JP2001231549A - 不死化血管内皮細胞株 - Google Patents
不死化血管内皮細胞株Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血管内皮細胞としての機能・特性を保持する
不死化血管内皮細胞株や、その培養によりかかる不死化
血管内皮細胞株に分化することができ、かつあらゆる臓
器の血管に分化しうる血管内皮前駆細胞や、これら細胞
株や前駆細胞を用いた細胞分化促進又は抑制物質等の有
用物質のスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】 ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クラットの骨髄から単核球画分を採取して血管内皮前駆
細胞を調製し、次いで、この血管内皮前駆細胞を培養し
て血管内皮細胞に分化させ、この分化した血管内皮細胞
を継代培養して、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２を発現する不死
化血管内皮細胞株を樹立する。また、この不死化血管内
皮細胞株は、マトリジェル中において管腔構造形成能を
有する。
不死化血管内皮細胞株や、その培養によりかかる不死化
血管内皮細胞株に分化することができ、かつあらゆる臓
器の血管に分化しうる血管内皮前駆細胞や、これら細胞
株や前駆細胞を用いた細胞分化促進又は抑制物質等の有
用物質のスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】 ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クラットの骨髄から単核球画分を採取して血管内皮前駆
細胞を調製し、次いで、この血管内皮前駆細胞を培養し
て血管内皮細胞に分化させ、この分化した血管内皮細胞
を継代培養して、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２を発現する不死
化血管内皮細胞株を樹立する。また、この不死化血管内
皮細胞株は、マトリジェル中において管腔構造形成能を
有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は不死化血管内皮細胞
株又は血管内皮前駆細胞に関し、詳しくはＳＶ４０の温
度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラットの骨髄に由来する血
管内皮前駆細胞や、該血管内皮前駆細胞を継代培養して
樹立することができる、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因
子）受容体１及びＴＩＥ（Tyrosine kinase with Ig an
d EGF homology domains）１，２を発現する不死化血管
内皮細胞株に関する。
株又は血管内皮前駆細胞に関し、詳しくはＳＶ４０の温
度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を
導入したトランスジェニックラットの骨髄に由来する血
管内皮前駆細胞や、該血管内皮前駆細胞を継代培養して
樹立することができる、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因
子）受容体１及びＴＩＥ（Tyrosine kinase with Ig an
d EGF homology domains）１，２を発現する不死化血管
内皮細胞株に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、医薬品の安全性や有効性に関する
試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛
護の点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用い
てインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する
技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、
生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死
化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に
動物試験を行うことが行われている。しかし、初代細胞
は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第
に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老
化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織
から採取する度に異なるという危惧に加え、継代ととも
に変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非
常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供
するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとさ
れている。
試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛
護の点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用い
てインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する
技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、
生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死
化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に
動物試験を行うことが行われている。しかし、初代細胞
は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第
に増殖が停止し、やがては死滅する（この現象を細胞老
化という）。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織
から採取する度に異なるという危惧に加え、継代ととも
に変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非
常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供
するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとさ
れている。
【０００３】一方、初代培養の継代を重ねるなかで、細
胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞
では、安定して均一の特性を有することになるが、この
ような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本
来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する
ため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その
細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映する
ことは難しいとされていた。そこで、初代細胞にras遺
伝子やc-myc遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウィルス
のＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウィルスのラージＴ抗原遺伝
子、ヒトパピローマウィルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導
入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖
能を継続的に保持し、しかも継代することによってもそ
の細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試
みがなされている。ところが、このような不死化細胞に
おいても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を
調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入
する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来
の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困
難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微少器
官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは
極めて困難であった。
胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞
では、安定して均一の特性を有することになるが、この
ような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本
来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失する
ため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その
細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映する
ことは難しいとされていた。そこで、初代細胞にras遺
伝子やc-myc遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウィルス
のＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウィルスのラージＴ抗原遺伝
子、ヒトパピローマウィルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導
入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖
能を継続的に保持し、しかも継代することによってもそ
の細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試
みがなされている。ところが、このような不死化細胞に
おいても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を
調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入
する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来
の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困
難であった。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微少器
官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは
極めて困難であった。
【０００４】これに対し、近年確立された動物個体への
遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラー
ジＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を
安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し
て、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗
原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞
を調製して、これを継代することにより不死化細胞を樹
立する方法が報告されている。例えば、本発明者らによ
る特開平５−２９２９５８号公報には、温度感受性突然
変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を哺乳動物の全能性細
胞に導入し、この動物の正常な産出によって得られる遺
伝子導入動物の各種臓器の組織細胞、例えば、肝細胞や
骨髄細胞を採取し、これを継代培養して不死化細胞株を
樹立する方法が記載されている。特にＳＶ４０の温度感
受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックマウスの臓器から得られる不死
化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えるこ
とによって操作することができるため非常に有効である
とされている(Noble M et al.(1995) Transgenic Resea
rch 4, 215-225；Obinata M.(1997) Genes to Cells 2,
235-244）。
遺伝子導入技術を用いて、個々の細胞に癌遺伝子やラー
ジＴ抗原遺伝子を導入するかわりに、これらの遺伝子を
安定的に染色体に組み込んだ遺伝子導入動物を作出し
て、個体の発生時点において既に癌遺伝子やラージＴ抗
原遺伝子を細胞の中に保有する動物の臓器から初代細胞
を調製して、これを継代することにより不死化細胞を樹
立する方法が報告されている。例えば、本発明者らによ
る特開平５−２９２９５８号公報には、温度感受性突然
変異ＳＶ４０ラージＴ抗原遺伝子を哺乳動物の全能性細
胞に導入し、この動物の正常な産出によって得られる遺
伝子導入動物の各種臓器の組織細胞、例えば、肝細胞や
骨髄細胞を採取し、これを継代培養して不死化細胞株を
樹立する方法が記載されている。特にＳＶ４０の温度感
受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入
したトランスジェニックマウスの臓器から得られる不死
化細胞は、その増殖や分化形質の発現を温度を変えるこ
とによって操作することができるため非常に有効である
とされている(Noble M et al.(1995) Transgenic Resea
rch 4, 215-225；Obinata M.(1997) Genes to Cells 2,
235-244）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】血管内皮細胞は、血管
新生のメカニズムの研究において重要視されてきてお
り、動物愛護の観点から動物試験に代えてヒト臍帯静脈
内皮細胞の初代培養細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いる方法が
試みられるようになってきている。このＨＵＶＥＣは初
代培養細胞であることから、継代を重ねると性状が変化
し、通常５代までの継代しか行えないため、遺伝子導入
実験などを行うことができない。また、これまでによく
用いられている血管内皮細胞株は、細胞単離後にトラン
スフォームした細胞であり、癌化しているため、生体内
の性状を保持している細胞ではなく、限られた用途にし
か用いることができなかった。
新生のメカニズムの研究において重要視されてきてお
り、動物愛護の観点から動物試験に代えてヒト臍帯静脈
内皮細胞の初代培養細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いる方法が
試みられるようになってきている。このＨＵＶＥＣは初
代培養細胞であることから、継代を重ねると性状が変化
し、通常５代までの継代しか行えないため、遺伝子導入
実験などを行うことができない。また、これまでによく
用いられている血管内皮細胞株は、細胞単離後にトラン
スフォームした細胞であり、癌化しているため、生体内
の性状を保持している細胞ではなく、限られた用途にし
か用いることができなかった。
【０００６】最近、骨髄に血管内皮細胞の前駆細胞が存
在し、成体においても血管新生に寄与することが明らか
にされた（Science 275, 964-967, 1997）。上記従来用
いられている血管内皮細胞の初代培養細胞や血管内皮細
胞株は各種臓器に由来しており、臓器ごとに血管内皮細
胞の性状、例えばＶＥＧＦ依存性やトランスポーターの
発現などが異なることから、血管内皮細胞の初代培養細
胞や血管内皮細胞株も新生血管のモデルとしては普遍的
とは言えない。しかし、このような既存血管由来の内皮
細胞と異なり、骨髄より分化した血管内皮前駆細胞はあ
らゆる臓器の血管にも分化しうる細胞である。したがっ
て、骨髄より血管内皮細胞の前駆細胞である血管内皮前
駆細胞を単離し、インビトロで分化させることにより、
より普遍的な血管内皮細胞のモデルを得ることが可能と
なる。
在し、成体においても血管新生に寄与することが明らか
にされた（Science 275, 964-967, 1997）。上記従来用
いられている血管内皮細胞の初代培養細胞や血管内皮細
胞株は各種臓器に由来しており、臓器ごとに血管内皮細
胞の性状、例えばＶＥＧＦ依存性やトランスポーターの
発現などが異なることから、血管内皮細胞の初代培養細
胞や血管内皮細胞株も新生血管のモデルとしては普遍的
とは言えない。しかし、このような既存血管由来の内皮
細胞と異なり、骨髄より分化した血管内皮前駆細胞はあ
らゆる臓器の血管にも分化しうる細胞である。したがっ
て、骨髄より血管内皮細胞の前駆細胞である血管内皮前
駆細胞を単離し、インビトロで分化させることにより、
より普遍的な血管内皮細胞のモデルを得ることが可能と
なる。
【０００７】本発明の課題は、血管内皮細胞としての機
能・特性を保持する不死化血管内皮細胞株や、その培養
によりかかる不死化血管内皮細胞株に分化することがで
き、かつあらゆる臓器の血管に分化しうる血管内皮前駆
細胞や、これら不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細
胞を用いた細胞分化促進又は抑制物質等の有用物質のス
クリーニング方法を提供することにある。
能・特性を保持する不死化血管内皮細胞株や、その培養
によりかかる不死化血管内皮細胞株に分化することがで
き、かつあらゆる臓器の血管に分化しうる血管内皮前駆
細胞や、これら不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細
胞を用いた細胞分化促進又は抑制物質等の有用物質のス
クリーニング方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、骨髄に由来する細胞を株
化する場合には、マウスに比べ体重が約１０倍あるラッ
トが不死化細胞株樹立に供する前駆細胞を調製する上で
有利であるとの知見に基づき、不死化遺伝子としてのＳ
Ｖ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗
原遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作製
し、その骨髄から血管内皮細胞の前駆細胞を分離し、得
られた前駆細胞を継代培養することによって不死化血管
内皮細胞株を樹立することができることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究し、骨髄に由来する細胞を株
化する場合には、マウスに比べ体重が約１０倍あるラッ
トが不死化細胞株樹立に供する前駆細胞を調製する上で
有利であるとの知見に基づき、不死化遺伝子としてのＳ
Ｖ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗
原遺伝子を導入したトランスジェニックラットを作製
し、その骨髄から血管内皮細胞の前駆細胞を分離し、得
られた前駆細胞を継代培養することによって不死化血管
内皮細胞株を樹立することができることを見い出し、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、血管内皮前駆細胞の培
養により得られる、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を保持
したことを特徴とする不死化血管内皮細胞株（請求項
１）や、血管内皮前駆細胞が、骨髄に由来することを特
徴とする請求項１記載の不死化血管内皮細胞株（請求項
２）や、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子の発現能を有することを特徴とする
請求項１又は２記載の不死化血管内皮細胞株（請求項
３）や、マトリジェル中において管腔構造形成能を有す
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の不死
化血管内皮細胞株（請求項４）や、齧歯類起源であるこ
とを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の不死化血
管内皮細胞株（請求項５）や、齧歯類がラットであるこ
とを特徴とする請求項５記載の不死化血管内皮細胞株
（請求項６）や、不死化血管内皮細胞株ＴＲ−ＢＭＥ１
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２５）（請求項７）に関す
る。
養により得られる、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を保持
したことを特徴とする不死化血管内皮細胞株（請求項
１）や、血管内皮前駆細胞が、骨髄に由来することを特
徴とする請求項１記載の不死化血管内皮細胞株（請求項
２）や、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子の発現能を有することを特徴とする
請求項１又は２記載の不死化血管内皮細胞株（請求項
３）や、マトリジェル中において管腔構造形成能を有す
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の不死
化血管内皮細胞株（請求項４）や、齧歯類起源であるこ
とを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の不死化血
管内皮細胞株（請求項５）や、齧歯類がラットであるこ
とを特徴とする請求項５記載の不死化血管内皮細胞株
（請求項６）や、不死化血管内皮細胞株ＴＲ−ＢＭＥ１
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２５）（請求項７）に関す
る。
【００１０】また本発明は、ＳＶ４０の温度感受性突然
変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラ
ンスジェニックラットの骨髄から単離して得られる血管
内皮前駆細胞を培養して、アセチル化ＬＤＬの取込み活
性を有し、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＶＥＧＦ
受容体１及びＴＩＥ１，２を発現する不死化細胞を樹立
することを特徴とする不死化血管内皮細胞株の製造方法
（請求項８）や、血管内皮前駆細胞が、マトリジェル中
において管腔構造形成能を有することを特徴とする請求
項８記載の不死化血管内皮細胞株の製造方法（請求項
９）に関する。
変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラ
ンスジェニックラットの骨髄から単離して得られる血管
内皮前駆細胞を培養して、アセチル化ＬＤＬの取込み活
性を有し、温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＶＥＧＦ
受容体１及びＴＩＥ１，２を発現する不死化細胞を樹立
することを特徴とする不死化血管内皮細胞株の製造方法
（請求項８）や、血管内皮前駆細胞が、マトリジェル中
において管腔構造形成能を有することを特徴とする請求
項８記載の不死化血管内皮細胞株の製造方法（請求項
９）に関する。
【００１１】また本発明は、骨髄に由来し、その培養に
より、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有し、ＶＥＧＦ
受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を保持した不死化血
管内皮細胞株に分化することができることを特徴とする
血管内皮前駆細胞（請求項１０）や、不死化血管内皮細
胞株が、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子の発現能を有することを特徴とする
請求項１０記載の血管内皮前駆細胞（請求項１１）や、
不死化血管内皮細胞株が、マトリジェル中において管腔
構造形成能を有することを特徴とする請求項１０又は１
１記載の血管内皮前駆細胞（請求項１２）や、齧歯類起
源であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか
記載の血管内皮前駆細胞（請求項１３）や、齧歯類がラ
ットであることを特徴とする請求項１３記載の血管内皮
前駆細胞（請求項１４）に関する。
より、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有し、ＶＥＧＦ
受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を保持した不死化血
管内皮細胞株に分化することができることを特徴とする
血管内皮前駆細胞（請求項１０）や、不死化血管内皮細
胞株が、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子の発現能を有することを特徴とする
請求項１０記載の血管内皮前駆細胞（請求項１１）や、
不死化血管内皮細胞株が、マトリジェル中において管腔
構造形成能を有することを特徴とする請求項１０又は１
１記載の血管内皮前駆細胞（請求項１２）や、齧歯類起
源であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか
記載の血管内皮前駆細胞（請求項１３）や、齧歯類がラ
ットであることを特徴とする請求項１３記載の血管内皮
前駆細胞（請求項１４）に関する。
【００１２】また本発明は、被検物質の存在下、請求項
１〜７のいずれか記載の不死化血管内皮細胞株又は請求
項１０〜１４のいずれか記載の血管内皮前駆細胞を培養
し、該不死化細胞株におけるマーカータンパク質の活性
及び／又は発現の程度を測定・評価することを特徴とす
る不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞における
マーカータンパク質発現の促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法（請求項１５）や、マーカータンパク質が、
ＶＥＧＦ受容体１又はＴＩＥ１，２であることを特徴と
する請求項１５記載の不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発現の促進又は
抑制物質のスクリーニング方法（請求項１６）や、被検
物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化血
管内皮細胞株又は請求項１０〜１４のいずれか記載の血
管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株のアセチル化
ＬＤＬの取込み活性の程度を測定・評価することを特徴
とする不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞にお
けるアセチル化ＬＤＬの取込み活性を促進又は抑制物質
のスクリーニング方法（請求項１７）や、被検物質の存
在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化血管内皮細
胞株又は請求項１０〜１４のいずれか記載の血管内皮前
駆細胞を培養し、該不死化細胞株におけるマトリジェル
中における管腔構造形成能の程度を解析・評価すること
を特徴とする不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細
胞におけるマトリジェル中における管腔構造形成の促進
又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１８）に関
する。
１〜７のいずれか記載の不死化血管内皮細胞株又は請求
項１０〜１４のいずれか記載の血管内皮前駆細胞を培養
し、該不死化細胞株におけるマーカータンパク質の活性
及び／又は発現の程度を測定・評価することを特徴とす
る不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞における
マーカータンパク質発現の促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法（請求項１５）や、マーカータンパク質が、
ＶＥＧＦ受容体１又はＴＩＥ１，２であることを特徴と
する請求項１５記載の不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発現の促進又は
抑制物質のスクリーニング方法（請求項１６）や、被検
物質の存在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化血
管内皮細胞株又は請求項１０〜１４のいずれか記載の血
管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株のアセチル化
ＬＤＬの取込み活性の程度を測定・評価することを特徴
とする不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞にお
けるアセチル化ＬＤＬの取込み活性を促進又は抑制物質
のスクリーニング方法（請求項１７）や、被検物質の存
在下、請求項１〜７のいずれか記載の不死化血管内皮細
胞株又は請求項１０〜１４のいずれか記載の血管内皮前
駆細胞を培養し、該不死化細胞株におけるマトリジェル
中における管腔構造形成能の程度を解析・評価すること
を特徴とする不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細
胞におけるマトリジェル中における管腔構造形成の促進
又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項１８）に関
する。
【００１３】また本発明は、請求項１５又は１６記載の
スクリーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞
株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発
現促進物質（請求項１９）や、請求項１７記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活
性促進物質（請求項２０）や、請求項１８記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成
促進物質（請求項２１）や、請求項１５又は１６記載の
スクリーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞
株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発
現抑制物質（請求項２２）や、請求項１７記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活
性抑制物質（請求項２３）や、請求項１８記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成
抑制物質（請求項２４）に関する。
スクリーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞
株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発
現促進物質（請求項１９）や、請求項１７記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活
性促進物質（請求項２０）や、請求項１８記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成
促進物質（請求項２１）や、請求項１５又は１６記載の
スクリーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞
株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発
現抑制物質（請求項２２）や、請求項１７記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活
性抑制物質（請求項２３）や、請求項１８記載のスクリ
ーニング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成
抑制物質（請求項２４）に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明の不死化血管内皮細胞株と
しては、血管内皮前駆細胞の培養により得られ、アセチ
ル化ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）の取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２（ＴＩＥ１とＴ
ＩＥ２）の発現能を保持した樹立細胞であればどのよう
なものでもよく、例えば、前記血管内皮前駆細胞が骨髄
に由来するものや、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を発現するものや、マト
リジェル中において管腔構造形成能を有するものを挙げ
ることができる。また、このような不死化血管内皮細胞
株の具体例として、ＴＲ−ＢＭＥ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−７０２５）を挙げることができる。また、本発明の血
管内皮前駆細胞としては、培養することにより、上記不
死化血管内皮細胞株に分化することができる骨髄由来の
細胞であれば特に制限されるものではない。そして、本
発明の不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細胞は、ラ
ット等の齧歯類などの動物から得ることができるが、ラ
ットは病態モデルが豊富で、薬理作用の評価に広く用い
られていることから、以下、不死化血管内皮細胞株や血
管内皮前駆細胞の製造方法を、ラットを用いた方法を例
にとって説明する。
しては、血管内皮前駆細胞の培養により得られ、アセチ
ル化ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）の取込み活性を有
し、ＶＥＧＦ受容体１及びＴＩＥ１，２（ＴＩＥ１とＴ
ＩＥ２）の発現能を保持した樹立細胞であればどのよう
なものでもよく、例えば、前記血管内皮前駆細胞が骨髄
に由来するものや、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔ
ｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を発現するものや、マト
リジェル中において管腔構造形成能を有するものを挙げ
ることができる。また、このような不死化血管内皮細胞
株の具体例として、ＴＲ−ＢＭＥ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−７０２５）を挙げることができる。また、本発明の血
管内皮前駆細胞としては、培養することにより、上記不
死化血管内皮細胞株に分化することができる骨髄由来の
細胞であれば特に制限されるものではない。そして、本
発明の不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細胞は、ラ
ット等の齧歯類などの動物から得ることができるが、ラ
ットは病態モデルが豊富で、薬理作用の評価に広く用い
られていることから、以下、不死化血管内皮細胞株や血
管内皮前駆細胞の製造方法を、ラットを用いた方法を例
にとって説明する。
【００１５】例えば、ＳＶ４０の温度感受性突然変異株
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラットの骨髄から、文献（Nature Medicine vo
l.5,434-438, 1999）記載の方法に準じて細胞を採取
し、ヒストパック（histopaq）を用いて単核球細胞を単
離することにより、血管内皮前駆細胞を調製することが
できる。かかる血管内皮前駆細胞をコラーゲンとファイ
ブロネクチンをコートしたディッシュ上で３７℃、２週
間培養し、血液内皮細胞に分化させ、これら分化させた
細胞を別のディッシュに８０００細胞／１００ｍｍディ
ッシュの濃度に継代培養して、３３℃に移して、コロニ
ーの形成を待って細胞をクローン化し、クローン化した
各細胞についてアセチル化ＬＤＬの取り込み能と、ＲＴ
−ＰＣＲによる内皮細胞のマーカー遺伝子であるＶＥＧ
Ｆ受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を有する細胞株を
選択することにより、不死化細胞株を樹立することがで
きる。
ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジ
ェニックラットの骨髄から、文献（Nature Medicine vo
l.5,434-438, 1999）記載の方法に準じて細胞を採取
し、ヒストパック（histopaq）を用いて単核球細胞を単
離することにより、血管内皮前駆細胞を調製することが
できる。かかる血管内皮前駆細胞をコラーゲンとファイ
ブロネクチンをコートしたディッシュ上で３７℃、２週
間培養し、血液内皮細胞に分化させ、これら分化させた
細胞を別のディッシュに８０００細胞／１００ｍｍディ
ッシュの濃度に継代培養して、３３℃に移して、コロニ
ーの形成を待って細胞をクローン化し、クローン化した
各細胞についてアセチル化ＬＤＬの取り込み能と、ＲＴ
−ＰＣＲによる内皮細胞のマーカー遺伝子であるＶＥＧ
Ｆ受容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を有する細胞株を
選択することにより、不死化細胞株を樹立することがで
きる。
【００１６】上記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓ
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニ
ックラットは、以下のようにして作製することができ
る。例えば、ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させ
たｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素Ｂ
ａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミド
ｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（OhnoT. et al., Cytotec
hnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大
量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。こ
のラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ
断片を常法に従いラット等の齧歯類などの動物の全能性
細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受
性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての
細胞内に有する遺伝子導入ラット、すなわちトランスジ
ェニックラットを作出することができる。かかるトラン
スジェニックラットは、その全ての体細胞においてｔｓ
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そ
して、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほ
か、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げるこ
とができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法と
しては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、
リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導
入法を用いることができる。
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニ
ックラットは、以下のようにして作製することができ
る。例えば、ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失させ
たｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−２の全ＤＮＡを制限酸素Ｂ
ａｍＨＩで開環してｐＢＲ３２２に導入したプラスミド
ｐＳＶｔｓＡ５８（−）−２（OhnoT. et al., Cytotec
hnology 7, 165-172, 1991）を常法に従い大腸菌内で大
量に増幅させ、この増幅したプラスミドを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで切断してベクター部位を除去し、ｔｓＡ５８の
ラージＴ抗原遺伝子を有するＤＮＡ断片を調製する。こ
のラージＴ抗原遺伝子のプロモーターが内在するＤＮＡ
断片を常法に従いラット等の齧歯類などの動物の全能性
細胞に遺伝子導入することにより、ＳＶ４０の温度感受
性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を全ての
細胞内に有する遺伝子導入ラット、すなわちトランスジ
ェニックラットを作出することができる。かかるトラン
スジェニックラットは、その全ての体細胞においてｔｓ
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子が発現することになる。そ
して、上記全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほ
か、多分化能を有するＥＳ細胞などを具体的に挙げるこ
とができる。また、全能性細胞へのＤＮＡの導入方法と
しては、マイクロインジェクション法、電気パルス法、
リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の遺伝子導
入法を用いることができる。
【００１７】上記ラット等の齧歯類などの動物の全能性
細胞（培養細胞）の核を、除核末受精卵に移植して初期
化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突
然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入するこ
とができる。また、前核期受精卵の雄生前核にＳＶ４０
の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝
子をマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親
の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ
産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個
体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラー
ジＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた
遺伝子導入ラット、すなわちトランスジェニックラット
を効率よく作出することができる。
細胞（培養細胞）の核を、除核末受精卵に移植して初期
化すること（核移植）で卵子にＳＶ４０の温度感受性突
然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入するこ
とができる。また、前核期受精卵の雄生前核にＳＶ４０
の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝
子をマイクロインジェクションして得られる卵子を仮親
の卵管に移植して産仔を得た後、注入した遺伝子を持つ
産仔を選出し、安定的にかかる遺伝子が組み込まれた個
体を得ることで、個体発生時にすでにｔｓＡ５８のラー
ジＴ抗原遺伝子が各組織の細胞の染色体に組み込まれた
遺伝子導入ラット、すなわちトランスジェニックラット
を効率よく作出することができる。
【００１８】本発明の血管内皮前駆細胞は、上記作出し
たトランスジェニックラットの骨髄から単核球を単離す
ることにより得ることができる。また、本発明の不死化
血管内皮細胞株は、かかる血管内皮前駆細胞を培養する
ことにより分化させることにより得ることができ、３３
〜３７℃において永久的増殖能を保持し、３９℃におい
ては増殖を停止するための細胞固有の分化形質の発現を
制御することができるという特色を有している。また、
前記のように、樹立された不死化血管内皮細胞株は温度
感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＶＥＧＦ受容体１、及び
ＴＩＥ１，２の発現をＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウエスタ
ンブロッテイング法で検出することにより同定すること
ができる。この不死化血管内皮細胞株は、５０回の継代
培養後においても３３℃で良好な増殖性を示し、血管内
皮前駆細胞としての機能を保持している。
たトランスジェニックラットの骨髄から単核球を単離す
ることにより得ることができる。また、本発明の不死化
血管内皮細胞株は、かかる血管内皮前駆細胞を培養する
ことにより分化させることにより得ることができ、３３
〜３７℃において永久的増殖能を保持し、３９℃におい
ては増殖を停止するための細胞固有の分化形質の発現を
制御することができるという特色を有している。また、
前記のように、樹立された不死化血管内皮細胞株は温度
感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＶＥＧＦ受容体１、及び
ＴＩＥ１，２の発現をＲＴ−ＰＣＲ及び／又はウエスタ
ンブロッテイング法で検出することにより同定すること
ができる。この不死化血管内皮細胞株は、５０回の継代
培養後においても３３℃で良好な増殖性を示し、血管内
皮前駆細胞としての機能を保持している。
【００１９】本発明の不死化血管内皮細胞株や血管内皮
前駆細胞は、血管新生の関与する病態、例えば、固形腫
瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎など
の研究や、これら病態に関連する疾患等の診断薬や治療
薬の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。ま
た、本発明者らは同種のトランスジェニックラットから
不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７０２４）を得ており（特願２０００−３７
８２７号参照）、かかる不死化脳毛細血管周皮細胞株と
本発明の不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細胞とを
組み合わせることにより、血管新生のメカニズム、特に
新生血管の成熟化、例えば血管内皮細胞と周皮細胞との
相互作用や血管内皮細胞の臓器特異的な分化のモデル系
の構築が可能となる。以下、本発明の不死化血管内皮細
胞株や血管内皮前駆細胞を用いた血管内皮細胞を標的と
した医薬品等の有用物質のスクリーニング方法について
説明する。
前駆細胞は、血管新生の関与する病態、例えば、固形腫
瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎など
の研究や、これら病態に関連する疾患等の診断薬や治療
薬の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。ま
た、本発明者らは同種のトランスジェニックラットから
不死化脳毛細血管周皮細胞株ＴＲ−ＰＣＴ１株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７０２４）を得ており（特願２０００−３７
８２７号参照）、かかる不死化脳毛細血管周皮細胞株と
本発明の不死化血管内皮細胞株や血管内皮前駆細胞とを
組み合わせることにより、血管新生のメカニズム、特に
新生血管の成熟化、例えば血管内皮細胞と周皮細胞との
相互作用や血管内皮細胞の臓器特異的な分化のモデル系
の構築が可能となる。以下、本発明の不死化血管内皮細
胞株や血管内皮前駆細胞を用いた血管内皮細胞を標的と
した医薬品等の有用物質のスクリーニング方法について
説明する。
【００２０】本発明におけるスクリーニング方法として
は、被検物質の存在下、上記不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株におけるＶ
ＥＧＦ受容体１又はＴＩＥ１，２等のマーカータンパク
質の活性及び／又は発現の程度を測定・評価する、不死
化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカ
ータンパク質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング
方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管内皮細胞株
又は血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株のアセ
チル化ＬＤＬの取込み活性の程度を測定・評価する、不
死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるアセ
チル化ＬＤＬの取込み活性を促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管内
皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞
株におけるマトリジェル中における管腔構造形成能の程
度を解析・評価する、不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマトリジェル中における管腔構造形
成の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を挙げる
ことができる。
は、被検物質の存在下、上記不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株におけるＶ
ＥＧＦ受容体１又はＴＩＥ１，２等のマーカータンパク
質の活性及び／又は発現の程度を測定・評価する、不死
化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカ
ータンパク質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング
方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管内皮細胞株
又は血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞株のアセ
チル化ＬＤＬの取込み活性の程度を測定・評価する、不
死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるアセ
チル化ＬＤＬの取込み活性を促進又は抑制物質のスクリ
ーニング方法や、被検物質の存在下、上記不死化血管内
皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を培養し、該不死化細胞
株におけるマトリジェル中における管腔構造形成能の程
度を解析・評価する、不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマトリジェル中における管腔構造形
成の促進又は抑制物質のスクリーニング方法等を挙げる
ことができる。
【００２１】不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細
胞におけるマーカータンパク質発現の促進又は抑制物質
のスクリーニングは、不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ
培養し、一定時間培養後に発現したマーカータンパク質
の量を検出・測定し、被検物質の不存在下に培養した対
照のものと比較・評価することにより行われる。例え
ば、血管内皮前駆細胞の表面マーカーであるＶＥＧＦ受
容体１は、それぞれ特異抗体を用いた免疫化学的方法、
あるいはＲＴ−ＰＣＲ法により検出・測定することがで
きる。また、血管内皮細胞に特異的なＴＩＥ１，２は、
相当するｍＲＮＡの発現量を常法により検出することに
より測定することができる。上記不死化血管内皮細胞株
又は血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込
み活性を促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化
血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を種々の濃度の被
検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後にア
セチル化ＬＤＬの取込み活性を測定し、被検物質の不存
在下に培養した対照のものと比較・評価することにより
行われる。また、上記不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマトリジェル中における管腔構造形
成の促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化血管
内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を種々の濃度の被検物
質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後にマトリ
ジェル中における管腔構造形成能の程度を解析し、被検
物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価する
ことにより行われる。これらスクリーニングにおいて、
血管内皮前駆細胞を用いる場合、かかる血管内皮前駆細
胞の各臓器の血管内皮細胞への分化に際して種々の活性
の促進又は抑制物質を得ることができる可能性がある。
胞におけるマーカータンパク質発現の促進又は抑制物質
のスクリーニングは、不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞を種々の濃度の被検物質の存在下でそれぞれ
培養し、一定時間培養後に発現したマーカータンパク質
の量を検出・測定し、被検物質の不存在下に培養した対
照のものと比較・評価することにより行われる。例え
ば、血管内皮前駆細胞の表面マーカーであるＶＥＧＦ受
容体１は、それぞれ特異抗体を用いた免疫化学的方法、
あるいはＲＴ−ＰＣＲ法により検出・測定することがで
きる。また、血管内皮細胞に特異的なＴＩＥ１，２は、
相当するｍＲＮＡの発現量を常法により検出することに
より測定することができる。上記不死化血管内皮細胞株
又は血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込
み活性を促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化
血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を種々の濃度の被
検物質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後にア
セチル化ＬＤＬの取込み活性を測定し、被検物質の不存
在下に培養した対照のものと比較・評価することにより
行われる。また、上記不死化血管内皮細胞株又は血管内
皮前駆細胞におけるマトリジェル中における管腔構造形
成の促進又は抑制物質のスクリーニングは、不死化血管
内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞を種々の濃度の被検物
質の存在下でそれぞれ培養し、一定時間培養後にマトリ
ジェル中における管腔構造形成能の程度を解析し、被検
物質の不存在下に培養した対照のものと比較・評価する
ことにより行われる。これらスクリーニングにおいて、
血管内皮前駆細胞を用いる場合、かかる血管内皮前駆細
胞の各臓器の血管内皮細胞への分化に際して種々の活性
の促進又は抑制物質を得ることができる可能性がある。
【００２２】そして、これらスクリーニング方法により
得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞に
おけるマーカータンパク質や、不死化血管内皮細胞株又
は血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み
活性促進又は抑制物質や、不死化血管内皮細胞株又は血
管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成促
進又は抑制物質は、血管新生の関与する疾患、例えば、
固形腫瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節
炎などに関連する疾患を有する患者を治療するのに用い
られる治療薬、予防及び／又は症状改善剤として使用で
きる可能性があり、有用である。
得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞に
おけるマーカータンパク質や、不死化血管内皮細胞株又
は血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み
活性促進又は抑制物質や、不死化血管内皮細胞株又は血
管内皮前駆細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成促
進又は抑制物質は、血管新生の関与する疾患、例えば、
固形腫瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節
炎などに関連する疾患を有する患者を治療するのに用い
られる治療薬、予防及び／又は症状改善剤として使用で
きる可能性があり、有用である。
【００２３】以下の実施例をもって本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１（トランスジェニックラットの作出）ＳＶ４０
の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入した
トランスジェニックラットは、下記の手順で作出した。
説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１（トランスジェニックラットの作出）ＳＶ４０
の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のＤＮＡを導入した
トランスジェニックラットは、下記の手順で作出した。
【００２４】（導入遺伝子の調製）マイクロインジェク
ションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８
のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡ
を制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍ
ＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換して
ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）
としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−
２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 199
1；図１参照）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製し
た。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより
得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ
（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化
した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガ
ー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール
・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮ
Ａを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー
（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製Ｄ
ＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッフ
ァー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希
釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤ
ＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。
ションにはＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８
のゲノムＤＮＡを使用した。ｔｓＡ５８のゲノムＤＮＡ
を制限酵素ＢａｍＨＩで開環し、ｐＢＲ３２２のＢａｍ
ＨＩ部位に導入し、ＳｆｉＩ配列をＳａｃIIに変換して
ＳＶ４０の複製起点（ｏｒｉ）を欠失するｏｒｉ（−）
としたＤＮＡクローンｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ（−）−
２（Ohno T. et al., Cytotechnology, 165-172, 199
1；図１参照）から常法に従い導入用ＤＮＡを調製し
た。すなわち、大腸菌内で大量に増幅させることにより
得られたプラスミドＤＮＡのｐＳＶｔｓＡ５８ｏｒｉ
（−）−２を制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化
した後、アガロース電気泳動法（１％ゲル；ベーリンガ
ー社製）により分離し、ゲルを溶解した後、フェノール
・クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行いＤＮ
Ａを回収した。回収した精製ＤＮＡをＴＥバッファー
（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ；ｐＨ７．６）に溶解して１７０μｇ／ｍｌの精製Ｄ
ＮＡを含む溶液を得た。このＤＮＡ溶液を注入用バッフ
ァー（０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ；ｐＨ７．６）で５μｇ／ｍｌとなるように希
釈して注入用ＤＮＡ溶液を調製した。なお、調製したＤ
ＮＡ溶液は注入操作まで−２０℃で保存した。
【００２５】（トランスジェニックラットの作出）ラッ
ト前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマ
イクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟
した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２時間
（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、
湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を
観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラット
により１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン
（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnanto mare ser
um gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その
４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic
gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を行
った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与３
２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵
管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Ch
ang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使
用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ
（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲ
Ｂ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除
去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、Ｄ
ＮＡ注入操作までＣＯ2−インキュベーター内（５％の
ＣＯ2−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存し
た。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に前
記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹
の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入Ｄ
ＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾よ
り調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プラ
イマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴ
ＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４部
位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−Ａ
ＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１５
７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結
果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、
生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１
２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラ
ット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−
６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，
＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃
１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニ
ックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダ
ーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウン
ダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−
８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
ト前核期受精卵への上記調製した注入用ＤＮＡ溶液のマ
イクロインジェクションは下記の要領で行った。性成熟
した８週齢のウィスターラットを明暗サイクル１２時間
（４：００〜１６：００を明時間）、温度２３±２℃、
湿度５５±５％で飼育し、膣スメアにより雌の性周期を
観察して、ホルモン処理日を選択した。まず、雌ラット
により１５０ＩＵ／ｋｇの妊馬血清性性腺刺激ホルモン
（日本ゼンヤク社製；ＰＭＳ全薬（pregnanto mare ser
um gonadotropin：ＰＭＳＧ））を腹腔内投与し、その
４８時間後に７５ＩＵ／ｋｇのヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン（三共臓器社製；プベローゲン（human chorionic
gonadotropin：ｈＣＧ））を投与して過剰排卵処理を行
った後、雄との同居により交配を行った．ｈＣＧ投与３
２時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。卵
管灌流及び卵の培養にはｍＫＲＢ液（Toyoda Y. and Ch
ang M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22, 1974）を使
用した。採取した受精卵を０．１％のヒアルロニダーゼ
（シグマ社製；Hyaluronidase Typel-S）を含むｍＫＲ
Ｂ液中で３７℃、５分間の酵素処理を行い卵丘細胞を除
去した後、ｍＫＲＢ液で３回洗浄して酵素を除去し、Ｄ
ＮＡ注入操作までＣＯ2−インキュベーター内（５％の
ＣＯ2−９５％のＡｉｒ，３７℃、飽和湿度）に保存し
た。この様にして準備したラット受精卵の雄性前核に前
記ＤＮＡ溶液を注入した。注入した２２８個の卵を９匹
の仮親に移植して出産させ８０匹の産仔を得た。注入Ｄ
ＮＡのラットへの導入は、離乳直後に断尾して得た尾よ
り調製したＤＮＡをＰＣＲ法により検定した［使用プラ
イマー；ｔｓＡ５８−１Ａ，５′−ＴＣＣＴＡＡＴＧＴ
ＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧ−３′（１３６５〜１３８４部
位に相当：配列番号１）、ｔｓＡ５８−１Ｂ，５′−Ａ
ＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧ−３′（１５
７１〜１５９０部位に相当：配列番号２）］。その結
果、遺伝子導入の認められた２０匹（雄６匹、雌８匹、
生別不明６匹）の産仔の中から性成熟期間を経過する１
２週齢まで生存した１１ラインのトランスジェニックラ
ット（雄ライン：＃０７−２，＃０７−５，＃０９−
６，＃１２−３，＃１９−５，雌ライン：＃０９−７，
＃１１−６，＃１２−５，＃１２−７，＃１８−５，＃
１９−８）を得た。これらのＧ0世代のトランスジェニ
ックラットとウィスターラットを交配し、雄ファウンダ
ーの２ライン（＃０７−２，＃０７−５）と雌ファウン
ダーの３ライン（＃０９−７，＃１１−６，＃１９−
８）において次世代以降への遺伝子の伝達を確認した。
【００２６】実施例２（骨髄からの血管内皮前駆細胞の
分離・調製） 骨髄からの血管内皮前駆細胞の分離・調製は次のように
して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性
変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラ
ンスジェニックラット（１匹）の大腿骨より、注射筒と
ＤＰＢＳＥ（１ｍＭの濃度でＥＤＴＡが含有したＰＢ
Ｓ）を用いて、骨髄を採取した。採取した骨髄から常法
に従い細胞を採取し、得られた細胞を遠心操作（１２０
０ｒｐｍ、５分間、４℃下）により集めて、０．１３Ｍ
のクエン酸ナトリウム３ｍｌに懸濁し、この懸濁液を３
ｍｌのヒストパック（シグマ社製、＃１０７７−１）が
入った１５ｍｌの遠心チューブに静かに重層した。この
混合物を遠心操作（２１５０ｒｐｍ、２０分間、室温）
後、中間に層状になった細胞（血管内皮前駆細胞）をピ
ペットにより採取して単核球画分とした。これら細胞を
３ｍｌのＤＰＢＳＥに懸濁し、遠心操作（２４５０ｒｐ
ｍ、５分間、４℃）を行い、細胞を洗浄して、血管内皮
前駆細胞を調製した。
分離・調製） 骨髄からの血管内皮前駆細胞の分離・調製は次のように
して行った。実施例１で得られたＳＶ４０の温度感受性
変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトラ
ンスジェニックラット（１匹）の大腿骨より、注射筒と
ＤＰＢＳＥ（１ｍＭの濃度でＥＤＴＡが含有したＰＢ
Ｓ）を用いて、骨髄を採取した。採取した骨髄から常法
に従い細胞を採取し、得られた細胞を遠心操作（１２０
０ｒｐｍ、５分間、４℃下）により集めて、０．１３Ｍ
のクエン酸ナトリウム３ｍｌに懸濁し、この懸濁液を３
ｍｌのヒストパック（シグマ社製、＃１０７７−１）が
入った１５ｍｌの遠心チューブに静かに重層した。この
混合物を遠心操作（２１５０ｒｐｍ、２０分間、室温）
後、中間に層状になった細胞（血管内皮前駆細胞）をピ
ペットにより採取して単核球画分とした。これら細胞を
３ｍｌのＤＰＢＳＥに懸濁し、遠心操作（２４５０ｒｐ
ｍ、５分間、４℃）を行い、細胞を洗浄して、血管内皮
前駆細胞を調製した。
【００２７】実施例３（血管内皮前駆細胞から内皮細胞
への分化と内皮細胞株の同定） これら骨髄から分離・調製した血管内皮前駆細胞を、Ｅ
ＧＭ−２ブリットキット（旭テクノグラス社製、＃ＣＣ
Ｍ−３１６２、但し、かかるキット中のヒドロコルチゾ
ンは除く）１０ｍｌに懸濁し、あらかじめコラーゲンと
ファイブロネクチンでコートした１００ｍｍディッシュ
上で培養した。かかるコラーゲンとファイブロネクチン
でコートしたディッシュは、コラーゲンタイプＩ溶液
（和光純薬社製−＃０３８−１３８９２）に３倍量の６
０％エタノール水溶液を加え、これを２．４ｍｌ／ディ
ッシュに分注し、一晩クリーンベンチ内で乾燥させ、次
いでファイブロネクチン溶液（ヒト血漿ファイブロネク
チン（GibcoBRL社製−＃３３０１６−０１５）を４０μ
ｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解したもの）を１２ｍ
ｌ／ディッシュずつ分注し、３７℃で１時間インキュベ
ートし、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製したもの
を用いた。
への分化と内皮細胞株の同定） これら骨髄から分離・調製した血管内皮前駆細胞を、Ｅ
ＧＭ−２ブリットキット（旭テクノグラス社製、＃ＣＣ
Ｍ−３１６２、但し、かかるキット中のヒドロコルチゾ
ンは除く）１０ｍｌに懸濁し、あらかじめコラーゲンと
ファイブロネクチンでコートした１００ｍｍディッシュ
上で培養した。かかるコラーゲンとファイブロネクチン
でコートしたディッシュは、コラーゲンタイプＩ溶液
（和光純薬社製−＃０３８−１３８９２）に３倍量の６
０％エタノール水溶液を加え、これを２．４ｍｌ／ディ
ッシュに分注し、一晩クリーンベンチ内で乾燥させ、次
いでファイブロネクチン溶液（ヒト血漿ファイブロネク
チン（GibcoBRL社製−＃３３０１６−０１５）を４０μ
ｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解したもの）を１２ｍ
ｌ／ディッシュずつ分注し、３７℃で１時間インキュベ
ートし、ＰＢＳで２回洗浄することにより調製したもの
を用いた。
【００２８】上記のように、骨髄から調製した血管内皮
前駆細胞をＥＧＭ−２ブリットキット培地中において、
３７℃でコラーゲンとファイブロネクチンをコートした
ディッシュ上で培養すると、球形の浮遊細胞であった血
管内皮前駆細胞は３〜７日間で円盤状の形態の付着細胞
へと変化した。この３７℃での培養を１４日間継続し、
内皮細胞へと分化させた。この細胞をトリプシン−ＥＤ
ＴＡ溶液（０．２５％のトリプシン、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ；GibcoBRL社製−＃１５０５０−０６５）を用いてデ
ィッシュから回収し、８×１０3個の細胞をコラーゲン
とファイブロネクチンをコートした１００ｍｍディッシ
ュに播種し、３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロ
ニーを形成させた。４日ごとに培地を交換し、１８日後
にペニシリンカップを用いてコロニーを単離した。
前駆細胞をＥＧＭ−２ブリットキット培地中において、
３７℃でコラーゲンとファイブロネクチンをコートした
ディッシュ上で培養すると、球形の浮遊細胞であった血
管内皮前駆細胞は３〜７日間で円盤状の形態の付着細胞
へと変化した。この３７℃での培養を１４日間継続し、
内皮細胞へと分化させた。この細胞をトリプシン−ＥＤ
ＴＡ溶液（０．２５％のトリプシン、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ；GibcoBRL社製−＃１５０５０−０６５）を用いてデ
ィッシュから回収し、８×１０3個の細胞をコラーゲン
とファイブロネクチンをコートした１００ｍｍディッシ
ュに播種し、３３℃の炭酸ガス培養器内で培養してコロ
ニーを形成させた。４日ごとに培地を交換し、１８日後
にペニシリンカップを用いてコロニーを単離した。
【００２９】実施例４（内皮細胞株の同定） これら細胞についてアセチル化ＬＤＬの取り込みにより
内皮細胞であることの同定を以下のように行った。細胞
を直径１２ｍｍのカバーガラス上に２×１０4個播種
し、１晩培養し、ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０
ニッスイ社製−＃０５９１８に最終濃度で１００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシ
ン及び２ｍＭのグルタミン酸を添加し、さらに１０％の
ＮａＨＣＯ 3により約ｐＨ７．２に調製したもの）で２
回洗浄した。これら細胞に、アセチル化ＬＤＬ／ＲＰＭ
Ｉ１６４０（ＤｉＩ標識アセチル化ＬＤＬ（Biomedical
Technologies社製−＃ＢＴ−９０２）を１０μｇ／ｍ
ｌになるように添加したＲＰＭＩ１６４０）を加え、３
７℃、５％ＣＯ2存在下で４時間インキュベーションし
た。次いでＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、３％の
ホルマリン溶液で細胞を固定し、蒸留水で１回洗浄後、
スライドグラス上で包埋して蛍光顕微鏡で観察した。蛍
光顕微鏡写真を図１として示す（参考写真１及び２参
照）。そして、アセチル化ＬＤＬの取り込み活性の認め
られた細胞を内皮と同定した。かかる結果から、比較的
取り込み能の強い細胞株を１株選び、２回目の限界希釈
により再度クローニングを行った。
内皮細胞であることの同定を以下のように行った。細胞
を直径１２ｍｍのカバーガラス上に２×１０4個播種
し、１晩培養し、ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０
ニッスイ社製−＃０５９１８に最終濃度で１００Ｕ／ｍ
ｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシ
ン及び２ｍＭのグルタミン酸を添加し、さらに１０％の
ＮａＨＣＯ 3により約ｐＨ７．２に調製したもの）で２
回洗浄した。これら細胞に、アセチル化ＬＤＬ／ＲＰＭ
Ｉ１６４０（ＤｉＩ標識アセチル化ＬＤＬ（Biomedical
Technologies社製−＃ＢＴ−９０２）を１０μｇ／ｍ
ｌになるように添加したＲＰＭＩ１６４０）を加え、３
７℃、５％ＣＯ2存在下で４時間インキュベーションし
た。次いでＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、３％の
ホルマリン溶液で細胞を固定し、蒸留水で１回洗浄後、
スライドグラス上で包埋して蛍光顕微鏡で観察した。蛍
光顕微鏡写真を図１として示す（参考写真１及び２参
照）。そして、アセチル化ＬＤＬの取り込み活性の認め
られた細胞を内皮と同定した。かかる結果から、比較的
取り込み能の強い細胞株を１株選び、２回目の限界希釈
により再度クローニングを行った。
【００３０】９６穴プレートは１００ｍｍディッシュと
同様に、コラーゲンとファイブロネクチンでコートした
ものを用いた。この９６穴プレートに前記細胞株を約
０．１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように希釈し、３３
℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。４日ごとに培地交換
を行い、コロニーの形成を待って、クローン化した。ク
ローン化した各細胞について、アセチル化ＬＤＬ取り込
み能と、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺伝
子の発現の検討を行い、最も内皮細胞の形質を保持して
いると思われたクローンを骨髄由来血管内皮細胞株ＴＲ
−ＢＭＥ１とした。このＴＲ−ＢＭＥ１株は、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約
に基づいて、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市）に、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２
５」として寄託されている。
同様に、コラーゲンとファイブロネクチンでコートした
ものを用いた。この９６穴プレートに前記細胞株を約
０．１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように希釈し、３３
℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。４日ごとに培地交換
を行い、コロニーの形成を待って、クローン化した。ク
ローン化した各細胞について、アセチル化ＬＤＬ取り込
み能と、以下に述べるＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺伝
子の発現の検討を行い、最も内皮細胞の形質を保持して
いると思われたクローンを骨髄由来血管内皮細胞株ＴＲ
−ＢＭＥ１とした。このＴＲ−ＢＭＥ１株は、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約
に基づいて、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市）に、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２
５」として寄託されている。
【００３１】実施例５（ＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺
伝子の発現の検討） 上記ＴＲ−ＢＭＥ１株の性状解析として血管内皮細胞の
マーカー遺伝子といわれているＶＥＧＦ受容体１、ＴＩ
Ｅ−１，２、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、ＶＥ
−カドヘリン（cadherin）の６種について、ＲＴ−ＰＣ
Ｒにより発現の検討を行った。ＴＲ−ＢＭＥ１株からの
ＲＮＡの調製は、細胞を１００ｍｍディッシュ１枚にお
およそ８０％コンフルエントになるように前記ＥＧＭ−
２ブリットキット培地で培養し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポ
ンジーン社製−＃３１１−０２５０１）を用いて、説明
書に従って行った。得られたＲＮＡに対してＤＮａｓｅ
（ニッポンジーン社製−＃３１３−０３１６１）処理を
行い、ＤＮａｓｅ処理後のＲＮＡに対して、ＲｅｖａＴ
ｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製−＃ＴＲＴ−１０１）を用い
て、テクニカルノート（カタログｐ７５参照）に従っ
て、逆転写反応を行った。
伝子の発現の検討） 上記ＴＲ−ＢＭＥ１株の性状解析として血管内皮細胞の
マーカー遺伝子といわれているＶＥＧＦ受容体１、ＴＩ
Ｅ−１，２、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、ＶＥ
−カドヘリン（cadherin）の６種について、ＲＴ−ＰＣ
Ｒにより発現の検討を行った。ＴＲ−ＢＭＥ１株からの
ＲＮＡの調製は、細胞を１００ｍｍディッシュ１枚にお
およそ８０％コンフルエントになるように前記ＥＧＭ−
２ブリットキット培地で培養し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポ
ンジーン社製−＃３１１−０２５０１）を用いて、説明
書に従って行った。得られたＲＮＡに対してＤＮａｓｅ
（ニッポンジーン社製−＃３１３−０３１６１）処理を
行い、ＤＮａｓｅ処理後のＲＮＡに対して、ＲｅｖａＴ
ｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製−＃ＴＲＴ−１０１）を用い
て、テクニカルノート（カタログｐ７５参照）に従っ
て、逆転写反応を行った。
【００３２】得られた逆転写反応産物２μｌに対して、
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応における各遺伝子のプ
ライマーの組合せとしては、ＶＥＧＦ受容体１［セン
ス：５′−ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣ
ＴＡ−３′（配列番号３）、アンチセンス：５′−ＣＣ
ＴＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣ−３′（配
列番号４）］、ＴＩＥ−１［センス：５′−ＴＣＴＧＣ
ＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴ−３′（配列番号
５）、アンチセンス：５′−ＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴ
ＣＧＡＴＧＧＴＣＡ−３′（配列番号６）］、ＴＩＥ−
２［センス：５′−ＧＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣ
ＣＡＧＣＡＣ−３′（配列番号７）、アンチセンス：
５′−ＧＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴ
−３′（配列番号８）］、ｖＷＦ［センス：５′−ＧＣ
ＣＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧ−３′
（配列番号９）、アンチセンス：５′−ＡＴＣＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣ−３′（配列番号
１０）］、ＶＥ−カドヘリン［センス：５′−ＧＧＣＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣ−３′（配列番
号１１）、アンチセンス：５′−ＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧ
ＴＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧ−３′（配列番号１２）］をそ
れぞれ用いた。
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応における各遺伝子のプ
ライマーの組合せとしては、ＶＥＧＦ受容体１［セン
ス：５′−ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣ
ＴＡ−３′（配列番号３）、アンチセンス：５′−ＣＣ
ＴＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣ−３′（配
列番号４）］、ＴＩＥ−１［センス：５′−ＴＣＴＧＣ
ＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴ−３′（配列番号
５）、アンチセンス：５′−ＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＴ
ＣＧＡＴＧＧＴＣＡ−３′（配列番号６）］、ＴＩＥ−
２［センス：５′−ＧＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＣ
ＣＡＧＣＡＣ−３′（配列番号７）、アンチセンス：
５′−ＧＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴ
−３′（配列番号８）］、ｖＷＦ［センス：５′−ＧＣ
ＣＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧ−３′
（配列番号９）、アンチセンス：５′−ＡＴＣＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣ−３′（配列番号
１０）］、ＶＥ−カドヘリン［センス：５′−ＧＧＣＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣ−３′（配列番
号１１）、アンチセンス：５′−ＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧ
ＴＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧ−３′（配列番号１２）］をそ
れぞれ用いた。
【００３３】ＰＣＲは、上記各プライマー２０μＭを２
μｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製−＃ＲＲ００１Ｂ）を
０．２μｌ、全量を５０μｌで行った。サーマルサイク
ルのプログラムは、変性温度が９４℃で３０秒、伸長反
応が７２℃で６０秒、アニーリング温度は、各プライマ
ーそれぞれについて、以下の通りとした。ＶＥＧＦ受容
体１では５７℃、ＴＩＥ−１では５７℃、ＴＩＥ−２で
は５９℃、ｖＷＦでは６５℃、ＶＥ−カドヘリンでは５
７℃で行った。以上の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果
を図２と図３に示す。図２から、ＴＲ−ＢＭＥ１株にお
いてはＶＥＧＦ受容体１、ＴＩＥ−１，２の発現が認め
られた。また、ＲＴ(−)のサンプルについてはバンドが
検出されなかったことから、これらＰＣＲ産物がＤＮＡ
由来ではなくＲＮＡ由来であることを確認することがで
きた。一方、図３においては、ＴＲ−ＢＭＥ１株ではｖ
ＷＦやＶＥ−カドヘリンは発現していなかったが、分化
の異なるどのような細胞でも常に発現しているＧ３ＰＤ
Ｈ（ハウスキーピング遺伝子）は発現していることを確
認した。なお、コントロールとして用いた脳の初代細胞
株（脳Primary）ではＧ３ＰＤＨ及びＶＥ−カドヘリン
の発現を確認した。
μｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製−＃ＲＲ００１Ｂ）を
０．２μｌ、全量を５０μｌで行った。サーマルサイク
ルのプログラムは、変性温度が９４℃で３０秒、伸長反
応が７２℃で６０秒、アニーリング温度は、各プライマ
ーそれぞれについて、以下の通りとした。ＶＥＧＦ受容
体１では５７℃、ＴＩＥ−１では５７℃、ＴＩＥ−２で
は５９℃、ｖＷＦでは６５℃、ＶＥ−カドヘリンでは５
７℃で行った。以上の条件でＲＴ−ＰＣＲを行った結果
を図２と図３に示す。図２から、ＴＲ−ＢＭＥ１株にお
いてはＶＥＧＦ受容体１、ＴＩＥ−１，２の発現が認め
られた。また、ＲＴ(−)のサンプルについてはバンドが
検出されなかったことから、これらＰＣＲ産物がＤＮＡ
由来ではなくＲＮＡ由来であることを確認することがで
きた。一方、図３においては、ＴＲ−ＢＭＥ１株ではｖ
ＷＦやＶＥ−カドヘリンは発現していなかったが、分化
の異なるどのような細胞でも常に発現しているＧ３ＰＤ
Ｈ（ハウスキーピング遺伝子）は発現していることを確
認した。なお、コントロールとして用いた脳の初代細胞
株（脳Primary）ではＧ３ＰＤＨ及びＶＥ−カドヘリン
の発現を確認した。
【００３４】実施例６（管腔構造形成の確認） ２４穴プレートにマトリジェル（ベクトン・ディッキン
ソン社製−＃３５６２３４）を２５０μｌ／ｗｅｌｌ入
れ、３７℃で１時間インキュベーションし、ゲル化させ
た。ＴＲ−ＢＭＥ１株（４×１０4個）を５００μｌの
前記ＥＧＭ−２ブリットキット培地に懸濁して、マトリ
ジェル上に播種し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時
間インキュベートした。播種後約１時間から細胞の形態
が変化し、１３時間後には管腔構造の形成が認められ
た。培養開始１時間後のＴＲ−ＢＭＥ１株の位相差顕微
鏡写真を図４（参考写真３参照）として、管腔構造の形
成が認められた培養開始１３時間後のＴＲ−ＢＭＥ１株
の位相差顕微鏡写真を図５（参考写真４参照）としてそ
れぞれ示す。
ソン社製−＃３５６２３４）を２５０μｌ／ｗｅｌｌ入
れ、３７℃で１時間インキュベーションし、ゲル化させ
た。ＴＲ−ＢＭＥ１株（４×１０4個）を５００μｌの
前記ＥＧＭ−２ブリットキット培地に懸濁して、マトリ
ジェル上に播種し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時
間インキュベートした。播種後約１時間から細胞の形態
が変化し、１３時間後には管腔構造の形成が認められ
た。培養開始１時間後のＴＲ−ＢＭＥ１株の位相差顕微
鏡写真を図４（参考写真３参照）として、管腔構造の形
成が認められた培養開始１３時間後のＴＲ−ＢＭＥ１株
の位相差顕微鏡写真を図５（参考写真４参照）としてそ
れぞれ示す。
【００３５】実施例７（ラージＴ抗原タンパク質発現と
温度依存性の発現量の低下の確認） ウエスタンブロット法により、ラージＴ抗原の発現につ
いて調べた。ＴＲ−ＢＭＥ１株を、前記ＥＧＭ−２ブリ
ットキット培地を用いて１００ｍｍディッシュ上に８０
％コンフルエントになるまで培養した後、培地をアスピ
レートして除去した。次いで、ＰＢＳで細胞を２回洗浄
後、溶解液（Lysis buffer：１％のＳＤＳ、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセ
リン；ｐＨ７．４）を２００μｌ加え、セルスクレーパ
ーでかき取り、１．５ｍｌチューブに移した。１００℃
で１０分間加熱処理後、２６Ｇの注射針に２〜３回通
し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいチ
ューブに移し、細胞溶解物（cell lysate）とした。タ
ンパク質濃度はＢＣＡプロテインアッセイキット（ＰＩ
ＥＲＣＥ社製−＃２３２２５）を用いて測定した。７．
５％のアクリルアミドゲルを用いて、常法（Ｌａｅｍｌ
ｉの条件）に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳
動後、タンク式のブロッティング装置を用いて、ブロッ
ティング溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭのグリ
シン）中で、１００Ｖの定電圧で１時間かけてニトロセ
ルロースメンブレンにブロットした。５％のスキムミル
ク中に１時間保持してブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔ
（０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０が含有したＰＢＳ）で
１回洗浄後、１次抗体溶液中（抗ＳＶ４０Ｔ抗原抗体
（Oncogene社製−＃ＤＰ０２）を１％のＢＳＡを含むＰ
ＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈したもの）に室温で１時間保
持した。ＰＢＳ−Ｔ中に５分間放置してから洗浄する操
作を３回繰り返した後、２次抗体溶液中（抗マウス抗体
ＨＲＰ接合体（Amersham Pharmacia社製−＃ＲＰＮ２１
０６Ｍ１）を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで１／２００
０倍に希釈したもの）に室温で１時間保持した。ＰＢＳ
−Ｔ中に５分間放置してから洗浄する操作を４回繰り返
した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Am
ersham Pharmacia社製−＃ＲＰＮ２１０９）を用いて、
ラージＴ抗原タンパク質の検出を行った。その結果、Ｔ
Ｒ−ＢＭＥ１株にラージＴ抗原が発現していること、３
７℃で４日間前記ＥＧＭ−２ブリットキット培地で培養
することにより、ラージＴ抗原の発現量が減少すること
が確認された。
温度依存性の発現量の低下の確認） ウエスタンブロット法により、ラージＴ抗原の発現につ
いて調べた。ＴＲ−ＢＭＥ１株を、前記ＥＧＭ−２ブリ
ットキット培地を用いて１００ｍｍディッシュ上に８０
％コンフルエントになるまで培養した後、培地をアスピ
レートして除去した。次いで、ＰＢＳで細胞を２回洗浄
後、溶解液（Lysis buffer：１％のＳＤＳ、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセ
リン；ｐＨ７．４）を２００μｌ加え、セルスクレーパ
ーでかき取り、１．５ｍｌチューブに移した。１００℃
で１０分間加熱処理後、２６Ｇの注射針に２〜３回通
し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しいチ
ューブに移し、細胞溶解物（cell lysate）とした。タ
ンパク質濃度はＢＣＡプロテインアッセイキット（ＰＩ
ＥＲＣＥ社製−＃２３２２５）を用いて測定した。７．
５％のアクリルアミドゲルを用いて、常法（Ｌａｅｍｌ
ｉの条件）に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳
動後、タンク式のブロッティング装置を用いて、ブロッ
ティング溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭのグリ
シン）中で、１００Ｖの定電圧で１時間かけてニトロセ
ルロースメンブレンにブロットした。５％のスキムミル
ク中に１時間保持してブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔ
（０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０が含有したＰＢＳ）で
１回洗浄後、１次抗体溶液中（抗ＳＶ４０Ｔ抗原抗体
（Oncogene社製−＃ＤＰ０２）を１％のＢＳＡを含むＰ
ＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈したもの）に室温で１時間保
持した。ＰＢＳ−Ｔ中に５分間放置してから洗浄する操
作を３回繰り返した後、２次抗体溶液中（抗マウス抗体
ＨＲＰ接合体（Amersham Pharmacia社製−＃ＲＰＮ２１
０６Ｍ１）を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで１／２００
０倍に希釈したもの）に室温で１時間保持した。ＰＢＳ
−Ｔ中に５分間放置してから洗浄する操作を４回繰り返
した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Am
ersham Pharmacia社製−＃ＲＰＮ２１０９）を用いて、
ラージＴ抗原タンパク質の検出を行った。その結果、Ｔ
Ｒ−ＢＭＥ１株にラージＴ抗原が発現していること、３
７℃で４日間前記ＥＧＭ−２ブリットキット培地で培養
することにより、ラージＴ抗原の発現量が減少すること
が確認された。
【００３６】（ＴＲ−ＢＭＥ１株の性状）以上の結果か
ら、温度感受性ラージＴ抗原トランスジェニックラット
の骨髄より樹立した不死化細胞株であるＴＲ−ＢＭＥ１
株は、強いアセチル化ＬＤＬの取り込み能を有してお
り、マトリジェル上での管腔構造形成能を持ち、ＶＥＧ
Ｆ受容体１、ＴＩＥ−１，２を発現していることから、
血管内皮細胞と同定することができ、さらに、ＴＲ−Ｂ
ＭＥ１株はコラーゲン−ファイブロネクチンをコートし
たディッシュ上では、ｖＷＦとＶＥ−カドヘリンを発現
していないが、管腔構造形成能を有することから、完全
には分化していない内皮細胞と考えられる。例えば、血
管内皮細胞のスタンダードとして最も広く用いられてい
るヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣにはｖＷＦとＶＥ−
カドヘリンのいずれもが発現しており、特に、ＶＥ−カ
ドヘリンは、抗ＶＥ−カドヘリン抗体により管腔構造の
形成が阻害されることから、内皮細胞間の接着に機能し
ている分子であることを考慮すると、ＴＲ−ＢＭＥ１株
はコラーゲン−ファイブロネクチンをコートしたディッ
シュ上では一部未分化な状態にあり、マトリジェル上で
分化する性状を有していると考えられる。以上のことか
ら、ＴＲ−ＢＭＥ１株は、既存の血管から単離された内
皮細胞とは異なり、新生血管のモデルとして、血管成熟
化の過程の解析・研究に有用であると考えられる。
ら、温度感受性ラージＴ抗原トランスジェニックラット
の骨髄より樹立した不死化細胞株であるＴＲ−ＢＭＥ１
株は、強いアセチル化ＬＤＬの取り込み能を有してお
り、マトリジェル上での管腔構造形成能を持ち、ＶＥＧ
Ｆ受容体１、ＴＩＥ−１，２を発現していることから、
血管内皮細胞と同定することができ、さらに、ＴＲ−Ｂ
ＭＥ１株はコラーゲン−ファイブロネクチンをコートし
たディッシュ上では、ｖＷＦとＶＥ−カドヘリンを発現
していないが、管腔構造形成能を有することから、完全
には分化していない内皮細胞と考えられる。例えば、血
管内皮細胞のスタンダードとして最も広く用いられてい
るヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣにはｖＷＦとＶＥ−
カドヘリンのいずれもが発現しており、特に、ＶＥ−カ
ドヘリンは、抗ＶＥ−カドヘリン抗体により管腔構造の
形成が阻害されることから、内皮細胞間の接着に機能し
ている分子であることを考慮すると、ＴＲ−ＢＭＥ１株
はコラーゲン−ファイブロネクチンをコートしたディッ
シュ上では一部未分化な状態にあり、マトリジェル上で
分化する性状を有していると考えられる。以上のことか
ら、ＴＲ−ＢＭＥ１株は、既存の血管から単離された内
皮細胞とは異なり、新生血管のモデルとして、血管成熟
化の過程の解析・研究に有用であると考えられる。
【００３７】
【発明の効果】本発明の不死化血管内皮細胞株や血管内
皮前駆細胞は、血管新生の関与する病態、例えば、固形
腫瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎な
どの研究や、これら病態に関連する疾患等の診断剤や治
療薬の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。ま
た、不死化脳毛細血管周皮細胞株と本発明の不死化血管
内皮細胞株や血管内皮前駆細胞とを組み合わせることに
より、血管新生のメカニズム、特に新生血管の成熟化、
例えば血管内皮細胞と周皮細胞との相互作用や血管内皮
細胞の臓器特異的な分化のモデル系の構築が可能とな
る。
皮前駆細胞は、血管新生の関与する病態、例えば、固形
腫瘍、動脈硬化、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎な
どの研究や、これら病態に関連する疾患等の診断剤や治
療薬の開発を細胞レベルで研究するのに有用である。ま
た、不死化脳毛細血管周皮細胞株と本発明の不死化血管
内皮細胞株や血管内皮前駆細胞とを組み合わせることに
より、血管新生のメカニズム、特に新生血管の成熟化、
例えば血管内皮細胞と周皮細胞との相互作用や血管内皮
細胞の臓器特異的な分化のモデル系の構築が可能とな
る。
【００３８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Immortalized Vascular Endothelial Cell Line <130> A081P08 <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 1 tcctaatgtg cagtcaggtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 2 atgacgagct ttggcacttg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 3 cagaagagga tgagggtgtc ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 4 cctaatgcca aatgccgaag cc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 5 tctgccacct gcctcaccat 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 6 cctgcaaagt ctcgatggtc a 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 7 gggcaaaaat gaagaccagc ac 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 gcatccatcc gtaacccatc ct 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 gcctctacca gtgaggtttt gaag 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 atctcatctc ttctctgctc cagc 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 11 ggccatcttc ctctgcatcc tc 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 12 atgtgcagtg tgtcgtatgg g 21
【図１】本発明のＴＲ−ＢＭＥ１によるＤｉＩ−アセチ
ル化ＬＤＬの取り込みを示す図である。
ル化ＬＤＬの取り込みを示す図である。
【図２】本発明のＴＲ−ＢＭＥ１でのＶＥＧＦ受容体
１、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２の発現を示す図である。
１、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２の発現を示す図である。
【図３】本発明のＴＲ−ＢＭＥ１でのｖＷＦ、ＶＥ−カ
ドヘリン及びＧ３ＰＤＨの発現を示す図である。
ドヘリン及びＧ３ＰＤＨの発現を示す図である。
【図４】本発明のＴＲ−ＢＭＥ１による培養開始１時間
後のマトリゲル上での管腔構造の形成を示す図である。
後のマトリゲル上での管腔構造の形成を示す図である。
【図５】本発明のＴＲ−ＢＭＥ１による培養開始１時間
後のマトリゲル上での管腔構造の形成を示す図である。
後のマトリゲル上での管腔構造の形成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 帯刀 益夫 宮城県仙台市青葉区八幡５−３−10−402 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BB20 CB01 CB13 FB02 4B024 AA11 BA63 CA01 DA02 GA18 HA01 HA11 4B063 QA05 QA19 QQ08 QQ79 QQ91 QR48 QR77 QS33 QS40 QX01 4B065 AA91X AA95Y AB01 AC01 BA01 BA06 BC46 BC50 CA24 CA46
Claims (24)
- 【請求項１】 血管内皮前駆細胞の培養により得られ
る、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有し、ＶＥＧＦ受
容体１及びＴＩＥ１，２の発現能を保持したことを特徴
とする不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項２】 血管内皮前駆細胞が、骨髄に由来するこ
とを特徴とする請求項１記載の不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項３】 ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子の発現能を有することを特徴
とする請求項１又は２記載の不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項４】 マトリジェル中において管腔構造形成能
を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載
の不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項５】 齧歯類起源であることを特徴とする請求
項１〜４のいずれか記載の不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項６】 齧歯類がラットであることを特徴とする
請求項５記載の不死化血管内皮細胞株。 - 【請求項７】 不死化血管内皮細胞株ＴＲ−ＢＭＥ１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−７０２５）。 - 【請求項８】 ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓＡ
５８のラージＴ抗原遺伝子を導入したトランスジェニッ
クラットの骨髄から単離して得られる血管内皮前駆細胞
を培養して、アセチル化ＬＤＬの取込み活性を有し、温
度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＶＥＧＦ受容体１及び
ＴＩＥ１，２を発現する不死化細胞を樹立することを特
徴とする不死化血管内皮細胞株の製造方法。 - 【請求項９】 血管内皮前駆細胞が、マトリジェル中に
おいて管腔構造形成能を有することを特徴とする請求項
８記載の不死化血管内皮細胞株の製造方法。 - 【請求項１０】 骨髄に由来し、その培養により、アセ
チル化ＬＤＬの取込み活性を有し、ＶＥＧＦ受容体１及
びＴＩＥ１，２の発現能を保持した不死化血管内皮細胞
株に分化することができることを特徴とする血管内皮前
駆細胞。 - 【請求項１１】 不死化血管内皮細胞株が、ＳＶ４０の
温度感受性突然変異株ｔｓＡ５８のラージＴ抗原遺伝子
の発現能を有することを特徴とする請求項１０記載の血
管内皮前駆細胞。 - 【請求項１２】 不死化血管内皮細胞株が、マトリジェ
ル中において管腔構造形成能を有することを特徴とする
請求項１０又は１１記載の血管内皮前駆細胞。 - 【請求項１３】 齧歯類起源であることを特徴とする請
求項１０〜１２のいずれか記載の血管内皮前駆細胞。 - 【請求項１４】 齧歯類がラットであることを特徴とす
る請求項１３記載の血管内皮前駆細胞。 - 【請求項１５】 被検物質の存在下、請求項１〜７のい
ずれか記載の不死化血管内皮細胞株又は請求項１０〜１
４のいずれか記載の血管内皮前駆細胞を培養し、該不死
化細胞株におけるマーカータンパク質の活性及び／又は
発現の程度を測定・評価することを特徴とする不死化血
管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるマーカータ
ンパク質発現の促進又は抑制物質のスクリーニング方
法。 - 【請求項１６】 マーカータンパク質が、ＶＥＧＦ受容
体１又はＴＩＥ１，２であることを特徴とする請求項１
５記載の不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞に
おけるマーカータンパク質発現の促進又は抑制物質のス
クリーニング方法。 - 【請求項１７】 被検物質の存在下、請求項１〜７のい
ずれか記載の不死化血管内皮細胞株又は請求項１０〜１
４のいずれか記載の血管内皮前駆細胞を培養し、該不死
化細胞株のアセチル化ＬＤＬの取込み活性の程度を測定
・評価することを特徴とする不死化血管内皮細胞株又は
血管内皮前駆細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活
性を促進又は抑制物質のスクリーニング方法。 - 【請求項１８】 被検物質の存在下、請求項１〜７のい
ずれか記載の不死化血管内皮細胞株又は請求項１０〜１
４のいずれか記載の血管内皮前駆細胞を培養し、該不死
化細胞株におけるマトリジェル中における管腔構造形成
能の程度を解析・評価することを特徴とする不死化血管
内皮細胞株又は血管内皮前駆細胞におけるマトリジェル
中における管腔構造形成の促進又は抑制物質のスクリー
ニング方法。 - 【請求項１９】 請求項１５又は１６記載のスクリーニ
ング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管
内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発現促進物
質。 - 【請求項２０】 請求項１７記載のスクリーニング方法
により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆
細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活性促進物質。 - 【請求項２１】 請求項１８記載のスクリーニング方法
により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆
細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成促進物質。 - 【請求項２２】 請求項１５又は１６記載のスクリーニ
ング方法により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管
内皮前駆細胞におけるマーカータンパク質発現抑制物
質。 - 【請求項２３】 請求項１７記載のスクリーニング方法
により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆
細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取込み活性抑制物質。 - 【請求項２４】 請求項１８記載のスクリーニング方法
により得られる不死化血管内皮細胞株又は血管内皮前駆
細胞におけるマトリジェル中管腔構造形成抑制物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000050691A JP2001231549A (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 不死化血管内皮細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000050691A JP2001231549A (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 不死化血管内皮細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001231549A true JP2001231549A (ja) | 2001-08-28 |
Family
ID=18572450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000050691A Pending JP2001231549A (ja) | 2000-02-28 | 2000-02-28 | 不死化血管内皮細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001231549A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002112764A (ja) * | 2000-10-05 | 2002-04-16 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | 株化網膜神経細胞 |
| WO2008044339A1 (fr) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Aqumen Biopharmaceuticals K.K. | Agent thérapeutique/de prévention contenant un composé de statine, utilisé pour une maladie intraoculaire |
| WO2008142862A1 (ja) | 2007-05-18 | 2008-11-27 | National University Corporation Asahikawa Medical College | 血管内皮前駆細胞の移植による抗がん療法 |
| WO2013118786A1 (ja) * | 2012-02-08 | 2013-08-15 | 国立大学法人旭川医科大学 | 末梢組織の毛細血管構成細胞の不死化細胞株 |
-
2000
- 2000-02-28 JP JP2000050691A patent/JP2001231549A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002112764A (ja) * | 2000-10-05 | 2002-04-16 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | 株化網膜神経細胞 |
| WO2008044339A1 (fr) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Aqumen Biopharmaceuticals K.K. | Agent thérapeutique/de prévention contenant un composé de statine, utilisé pour une maladie intraoculaire |
| WO2008142862A1 (ja) | 2007-05-18 | 2008-11-27 | National University Corporation Asahikawa Medical College | 血管内皮前駆細胞の移植による抗がん療法 |
| EP2163250A1 (en) * | 2007-05-18 | 2010-03-17 | National University Corporation Asahikawa Medical College | Anticancer therapy by transplanting vascular endothelial progenitor cells |
| EP2163250A4 (en) * | 2007-05-18 | 2011-01-19 | Nat University Corp Asahikawa Medical College | ANTICANCER THERAPY BY TRANSPLANTATION OF ENDOTHELIAL VASCULAR STEM CELLS |
| US8491887B2 (en) | 2007-05-18 | 2013-07-23 | National University Corporation Asahikawa Medical University | Anticancer therapy by transplanting vascular endothelial progenitor cells |
| WO2013118786A1 (ja) * | 2012-02-08 | 2013-08-15 | 国立大学法人旭川医科大学 | 末梢組織の毛細血管構成細胞の不死化細胞株 |
| JPWO2013118786A1 (ja) * | 2012-02-08 | 2015-05-11 | 国立大学法人旭川医科大学 | 末梢組織の毛細血管構成細胞の不死化細胞株 |
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