T cell receptor, 이하 "TCR"이라 약칭함)와 결합하여 흉선세포를 자극시키는 역할을 수행한다. 성숙한 흉선세포가 가지는 자가 MHC 제한이란 흉선세포가 자가 MHC에 결합된 펩티드 항원만을 인식하여 면역기능을 수행하는데 필수적인 능력이고, 자가관용이란 흉선세포가 자가-MHC에 결합된 자가 펩티드 항원을 인식하지 않아 자가조직을 면역작용으로부터 보호하는데 필수적인 능력이다.
성숙한 흉선세포가 되기 위하여, 미성숙한 흉선세포는 일련의 유전자 재배열(gene rearrangement)을 거쳐 α-TCR 및 β-TCR을 발현시키고, 적절한 TCR을 발현하는 흉선세포가 선택되어 CD4 흉선세포 또는 CD8 흉선세포로 분화된다. 구체적으로, 흉선세포의 세포표면에 TCR이 발현되면 흉선세포는 펩티드 항원(peptide antigen)이 결합된 자가 MHC만을 인식하여 적절히 결합할 수 있는 흉선세포만 선택되는 긍정적 선별과정(positive selection process)을 통하여 CD4 또는 CD8 흉선세포로 분화된다(Janeway C.A. Jr.et al., Immunity,1, 3-6, 1994). 긍정적 선별과정에서 CD4/CD8 이중양성 흉선세포는 프로그램화된 세포사멸과정인 아폽토시스를 통해서 제거되는데, 이것은 이중양성 흉선세포가 TCR에 의해 매개되는 적절한 생존신호를 받지 못하여 아폽토시스가 유발되기 때문이다(Surh C.D. and Sprent J.et al., Nature,372, 100-103, 1994).
반면, 펩티드 항원이 결합된 자가 MHC와 필요이상으로 강한 결합을 하는 흉선세포는 부정적 선별과정(negative selection process)을 통하여 제거되는데, 이때 제거되는 흉선세포의 사멸은 아폽토시스에 의하여 유도되고, 생존한 흉선세포는 비로서 자가-관용을 가지게 되어 면역작용으로부터 자가조직을 보호하게 된다(Matzinger P.et al., Nature,308, 738-741, 1984; Sprent J. et al., Immunol. Rev., 101, 173-190, 1988; Schwartz R.H.et al., Cell,57, 1073-1081,1989). 따라서, 흉선세포의 TCR과 펩티드 항원이 결합된 자가 MHC 사이의 결합력은 분화과정의 흉선세포가 생존하는지 사멸하는지를 결정하는 중요한 요소로 작용하는 것으로 보고되고 있다(Ashton-Rickardt P.G.et al., Cell76, 651-663, 1994; Sebzda E.et al., Immunol. 17, 829-874, 1999).
한편, 흉선세포가 긍정적 선별과정을 거쳐 선택될 때 어떤 기작으로 아폽토시스가 일어나지 않는지는 아직 정확히 알려져 있지 않으나, 글루코코르티코이드가 상기 긍정적 선별과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있다(Yang Y. and Ashwell J.D.,J Clin. Immunol., 19, 337-349, 1999). 현재까지 글루코코르티코이드에 관한 연구결과, 글루코코르티코이드는 부신(adrenal gland) 및 흉선에서 생산되는 호르몬으로 긍정적 선별과정에서 선택되지 못한 미성숙 흉선세포의 아폽토시스를 유발시킨다. 따라서, 미성숙 흉선세포는 상기 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대하여 민감한 반면, 성숙한 CD4 또는 CD8 T 세포는 상대적으로 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대하여 저항성을 갖는다(Cohen J.et al.,Semin. Immunol., 4, 363-369, 1992). 상술한 바와 같이, 미성숙 흉선세포와 성숙한 단일양성 T 세포사이의 글루코코르티코이드에 대한 민감도 차이를 명확하게 설명할 수 있는 분자생물학적 기작이 아직까지 정확하게 규명되어 있지 않으므로 긍정적 선별과정에서 선택된 미성숙 흉선세포가 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대하여 저항성을 획득하는 방법에 관한 연구가 요구되고 있다.
전술한 바와 같은 흉선세포 분화에서의 글루코코티코이드의 작용에 근거하여 글루코코티코이드의 유사체인 덱사메타손(Dexamethasone) 또는하이드로코르티손(Hydrocortisone)등이 면역억제제로서 시판되고 있다. 글루코코르티코이드의 면역기능 조절은 글루코코르티코이드 수용체를 통하여 이루어지는데, 이러한 연구의 일환으로 최근에 글루코코르티코이드의 면역기능을 조절하는 SRG3가 발견되었다.
SRG3는 글루코코르티코이드에 의한 미성숙 흉선세포의 아폽토시스를 조절하는 과정에서 중추적인 역할을 담당하는 단백질로서 글루코코르티코이드 수용체의 전사활성을 조절하는 것으로 알려졌다(Jeon S.H.et al., J. Exp. Med.185, 1827-1836, 1997). SRG3는 성숙한 T 세포에 비하여 미성숙 흉선세포에서 그 발현량이 매우 높은 반면, 긍정적 선별과정에 의해 선택된 흉선세포에서의 SRG3 발현량은 감소되는데, 이는 SRG3 발현량이 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대한 흉선세포의 민감도를 결정하기 때문이다. 구체적으로, SRG3 발현량이 높을 경우는 SRG3가 글루코코르티코이드 수용체와 결합하여 상기 수용체의 전사활성화를 가속화시켜 아폽토시스를 유도하고, SRG3 발현량이 낮을 경우는 글루코코르티코이드 수용체와 결합하는 SRG3 분자수가 감소되어 글루코코르티코이드 수용체의 전사활성이 저하되기 때문에 아폽토시스가 유발되지 않는다.
SRG3에 대한 최근 연구결과, 흉선세포의 분화에 중요한 기능을 하는 노취(Notch) 단백질이 SRG3 단백질의 발현을 억제하여 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스를 저해함으로써 미성숙 흉선세포가 CD4 또는 CD8 T 세포로 분화하는데 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Deftos M.L.et al., Immunity,9, 777-786, 1998). 특히, 노취 단백질의 내부도메인(이하 "노취IC"라 약칭함)이 발현되는 생쥐 흉선세포에서 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스가 억제되고, 상기 생쥐 흉선세포에 SRG3를 과발현시키면 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대한 흉선세포의 민감도가 부분적으로 회복되는데, 이는 노취 단백질중 노취1이 SRG3 발현을 저해하여 글루코코르티코이드에 의한 흉선세포의 아폽토시스를 억제하는데 핵심적인 역할을 수행하는 것을 의미한다(Deftos M.L.et al., Immunity,9, 777-786, 1998). 따라서, 노취에 의하여 SRG3 발현량이 정확히 조절되어 미성숙 흉선세포의 분화과정중 선택되지 못하는 흉선세포에서의 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스가 조절된다.
비록 노취에 의한 SRG3 발현저해로 인하여 글루코코르티코이드로 유발되는 미성숙 흉선세포의 아폽토시스가 저해된다는 사실은 밝혀졌지만 그 기작은 아직까지 알려져 있지 않다. 따라서, 흉선세포의 분화과정중에 유발되는 아폽토시스의 조절기작을 정확히 밟히기 위해서는 글루코코르티코이드로 유발되는 흉선세포의 아폽토시스가 SRG3 발현저해로 인하여 억제되는 기작에 관한 활발한 연구가 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 스트레스 호르몬의 일종인 글루코코르티코이드에 의한 말단 면역세포의 활성화 억제를 규명하기 위하여 노력하던 중, 흉선세포 및 흉선암 세포주에서 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스를 조절하는 SRG3 단백질을 SRG3 유전자를 과발현시키는 방법으로 발현량을 증가시킴으로써 글루코코르티코이드에 대한 민감성이 증가된 성숙한 말단 T 세포를 가지는 형질전환 생쥐를 제조하였으며, 상기 형질전환 생쥐에서 SRG3 단백질이 과발현되고, 이로인해 성숙한 T 세포의 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스 민감성이 증가되었고, 또한 스트레스에 의해서 성숙한 말단 T 세포의 수가 줄어든다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역세포 분화 및 면역기능의 조절기작을 연구하기 위한 생체 동물모델을 제공하기 위하여, 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드에 대한 민감성이 증가된 성숙한 말단 T 세포를 가지는 형질전환 동물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 발현벡터내에 인간 CD2 프로모터와 폴리 A 서열을 가지는 LCR 사이에 3.4 kb의 SRG3 cDNA가 삽입된 것을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1: 1kb DNA 사이즈 마커(DNA size marker)
레인 2: 제한효소BglII으로 절단하여 얻은 DNA 단편
도 2는 SRG3 유전자를 발현하는 발명의 발현벡터의 개열지도를 나타내는 것이고,
도 3은 본 발명의 형질전환 생쥐를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,
도 4a는 게놈내에 생쥐 SRG3 cDNA를 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트가 삽입된 형질전환 생쥐를 선별하기 위하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1: DNA 사이즈 마커
레인 2: 형질전환 생쥐의 꼬리 DNA를 PCR로 증폭시켜 얻은 SRG3 cDNA 단편
도 4b는 게놈내에 생쥐 SRG3 cDNA를 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트가 삽입된 형질전환 생쥐를 선별하기 위하여 서던 블로팅을 한 결과이고,
레인 1: control FVB
레인 2, 3: 서로 다른 두 line의 생쥐의 서던 블로팅 결과
도 5는 본 발명의 형질전환 생쥐에서 SRG3 단백질의 발현양상을 확인하기 위하여, 흉선 세포와 림프절 세포의 파쇄액을 이용하여 웨스턴 블러팅(western blotting) 수행한 결과를 나타낸 것이고,
레인 1: 정상 생쥐 흉선 세포 파쇄액
레인 2: 형질전환 생쥐 흉선 세포 파쇄액
레인 3: 정상 생쥐 림프절 세포 파쇄액
레인 4: 형질전환 생쥐 림프절 세포 파쇄액
도 6은 본 발명의 형질전환 생쥐의 림프절에 있는 성숙한 T 세포의 글루코코르티코이드 유사체인 덱사메타손(dexamethasone)에 의한 아폽토시스를 측정하여 비교한 결과이고,
도 7은 본 발명의 형질전환 생쥐의 림프절 T 세포가 정상 생쥐의 림프절 T 세포에 비해 글루코코르티코이드외에 다른 종류의 물질에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 민감성이 변화하지 않았음을 보여주는 결과이고,
도 8은 본 발명의 형질전환 생쥐의 비장 및 흉선의 T 세포가 정상 생쥐의 비장 및 흉선의 T 세포에 비해 스트레스에 더 민감해져서, 스트레스 상황을 반복적으로 가할 때, T 세포의 수가 더 빨리 줄어드는 것을 보여주는 결과이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 CD2 프로모터, 상기 프로모터의 뒤에 삽입된 생쥐 SRG3 cDNA 및 폴리A 서열이 결합된 LCR (locus control region)을 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 유전자 컨스트럭트를 함유하여 T 세포 특이적으로 SRG3 단백질을 과발현시킬 수 있는 발현벡터를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 벡터중 본 발명의 융합 유전자 컨스트럭트가 게놈내에 삽입된 수정란 및 이로부터 얻은 형질전환 동물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 형질전환 동물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 성숙한 말단 T 세포 특이적으로 유전자의 발현을 유도시키는 인간 CD2 프로모터와 폴리A 서열이 결합된 LCR (locus control region) 사이에 생쥐 SRG3 cDNA가 삽입된 융합 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
상기 융합 유전자 컨스트럭트는 모든 T 세포계열군에서 활성화되는 인간 CD2 프로모터를 포함하여 SRG3 단백질을 T 세포 계열에서만 특이적으로 발현시키는데, 이는 CD2가 흉선 및 T 세포 계열에서만 발현되는 단백질이기 때문이다.
또한, 본 발명의 융합 유전자 컨스트럭트내 SRG3 cDNA의 3'-말단(3'-terminus)에 폴리A 서열이 결합된 LCR이 부착되어 있는데, 이는 폴리A 서열이 포유동물에서의 유전자 발현에 필수적인 서열이기 때문이다. 따라서, 본 발명의 융합 유전자 컨스트럭트는 인간 CD2 프로모터의 조절하에서 상기 융합 유전자 컨스트럭트로부터 SRG3 유전자의 3'-말단에 폴리A 서열이 결합된 LCR이 부착된 융합 RNA를 T 세포 특이적으로 발현시킬 수 있다(도 2참조).
또한, 본 발명은 상기 융합 유전자 컨스트럭트를 포함하여 T 세포 특이적으로 SRG3 유전자 및 단백질을 과발현시킬 수 있는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 인간 CD2 프로모터 및 폴리A 서열이 결합된 LCR을 포함하는 벡터 (Greaveset al., Cell, 56, 979-986, 1989)을 이용하여 제조되었다.
SRG3 cDNA를 얻기 위하여, 3.4 kb의 생쥐 SRG3 cDNA가 클로닝된 재조합 벡터로부터 3.4 kb의 SRG3 cDNA를 절단한 후 이를 벡터 내 인간 CD2 프로모터와 폴리A서열이 결합된 LCR 사이에 삽입하여 T 세포 특이적으로 SRG3 유전자 및 단백질을 과발현하는 발현벡터를 제조하였다(도 2참조). 본 발명의 발현벡터를 T 세포에 형질전환시키면 인간 CD2 프로모터의 조절에 의해 SRG3 유전자 및 단백질이 과발현되어 SRG3 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 발현벡터는 T 세포 및 T 세포주에서 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스를 조절하는 SRG3 단백질의 발현량을 증가시킴으로써 글루코코르티코이드의 기능 및 스트레스 상황하에서의 면역기능의 조절 기작을 이해하는데 유용하게 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 발현벡터중 인간 CD2 프로모터, 이 프로모터 뒤에 삽입된 SRG3 cDNA, 폴리A 서열로 구성되는 DNA 단편을 미세주입방법으로 생쥐 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 생쥐 수정란 및 이로부터 얻은 형질전환 생쥐를 제공한다.
본 발명의 발현벡터를 제한효소로 절단하여 상기 DNA 단편을 얻고, 이를 미세주입방법으로 생쥐 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 생쥐 수정란을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 3월 16일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0974BP)(도 3참조).
구체적으로, 본 발명의 형질전환 생쥐 수정란은 T 세포 특이적 프로모터인 인간 CD2 프로모터와, 여기에 결합된 SRG3 cDNA 및 포유동물에서 유전자 발현에 관여하는 폴리A 서열을 포함하는 DNA 단편을 정핵과 난핵이 융합되지 않은 생쥐 수정란에 미세주입방법으로 주입하여 확보하며, 상기 형질전환 생쥐 수정란은 세포분열시 형성되는 모든 세포내에 상기 DNA 단편을 포함한다.
본 발명의 형질전환 생쥐 수정란을 이용하여 SRG3 단백질을 과발현하여 SRG3 단백질의 발현량이 증가되는 형질전환 생쥐를 얻을 수 있다.
본 발명의 형질전환 생쥐는 인간 CD2 근접 프로모터와 여기에 삽입된 SRG3 cDNA 및 포유동물에서의 유전자 발현에 관여하는 폴리A 서열을 포함하는 DNA 단편이 주입된 생쥐 수정란을 가임신된 대리모 생쥐에 착상시켜 제조된다(도 3참조). 상기 형질전환 생쥐는 모든 체세포 및 생식세포의 게놈내에 SRG3 cDNA 단편이 삽입되어 있으므로 생식세포를 통하여 SRG3 cDNA 단편을 유전시킬 수 있다. 또한, 인간 CD2 프로모터는 T 세포에서만 유전자 발현을 유도하는 T 세포 특이적 프로모터이고 상기 프로모터의 뒤에 SRG3 cDNA가 삽입되어 있기 때문에 본 발명의 형질전환 생쥐는 체세포중 T 세포에서만 SRG3 유전자 및 단백질을 과발현시킨다.
따라서, 본 발명의 형질전환 생쥐는 생체내에서 SRG3 단백질의 발현 증가시에 글루코코르티코이드에 대한 성숙한 말단 T 세포의 민감성 증가가 말단 T 세포의 활성화 과정 및 이후의 면역반응에 미치는 영향을 이해하는데 유용하게 이용될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 상기 형질전환 생쥐의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은
1) T 세포 특이적 프로모터와 포유동물 유래 유전자 사이에 SRG3 cDNA를 삽입하여 발현벡터를 제조하는 단계(단계 1);
2) 상기 발현벡터를 제한효소로 절단하여 T 세포 특이적 프로모터, 상기 프로모터 뒤에 삽입된 SRG3 cDNA 및 포유동물 유래 유전자로 구성된 융합 유전자 컨스트럭트를 얻는 단계(단계 2);
3) 상기 융합 유전자 컨스트럭트를 포유동물 수정란에 삽입하여 형질전환 수정란을 제조하는 단계(단계 3); 및
4) 상기 형질전환 수정란을 가임심된 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 얻는 단계(단계 4)로 이루어진다.
단계 1을 구체적으로 설명하면, T 세포 특이적 프로모터는 인간 CD2 프로모터, Lck 근접 프로모터, CD4 minigene 프로모터, TCR 프로모터 및 CD3 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되어 사용될 수 있으며, SRG3 cDNA는 생쥐 SRG3 cDNA를 이용하였다. 포유동물 유래 유전자는 폴리A 서열이 결합된 인간 CD2 LCR, 폴리A 서열이 결합된 인간 성장호르몬 (hGH PolyA), 소성장호르몬 (bGH PolyA), 인간 CD2 (hCD2 polyA), 및 SV40 (SV40 PolyA)으로 이루어지는 군에서 선택되어 사용될 수 있다. 폴리A 서열은 유전자의 발현을 안정화하는 역할을 하는데, 본 발명에서는 3' 말단에 폴리A 서열이 결합된 인간 CD2 유전자의 LCR (hCD2 locus control region)을 이용하였다.
단계 2를 구체적으로 설명하면, 단계 2의 융합 유전자 컨스트럭트는 포유동물에서 유전자로부터 RNA를 생성하는데 필수적인 구성요소를 갖춘 컨스트럭트이다. T 세포 특이적 프로모터는 T 세포 계열에서만 유전자 발현을 유도하는 프로모터로서 인간 CD2 프로모터, Lck 말단 프로모터, CD4 minigene promoter, CD3 프로모터가 이용될 수 있는데, 본 발명에서는 인간 CD2 프로모터를 이용하였다.
단계 3을 구체적으로 설명하면, 포유동물 수정란은 정핵과 난핵이 융합되지 않은 상태의 1 세포기 수정란으로서 제조하고자 하는 형질전환 동물에 따라 생쥐, 기니아 피그(guinea pig), 렛트(rat), 염소, 소 등의 수정란이 이용될 수 있고 형질전환 수정란은 단계 2의 융합 유전자 컨스트럭트를 상기 1 세포기의 포유동물 수정란에 미세주입하는 미세주입법, 융합 유전자 컨스트럭트를 삽입한 간(杆)세포(stem cell)를 발생중인 수정란과 결합시켜 만드는 세포혼합법등에 의하여 제조될 수 있는데, 본 발명에서는 생쥐 수정란에 상기 융합 유전자 컨스트럭트를 미세주입법으로 삽입하였다.
단계 4를 구체적으로 설명하면, 가임신된 대리모는 이용되는 형질전환 수정란에 따라 선택되며 수정관이 절제된 수컷 포유동물과 교배하여 가임신시킨 암컷 포유동물인데, 본 발명에서는 형질전환 생쥐 수정란을 이용하였기 때문에 가임신된 생쥐 대리모를 선택하였다. 형질전환 동물을 선별하기 위한 DNA 분석은 게놈 DNA내 SRG3 cDNA가 삽입된 형질전환 1 세대 동물을 확인하기 위하여 수행되는데, 꼬리 DNA를 이용한 서던 블러팅과 PCR이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> SRG3 단백질 과발현 벡터의 제조
SRG3 단백질을 T 세포 계열에서만 과발현시키는 발현벡터를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 T 세포 특이적으로 유전자 발현을 유도시키는 인간 CD2 프로모터와 삽입된 SRG3 cDNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였다.
먼저, 클로닝(cloning)되어 있는 생쥐의 SRG3 cDNA(Jeon, S.H.et al., J. Exp. Med., 185, 1827-1836, 1997)를 제한효소BamHI/DraI으로 절단하여 3.4 kb의 SRG3 cDNA를 얻고, 이를 Klenow DNA 중합 효소를 이용하여 DNA 말단을 blunt end로 만들어 3.4kb의 전체 SRG3 cDNA를 얻었다. 상기 3.4kb의 전체 SRG3 cDNA를 인간 CD2 (Greaves et al., Cell 56, 979-986, 1989) 벡터내 인간 CD2 프로모터와 폴리A 서열이 결합된 LCR 사이에 있는SmaI 위치에 삽입하여 T 세포 특이적으로 SRG3 단백질을 과발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였고, 이를 "pCD2-SRG3"이라 명명하였다(도 2).
상기 발현벡터내에 SRG3 cDNA가 클로닝되었는지 확인하기 위하여, 발현벡터를 제한효소BglII으로 절단한 후 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 벡터를 포함하는 14.6kb DNA 밴드와 SRG3 cDNA 전반부를 포함하는 3kb의 DNA 밴드를 관찰함으로써 SRG3 cDNA가 발현벡터 pCD2-SRG3내에 삽입되어 있음을 확인하였다(도 1).
<실시예 2> 형질전환 생쥐 수정란의 제조
인간 CD2 프로모터와 폴리A 서열을 포함하는 인간 CD2 LCR 사이에 SRG3 cDNA 가 삽입된 융합 유전자 컨스트럭트를 이용하여 형질전환 생쥐 수정란을 제조하기위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 실험을 실시하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 발현벡터 pCD2-SRG3로부터 인간 CD2 프로모터와 폴리A 서열을 포함하는 인간 CD2 LCR 사이에 SRG3 cDNA가 삽입된 융합 유전자 컨스트럭트를 얻기 위하여, 제한효소KpnI 및NotI 으로 상기 발현벡터를 각각 절단하고 전기영동한 후, SRG3 cDNA 단편을 포함하는 14.6 kb의 융합 유전자 컨스트럭트를 젤로부터 투석하여 정제하였다. 상기 정제된 14.6 kb의 융합 유전자 컨스트럭트를 정핵과 난핵이 융합되지 않은 생쥐 수정란에 표준방법으로 미세주입하여 형질전환 생쥐 수정란을 제조한 후 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 3월 16일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0974BP)(Hogan, B.et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
<실시예 3> 형질전환 생쥐의 제조
실시예 2에서 제조된 형질전환 생쥐 수정란을 이용하여 형질전환 생쥐를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 실험을 실시하였다.
실시예 2의 형질전환 생쥐 수정란을 가임신된 대리모 생쥐(FVB strain, Macrogen 서울대학교 의대 암연구소 소재)의 자궁에 착상시켜 얻은 생후 3 주령의 생쥐의 꼬리를 1 cm 절제한 후 이로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되며 SRG3 cDNA 단편의 3' 말단을 특이적으로 인식하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR를 수행하였다. 그 결과, 상기PCR 증폭에 의한 800 bp 크기의 PCR 산물이 검출된 1 세대 형질전환 생쥐를 선별하였고 이들의 게놈 DNA에 SRG3 cDNA 단편을 포함하는 14.6 kb DNA 단편이 삽입되어 있음을 확인하였다(도 4a및도 4b).
<실험예 1> SRG3 단백질 발현양상 분석
상기 실시예 3에서 선별된 형질전환 생쥐의 SRG3 단백질의 발현양상을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 정상 생쥐 및 SRG3 cDNA가 삽입된 형질전환 생쥐의 흉선과 림프절에서 분리한 세포 파쇄액을 이용하여 하기와 같은 방법으로 웨스턴 블러팅(western blotting)을 수행하였다.
정상 생쥐 및 형질전환 생쥐의 흉선세포 및 림프절의 세포(107개)를 파쇄하여 얻은 세포파쇄액을 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 분리한 후 단백질을 니트로셀룰로즈 막에 이동시켰다. 탈지유를 TBS/Tween-20(이하 "TBST"라 약칭함)에 희석하여 최종농도 5%로 만든 블러킹 용액(blocking solution)에서 상기 니트로셀룰로즈 막을 1 시간 동안 블러킹시킨 후 SRG3, BRG1 및 Lck 각각에 대한 일차 항체를 첨가하여 상온에서 3 시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 니트로셀룰로즈 막을 TBST로 15 분간 3 번 세척하고 HRP(horseradish peroxidase)가 접합된 이차 항체를 함유하는 TBST에서 상기 니트로셀룰로즈 막을 2 시간 동안 반응시킨 후 TBST로 15 분간 3 번 세척하였다. ECL 키트(Amersham Pharmacia, Sweden)를 이용하여 니트로셀룰로즈 막을 X-선 필름(X-ray film)에 노출시켜 SRG3, BRG1 및 Lck 밴드를 관찰한 후 바이오-라드 단백질 분석법(Bio-Rad Protein assay)으로 관찰된 단백질의 양을 결정하여 동량의 단백질이 로딩된 것을 확인하였으며, 젤-프로 분석기의 소프트웨어(Gel-Pro Analyzer software, Media Cybernetics, USA)를 사용하여 상기 단백질 밴드의 강도(band intensity)를 결정하였다.
그 결과, 형질전환을 시키지 않은 정상 생쥐의 BRG1, 글루코코르티코이드 수용체 및 Lck 밴드와 형질전환 생쥐의 BRG1 및 Lck 밴드는 거의 동일한 강도로 확인되었으나, 형질전환 생쥐의 SRG3 밴드는 정상 생쥐의 SRG3 밴드보다 2-3배 정도 강하게 탐지되어 형질전환 생쥐의 SRG3 발현량이 증가됨을 확인하였다(도 5). 상기의 결과로부터, 본 발명의 형질전환 생쥐의 T 세포에서 과발현되는 SRG3 유전자가 SRG3 단백질 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 형질전환 생쥐와 정상 생쥐의 말단 T 세포의 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스 비교
형질전환 생쥐와 정상 생쥐의 림프절 T 세포의 글루코코르티코이드에 대한 림프절 T 세포의 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스를 비교하기 위하여, 본 발명자들은 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 수행하여 아폽토시스를 일으킨 세포의 비율을 구하여 정상 생쥐와 형질 전환 생쥐에서의 글루코코르티코이드에 의한 림프절 T 세포의 아폽토시스 정도를 비교하였다.
먼저, 3 내지 4 주령의 형질전환 생쥐 및 정상 생쥐로부터 분리한 림프절 세포를 글루코코르티코이드가 첨가되지 않은 배지와 글루코코르티코이드가 10-8M10-7M10-6M 농도로 첨가된 배지에서 각각 배양하여 모은 흉선세포를 PE (Phycoerythrin)가 접합된 CD4에 대한 항체 및 FITC (Fluorescence isothiocyanate)가 접합된 CD8에 대한 항체와 반응시킨 후 PBS (Phosphate buffered saline) 1ml로 세척하였다. 상기 세척된 흉선세포를 2% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 PBS 1 ㎖에 현탁한 후 셀퀘스트 소프트웨어(CellQuest software)를 이용하는 FACStarplus플로우 사이토미터(flow cytometer, Becton Dickinson)로 죽은 세포와 산 세포를 FSC (Forward scatter)와 SSC (Side scatter)를 이용하여 분석하고 수학식 1에 따라 아폽토시스 발생률을 계산하였다. 상기와 같은 방법으로 형질 전환 생쥐와 정상 생쥐를 각각 3마리씩 분석한 후 그 결과를 도표로 전환하였다 (도 6). 상기 결과로부터, SRG3 단백질의 과발현은 성숙한 림프절의 T 세포가 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스를 증가시킨다는 것을 확인하였다.
그러나, 글루코코르티코이드 외에 T 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 항 FAS 항체나, 스타우로스포린을 처리하였을 때는 상기와 같이 분석을 한 경우에, 특이적 아폽토시스의 비율이 변화하지 않음을 확인하였다 (도 7).
<수학식 1>
이중양성 흉선세포의 특이적 아폽토시스 비율(specific apoptosis)(%) = 100 X (A-B)/(100-B)
A: 글루코코르티코이드가 첨가된 배지에서의 아폽토시스 발생률(%)
B: 글루코코르티코이드가 첨가되지 않은 배지에서의 아폽토시스 발생률(%)
(Deftos M.L.et al., Immunity, 9, 777-786, 1998)
그 결과, 글루코코르티코이드에 의하여 아폽토시스가 유도되었을 경우에 정상 생쥐의 성숙한 림프절 T 세포에 비해서 본 발명의 형질전환 생쥐의 림프절 T 세포는, 아폽토시스 발생률에서, 10-8M10-7M10-6M 글루코코르티코이드의 서로 다른 농도 조건에서 모두 20% 이상 증가했음을 나타내었고, 반면에 아폽토시스 유도 물질인 스타우로스포린이나 항 FAS 항체에 의해서는 정상생쥐와 형질 전환 생쥐의 림프절 T 세포에 특이적 아폽토시스 비율이 차이가 없음을 확인하였다 (도 6, 도 7). 상기의 결과로부터, 본 발명의 형질전환 생쥐의 림프절 T 세포에서 과발현된 SRG3 단백질이 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스에 대한 민감성을 특이적으로 증가시켰음을 확인하였다.
<실험예 3> 형질전환 생쥐와 정상 생쥐의 스트레스에 의한 T 세포의 수 변화 비교
형질전환 생쥐와 정상 생쥐의 림프절 T 세포의 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드에 대한 민감도에 차이가 있음을 확인하고, 실제 스트레스에 의해서 T세포 집단의 수가 변화하는가를 확인하기 위하여 형질전환 생쥐와 정상 생쥐에 구속 스트레스 (Restraint stress)를 가해서 T 세포수의 변화를 비교하였다.
구속 스트레스는 50ml Falcon Tube에 생쥐를 16시간 동안 가두었다가 8시간 동안 풀어주는 방법이다. 스트레스를 가한 후, 흉선과 비장의 T 세포를 분리하여 세포수를 세포수 측정기(Coulter counter, Coulter)를 이용하여 세고, 다시 항 T 세포 수용체 항체로 염색한 후, 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 T 세포와 비 T 세포의 비율을 계산하였다. 계산된 비율과 전체 세포 수를 곱하여 T 세포의 수를 계산하였다. 이 결과를 도표로 제작한 결과, 흉선과 비장 모두에서 스트레스를 오랜 기간 가할수록 본 발명의 형질전환 생쥐의 T 세포의 수가 현저히 빠른 속도로 감소하는 것을 확인하였다 (도 8).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형질전환 생쥐는 T 세포 특이적으로 SRG3 단백질이 과발현되어 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스 민감성이 증가된 T 세포를 가짐으로써 스트레스에 의한 면역기능의 억제 및 조절 기작을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
<110> SEONG, Rho Hyun JANG, Jae Jin KIM, Kil Soo Bio Genomics. INC. <120> Transgenic animal expressing SRG3 protein in T cells specifically and a method for preparing the transgenic animal <130> 0p-06-64 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gactagacca aacatctacc tc 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtcaactgag cgacttggat c 21
Claims (11)
- T 세포 특이적 프로모터인 인간 CD2 프로모터, 상기 프로모터에 삽입된 생쥐 SRG3 cDNA 및 인간 CD2 폴리 A 서열을 포함한 인간 CD2 LCR (locus control region)의 순서로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 융합 유전자 컨스트럭트(fusion gene construct)를 인간이외의 포유동물 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 수정란.
- 삭제
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- 제 1항에 있어서, 상기 융합 유전자 컨스트럭트는 발현벡터 pCD2-SRG3로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 수정란.
- 제 1항에 있어서, 상기 융합 유전자 컨스트럭트의 주입은 미세주입방법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 수정란.
- 제 1항에 있어서, 포유동물 수정란은 생쥐 수정란인 것을 특징으로 하는 형질전환 수정란(수탁번호: KCTC 0974BP).
- 제 1항의 형질전환 수정란을 인간을 제외한 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 동물.
- 제 7항에 있어서, 대리모는 가임신된 암컷 생쥐인 것을 특징으로 하는 형질전환 생쥐.
- 1) T 세포 특이적 프로모터와 포유동물 유래 유전자 사이에 SRG3 cDNA를 삽입하여 발현벡터를 제조하는 단계(단계 1);2) 상기 발현벡터를 제한효소로 절단하여 T 세포 특이적 프로모터, 상기 프로모터 뒤편에 삽입된 SRG3 cDNA 및 폴리 A 서열을 포함하는 LCR로 구성된 융합 유전자 컨스트럭트를 얻는 단계(단계 2);3) 상기 융합 유전자 컨스트럭트를 인간이외의 포유동물 수정란에 삽입하여 형질전환 수정란을 제조하는 단계(단계 3); 및4) 상기 형질전환 수정란을 인간을 제외한 가임신된 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 얻는 단계(단계 4)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 7항의 형질전환 동물의 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 단계 1의 T 세포 특이적 프로모터는, 인간 CD2 프로모터, Lck 근접 프로모터, CD4 minigene 프로모터, TCR 프로모터 및 CD3 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 단계 1의 포유동물 유래 유전자는 폴리A 서열이 결합된 인간 CD2 LCR, 폴리A 서열이 결합된 인간 성장호르몬 (hGH PolyA), 소성장호르몬(bGH PolyA), 인간 CD2 (hCD2 polyA), 및 SV40 (SV40 PolyA)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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