JP4321936B2

JP4321936B2 - 不死化血管周皮細胞株

Info

Publication number: JP4321936B2
Application number: JP2000037827A
Authority: JP
Inventors: 久飯笹; 研之服部; 恵美中島; 哲也寺崎; 益夫帯刀
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-02-16
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2020-02-16
Also published as: EP1256625A4; US20030175953A1; US7316926B2; WO2001060984A1; EP1256625A1; CA2400361C; CA2400361A1; DE60143740D1; EP1256625B1; JP2001224367A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は不死化血管周皮細胞株に関し、詳しくはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの脳毛細血管細胞を継代培養して樹立することができる、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）受容体β及びアンギオポエチン−１を発現する不死化血管周皮細胞株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験を行うことが行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという危惧に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされている。
【０００３】
一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失するため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。そこで、初代細胞にras遺伝子やc-myc遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウィルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウィルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウィルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、しかも継代することによってもその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微少器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であった。
【０００４】
これに対し、近年確立された動物個体への遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出して、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞を調製して、これを継代することにより不死化細胞を樹立する方法が報告されている。例えば、本発明者らによる特開平５−２９２９５８号公報には、温度感受性突然変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この動物の正常な産出によって得られる遺伝子導入動物の各種臓器の組織細胞、例えば、肝細胞や骨髄細胞を採取し、これを継代培養して不死化細胞株を樹立する方法が記載されている。特にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの臓器から得られる不死化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えることによって操作することができるため非常に有効であるとされている(Noble M et al.(1995) Transgenic Research 4, 215-225；Obinata M.(1997) Genes to Cells 2, 235-244）。
【０００５】
【発明者が解決しようとする課題】
毛細血管周皮細胞は血管壁変性疾患の研究において重要視されてきており、動物愛護の観点から動物試験に代えて毛細血管周皮細胞の初代細胞を用いる方法が試みられるようになってきている。この場合に、試験に供するに足る細胞を小型の実験動物から得ることが難しく、組織によって毛細血管周皮細胞の数が異なるため、ウシ等の大型家畜の組織を使用しなければならないが、ウシ等の大型家畜では培養細胞から得た情報を生体に還元することが困難であることから、これに代わる有効な毛細血管周皮細胞株の提供が切望されていた。本発明の課題は、当該細胞株の由来する組織における本来の機能・特性を保持する不死化血管周皮細胞株及びその樹立方法並びに当該不死化血管周皮細胞株を用いた有用物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、脳毛細血管周皮細胞のような微少器官に由来する細胞を株化する場合には、マウスに比べ体重が約１０倍あるラットが不死化細胞株樹立に供する細胞を調製する上で有利であるとの知見に基づき、不死化遺伝子としてのＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作製し、その大脳組織をホモジナイズして脳毛細血管を分離し、得られた脳毛細血管をプロテアーゼ処理し、得られる細胞を継代培養することによって不死化毛細血管周皮細胞株を樹立することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの大脳組織をホモジナイズして得られる脳毛細血管をプロテアーゼ処理し、毛細血管を不要な組織から分離させた後、再び遠心分離して得られたペレットを２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに懸濁し、この懸濁液を培養シャーレに播種して２回の継代培養の後、コロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離し、再びコロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーを選択し、継代培養して、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１を発現する不死化細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を樹立することを特徴とする不死化血管周皮細胞株の製造方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（２）温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１を発現する不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）に関する。
【０００９】
また本発明は、（３）被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を培養し、該細胞におけるマーカータンパク質の活性及び／又は発現の程度を測定・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（４）マーカータンパク質が、ＰＤＧＦ受容体β、Ｔｈｙ−１、ＩＣＡＭ−１、又はアンギオポエチン−１であることを特徴とする上記（３）記載の不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（５）被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（６）被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を高密度で培養し、該細胞におけるマトリックス塊に沈着したカルシウムの程度を検出・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の不死化血管周皮細胞株としては、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１（Angiopoietin-1）の発現能を保持した樹立細胞であればどのようなものでもよく、例えば、脳毛細血管周皮細胞に由来するものや、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を発現するものや、高濃度培養によるマトリックス塊カルシウム沈着能を有するものを挙げることができる。また、このような不死化血管周皮細胞株の具体例として、ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を挙げることができる。そして、本発明の不死化血管周皮細胞株は、ラット等の齧歯類などの動物から得ることができるが、各種臓器からの細胞株樹立に供する細胞を調製する上で、特に、脳毛細血管周皮細胞のような微少器官に由来する細胞を株化する場合には、器官を分離して初代細胞を容易に得ることができることから、ラットを用いることが好ましい。以下に、不死化血管周皮細胞株の製造方法を、ラットを用いた方法を例にとって説明する。
【００１２】
例えば、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの大脳組織をホモジナイズして脳毛細血管を分離し、得られた脳毛細血管をコラゲナーゼ等のプロテアーゼにより処理し、得られる脳毛細血管周皮細胞を継代培養して、周皮細胞の表面マーカーであるＰＤＧＦ受容体β及び血管壁細胞に特異的なアンギオポエチン−１を発現する不死化細胞を樹立することができる。
【００１３】
上記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットは、以下のようにして作製することができる。例えば、ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させたｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素ＢａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミドｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（OhnoT. et al., Cytotechnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。このラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ断片を常法に従いラット等の齧歯類などの動物の全能性細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての細胞内に有する遺伝子導入ラット、すなわちトランスジェニックラットを作出することができる。かかるトランスジェニックラットは、その全ての体細胞においてｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そして、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げることができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法としては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。
【００１４】
上記ラット等の齧歯類などの動物の全能性細胞（培養細胞）の核を、除核末受精卵に移植して初期化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入することができる。また、前核期受精卵の雄生前核にＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子をマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた遺伝子導入ラット、すなわちトランスジェニックラットを効率よく作出することができる。
【００１５】
本発明の不死化血管周皮細胞は、上記作出したトランスジェニックラットの大脳を摘出して緩衝液でよく洗浄し、この大脳を細切りにし、ホモゲナイザーで組織をすりつぶして得られたスラリーに緩衝液を加え、遠心分離することによってペレットを得ることができる。この得られたペレットを酵素（プロテアーゼ）溶液に懸濁して振盪しながら酵素処理し、毛細血管を不要な組織から分離させた後、再び遠心分離して得られたペレットを２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに懸濁し、この懸濁液を培養シャーレに播種して２回の継代培養の後、コロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離し、再びコロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離することができる。
【００１６】
上記単離した不死化血管周皮細胞は、３３〜３７℃において永久的増殖能を保持し、３９℃においては増殖を停止するための細胞固有の分化形質の発現を制御することができるという特色を有している。また、単離された不死化血管周皮細胞は温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＰＤＧＦ受容体β、及びアンギオポエチン−１の発現をＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウエスタンブロッテイング法で検出することにより同定することができる。この不死化血管周皮細胞株は、５０回の継代培養後においても３３℃で良好な増殖性を示し、脳毛細血管周皮細胞としての機能を保持している。
【００１７】
本発明の不死化血管周皮細胞株は、血管壁変性疾患の研究や、脳における自己免疫疾患の研究や、脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患の研究や、固形腫瘍、動脈硬化等の血管新生の関与する疾患の研究や、これら疾患等の診断や治療方法の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。また、本発明の不死化血管周皮細胞株は、多くの細胞マーカーの発現を保持し、高密度シャーレ上で培養するとカルシウム成分を豊富に含むマトリックス塊構造が認められることから、以下に示すように、血管周皮細胞を標的とした医薬品等の有用物質のスクリーニングに用いることができる。
【００１８】
本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下、上記不死化血管周皮細胞株を培養し、該細胞におけるＰＤＧＦ受容体β、Ｔｈｙ−１、ＩＣＡＭ−１、又はアンギオポエチン−１等のマーカータンパク質の活性及び／又は発現の程度を測定・評価する、不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管周皮細胞株を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価する、不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管周皮細胞株を高密度で培養し、該細胞におけるマトリックス塊に沈着したカルシウムの程度を検出・評価する、不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を挙げることができる。
【００１９】
上記不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化血管周皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に発現したマーカータンパク質の量を検出・測定し、被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。例えば、血管周皮細胞の表面マーカーであるＰＤＧＦ受容体βやＴｈｙ−１は、それぞれ特異抗体を用いて常法により免疫化学的に検出することにより測定することができる。また、血管壁細胞に特異的なアンギオポエチン−１やＩＣＡＭ−１は、相当するｍＲＮＡの発現量を常法により検出することにより測定することができる。上記不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化血管周皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後に細胞数や細胞の形態を測定・解析し、被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。また、上記不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化血管周皮細胞株を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ高密度培養し、一定時間培養後にマトリックス塊におけるカルシウム沈着を顕微鏡等により検出し、被検物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価することにより行われる。
【００２０】
そして、これらスクリーニング方法により得られる不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質や、不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質や、不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質は、血管壁変性疾患、血管新生疾患、脳における自己免疫疾患、脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患などを有する患者を治療するのに用いられる治療薬、予防及び／又は症状改善剤として使用できる可能性があり、有用である。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１（トランスジェニックラットの作出）
ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入したトランスジェニックラットは、下記の手順で作出した。
【００２２】
（導入遺伝子の調製）
マイクロインジェクションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換してＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 1991；図１参照）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製した。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮＡを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製ＤＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッファー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。
【００２３】
（トランスジェニックラットの作出）
ラット前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラットにより１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnant mare serum gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を行った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与３２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Chang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲＢ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、ＤＮＡ注入操作までＣＯ₂−インキュベーター内（５％のＣＯ₂−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存した。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に前記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入ＤＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾より調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プライマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４部位に相当）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−ＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１５７１〜１５９０部位に相当）］。その結果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃１９−８）を得た。これらのＧ₀世代のトランスジェニックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウンダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
【００２４】
実施例２（脳毛細血管周皮細胞の分離）
大脳からの脳毛細血管周皮細胞の分離はＩｃｈｉｋａｗａらの方法（Ichikawa N et al., (1996) J. Pharmacol. Toxicol. Method., 36, 45-52）、Ｃａｐｅｔａｎｄｅｓらの方法（Capetandes A and Gerristen ME (1990) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 31, 1738-1744）を改良して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラット（１匹）から脳を摘出した。摘出した脳は、大脳以外の間脳、脳管などを取り除いた後、クリーンベンチ内で氷冷した調製用緩衝液（１２２ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ₂、１．２ｍＭのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．４ｍＭのＫ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ；ｐＨ７．４）でよく洗浄した。洗浄した大脳は、組織を１〜２ｍｍ²に細切した。細切した組織を１０ｍＬ用Potter-Elvehjemホモゲナイザー（東京理化器械社製）に移し、大脳の４倍量の氷冷した調製用緩衝液を加え、１０回のアップダウンのストロークを行い組織をホモゲナイズし、３２％のデキストランを含むＰＢＳを等量加え、３回のアップダウンのストロークを行いスラリーを得た。このスリラーを遠心（４℃下、４５００ｇで１５分間）して得られるペレットを２．４ｍＬの酵素溶液［０．０６６％のcollagenase/dispase（Boehringer Mannheim 社製)、０．０３３％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ］に懸濁し、振盪を加えた水溶中で酵素処理（３７℃、３時間）を行い、不要な細胞外マトリックスを分離し、遠心（４℃下、６００ｇで５分間）してペレットを得た。得られたペレットを１０ｍＬの培養液（１００Ｕ／ｍＬのbenzylpenicillin potassium、１００μｇ／ｍＬのstreptomycin sulfate、２．５０μｇ／ｍＬのamphotericin B、２０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）に分散して４枚の３５ｍｍφ培養シャーレ（Falcon社製）に種播した。３３℃の炭酸ガス培養器（５％のＣＯ₂−９５％のＡｉｒ、飽和湿度）内で培養（初代培養）した。培地を１週間に２回交換し、継代はトリプシン液（０．０５％のTrypsin、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ；Gibco BRL社製）を用いておよそ１週間隔で行った。２回の継代の後、１０⁴個の細胞を１００ｍｍφ培養シャーレ（Falcon社製）に種播した。培地を１週間に２回交換し、７〜１０日後にコロニーを形成した増殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離し、得られた１０³個の細胞を再び１００ｍｍφ培養シャーレに種播して３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロニー形成を行った。ペニシリンカップを用いて増殖速度の比較的速いコロニーを周囲の細胞から単離して２種の細胞株（ＴＲ−ＰＣＴ１，ＴＲ−ＰＣＴ２）を得た。
このＴＲ−ＰＣＴ１株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて、工業技術院生命工学工業技術究所（茨城県つくば市）に、受託番号「ＦＥＲＭＢＰ−７０２４」として寄託されている。
【００２５】
実施例３（ラージＴ抗原タンパク質の確認）
実験例２で得られた２種の細胞株のラージＴ抗原蛋白質を、ウェスタンブロット法（実験医学別冊マニュアルＵＰシリーズ「分子生物学的アプローチによる癌研究プロトコール」１０８〜１１５頁、羊土社、１９９５年発行）により検出した。２種の細胞株をそれぞれＰＢＳで洗浄後、１ｍＬの可溶化溶液（１％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のglycerin）で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した後、遠心（１００００ｒｐｍで１０分間）して不溶画分を除去した後、フラッドフォード法（ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡプロテインアッセイ試薬Ａを使用）で総蛋白質量を定量した。それぞれ１０μｇの蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、ニトロセルロース膜に転写した。３％のスキムミルク溶液でブロッキングしたニトロセルロース膜に１次抗体として抗ＳＶ４０ラージＴ抗原マウス抗体（ＤＰ０２−Ｃ；CALBIOCHEM社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham社製）を反応させ、ラージＴ抗原特異的な反応をアマシャム社製ＥＣＬウエスタンブロティング検出システム（ＲＰＮ２１０６Ｍ１）を用いて検出した。結果を表１に示す。この結果、得られた２種の細胞株全てにおいてラージＴ抗原蛋白質を確認した。
【００２６】
【表１】

【００２７】
実施例４（ＰＤＧＦ受容体βとＴｈｙ−１の確認）
得られた細胞株を単層培養し、細胞膜に発現されたＰＤＧＦ受容体βとＴｈｙ−１を免疫染色し、顕微鏡を用いて確認した。実施例２で得られた細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を24 well dish（Falcon社製）のカバーグラス上で培養した。培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５ｍＬの固定液（３．６％のパラホルムアルデヒド）を加え、４℃で２０分間放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。０．５ｍＬの３％ＢＳＡ−ＰＢＳを加え、室温で２時間放置してブロッキングした後、１次抗体（抗ＰＤＧＦ受容体βヤギ抗体；Santacruze社製、ＦＩＴＣ標識抗Ｔｈｙ−１マウス抗体；Pharmingen社製）を室温で１時間反応させた。０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗浄後、２次抗体（ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ；シグマ社製（ＰＤＧＦ受容体β検出のみ使用））を室温で１時間反応させ、０．１％のＢＳＡ−ＰＢＳで５回洗浄した。最後に標識した細胞をグリセリン封入液（９０％のglycerol、１ｍｇ／ｍＬのp-phenylendiamine、０．０１ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄；ｐＨ８．５）で封入した。観察は顕微鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１では細胞膜上にＰＤＧＦ受容体β、及びＴｈｙ−１の発現を認めた。またＰＤＧＦ受容体βの発現は、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲにおいても確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得られた。
【００２８】
実施例５（アンギオポエチン−１とオステオポエチン、ＩＣＡＭ−１の確認）
得られた細胞株を単層培養し、細胞に発現されたアンギオポエチン−１とオステオポエチン（Osteopontin）、ＩＣＡＭ−１をＲＴ−ＰＣＲにて検出した。実施例２で得られた細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を１００ｍｍφ培養シャーレ（Falcon社製）に培養した。培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、セルスクレーパー（Iwaki社製）にて細胞をかき集め、ＲＮＡ抽出試薬（Ｔｒｉｚｏｌ；Gibco社製）にて全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（Rev Tra Ace：TOYOBO社製）を用いて、抽出した全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法（ｅｘＴａｑ；宝酒造社製）にて発現を確認した。ＰＣＲ増幅産物の確認は、５％アクリルアミドゲルの電気泳動にて行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１においてアンギオポエチン−１とオステオポエチン及びＩＣＡＭ−１の発現を確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得られた。
【００２９】
実施例６（高密度培養によるマトリックス塊カルシウム沈着の確認）
得られた細胞株を単層培養し、マトリックス塊に沈着したカルシウムをｖｏｎｋｏｓｓａ染色にて確認した。実施例２で得られた１０⁶個の細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１を、ＤＭＥＭにて１００ｍｍφ培養シャーレ（Falcon社製）及び１００ｍｍφＩ型コラーゲンコート培養シャーレ（Iwaki社製）に培養した。１００ｍｍφＩ型コラーゲンコート培養シャーレの培養液には１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を添加した。３日後培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、８ｍＬの固定液（０．１％のグルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を加え、室温で１５分放置後、蒸留水で２回洗浄した。８ｍＬの５％の硝酸銀水溶液（Wako社製）を加え遮光し、室温で３０分放置した後、５％の硝酸銀水溶液を除去し、蒸留水で２回洗浄した。シャーレは室温で３０分露光させ、観察は顕微鏡で行った。この結果、細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１ではマトリック塊にカルシウムの沈着を認め、コラーゲンコート培養シャーレではカルシウム沈着の増加を確認した。なお、ＴＲ−ＰＣＴ２についても同様の結果が得られた。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によると、血管壁変性疾患の研究、脳の栄養代謝研究、血管新生研究、脳における自己免疫疾患の研究、血管周皮細胞を標的とした医薬品のスクリーニング、脳の栄養代謝及び恒常性機能障害に関連する疾患の診断、あるいはその治療方法の開発を細胞レベルで研究するのに有用である不死化血管周皮細胞株を提供することができる。
【００３１】
【配列表】

Claims

ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットの大脳組織をホモジナイズして得られる脳毛細血管をプロテアーゼ処理し、毛細血管を不要な組織から分離させた後、再び遠心分離して得られたペレットを２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに懸濁し、この懸濁液を培養シャーレに播種して２回の継代培養の後、コロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーをペニシリンカップを用いて周囲の細胞から単離し、再びコロニー形成を行い、増殖速度の比較的速いコロニーを選択し、継代培養して、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１を発現する不死化細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を樹立することを特徴とする不死化血管周皮細胞株の製造方法。
温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＰＤＧＦ受容体β及びアンギオポエチン−１を発現する不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）。
被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を培養し、該細胞におけるマーカータンパク質の活性及び／又は発現の程度を測定・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
マーカータンパク質が、ＰＤＧＦ受容体β、Ｔｈｙ−１、ＩＣＡＭ−１、又はアンギオポエチン−１であることを特徴とする請求項３記載の不死化血管周皮細胞における分化形質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を培養し、該細胞の増殖の程度を測定・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞における増殖の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
被検物質の存在下、不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲＭＢＰ−７０２４）を高密度で培養し、該細胞におけるマトリックス塊に沈着したカルシウムの程度を検出・評価することを特徴とする不死化血管周皮細胞におけるマトリックス塊カルシウム沈着の促進又は抑制物質のスクリーニング方法。