JP2004518405A - 組換えタンパク質、細胞、および生物を産生するための体細胞クローニング遺伝子移入 - Google Patents
組換えタンパク質、細胞、および生物を産生するための体細胞クローニング遺伝子移入 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004518405A JP2004518405A JP2002515074A JP2002515074A JP2004518405A JP 2004518405 A JP2004518405 A JP 2004518405A JP 2002515074 A JP2002515074 A JP 2002515074A JP 2002515074 A JP2002515074 A JP 2002515074A JP 2004518405 A JP2004518405 A JP 2004518405A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- animal
- individual
- organism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 24
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 title description 4
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 title description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 19
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 20
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 24
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/101—Bovine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、物質の組換え産生のための方法に関するものであり、ここで、細胞は、該物質をコードするヌクレオチド配列で形質転換され、形質転換された細胞は、クローン化され、そのようにして得られた細胞は、受容生物に挿入される。より特定すると、本発明は、組換えタンパク質、組換え細胞および組換え組織の産生における、該方法の使用に関する。本発明は、さらに、個体の細胞が単離し、更なる成長のために該細胞を免疫不全動物中に挿入し、そしてその動物中で成長した細胞、組織および器官を、再度単離し、固体に挿入する方法にも関する。
Description
【0001】
本発明は、物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換する工程と、該形質転換細胞をクローニング工程に供する工程と、このようにして得た細胞を宿主生物に組み込む工程とを含む、物質の組換え製造法に関する。本発明は、特に、組換えタンパク質、細胞、および組織の産生方法の使用に関する。さらなる局面によれば、本発明は、個体の細胞を単離する工程と、さらに成長させるためにこれらの細胞を免疫不全動物に導入する工程と、該動物中で培養した細胞、組織、および/または器官を再度単離して個体に導入する工程とを含む方法に関する。
【0002】
組換え遺伝子技術が発達するにつれ、有用な物質の製造に生物系がますます必要とされている。ヒトゲノムのヌクレオチド配列の定義を使用して、新規のタンパク質およびヒトの身体におけるその役割の発見は、近い将来医学または他の目的のための多数の物質が利用可能となることを促進および加速し、これらの製造が望まれると予想することができる。それにもかかわらず、この目的のためのインビトロでの既存の細胞培養系の使用には、特定の物質の最適な産生まで少なくとも1〜2年間かかるという欠点を含む。さらに、このような系の取扱いは複雑であり、障害も起こりやすく、そして費用がかかる傾向がある。したがって、例えば、細胞培養系の大量操作における主な困難の1つは、培養液の汚染リスクである。
【0003】
近年、目的の物質および医薬品の生産にますます動物が使用されている。これを行うために、いわゆる生殖系列トランスジェニック動物の作製にともなって、特定の物質をコードするDNAを標的個体の体細胞に導入する体細胞遺伝子移入を使用する。これをインビボ(すなわち、完全な生物)またはインビトロもしくは実験で生物から採取した細胞で行い、該細胞への構築物の挿入後、これらの細胞を生物に再導入する。次いで、目的の物質が動物内でその効果を発揮することができるように動物内で構築物の発現を誘導する。
【0004】
組み込んだ遺伝子が発現するか処理した個体のみで効果を発揮し、その効果が形質転換細胞の一生に限定されるという事実は、体細胞における遺伝子構築物移入における固有の欠点である。その後の世代には移入されない。
【0005】
体細胞遺伝子移入では、標的細胞の特徴および/または挙動に否定的な影響を与え得る他の頻繁に遭遇する問題には、特に、多大な努力および挿入構築物組み込みの偶然性によってのみ、安定にトランスフェクションした十分に多数の特異的標的細胞が頻繁に得られるという事実が含まれる。さらに、挿入構築物によってコードされるポリペプチドの不十分な発現に関する問題がしばしば起こり、それに伴うDNAレベルの問題点は細胞内および細胞外障害物にも関連し、それぞれ調査しなければならない。したがって、上記の問題は、広義での生物工学における体細胞遺伝子移入への適用の使用を制限し、これは特に家畜生産で顕著である。
【0006】
したがって、本発明の目的は、先行技術の欠点の排除であり、特定の目的の物質の新規の製造法を提供することにある。
【0007】
この目的は、第1の工程で物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換し、形質転換細胞をクローニング工程に供し、クローニング工程で得られた細胞を宿主生物に導入する、物質の組換え製造法によって達成される。
【0008】
この方法の第1の工程で使用した細胞は、クローニング法に供することができる個体から単離した任意の細胞であり得る。これらの例は、特に、胚または成体線維芽細胞、始原生殖細胞、顆粒膜細胞、胸腺細胞、脾細胞、肝細胞、マクロファージ、精巣もしくは卵巣細胞などである。したがって、細胞を単離または培養することにより、形質転換前にクローニング法に供することもできる。
【0009】
好ましい実施形態によれば、形質転換に使用される細胞は、既に利用可能な細胞クローン、細胞培養物、または生物から単離される。本発明の意味では、細胞クローンを、インビトロでクローン化した培養細胞、クローニングによって得られた胎、またはクローン化動物と定義する。
【0010】
次いで、細胞を、目的の物質をクローニングするヌクレオチド配列を使用して形質転換する。この文脈では、物質を、タンパク質、多糖類、脂質などならびに挿入ヌクレオチド配列を示す細胞、組織、および器官などの体内で合成される全ての物質と定義する。したがって、物質をコードするヌクレオチド配列は、配列を直接コードする配列だけでなく、細胞内または細胞外に目的の物質を形成する異なるポリペプチド/酵素をコードする配列である。本発明の文脈では、「組換え体」を、動物が外因的または内因的に変化するが、例えば分化特異的発現パターンまたは発現量などの組換え遺伝子技術によって発現パターンが変化する遺伝子と定義する。
【0011】
現在公知の全ての技術を、物理的、化学的、またはウイルス技術などの形質転換に使用することができる。ゲノム中の特定の部位での構築物の標的化組み込みに照らして、相同組換えの使用が好ましい。巨大な遺伝子クラスターを宿主細胞に挿入する場合、人工染色体の使用も可能である。細胞ハイブリッドもまた、マッピングで使用されるように、産生動物ゲノムに加えて標的ゲノム由来の特異的染色体フラグメントも含むように作製および選択することができる。これは標的ゲノム系の全てが例えば免疫グロブリン遺伝子系などに移入された場合に特に有利である。
【0012】
次いで、細胞をクローニング法に供する。クローニング法は公知であり、例えば、PCT/欧州特許第98/00230号(国際公開公報第99/36510号)およびPCT/欧州特許第00229号(国際公開公報第・・号)(参照として本明細書に組み入れられる)に記載されている。次いで、クローン化細胞を、インビボおよび/またはインビトロで特定の発達段階まで(例えば、胎まで)増殖させ、その後宿主細胞に組み込む(請求項1の工程c)。同様に、クローン化細胞を、一定の分化時点まで増殖させ、一定の既に分化した細胞を宿主生物に組み込む。
【0013】
次いで、クローン化細胞を宿主細胞に挿入し、宿主細胞は動物、動物の胎、動物の胚、または動物の細胞凝集体ならびにクローン化動物、クローン化動物胎児、クローン化動物胚、および細胞凝集体であり得る。好ましい実施形態では、形質転換してクローニング法に供した元のドナー細胞は、宿主生物と遺伝子型が同一である。
【0014】
このような方法の利点は、好ましくは新規の発現のための遺伝子を含む同一の遺伝子型の細胞を有する、既に利用可能な、すなわち、ストックの宿主生物を非常に短時間で得ることができ、これが組換え物質を産生することができることである。従来の生殖細胞遺伝子移入と比較して産生準備ができた動物を得るまでの5年までもの時間の節約が実現された。さらに、本発明の方法は、節約時間ならびにより迅速に産生される産生系およびそれによるコストの節約にもかかわらず、産生生物をより高い費用効果で作製することができるので、より効率的でもある。したがって、クローンであり、先天的に同一の遺伝子型を有するので、既に生きた動物が利用可能であることに加えて、形質転換用の元のドナー細胞としてインビトロで利用可能なクローン細胞を使用し、形質転換およびクローニング後に宿主生物に導入することが可能である。
【0015】
本明細書に記載の体細胞クローニング遺伝子移入法のさらなる利点はまた、組換えタンパク質が発現した場合の新たな要求または必要性に迅速に応答することができることである。通常、世代間隔の短い産生動物種(実施例7のウサギなど)を使用した場合でさえも、発現遺伝子の最初の研究に十分な材料が利用可能となるまでには構築物の作製後7ヶ月を要し得る。標的ポリペプチドの産生にはさらなる年月を要する。畜牛の場合、目的のポリペプチドをトランスジェニック動物によって得ることができるまでに、このプロセスに少なくとも3〜4年かかる。対照的に、本発明の方法は、既に利用可能な宿主生物で新規の構築物を使用して細胞を形質転換し、発現クローンを得るための時間を非常に短縮することができる(わずか2ヶ月)。
【0016】
したがって、本発明の方法により、インビトロ細胞培養の期間に匹敵する期間で分析用の第1のタンパク質量を得ることが可能であり、本発明によれば、標的物質の産生に使用することができる産生系は既に付加的に利用可能である。したがって、標的物質の製造のために、宿主生物または動物を、迅速に使用することができる。
【0017】
場合によっては、特にその後の体細胞遺伝子移入用のストックのために産生されるか産生すべきである宿主生物の調製に有利である。これは、発現または徴候(manifestation)を改善するために宿主生物中に存在する細胞または構造と比較して有利な適用トランスジェニックまたはその他の処理細胞が得られる場合に特に必要である。
【0018】
この目的のために、例えば宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を除去することができ、これを物理学的、化学的、免疫学的、分子遺伝学的、または手術による方法を使用して行うことができる。さらに、特定の遺伝子座でネガティブに交配した動物または胎児はホモ接合体ネガティブであるか(選別の概念)、保存して必要に応じて使用する。
【0019】
宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を使い果たす1つの可能性は、発達段階特異的または誘導可能プロモーターの制御下にある構築物を含む、すでにトランスジェニックの生物を使用することである。第1の例では、特定の発生段階の間のプロモーターの活性化の際、組織特異的タンパク質が自動的に作製されて、特定の細胞(例えば、ジフテリア毒素)がアポトーシスを起こすかまたは死滅する。第2の例では、テトラサイクリンまたはエクジソンなどの特異的なエフェクターの適用によって適切な組織特異的プロモーターがプレプログラミングされた自殺遺伝子構築物が活性化され、細胞、組織、または器官が特異的に枯渇する。
【0020】
このような生物の調製および成長を簡単にできるものは、一旦生物に導入されると確実に子孫に継代することができる構築物を使用したクローニングである。この使用により、生物中のこの任意の細胞、組織、または器官がその増殖または発達において必要に応じて影響を受け得ることが明白である。
【0021】
一定の細胞の枯渇の例として、細胞/組織(通常、乳腺が発生する)の除去を使用することができる。動物の出生時に、これらの細胞が比較的少数で存在する。これらの細胞は最初の妊娠時のみで発生し、出生直前に爆発的に増殖して機能的乳腺を形成する。したがって、少数しか存在しないこれらの動物の乳腺幹細胞が宿主生物の発達初期段階で除去され、除去細胞が特定の組換え物質合成のための発現がプログラミングされたこの型の組換え(形質転換)細胞に置換される場合、この様式で得られた動物において、適用された形質転換細胞から乳腺が発達するという結果が得られる。したがって、産生動物中で、導入された哺乳動物系において、組み合え物質もまた発現する。このような方法で節約された時間は約3年である。
【0022】
さらなる例は、例えば照射、または別の方法および本発明によって形質転換された形質転換幹細胞との置換、およびクローニング法による宿主生物からの血液幹細胞または免疫系の幹細胞の全部または部分的除去であり、これにより例えばヒト化抗体(AB)またはABフラグメント(例えば、二重特異性AB)または他の動物もしくはヒト血液因子を発現可能である。クローン化された幹細胞において動物の免疫グロブリン遺伝子がインビトロでヒトの遺伝子と置換された場合、および本発明の方法を使用してこれらの細胞が宿主生物に導入された場合、該宿主生物はヒト疾患治療に非常に価値があり得るヒト同一性ポリクローナル抗体を形成する。
【0023】
さらに、本発明の方法を用いて、動物中に存在するが回収するには動物中の濃度が低すぎて商業上の目的とされなかった因子についての有効且つ問題のない系を得ることができる。これの1つの例は、非常に強力なプロモーター下でのいくつかのヘパリン合成遺伝子の発現である。ヘパリンは生物中に天然に存在するので、同一遺伝子型であるならば好ましい細胞に対しても、産物に対しても免疫反応を起こさないであろう。
【0024】
細胞の再クローニングは、少なくとも3回繰り返すことができる。細胞は150回分裂することができることが発見されている;言い換えれば、クローニング法由来の細胞は通常の細胞よりも実質的に長く生き延びるので、数回のクローニング後でさえも動物中で生存し、少なくとも動物が生存している限り遺伝子を発現することができる。
【0025】
類似の様式および上記の適用範囲のさらなる開発において、入手利用可能な動物、胚、胎児から細胞を採取して、確立された細胞株をインビトロで培養することができる。次いでこれらの細胞株を、公知の方法を使用して遺伝的に改変する。次いで、細胞をインビトロ培養で直接分化させるか、再クローニング後に胎児の器官から単離して「移入遺伝子」または遺伝子型の同種発生細胞として成体の元のドナー生物に導入する。移入遺伝子を除いて、これらの細胞はもとの動物と異ならないので、細胞は動物中で細胞自体を確立することができ、例えば、遺伝子形質転換によって組換え物質を産生する。
【0026】
さらなる局面によれば、本発明はまた、第1の工程では個体由来の細胞を単離する工程と、該細胞を免疫不全動物生物に導入する工程と、該動物を交配する工程と、該生物中で増殖した細胞を単離する工程と、該単離細胞を個体に導入する工程とを含む、細胞、組織、または器官の製造法に関する。
【0027】
動物宿主生物中の細胞が増加するかさらに成長して組織および器官を形成するので、この方法は好ましくは動物中のヒト起源の細胞、組織、および器官の培養に特に適切である。
【0028】
好ましい態様によれば、元のドナー個体の細胞またはこれから培養した組織もしくは器官を、これらを採取した個体と同一の個体に戻し、それにより、個体に再導入(移植)した場合に拒絶されない組織または器官を利用可能にする。
【0029】
免疫不全動物を、元のドナー個体由来の細胞を拒絶しない任意の動物もしくは胎児または動物の胚/細胞凝集体と定義する。免疫欠損を付与された生物ならびに発達段階の免疫系が自己および非自己との間の相違を未だ「学習」していないこのような発生初期段階の生物がこの目的に適切である。したがって、元のドナー個体由来の細胞がこのような宿主生物に導入された場合、これらの細胞は拒絶されないが、本質的に自己として認識され、さらに適切に発達する。
【0030】
したがって、好ましくは、クローニングによって維持された動物は動物宿主生物として適切である。したがって、ストック中で複数の胎児もしくは胚または細胞凝集体を維持し、必要に応じてもとのドナー個体の細胞を使用してこれらを処理することが可能である。胎児/胚/細胞凝集体を、所望の効果が得られる段階まで(例えば、成熟器官もしくは組織または十分な量の元のドナー個体の細胞が得られる時点まで)成長させる。次いで、この組織/器官またはこれらの細胞を、例えば動物からの器官の取り出しによって採取し、元のドナー個体に移植する。本来、これは、特定の器官の除去に依存した動物の屠殺を含み得る。
【0031】
元のドナー個体の細胞を、従来の宿主生物に導入することができる。この場合、動物は動物自体の細胞/組織/器官を有する細胞/組織/器官由来のキメラを形成すると予想されるに違いない。動物自体の細胞が元のドナー個体に再導入されることを確認するために、特定の全組織/器官/細胞を単離し、動物細胞を分離し、例えば、動物細胞に対する抗体の使用およびFACS(蛍光細胞分析分離装置)を使用した分離によってこれを行うことができる。
【0032】
しかし、好ましい態様によれば、宿主生物由来の罹患細胞/組織/器官を除去し、これを上記のように行うことができる。
【0033】
したがって、例えば、器官系が除去された胎児宿主生物では、元のドナー個体(例えば、関連器官から直接採取した成体ヒト幹細胞など)の対応する器官特異的幹細胞を胎児に導入し、枯渇細胞と置換し、特定の器官を形成させる。これを行うと、移植に適切な異種器官を有するキメラ生物が作製される。罹患器官は動物中に免疫能を示さない胎児によって拒絶されない異種器官を示す。元のドナー個体(例えば、ヒト患者)への首尾の良い移植後、ヒト幹細胞を使用した場合、外因性ではなく同種異系移植であるか、適切ならば自家移植でさえも、器官が特定の個体/患者の成体幹細胞から作製された場合、約1年の時間が必要であるにもかかわらず一定の器官および疾患(例えば、腎臓または肝臓)の場合可能である。
【0034】
したがって、本発明の方法の使用により、一定の患者でさえも実質的または絶対的にMHC型が一致した器官を迅速に得ることができるように短期間内で細胞、組織、または器官を作製可能である。したがって、本発明の方法により、移植に利用可能な器官/組織の不足という現在の問題が解決される。
【0035】
以下の実施例は、本発明を制限することなく本発明を説明する。実施例では、非トランスジェニッククローン化子牛の血清由来の二重特異性抗体の採取を記載する。PCT/欧州特許第98/00230号およびPCT/欧州特許第98/0029号(参照として本明細書に組み入れられる)を参照して、トランスジェニック骨髄細胞を有する子牛の作製のために以下の工程を行った。
【0036】
1.初代ウシ胎児線維芽細胞の採取および遺伝子形質転換。
2.宿主動物へのトランスジェニック胚の核移入によるクローニング。
3.胎児の採取および胎児肝臓からのトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
4.同一の染色体遺伝子型の利用可能なクローン子牛へのトランスジェニック細胞の注入。
5.採血による血清の採取。
6.二重特異性抗体による腫瘍細胞の溶解。
【0037】
実施例1
1.初代ウシ胎児線維芽細胞(BOFF)の採取/遺伝子形質転換。
a)種々の抗生物質(選択マーカー)に対するウシ胎児線維芽細胞(BOFF)の感受性の調査
BOFFを半コンフルエントにプレートし、ネオマイシン(G418)、ハイグロマイシン、ピューロマイシンについての濃度および効果/時間に対する感受性を試験した。種々のBOFF調製物は、LD100への到達に必要な抗生物質の濃度が明確に(2100倍まで)異なった。調製物間および調製物内の時間/効果ウィンドウは一部非常にシフトしていた。1.5μg/mlで濃度でピューロマイシンを使用して最良の結果が得られた(安定なヒトまたはマウス線維芽細胞株の選択に対して3〜5倍の濃度)。
【0038】
確立された細胞株のトランスフェクションのために従来から使用されている種々のトランスフェクション法を、BOFFにおけるその効率(抗生物質耐性クローン/トランスフェクション比)について試験した。以下を試験した。
DOSPER(Roche、リポフェクション、ポリカチオン性脂質);
LIPOFECTINAMINE(登録商標)(GIBCOBRL Life Technologies、リポフェクチン、ポリカチオン性脂質);
CLONfectin(登録商標)(Clontech、カチオン性および両親媒性[sic]脂質);
TransFast(登録商標)(Promega、カチオン性および両親媒性脂質);
12%DMSOの存在下でのCa3(PO4)2DNA沈殿物。
【0039】
抗生物質耐性クローンが得られるような高い希釈度で希釈することなく選択することができる確立された線維芽細胞株と対照的に、BOFFは、一定の臨界密度未満でプレートすることができない。各クローンを単離するための1細胞クローンの選択または限界希釈物(extreme dilution)からの増殖の場合、BOFFは死滅するか、又は形態学および/または増殖挙動が変化することになる、1つ以上の危険性を経る。したがって、最適な増殖が可能となるようにプレーティング密度を選択した。しかし、これにより、集団を構成する細胞が抗生物質耐性を示し、これはクローン起源ではない。その後の単離およびサブクローニングにより、トランスジェニッククローン細胞を作製する。
【0040】
b)BOFFにおけるScFvおよびpJW6puroでのトランスフェクション
使用プラスミド:
MAR::ScFv:MAR配列(ニワトリリゾチーム遺伝子基質結合領域;Castillaら、Nat.Biotechnol.、16、1998、349)を、BlueScript(Stratagene)中のScFv、pUC18(Noranderら、Gene、26、1983、101)中のp77(Bremら、Theriogenology、43、1995、175)を使用してクローン化した。
【0041】
pJW6puro(Morgenstern & Land、Nucleic Acids Res.、18、1068)p77およびMAR::ScFvを線状化して、構築物の機能的組み込みを確認した。制限酵素切断点の利用可能性に基づいて、ベクター配列を遺伝子構築物の配列から分離できなかった。pJW6puroを、環状に突き刺す/スーパーコイルにした。使用DNA量またはScFv:選択マーカー混合比は8:1(2.5μg p77+2.5μg MAR::ScFv+0.6μg pJW6puro=5.6μgの全DNA)または3:1(0.7μg p77+0.9μg MAR::ScFv+0.6μg pJW6puro=2.2μgの全DNA)であった。
【0042】
これを行う場合、1年以上前の胚のトランスフェクションおよび移入後にBOFF#32330201p1細胞を使用して、クローン子牛(10匹の子牛が誕生)を作製した。トリプシン処理後、細胞懸濁液を10mmの培養プレートに移し、10%ウシ胎児血清(Biochrom、Berlin)、2mM L−グルタミン、104mM 2−メルカプトエタノール、2mM 非必須アミノ酸(Sigma、St.Louis、MO)、100IU/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地(Gibco、Grand Island、NY)を使用して培養した。細胞を、37℃で5%CO2を含む空気の下で細胞シートがサブコンフルエント(2〜3日間)になるまで培養し、この「0世代」の一部を凍結し(10%ジメチルスルホキシド、Sigma)、液体窒素中で保存した。
【0043】
トランスフェクション調製物:トランスフェクション前にBOFFを6ウェル培養皿(直径35mm)(MEM、15%FCS、1×グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン)中でプレートし、サブコンフルエント(約5×104〜105細胞)にした。細胞による線維芽細胞形態学の設定および発現後にトランスフェクションを行った。それぞれ直径35mmのプレートについてトランスフェクション実験を行った。トランスファースト(登録商標)リポフェクション:DNA:リポソーム比=1:2、インキュベーション時間は1.5時間。
【0044】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:
4時間のインキュベーション後、2分間の12%DMSOの添加によってトランスフェクション効率が増加した(Mullerら、EMBO J.、12、1993、4221)。
【0045】
トランスフェクタントプールの選択、確立、および分析:
トランスフェクションの24時間後に選択培地を添加した。6ウェル培養プレート中での選択から2日後、1つの直径35mmウェルの細胞を24ウェルプレートに1:150で分割した(濃度28×102細胞/ウェル)。プレート上でのプロ(登録商標)BOFFとのサブコンフルエント増殖まで選択を継続した(49日間)。プールを拡大し、低温保存し、PCRを使用してp77MAR::ScFvでの首尾の良いトランスフェクションについて試験した。
【0046】
ScFvトランスフェクタントのスクリーニング:
プライマー377L2/f 5′CAGGTGTCCTCTCTGACATCG3′および
377R25′CGCAGAGTCCACAGAGG3′
(アニーリング温度、66℃;1kb増幅物)
【0047】
p77トランスフェクタントのスクリーニング:
プライマー: 246 5′GAAGACCCCATTTTGTCCCAAG3′および
251 5′GTCCCGAGGTAGATCTTCCC3′(アニーリング温度、62℃;2.5kb増幅物)
プライマー: 248 5′GATGCTTCTCTATTCCTCTG3′および
251 5′GTCCCGAGGTAGATCTTCCC3′(アニーリング温度、60℃;1.2kb増幅物)
【0048】
PCRの結果:
トランスファースト(登録商標)リポフェクション:両試験DNA比を使用してp77/MAR::ScFvポジティブプールなし。
【0049】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:目的のDNA:選択マーカー=3:1:p77/MAR::ScFvポジティブプールなし。
【0050】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:目的のDNA:選択マーカー=8:1(プール3):p77にポジティブな24プールのうちの6プールおよびポジティブクローン/プールのMAR::ScFv特徴づけ:A3、B2、B3、C2、C3、C6(強いシグナル)。
【0051】
実施例2
PCT/欧州特許第98/00229号に記載の方法に従って動物をクローン化し、トランスジェニック胚を宿主動物に移入した。
【0052】
実施例3
胎児の採取および胎児肝臓由来のトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
妊娠中期のトランスジェニックウシ胎児を採取した。この期間(胎児発達の肝臓造血期(hepatolineal period))では、肝臓は血液形成の主要部位であり、全血球の幹細胞(血球始原細胞)の所在地である。リンパ球産生の間の骨髄腔への移動後に、これらの血球始原細胞からBリンパ球が発達する。胎児の肝臓を無菌状態で採取し、4μg硫酸ゲンタマイシンおよび抗凝固剤として200IU/mlヘパリンを含むRPMI培地に置いた。厳密な滅菌条件下で各細胞の分離を行った。
【0053】
実施例4
同一の染色体遺伝子型のクローン子牛へのトランスジェニック細胞の導入
静脈内カテーテル注入(14ゲージ、1.7mm×64mm、Terno Co., Ltd)によって胎児造血細胞の生理食塩水懸濁液または培地の移植を行う。
【0054】
実施例5
採血による血清の採取および精製
トランスジェニック血球の導入後、頸静脈穿刺によって一定間隔で採血する。血液の遠心分離(1000×g、30分)によって血球から血清を分離する。アジ化ナトリウム(最終濃度:0.02%)を血清に添加し、その後酢酸セルロースフィルター(0.22μm)で濾過する。残渣を、1M NaOHwo使用してpH7.2に調整する。biscFV分子の浄化のために、培養残渣を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したタンパク質L−アガロースカラム(#20520 Pierce、Rockford II、USA)に通過させる(タンパク質LはヒトIgGの特に一本鎖可変エレメント(ScFv)に結合するが、ウシIgG1およびIgG2に結合しない)。培養残渣の適用後、カラムベッドを0.1Mリン酸緩衝液で洗浄する。結合タンパク質を、pH3.0および2.0の0.1Mグリシン緩衝液を段階的に使用して溶出する。回収した溶出液をPBSに対して一晩透析し、0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存する。
【0055】
実施例6
二重特異性抗体を使用した腫瘍細胞の溶解
二重特異性抗体の生物活性を、5000個のSKMel63またはM21腫瘍細胞を使用した細胞傷害性試験によって試験する。これら2つの黒色腫細胞株は、9.2.27モノクローナル抗体(scFv部分のみ)によって認識されるHMWG(高分子量糖タンパク質)標的抗原に強い陽性を示す。末梢血リンパ球(健常なヒトドナーから新たに採取し、Ficoll勾配によって単離したPBL)を、10:1の比で標的細胞に添加する。次いで、9.2.27×CD3特異性を示す150μg/mlの化学的に接合したbsF(ab′)2(全Tリンパ球のパンクローナル(panclonal)刺激についての全細胞培養プレート中での黒色腫×Tリンパ球(この濃度のみでは移動特性を示さない))を添加し、血清から精製した組換えbisFv分子を直接添加する。マイクロタイタープレート中の細胞培養プレートあたりの全実験調製物の体積は150μlである。プレートを37dc/5%CO2のインキュベーター中で5日間インキュベートする。PBSでの複数回の洗浄後に非接着血液リンパ球が除去され、残存する接着腫瘍細胞のみが細胞培養皿に残存する(目視)。100μlの新鮮な培地および10μlの細胞増殖株WST(Boehringer Mannheim、<カテゴリー>省略、N 1644 807)を細胞培養皿に添加する。次いで、インキュベーター中で1〜4時間インキュベートし(47dc/5%CO2)、ELISAリーダー(480nm)で評価する。目視による評価および光学密度の低さは100%の腫瘍細胞の死滅を示す。これは、トランスジェニック血球中で産生された組換え二重特異性抗体は非常に有効であることを証明している。
本発明は、物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換する工程と、該形質転換細胞をクローニング工程に供する工程と、このようにして得た細胞を宿主生物に組み込む工程とを含む、物質の組換え製造法に関する。本発明は、特に、組換えタンパク質、細胞、および組織の産生方法の使用に関する。さらなる局面によれば、本発明は、個体の細胞を単離する工程と、さらに成長させるためにこれらの細胞を免疫不全動物に導入する工程と、該動物中で培養した細胞、組織、および/または器官を再度単離して個体に導入する工程とを含む方法に関する。
【0002】
組換え遺伝子技術が発達するにつれ、有用な物質の製造に生物系がますます必要とされている。ヒトゲノムのヌクレオチド配列の定義を使用して、新規のタンパク質およびヒトの身体におけるその役割の発見は、近い将来医学または他の目的のための多数の物質が利用可能となることを促進および加速し、これらの製造が望まれると予想することができる。それにもかかわらず、この目的のためのインビトロでの既存の細胞培養系の使用には、特定の物質の最適な産生まで少なくとも1〜2年間かかるという欠点を含む。さらに、このような系の取扱いは複雑であり、障害も起こりやすく、そして費用がかかる傾向がある。したがって、例えば、細胞培養系の大量操作における主な困難の1つは、培養液の汚染リスクである。
【0003】
近年、目的の物質および医薬品の生産にますます動物が使用されている。これを行うために、いわゆる生殖系列トランスジェニック動物の作製にともなって、特定の物質をコードするDNAを標的個体の体細胞に導入する体細胞遺伝子移入を使用する。これをインビボ(すなわち、完全な生物)またはインビトロもしくは実験で生物から採取した細胞で行い、該細胞への構築物の挿入後、これらの細胞を生物に再導入する。次いで、目的の物質が動物内でその効果を発揮することができるように動物内で構築物の発現を誘導する。
【0004】
組み込んだ遺伝子が発現するか処理した個体のみで効果を発揮し、その効果が形質転換細胞の一生に限定されるという事実は、体細胞における遺伝子構築物移入における固有の欠点である。その後の世代には移入されない。
【0005】
体細胞遺伝子移入では、標的細胞の特徴および/または挙動に否定的な影響を与え得る他の頻繁に遭遇する問題には、特に、多大な努力および挿入構築物組み込みの偶然性によってのみ、安定にトランスフェクションした十分に多数の特異的標的細胞が頻繁に得られるという事実が含まれる。さらに、挿入構築物によってコードされるポリペプチドの不十分な発現に関する問題がしばしば起こり、それに伴うDNAレベルの問題点は細胞内および細胞外障害物にも関連し、それぞれ調査しなければならない。したがって、上記の問題は、広義での生物工学における体細胞遺伝子移入への適用の使用を制限し、これは特に家畜生産で顕著である。
【0006】
したがって、本発明の目的は、先行技術の欠点の排除であり、特定の目的の物質の新規の製造法を提供することにある。
【0007】
この目的は、第1の工程で物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換し、形質転換細胞をクローニング工程に供し、クローニング工程で得られた細胞を宿主生物に導入する、物質の組換え製造法によって達成される。
【0008】
この方法の第1の工程で使用した細胞は、クローニング法に供することができる個体から単離した任意の細胞であり得る。これらの例は、特に、胚または成体線維芽細胞、始原生殖細胞、顆粒膜細胞、胸腺細胞、脾細胞、肝細胞、マクロファージ、精巣もしくは卵巣細胞などである。したがって、細胞を単離または培養することにより、形質転換前にクローニング法に供することもできる。
【0009】
好ましい実施形態によれば、形質転換に使用される細胞は、既に利用可能な細胞クローン、細胞培養物、または生物から単離される。本発明の意味では、細胞クローンを、インビトロでクローン化した培養細胞、クローニングによって得られた胎、またはクローン化動物と定義する。
【0010】
次いで、細胞を、目的の物質をクローニングするヌクレオチド配列を使用して形質転換する。この文脈では、物質を、タンパク質、多糖類、脂質などならびに挿入ヌクレオチド配列を示す細胞、組織、および器官などの体内で合成される全ての物質と定義する。したがって、物質をコードするヌクレオチド配列は、配列を直接コードする配列だけでなく、細胞内または細胞外に目的の物質を形成する異なるポリペプチド/酵素をコードする配列である。本発明の文脈では、「組換え体」を、動物が外因的または内因的に変化するが、例えば分化特異的発現パターンまたは発現量などの組換え遺伝子技術によって発現パターンが変化する遺伝子と定義する。
【0011】
現在公知の全ての技術を、物理的、化学的、またはウイルス技術などの形質転換に使用することができる。ゲノム中の特定の部位での構築物の標的化組み込みに照らして、相同組換えの使用が好ましい。巨大な遺伝子クラスターを宿主細胞に挿入する場合、人工染色体の使用も可能である。細胞ハイブリッドもまた、マッピングで使用されるように、産生動物ゲノムに加えて標的ゲノム由来の特異的染色体フラグメントも含むように作製および選択することができる。これは標的ゲノム系の全てが例えば免疫グロブリン遺伝子系などに移入された場合に特に有利である。
【0012】
次いで、細胞をクローニング法に供する。クローニング法は公知であり、例えば、PCT/欧州特許第98/00230号(国際公開公報第99/36510号)およびPCT/欧州特許第00229号(国際公開公報第・・号)(参照として本明細書に組み入れられる)に記載されている。次いで、クローン化細胞を、インビボおよび/またはインビトロで特定の発達段階まで(例えば、胎まで)増殖させ、その後宿主細胞に組み込む(請求項1の工程c)。同様に、クローン化細胞を、一定の分化時点まで増殖させ、一定の既に分化した細胞を宿主生物に組み込む。
【0013】
次いで、クローン化細胞を宿主細胞に挿入し、宿主細胞は動物、動物の胎、動物の胚、または動物の細胞凝集体ならびにクローン化動物、クローン化動物胎児、クローン化動物胚、および細胞凝集体であり得る。好ましい実施形態では、形質転換してクローニング法に供した元のドナー細胞は、宿主生物と遺伝子型が同一である。
【0014】
このような方法の利点は、好ましくは新規の発現のための遺伝子を含む同一の遺伝子型の細胞を有する、既に利用可能な、すなわち、ストックの宿主生物を非常に短時間で得ることができ、これが組換え物質を産生することができることである。従来の生殖細胞遺伝子移入と比較して産生準備ができた動物を得るまでの5年までもの時間の節約が実現された。さらに、本発明の方法は、節約時間ならびにより迅速に産生される産生系およびそれによるコストの節約にもかかわらず、産生生物をより高い費用効果で作製することができるので、より効率的でもある。したがって、クローンであり、先天的に同一の遺伝子型を有するので、既に生きた動物が利用可能であることに加えて、形質転換用の元のドナー細胞としてインビトロで利用可能なクローン細胞を使用し、形質転換およびクローニング後に宿主生物に導入することが可能である。
【0015】
本明細書に記載の体細胞クローニング遺伝子移入法のさらなる利点はまた、組換えタンパク質が発現した場合の新たな要求または必要性に迅速に応答することができることである。通常、世代間隔の短い産生動物種(実施例7のウサギなど)を使用した場合でさえも、発現遺伝子の最初の研究に十分な材料が利用可能となるまでには構築物の作製後7ヶ月を要し得る。標的ポリペプチドの産生にはさらなる年月を要する。畜牛の場合、目的のポリペプチドをトランスジェニック動物によって得ることができるまでに、このプロセスに少なくとも3〜4年かかる。対照的に、本発明の方法は、既に利用可能な宿主生物で新規の構築物を使用して細胞を形質転換し、発現クローンを得るための時間を非常に短縮することができる(わずか2ヶ月)。
【0016】
したがって、本発明の方法により、インビトロ細胞培養の期間に匹敵する期間で分析用の第1のタンパク質量を得ることが可能であり、本発明によれば、標的物質の産生に使用することができる産生系は既に付加的に利用可能である。したがって、標的物質の製造のために、宿主生物または動物を、迅速に使用することができる。
【0017】
場合によっては、特にその後の体細胞遺伝子移入用のストックのために産生されるか産生すべきである宿主生物の調製に有利である。これは、発現または徴候(manifestation)を改善するために宿主生物中に存在する細胞または構造と比較して有利な適用トランスジェニックまたはその他の処理細胞が得られる場合に特に必要である。
【0018】
この目的のために、例えば宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を除去することができ、これを物理学的、化学的、免疫学的、分子遺伝学的、または手術による方法を使用して行うことができる。さらに、特定の遺伝子座でネガティブに交配した動物または胎児はホモ接合体ネガティブであるか(選別の概念)、保存して必要に応じて使用する。
【0019】
宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を使い果たす1つの可能性は、発達段階特異的または誘導可能プロモーターの制御下にある構築物を含む、すでにトランスジェニックの生物を使用することである。第1の例では、特定の発生段階の間のプロモーターの活性化の際、組織特異的タンパク質が自動的に作製されて、特定の細胞(例えば、ジフテリア毒素)がアポトーシスを起こすかまたは死滅する。第2の例では、テトラサイクリンまたはエクジソンなどの特異的なエフェクターの適用によって適切な組織特異的プロモーターがプレプログラミングされた自殺遺伝子構築物が活性化され、細胞、組織、または器官が特異的に枯渇する。
【0020】
このような生物の調製および成長を簡単にできるものは、一旦生物に導入されると確実に子孫に継代することができる構築物を使用したクローニングである。この使用により、生物中のこの任意の細胞、組織、または器官がその増殖または発達において必要に応じて影響を受け得ることが明白である。
【0021】
一定の細胞の枯渇の例として、細胞/組織(通常、乳腺が発生する)の除去を使用することができる。動物の出生時に、これらの細胞が比較的少数で存在する。これらの細胞は最初の妊娠時のみで発生し、出生直前に爆発的に増殖して機能的乳腺を形成する。したがって、少数しか存在しないこれらの動物の乳腺幹細胞が宿主生物の発達初期段階で除去され、除去細胞が特定の組換え物質合成のための発現がプログラミングされたこの型の組換え(形質転換)細胞に置換される場合、この様式で得られた動物において、適用された形質転換細胞から乳腺が発達するという結果が得られる。したがって、産生動物中で、導入された哺乳動物系において、組み合え物質もまた発現する。このような方法で節約された時間は約3年である。
【0022】
さらなる例は、例えば照射、または別の方法および本発明によって形質転換された形質転換幹細胞との置換、およびクローニング法による宿主生物からの血液幹細胞または免疫系の幹細胞の全部または部分的除去であり、これにより例えばヒト化抗体(AB)またはABフラグメント(例えば、二重特異性AB)または他の動物もしくはヒト血液因子を発現可能である。クローン化された幹細胞において動物の免疫グロブリン遺伝子がインビトロでヒトの遺伝子と置換された場合、および本発明の方法を使用してこれらの細胞が宿主生物に導入された場合、該宿主生物はヒト疾患治療に非常に価値があり得るヒト同一性ポリクローナル抗体を形成する。
【0023】
さらに、本発明の方法を用いて、動物中に存在するが回収するには動物中の濃度が低すぎて商業上の目的とされなかった因子についての有効且つ問題のない系を得ることができる。これの1つの例は、非常に強力なプロモーター下でのいくつかのヘパリン合成遺伝子の発現である。ヘパリンは生物中に天然に存在するので、同一遺伝子型であるならば好ましい細胞に対しても、産物に対しても免疫反応を起こさないであろう。
【0024】
細胞の再クローニングは、少なくとも3回繰り返すことができる。細胞は150回分裂することができることが発見されている;言い換えれば、クローニング法由来の細胞は通常の細胞よりも実質的に長く生き延びるので、数回のクローニング後でさえも動物中で生存し、少なくとも動物が生存している限り遺伝子を発現することができる。
【0025】
類似の様式および上記の適用範囲のさらなる開発において、入手利用可能な動物、胚、胎児から細胞を採取して、確立された細胞株をインビトロで培養することができる。次いでこれらの細胞株を、公知の方法を使用して遺伝的に改変する。次いで、細胞をインビトロ培養で直接分化させるか、再クローニング後に胎児の器官から単離して「移入遺伝子」または遺伝子型の同種発生細胞として成体の元のドナー生物に導入する。移入遺伝子を除いて、これらの細胞はもとの動物と異ならないので、細胞は動物中で細胞自体を確立することができ、例えば、遺伝子形質転換によって組換え物質を産生する。
【0026】
さらなる局面によれば、本発明はまた、第1の工程では個体由来の細胞を単離する工程と、該細胞を免疫不全動物生物に導入する工程と、該動物を交配する工程と、該生物中で増殖した細胞を単離する工程と、該単離細胞を個体に導入する工程とを含む、細胞、組織、または器官の製造法に関する。
【0027】
動物宿主生物中の細胞が増加するかさらに成長して組織および器官を形成するので、この方法は好ましくは動物中のヒト起源の細胞、組織、および器官の培養に特に適切である。
【0028】
好ましい態様によれば、元のドナー個体の細胞またはこれから培養した組織もしくは器官を、これらを採取した個体と同一の個体に戻し、それにより、個体に再導入(移植)した場合に拒絶されない組織または器官を利用可能にする。
【0029】
免疫不全動物を、元のドナー個体由来の細胞を拒絶しない任意の動物もしくは胎児または動物の胚/細胞凝集体と定義する。免疫欠損を付与された生物ならびに発達段階の免疫系が自己および非自己との間の相違を未だ「学習」していないこのような発生初期段階の生物がこの目的に適切である。したがって、元のドナー個体由来の細胞がこのような宿主生物に導入された場合、これらの細胞は拒絶されないが、本質的に自己として認識され、さらに適切に発達する。
【0030】
したがって、好ましくは、クローニングによって維持された動物は動物宿主生物として適切である。したがって、ストック中で複数の胎児もしくは胚または細胞凝集体を維持し、必要に応じてもとのドナー個体の細胞を使用してこれらを処理することが可能である。胎児/胚/細胞凝集体を、所望の効果が得られる段階まで(例えば、成熟器官もしくは組織または十分な量の元のドナー個体の細胞が得られる時点まで)成長させる。次いで、この組織/器官またはこれらの細胞を、例えば動物からの器官の取り出しによって採取し、元のドナー個体に移植する。本来、これは、特定の器官の除去に依存した動物の屠殺を含み得る。
【0031】
元のドナー個体の細胞を、従来の宿主生物に導入することができる。この場合、動物は動物自体の細胞/組織/器官を有する細胞/組織/器官由来のキメラを形成すると予想されるに違いない。動物自体の細胞が元のドナー個体に再導入されることを確認するために、特定の全組織/器官/細胞を単離し、動物細胞を分離し、例えば、動物細胞に対する抗体の使用およびFACS(蛍光細胞分析分離装置)を使用した分離によってこれを行うことができる。
【0032】
しかし、好ましい態様によれば、宿主生物由来の罹患細胞/組織/器官を除去し、これを上記のように行うことができる。
【0033】
したがって、例えば、器官系が除去された胎児宿主生物では、元のドナー個体(例えば、関連器官から直接採取した成体ヒト幹細胞など)の対応する器官特異的幹細胞を胎児に導入し、枯渇細胞と置換し、特定の器官を形成させる。これを行うと、移植に適切な異種器官を有するキメラ生物が作製される。罹患器官は動物中に免疫能を示さない胎児によって拒絶されない異種器官を示す。元のドナー個体(例えば、ヒト患者)への首尾の良い移植後、ヒト幹細胞を使用した場合、外因性ではなく同種異系移植であるか、適切ならば自家移植でさえも、器官が特定の個体/患者の成体幹細胞から作製された場合、約1年の時間が必要であるにもかかわらず一定の器官および疾患(例えば、腎臓または肝臓)の場合可能である。
【0034】
したがって、本発明の方法の使用により、一定の患者でさえも実質的または絶対的にMHC型が一致した器官を迅速に得ることができるように短期間内で細胞、組織、または器官を作製可能である。したがって、本発明の方法により、移植に利用可能な器官/組織の不足という現在の問題が解決される。
【0035】
以下の実施例は、本発明を制限することなく本発明を説明する。実施例では、非トランスジェニッククローン化子牛の血清由来の二重特異性抗体の採取を記載する。PCT/欧州特許第98/00230号およびPCT/欧州特許第98/0029号(参照として本明細書に組み入れられる)を参照して、トランスジェニック骨髄細胞を有する子牛の作製のために以下の工程を行った。
【0036】
1.初代ウシ胎児線維芽細胞の採取および遺伝子形質転換。
2.宿主動物へのトランスジェニック胚の核移入によるクローニング。
3.胎児の採取および胎児肝臓からのトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
4.同一の染色体遺伝子型の利用可能なクローン子牛へのトランスジェニック細胞の注入。
5.採血による血清の採取。
6.二重特異性抗体による腫瘍細胞の溶解。
【0037】
実施例1
1.初代ウシ胎児線維芽細胞(BOFF)の採取/遺伝子形質転換。
a)種々の抗生物質(選択マーカー)に対するウシ胎児線維芽細胞(BOFF)の感受性の調査
BOFFを半コンフルエントにプレートし、ネオマイシン(G418)、ハイグロマイシン、ピューロマイシンについての濃度および効果/時間に対する感受性を試験した。種々のBOFF調製物は、LD100への到達に必要な抗生物質の濃度が明確に(2100倍まで)異なった。調製物間および調製物内の時間/効果ウィンドウは一部非常にシフトしていた。1.5μg/mlで濃度でピューロマイシンを使用して最良の結果が得られた(安定なヒトまたはマウス線維芽細胞株の選択に対して3〜5倍の濃度)。
【0038】
確立された細胞株のトランスフェクションのために従来から使用されている種々のトランスフェクション法を、BOFFにおけるその効率(抗生物質耐性クローン/トランスフェクション比)について試験した。以下を試験した。
DOSPER(Roche、リポフェクション、ポリカチオン性脂質);
LIPOFECTINAMINE(登録商標)(GIBCOBRL Life Technologies、リポフェクチン、ポリカチオン性脂質);
CLONfectin(登録商標)(Clontech、カチオン性および両親媒性[sic]脂質);
TransFast(登録商標)(Promega、カチオン性および両親媒性脂質);
12%DMSOの存在下でのCa3(PO4)2DNA沈殿物。
【0039】
抗生物質耐性クローンが得られるような高い希釈度で希釈することなく選択することができる確立された線維芽細胞株と対照的に、BOFFは、一定の臨界密度未満でプレートすることができない。各クローンを単離するための1細胞クローンの選択または限界希釈物(extreme dilution)からの増殖の場合、BOFFは死滅するか、又は形態学および/または増殖挙動が変化することになる、1つ以上の危険性を経る。したがって、最適な増殖が可能となるようにプレーティング密度を選択した。しかし、これにより、集団を構成する細胞が抗生物質耐性を示し、これはクローン起源ではない。その後の単離およびサブクローニングにより、トランスジェニッククローン細胞を作製する。
【0040】
b)BOFFにおけるScFvおよびpJW6puroでのトランスフェクション
使用プラスミド:
MAR::ScFv:MAR配列(ニワトリリゾチーム遺伝子基質結合領域;Castillaら、Nat.Biotechnol.、16、1998、349)を、BlueScript(Stratagene)中のScFv、pUC18(Noranderら、Gene、26、1983、101)中のp77(Bremら、Theriogenology、43、1995、175)を使用してクローン化した。
【0041】
pJW6puro(Morgenstern & Land、Nucleic Acids Res.、18、1068)p77およびMAR::ScFvを線状化して、構築物の機能的組み込みを確認した。制限酵素切断点の利用可能性に基づいて、ベクター配列を遺伝子構築物の配列から分離できなかった。pJW6puroを、環状に突き刺す/スーパーコイルにした。使用DNA量またはScFv:選択マーカー混合比は8:1(2.5μg p77+2.5μg MAR::ScFv+0.6μg pJW6puro=5.6μgの全DNA)または3:1(0.7μg p77+0.9μg MAR::ScFv+0.6μg pJW6puro=2.2μgの全DNA)であった。
【0042】
これを行う場合、1年以上前の胚のトランスフェクションおよび移入後にBOFF#32330201p1細胞を使用して、クローン子牛(10匹の子牛が誕生)を作製した。トリプシン処理後、細胞懸濁液を10mmの培養プレートに移し、10%ウシ胎児血清(Biochrom、Berlin)、2mM L−グルタミン、104mM 2−メルカプトエタノール、2mM 非必須アミノ酸(Sigma、St.Louis、MO)、100IU/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地(Gibco、Grand Island、NY)を使用して培養した。細胞を、37℃で5%CO2を含む空気の下で細胞シートがサブコンフルエント(2〜3日間)になるまで培養し、この「0世代」の一部を凍結し(10%ジメチルスルホキシド、Sigma)、液体窒素中で保存した。
【0043】
トランスフェクション調製物:トランスフェクション前にBOFFを6ウェル培養皿(直径35mm)(MEM、15%FCS、1×グルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシン)中でプレートし、サブコンフルエント(約5×104〜105細胞)にした。細胞による線維芽細胞形態学の設定および発現後にトランスフェクションを行った。それぞれ直径35mmのプレートについてトランスフェクション実験を行った。トランスファースト(登録商標)リポフェクション:DNA:リポソーム比=1:2、インキュベーション時間は1.5時間。
【0044】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:
4時間のインキュベーション後、2分間の12%DMSOの添加によってトランスフェクション効率が増加した(Mullerら、EMBO J.、12、1993、4221)。
【0045】
トランスフェクタントプールの選択、確立、および分析:
トランスフェクションの24時間後に選択培地を添加した。6ウェル培養プレート中での選択から2日後、1つの直径35mmウェルの細胞を24ウェルプレートに1:150で分割した(濃度28×102細胞/ウェル)。プレート上でのプロ(登録商標)BOFFとのサブコンフルエント増殖まで選択を継続した(49日間)。プールを拡大し、低温保存し、PCRを使用してp77MAR::ScFvでの首尾の良いトランスフェクションについて試験した。
【0046】
ScFvトランスフェクタントのスクリーニング:
プライマー377L2/f 5′CAGGTGTCCTCTCTGACATCG3′および
377R25′CGCAGAGTCCACAGAGG3′
(アニーリング温度、66℃;1kb増幅物)
【0047】
p77トランスフェクタントのスクリーニング:
プライマー: 246 5′GAAGACCCCATTTTGTCCCAAG3′および
251 5′GTCCCGAGGTAGATCTTCCC3′(アニーリング温度、62℃;2.5kb増幅物)
プライマー: 248 5′GATGCTTCTCTATTCCTCTG3′および
251 5′GTCCCGAGGTAGATCTTCCC3′(アニーリング温度、60℃;1.2kb増幅物)
【0048】
PCRの結果:
トランスファースト(登録商標)リポフェクション:両試験DNA比を使用してp77/MAR::ScFvポジティブプールなし。
【0049】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:目的のDNA:選択マーカー=3:1:p77/MAR::ScFvポジティブプールなし。
【0050】
Ca3(PO4)2DNA沈殿トランスフェクション:目的のDNA:選択マーカー=8:1(プール3):p77にポジティブな24プールのうちの6プールおよびポジティブクローン/プールのMAR::ScFv特徴づけ:A3、B2、B3、C2、C3、C6(強いシグナル)。
【0051】
実施例2
PCT/欧州特許第98/00229号に記載の方法に従って動物をクローン化し、トランスジェニック胚を宿主動物に移入した。
【0052】
実施例3
胎児の採取および胎児肝臓由来のトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
妊娠中期のトランスジェニックウシ胎児を採取した。この期間(胎児発達の肝臓造血期(hepatolineal period))では、肝臓は血液形成の主要部位であり、全血球の幹細胞(血球始原細胞)の所在地である。リンパ球産生の間の骨髄腔への移動後に、これらの血球始原細胞からBリンパ球が発達する。胎児の肝臓を無菌状態で採取し、4μg硫酸ゲンタマイシンおよび抗凝固剤として200IU/mlヘパリンを含むRPMI培地に置いた。厳密な滅菌条件下で各細胞の分離を行った。
【0053】
実施例4
同一の染色体遺伝子型のクローン子牛へのトランスジェニック細胞の導入
静脈内カテーテル注入(14ゲージ、1.7mm×64mm、Terno Co., Ltd)によって胎児造血細胞の生理食塩水懸濁液または培地の移植を行う。
【0054】
実施例5
採血による血清の採取および精製
トランスジェニック血球の導入後、頸静脈穿刺によって一定間隔で採血する。血液の遠心分離(1000×g、30分)によって血球から血清を分離する。アジ化ナトリウム(最終濃度:0.02%)を血清に添加し、その後酢酸セルロースフィルター(0.22μm)で濾過する。残渣を、1M NaOHwo使用してpH7.2に調整する。biscFV分子の浄化のために、培養残渣を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したタンパク質L−アガロースカラム(#20520 Pierce、Rockford II、USA)に通過させる(タンパク質LはヒトIgGの特に一本鎖可変エレメント(ScFv)に結合するが、ウシIgG1およびIgG2に結合しない)。培養残渣の適用後、カラムベッドを0.1Mリン酸緩衝液で洗浄する。結合タンパク質を、pH3.0および2.0の0.1Mグリシン緩衝液を段階的に使用して溶出する。回収した溶出液をPBSに対して一晩透析し、0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存する。
【0055】
実施例6
二重特異性抗体を使用した腫瘍細胞の溶解
二重特異性抗体の生物活性を、5000個のSKMel63またはM21腫瘍細胞を使用した細胞傷害性試験によって試験する。これら2つの黒色腫細胞株は、9.2.27モノクローナル抗体(scFv部分のみ)によって認識されるHMWG(高分子量糖タンパク質)標的抗原に強い陽性を示す。末梢血リンパ球(健常なヒトドナーから新たに採取し、Ficoll勾配によって単離したPBL)を、10:1の比で標的細胞に添加する。次いで、9.2.27×CD3特異性を示す150μg/mlの化学的に接合したbsF(ab′)2(全Tリンパ球のパンクローナル(panclonal)刺激についての全細胞培養プレート中での黒色腫×Tリンパ球(この濃度のみでは移動特性を示さない))を添加し、血清から精製した組換えbisFv分子を直接添加する。マイクロタイタープレート中の細胞培養プレートあたりの全実験調製物の体積は150μlである。プレートを37dc/5%CO2のインキュベーター中で5日間インキュベートする。PBSでの複数回の洗浄後に非接着血液リンパ球が除去され、残存する接着腫瘍細胞のみが細胞培養皿に残存する(目視)。100μlの新鮮な培地および10μlの細胞増殖株WST(Boehringer Mannheim、<カテゴリー>省略、N 1644 807)を細胞培養皿に添加する。次いで、インキュベーター中で1〜4時間インキュベートし(47dc/5%CO2)、ELISAリーダー(480nm)で評価する。目視による評価および光学密度の低さは100%の腫瘍細胞の死滅を示す。これは、トランスジェニック血球中で産生された組換え二重特異性抗体は非常に有効であることを証明している。
Claims (14)
- a)物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換する工程と、
b)該形質転換細胞をクローニング工程に供する工程と、
c)工程b)で得られた細胞を宿主生物に導入する工程とを含む、物質の組換え製造方法。 - 工程a)で形質転換すべき細胞を形質転換前にクローニング工程に供する、請求項1記載の方法。
- 工程a)で形質転換すべき細胞を既存の細胞クローンまたは既存の生物から単離する、請求項1または2記載の方法。
- 該宿主生物が動物、胎、胚、または細胞凝集体である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 宿主クローン中の一定の細胞型を除去し、同一の細胞型の組換え細胞と置換する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 該宿主生物が、形質転換すべき細胞と同一の遺伝子型を有する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に従って作製された、トランスジェニック動物の、組換え物質を製造するための使用。
- a)細胞を個体から単離する工程と、
b)該細胞を免疫不全生物に導入する工程と、
c)該生物を培養する工程と、
d)該生物中で増殖した個体の細胞を単離する工程と、
e)該単離細胞を個体に導入する工程とを含む、動物の細胞、組織、器官の製造方法。 - 該細胞を組織および/または器官に成長させ、該成長組織/器官を個体に導入する、請求項8記載の方法。
- 該細胞が該細胞を再導入する該個体に由来する、請求項8または9記載の方法。
- 該動物がクローニングによって得られる、請求項6〜8のいずれか一項記載の方法。
- 該動物中で特定の型の内在性細胞を除去する、請求項8または9記載の方法。
- 移植片を製造するための、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法の使用。
- ヒト移植片、特に自己ヒト移植片が産生される、請求項13記載の使用。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/EP2000/007239 WO2002009507A1 (de) | 2000-07-27 | 2000-07-27 | Somatischer klonierungs-gentransfer zur produktion von rekombinanten proteinen, zellen und organen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004518405A true JP2004518405A (ja) | 2004-06-24 |
Family
ID=8164039
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002515074A Pending JP2004518405A (ja) | 2000-07-27 | 2000-07-27 | 組換えタンパク質、細胞、および生物を産生するための体細胞クローニング遺伝子移入 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8030537B1 (ja) |
EP (1) | EP1303183A1 (ja) |
JP (1) | JP2004518405A (ja) |
AU (1) | AU2000265672A1 (ja) |
CA (1) | CA2416877C (ja) |
WO (1) | WO2002009507A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG141239A1 (en) | 2001-01-26 | 2008-04-28 | Selexis Sa | Matrix attachment regions and methods for use thereof |
SE0300207D0 (sv) | 2003-01-29 | 2003-01-29 | Karolinska Innovations Ab | New use and composition |
JP5396653B2 (ja) | 2003-10-24 | 2014-01-22 | セレキス エスアー | Mar配列の多トランスフェクション手順による高効率の遺伝子導入および哺乳動物細胞における発現 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996039811A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novartis Ag | Immunocompromised animals comprising human synovial tissue |
WO2000026357A2 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-11 | Genzyme Transgenic Corp. | Transgenic and cloned mammals |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1991-07-18 | Brem Gottfried Prof Dr Dr | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
US5811635A (en) * | 1992-08-03 | 1998-09-22 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | Chimeric mouse for human and mouse immune systems |
US6018096A (en) * | 1993-05-03 | 2000-01-25 | Surrogen, Inc. | Animal model for engraftment, proliferation and differentiation of human hematopoietic stem cells |
WO1994027622A1 (en) * | 1993-05-24 | 1994-12-08 | The Johns Hopkins University | Surrogate tolerogenesis for the development of tolerance to xenografts |
US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
GB9703550D0 (en) * | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
DE19726597C1 (de) * | 1997-06-23 | 1998-11-19 | Wengler Georg S | Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörper |
WO1999009141A1 (en) | 1997-08-14 | 1999-02-25 | Biotransplant, Inc. | Porcine totipotent cells and method for long-term culture |
ATE407555T1 (de) * | 1998-01-16 | 2008-09-15 | Agrobiogen Gmbh | Efficienter kerntransfer mit primordialen keimzellen |
EP0972017B1 (de) | 1998-01-16 | 2004-10-06 | Agrobiogen GmbH | Effizienter kerntransfer mit fetalen fibroblasten |
-
2000
- 2000-07-27 US US10/333,670 patent/US8030537B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-27 CA CA2416877A patent/CA2416877C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-27 JP JP2002515074A patent/JP2004518405A/ja active Pending
- 2000-07-27 EP EP00953104A patent/EP1303183A1/de not_active Withdrawn
- 2000-07-27 WO PCT/EP2000/007239 patent/WO2002009507A1/de active Application Filing
- 2000-07-27 AU AU2000265672A patent/AU2000265672A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996039811A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novartis Ag | Immunocompromised animals comprising human synovial tissue |
WO2000026357A2 (en) * | 1998-11-02 | 2000-05-11 | Genzyme Transgenic Corp. | Transgenic and cloned mammals |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002009507A1 (de) | 2002-02-07 |
CA2416877C (en) | 2013-03-12 |
CA2416877A1 (en) | 2003-01-22 |
AU2000265672A1 (en) | 2002-02-13 |
EP1303183A1 (de) | 2003-04-23 |
US8030537B1 (en) | 2011-10-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100308764B1 (ko) | 키메라동물및그의제작법 | |
DE69534227T2 (de) | Stoffe und verfahren zur beherrschung der hyperakuten abstossung von menschlichen transplantaten | |
JP3333902B2 (ja) | 遺伝子導入動物、それから得られる細胞および細胞系、およびその使用 | |
US7145057B2 (en) | Chimeric bird from embryonic stem cells | |
US20020028488A1 (en) | Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies | |
US20020152488A1 (en) | Genetically engineered animals for use as organ donors | |
CN109476716A (zh) | 治疗线粒体障碍的方法 | |
IE83909B1 (en) | Transgenic animals, cells and cell lines therefrom, and their use | |
KR101563017B1 (ko) | 불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭 | |
JPH10504707A (ja) | 異種移植片の超急性拒否反応を減少させる方法 | |
JP4068516B2 (ja) | トランスジェニック哺乳動物およびクローン哺乳動物 | |
EP1487260A2 (en) | The functional disruption of avian immunoglobulin genes | |
US7626074B2 (en) | Method of screening candidate drugs for the treatment of leukemia | |
KR20170121262A (ko) | Etv2 및 그의 용도 | |
JP4267689B2 (ja) | 鳥類由来の細胞の培養方法および該培養方法によって得られた細胞系 | |
WO1994016065A1 (en) | Producing cells for transplantation to reduce host rejection and resulting cells | |
JP2004516834A (ja) | 胸腺上皮前駆細胞およびその使用 | |
JP2004518405A (ja) | 組換えタンパク質、細胞、および生物を産生するための体細胞クローニング遺伝子移入 | |
US10717991B2 (en) | Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof | |
JP4321936B2 (ja) | 不死化血管周皮細胞株 | |
CN100526460C (zh) | 朊病毒蛋白活性降低的转基因有蹄类动物及其用途 | |
WO2006048954A1 (ja) | 異種移植用豚細胞、その選抜方法及び異種移植用豚 | |
JPH08501451A (ja) | 異種移植臓器移植片の事前適応化、その他を目的とする膜間転移によるタンパク質の供給法 | |
WO2003106651A2 (en) | Spermatogonial cell line | |
JPH0779773A (ja) | 癌細胞株 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070723 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100727 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101221 |